Multibitch TMT揭示了误报,批量效应和缺失值*

  • Alejandro筋疲力尽
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    基因调控中心,邓迪大学生命科学学院,邓德,邓迪,邓迪,英国DD1 5eh
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  • Jens Hukelmann.
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  • Dalila Bensaddek.
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  • Angus I. Lamond.
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  • 作者脚注
    *此工作由Wellcome Trust / MRC资助[098503 / E / 12 / Z]和Wellcome Trust Grants [073980 / z / 03 / z,105024 / z / 14 / z]。
    §目前的地址:Paul-Ehrlich-str。 15,Tuebingen,72076,德国。
    ¶现代地址:Biosciences核心实验室,蛋白质组学,阿卜杜拉王科技大学,沙特阿拉伯23955-6900 Thuwal。
      用于大型蛋白质组学分析的多路复用策略变得越来越普遍,特别是串联质量标签(TMT)。在这里,我们使用了具有二十四个10-Plex TMT批次的大型IPSC蛋白质组学实验,以评估在单一分析中积分多次TMT批次的效果。我们确定了蛋白质缺失值的显着通胀率,因为多个批次被整合并且表明该模式在肽水平处加剧。我们还表明,没有正常化策略来解决批处理效果,在集成了来自多个TMT批次的数据时,不会再现单个多路复用TMT批次内的高精度。
      此外,通过使用Y染色体肽作为内部对照来研究误报的发生率。在该数据集中定量的IPSC线源自雄性和雌性供体,因此延伸到Y染色体的肽应该不存在雌性线。尽管如此,在所有TMT批次的雌性通道中始终检测到这些Y染色体特异性肽。然后我们使用相同的Y染色体特异性肽来量化离子配合水平以及初级和次级报告离子干扰的影响。这些结果用于提出解决方案以减轻多批次TMT分析的局限性。我们通过促进批次的归一化,确认在每个批量中包括普通参考线,通过促进批次的归一化,并提出了最小化交叉口报告离子干扰的实验设计。

      图形概要

      图缩略图FX1.
      强调
      • 随着多个TMT 10-Plex批次,揭示了缺失值的通胀。
      • 分析了多种TMT 10-PLEX批次对高丰度蛋白质量化精度的影响。
      • 建立了通过染色体肽在所有雌性通道中的发病率突出的伪阳性引起的假阳性检测。
      • 优化的新实验设计设置,以最小化交叉口报告离子干扰通过洞察分配给Coisolation和报告离子干扰。
      高吞吐量,霰弹枪蛋白质组学,使用数据相关的采集(DDA),
      使用的缩写是:
      达达
      数据相关的采集
      PTM.
      翻译后修改
      RII.
      记者离子干扰
      CII.
      Coisolation干扰
      TMT.
      串联质量标签。
      1使用的缩写是:达达
      数据相关的采集
      PTM.
      翻译后修改
      RII.
      记者离子干扰
      CII.
      Coisolation干扰
      TMT.
      串联质量标签。
      现在能够综合研究蛋白质体,从而鉴定10,000或更多来自细胞和组织的蛋白质(
      • Bekker -Jensen D.B.
      • Kelstrup C.D.
      • Batth T.S.
      • Larsen S.C.
      • 脱落C.
      • Bramsen J.B.
      • Sorensen K.D.
      • 霍耶斯。
      • orntoft t.f.
      • 安德森C.L.
      • Nielsen M.L.
      • 奥尔森J.V.
      综合人类蛋白质群快速产生的优化霰弹枪战略。
      ,
      • 贝克米
      • 施密特A.
      • Malmstroem J.
      • Claassen M.
      • ori a。
      • Szymborska A.
      • 赫罗特F.
      • rinner o.
      • Ellenberg J.
      • Aeberberold R.
      人细胞系的定量蛋白质组。
      ,
      • 梅尔F.
      • Geyer P.E.
      • 弗莱拉冬季S.
      • Cox J.
      BoxCar采集方法使单次蛋白质组学能够在100分钟内以10,000个蛋白的深度。
      )。然而,为了使用DDA实现这种深的蛋白质组覆盖,经常需要在质谱(MS)分析之前的大量提取物(MS)分析(
      • Bekker -Jensen D.B.
      • Kelstrup C.D.
      • Batth T.S.
      • Larsen S.C.
      • 脱落C.
      • Bramsen J.B.
      • Sorensen K.D.
      • 霍耶斯。
      • orntoft t.f.
      • 安德森C.L.
      • Nielsen M.L.
      • 奥尔森J.V.
      综合人类蛋白质群快速产生的优化霰弹枪战略。
      ,
      • Camerini S.
      • Mauri P.
      临床蛋白质组学中蛋白质和肽分离在质谱分析中的作用。
      )。为了评估所得数据的显着性,也需要至少为每个样本/条件进行3个重复(
      • rost h.l.
      • Malmstrom L.
      • Aeberberold R.
      用于系统生物学的可重复定量蛋白质数据矩阵。
      ,
      • Turck C.W.
      • Falick上午
      • Kowalak J.A.
      • 泳道W.S.
      • Lilley K.S.
      • Phinney B.S.
      • Weintraub S.T.
      • Witkowska H.E.
      • yates n.a.
      Biomolecula资源设施协会蛋白质组学研究,G,生物分子资源设施协会蛋白质组学研究组2006年研究:相对蛋白质定量。
      )。对于分析蛋白质组的多维特征的实验,涉及所涉及的数据采集时间仍然增加;例如,研究蛋白质亚细胞定位,周转率,翻译后修饰(PTMS)和蛋白质 - 蛋白质相互作用的差异(
      • 在努力硕士
      • Lamond A.I.
      细胞生物学的多维蛋白质组学。
      ,
      • Boisvert F.M.
      • Ahmad Y.
      • Gierlinski M.
      • Charriere F.
      • Lamont D.
      • 斯科特米
      • 巴顿G.
      • Lamond A.I.
      人体细胞蛋白质组果苗果实分析的定量空间蛋白质组学分析。
      ,
      • 在努力硕士
      • Kirkwood K.J.
      • TINTI M.
      • Brenes Murillo A.
      • Ferguson M.A.
      • Lamond A.I.
      全球膜蛋白蛋白联蛋白分析使用体内交联和基于质谱的蛋白质相关性分析。
      )。
      为了应对大规模蛋白质组学分析的挑战,已经开发了策略来允许并行分析多个样品,通过复用同位素标记的肽(
      • Hennrich M.L.
      • 罗马诺夫N.
      • 喇叭P.
      • Jaeger S.
      • Eckstein V.
      • 尖顶V.
      • 你好
      • 丁X.
      • Poisa-Beiro L.
      • 赖M.C.
      • 郎B.
      • Boultwood J.
      • luft t.
      • Zaugg J.B.
      • Pellagatti A.
      • Bork P.
      • aloy p.
      • Gavin A.c.
      • 何A.D.
      人骨髓细胞特异性蛋白质组分析揭示年龄依赖性功能下降的分子特征。
      ,
      • 慕尼黑我。
      • 摩根M.E.
      • Peltier J.
      • Weiland F.
      • Gregorczyk M.
      • 棕色F.C.
      • MacAltney T.
      • t
      • 胸衣M.
      • rouse J.
      磷蛋白酶筛选鉴定CDK15激酶的生理基质。
      )。最广泛使用的MS多路复用方法,TMT(
      • 汤普森A.
      • Schafer J.
      • Kuhn K.
      • Kienle S.
      • Schwarz J.
      • 施密特G.
      • Neumann T.
      • 约翰斯通r.
      • 穆罕默德A.K.
      • 哈蒙克
      串联质量标签:MS / MS的复合蛋白混合物比较分析的新量化策略。
      )和ITRAQ(
      • 罗斯P.L.
      • 黄玉。
      • Marchese J.N.
      • 威廉姆斯B.
      • 帕克克。
      • 哈桑斯。
      • Khainovski N.
      • Pillai S.
      • 丹尼尔斯S.
      • Purkayastha S.
      • Juhasz P.
      • 马丁斯。
      • Bartlet-Jones M.
      • 雅各布森A.
      • Pappin D.J.
      使用胺 - 反应性的异常标记试剂在酿酒酵母中的多重蛋白质定量。
      ),使用异甲态标签以同时肽鉴定和量化。 TMT的流行程度增加,现在广泛使用(
      • isasa m.
      • 玫瑰c.m.
      • Elsasser S.
      • Navarreete-Perea J.
      • 保罗J.A.
      • 芬利D.J.
      • Gygi S.P.
      多路复用,蛋白质植物蛋白表达分析:酵母脱脂酶敲除菌株。
      ,
      • Mcalister G.C.
      • Nusinow D.P.
      • Jedrychowski M.P.
      • Wuhr M.
      • Huttlin E.L.
      • 埃里克森B.K.
      • RAD R.
      • 哈斯W.
      • Gygi S.P.
      MultiToTCH MS3能够通过癌细胞系蛋白质组精确,灵敏和多重检测差异表达。
      )。这反映了多路复用TMT在蛋白质组学研究中提高样本吞吐量的能力,并降低了DDA蛋白质组学中固有的随机取样的“缺失值”问题(
      • 拉扎尔C.
      • Gatto L.
      • Ferro M.
      • Brululy C.
      • 汉堡T.
      在无标签定量蛋白质组学数据集中占用缺失值的多个自然,以比较撤销策略。
      ,
      • Webb-Robertson B.J.
      • Wiberg H.K.
      • matzke m.m.
      • 棕色J.N.
      • 王J.
      • McDermott J.E.
      • 史密斯r.d.
      • 罗德兰K.D.
      • Metz T.O.
      • 磅数J.G.
      • 水壶
      审查,评估和讨论基于质谱的无标签的全球蛋白质组学缺失价值归咎缺失的挑战。
      )。因此,在单个复用TMT批处理中,蛋白质水平缺失值的数量频繁低<2% (
      • isasa m.
      • 玫瑰c.m.
      • Elsasser S.
      • Navarreete-Perea J.
      • 保罗J.A.
      • 芬利D.J.
      • Gygi S.P.
      多路复用,蛋白质植物蛋白表达分析:酵母脱脂酶敲除菌株。
      )。此外,多路复用TMT批处理中的量化的精度高(
      • O'Connell J.D.
      • 保罗J.A.
      • o'brien J.J.
      • Gygi S.P.
      两种常见蛋白质定量方法的蛋白质全组评估。
      )。然而,不太清楚多路复用的TMT如何用于非常大规模分析,涉及许多TMT批次。
      在此稿件中,我们使用人体IPSC细胞的蛋白质组学数据集,涉及24个单独的10-Plex TMT批次(
      • 勃朗斯A.
      • Bensaddek D.
      • Hukelmann J.L.
      • afzal五。
      • Lamond A.I.
      IPSC蛋白质组学纲要。
      )。我们将数据的定量进行比较,在10-plex批次之间,并关注我们对4个主要问题的分析:(1)缺失值,(2)量化的准确性,(3)误报和(4)记者的效果离子干扰(RII)和配合干扰(CII)。
      我们显示对缺失值的通胀影响,因为来自多批次的数据在蛋白质和肽水平上集成。通过研究每个10-Plex TMT批量内的变化系数(CV)以及通过比较每批共用的参考线(IPSC线“Bubh_3”)的比较,评估重现性。此外,通过使用Y染色体肽作为内部对照研究了误报的发生率。在该数据集中定量的IPSC线衍生自163种不同的供体,包括雄性和雌性,因此应缺乏母线映射到Y染色体的肽。尽管如此,我们确认在所有TMT批次的雌性通道中一致地检测到这些Y染色体特异性肽。最后,通过使用这些Y染色体肽,我们量化了离子配合和报告离子干扰对TMT定量精度的影响。

      实验步骤

       实验设计与统计学理由

      该研究由240个IPSC重复组成,217个生物重复和24种技术复制,来自163种不同的供体。该研究包括二十四个10-Plex TMT批次。每批次由1个公共参考线(IPSC细胞系“Bubh_3”的技术复制)和9个不同的IPSC细胞系。技术复制用于下面描述的数据归一化策略。分析的240个重复中,142次来自女性供体和98名男性供体。

       TMT.样品制备

      对于蛋白质提取,用冰冷的PBS洗涤IPSC细胞粒料,并立即在200μl裂解缓冲液中重新溶解(8 m urea in 100 mm 三乙基碳酸氢铵(Temb))并在室温下混合15分钟。使用超声波(冰上6×20秒)剪切细胞DNA。使用Tris-羧乙基膦TCEP减少蛋白质(25米m)在室温下30分钟,然后使用碘乙酰胺在黑暗中烷基化30分钟(50米m)。使用EZQ测定(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)量化总蛋白质。对于具有质谱级溶酶内肽酶的第一次消化,Lys-C(Wako,Japan),裂解物用100米稀释4倍m 然后在用胰蛋白酶第二消化前进一步稀释2.5倍。用酶以1:50(w / w)的酶使用Lys-C和胰蛋白酶。将消化物在37℃下进行过夜,然后通过用三氟乙酸(TFA)酸化终浓度为1%(V:V)。使用C18 Sep-Pak盒(Waters,Millford,MA)脱谷物之后的制造商的说明书。
      对于基于串联质量标签(TMT)的量化,将干燥的肽重新溶解在100米中m 使用荧光法测定(CBQCA,Thermo Fisher Scientific)测量茶叶(50μL)及其浓度。对于从每种细胞系的每种10-Plex TMT批次100μg肽进行比较,在100μl茶叶中,用不同的TMT标签(40μl乙腈)(Thermo Fisher Scientific)(Thermo Fisher Scientific)标记为2 H在室温下。温育后,使用8μl5%羟胺(Thermo Fisher Scientific)淬灭标记反应30分钟,混合不同的细胞系/标签和干燥 真空.
      使用离线,高pH反相(RP)色谱法分离TMT样品:用3.5μm颗粒(水)将样品加载到4.6×250mm Xbridge BH130 C18柱上。使用Dionex Biors系统,使用25分钟的溶剂A(10μm)分离样品(10米m 在pH 9)和B(10米m 铵在80%乙腈中形成pH 9),流速为1ml / min。将肽分离成48个级分,将其固结成24个级分。随后将级分干燥,将肽重新溶解在5%甲酸中并通过LC-MS / MS分析。

       TMT. LC-MS / MS

       基于TMT的分析

      使用玻璃纤维融合纤维质谱仪(Thermo Fisher Scientific)分析样品,配备Dionex超高压液相色谱系统(RSLCNANO)。使用Dionex RSLCNANO HPLC(Thermo Fisher Scientific)进行RPLC。将肽注射到75μm×2cmpmap-c18预柱上并在75μm×50cm的RP-C18易喷雾温控集成柱 - 发射器(Thermo Fisher Scientific)上进行分解,使用四小时多学分从5%B到35%B的梯度,恒定流速为200 nL / min。移动相是:2%ACN掺入0.1%Fa(溶剂A)和80%ACN,其掺入0.1%Fa(溶剂B)。通过将2.5kV施加到易于喷雾发射器来启动喷雾,并且在Xcalibur软件的控制下使用顶速和4次持续时间在Xcalibur软件的控制下获取数据。调查扫描是在覆盖的壁画中获得的 m/z 范围为400至1,400汤姆森,质量分辨率为120,000,自动增益控制(AGC)目标为2.0×105 离子。选择最强烈的离子用于使用30%CID碰撞能量和1.6℃的隔离窗口中的CID进行碎片化。 AGC目标设定为1.0×104 对于70 ms的最大喷射时间和80秒的动态排除,扫描速率设置为“快速”。
      在MS3分析期间,使用同步前体选择,将5个片段离子与第2窗口的窗口分配,并使用55%的HCD碰撞能量进一步碎裂。然后将片段分析在壁图中,分辨率为60,000。 AGC目标设定为1.0×105 并且最大喷射时间设定为105毫秒。

       机器,空白和标准

      所有TMT批次分析在相同的玻璃岩融合MS仪器(Thermo Fisher Scientific)上分析。在每个单独的TMT实验之间,运行一个坯料,然后分析15个肽保留时间校准(RTC)标准,以评估保留时间漂移。然后通过分析MCF10A总细胞消化标准来评估肽和蛋白质鉴定。最后一步包括两个空白的分析,一个带有振荡梯度,一个具有渐变匹配要运行的样本的空白。

       识别和量化

      使用MaxQuant分析来自所有二十四个10-Plex TMT批次的数据是批次的分析(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      ,
      • Tyanova S.
      • Temu T.
      • Cox J.
      基于质谱的霰弹枪蛋白质组学的MaxQuant计算平台。
      )v。1.6.3.3。对于各自的肽谱匹配(PSM)和蛋白质水平,FDR阈值设定为1%。使用以下参数搜索数据;型被设置为报道离子MS3,用10plect TMT,稳定的氨基甲酰(c)改性,可变修饰,氧化(M),乙酰化(蛋白质N末端),脱酰胺(NQ),谷氨酰胺与吡喃 - 谷氨酸(n末端),有一个错过的胰蛋白酶切割阈值,记者质量耐受设定为0.03ppm。将最小肽长度设定为7个氨基酸。使用UNIPROT鉴定蛋白质和肽(Swissprot 2018年12月)。运行参数可在Proteomexchange(
      • VizCaino J.A.
      • 德意曲e.w.
      • 王R.
      • Csordas A.
      • Reinger F.
      • 里奥斯D.
      • 戴安斯J.A.
      • 太阳Z.
      • Farrah T.
      • Bandeira N.
      • binz p.a.
      • Xenarios I.
      • 艾森凯母线
      • Mayer G.
      • Gatto L.
      • 坎波奥A.
      • Chalkley R.J.
      • Kraus H.J.
      • Albar J.P.
      • 马丁内斯 - Bartolome S.
      • APWEILER R.
      • OPENN G.S.
      • 玛特L.
      • 琼斯A.R.
      • Hermjakob H.
      Proteomexchange提供全球协调的蛋白质组学数据提交和传播。
      )通过骄傲的存储库(
      • VizCaino J.A.
      • Csordas A.
      • Del-Toro N.
      • 戴安斯J.A.
      • 怜悯J.
      • Lavidas I.
      • Mayer G.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • Ternent T.
      • 徐Q.W.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      2016年更新自豪数据库及其相关工具。
      ),以及完全的maxquant(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )量化输出(PXD010557)。

       过滤

      丢弃标记为“反向”的“潜在污染物”或“仅鉴定的潜在污染物”或“仅鉴定的所有蛋白质被丢弃。最终亚特区包含9,640个蛋白质。也从分析中过滤标记为“潜在污染物”或“逆转”的肽。最终的肽数据组包含178,491个肽。

       副本编号生成

      在蛋白质组学标尺方法之后计算蛋白质拷贝数(
      • wisniewski J.R.
      • 嘿m.y.
      • Cox J.
      用于蛋白质拷贝数和浓度估计的“蛋白质组学标尺”,没有尖峰标准。
      )。对于蛋白质, p, UCNB,C,P 是未经校正的蛋白质副本号:
      uCNb,c,p=protein,MS3signalb,c,p×AMp×6.85×1012hb,chistonesMS3signalh为了b{1,2,24}渠道c{126C,127N,131N}


      在哪里 A 是艾艾艾奥拉德罗的常量, MP. 是蛋白质的摩尔质量 p,蛋白质MS3信号是蛋白质MS3强度,并且组蛋白MS3信号是所有组蛋白的MS3强度, h.
      这些未校正的副本数字将被称为“原始拷贝号”,用于研究变异系数(CV)。控制24种不同的10-Plex批次之间的技术变化,校正因子, CF. ,应用于每种蛋白质, p,在每批, b,调整蛋白质拷贝数。
      cfb,p=uCNb,126C,pbuCNb,126C,p/24为了b{1,2,24}


      在哪里 UCN.B,126c,p 是从报道通道126C(参考通道)导出的蛋白质拷贝数。标准化的副本编号, 诺斯卡,计算蛋白质, p 在所有批次, b和所有渠道 c:
      normCNb,c,p=uCNb,c,pcfb,p为了b{1,2,24}渠道c{126C,127N,,131N}


       缺少价值计算

      首先,为了在该DDA分析中估计缺失的值,针对每批计算,以至少1个以上的报告强度检测到的独特蛋白/肽列表。为了确定每种10-Plex TMT批次内缺失值的数量,将每条记者通道的独特蛋白/肽的数量与批次内鉴定的独特蛋白质/肽的数量进行比较。应用这种方法以为24个单个10-Plex TMT批次中的每一个生成缺失的值计算。
      为了评估集成多个TMT批次的效果,进行随机抽样来估计缺失的值如何受到分析的10-Plex TMT批次数量的逐步增加的影响。这以从2开始的增量方式进行,并且用22批次完成(PT6388未用于该分析),每级500次迭代。在第一级,2批次将随机选择无替换,并且在最后级别22批次,再次选择批次,再次没有替换。这是通过基础R芯封装的R函数“Sample()”部分进行的。
      在每个级别下,计算出在任何集成的TMT批次中大于零的至少1个报道离子强度检测到的蛋白质/肽的新列表,并评估每条记者通道的强度大于0的蛋白质/肽的数量新列表。

       变异系数

      使用LOG10转化的蛋白质拷贝数计算蛋白质丰度水平的变异系数(CV)。
      CV=SX×100


      对于每种蛋白质,CV等于拷贝数标准偏差除以平均拷贝数(X)次100.每种10-Plex TMT批次内的蛋白质CV为同一批次内的所有10个细胞系计算,使用每个记者渠道中检测到的所有蛋白质。使用在TMT中检测到的蛋白质来计算参考线CV10-126C(参考线)横跨所有24个10-Plex TMT批次的通道。

       相关聚类

      对于每个10-Plex TMT批次,针对同一批次内的所有细胞系计算了一致的相关性值。使用来自R包“Agricolae”1.2.8的“相关()”功能进行计算。
      应用相同的过程以计算参考线的一致性相关值, IE。 在所有TMT批处理中使用报告通道126c。

       肽强度标准化

      复制归一化强度, rni.,按肽计算, q:
      rniq=日志10(peptideMS3signalb,c,qmedian(Ib,c))Ib,c={peptideMS3signalb,c,q:q}给予,b渠道,c为了b{1,2,24}渠道c{126C,127N,,131N}


      中位数归一化强度, 米西,对于肽, q,是所有批次的中位数, b和渠道, c:
      mniq=median(rnib,c,q)为了全部批次b{1,2,24}渠道c{126C,127N,,131N}


      全球中位数 是中位数 米西 对于所有肽, q:
      globalmedian=median(mniq)


       记者离子干扰分类

      报告器离子干扰(RII)目标基于来自Thermofisher Scientific的10-Plex TMT标记试剂的典型产品数据表,如总结 表I. below:
      表I.记者离子干扰分类所有TMT批次,指定报告器质量标签,MaxQuant输出内的报告通道和主(+1DA)和次级(-1DA)报告离子干扰的目标通道
      群众标签记者渠道-1da(二级RII)+ 1DA(主RII)
      TMT.10-1261127C
      TMT.10-127N2128N
      TMT.10-127C3126128C
      TMT.10-128N4127N129N
      TMT.10-128C5127C129C
      TMT.10-129N6128N130N
      TMT.10-129C7128C130C
      TMT.10-130N8129N131
      TMT.10-130C9129C
      TMT.10-13110130N

       报告离子干扰分析

      为研究报告离子干扰跨不同TMT通道的影响,我们选择了69个肽的子集,其特异于唯一定位在Y染色体上的蛋白质编码基因列表; “cdy1,”“cdy2a,”“ddx3y”,“eif1ay,”kdm5d,“”nlgn4y“,”pcdh11y,“rps4y1,”“tbl1y,”“utp9y”和“uty”。
      使用来自Y染色体特异性基因的肽值的这种方法取决于每个10-Plex TMT批次中的雄性和女性供体衍生的IPSC线的不同混合物。然而,24个TMT批次中的两种包括雌性供体衍生的IPSCs,其已经显示出不具有QC分析中的Y染色体衍生的DNA(
      • Kilpinen H.
      • roncalves a。
      • Leha A.
      • afzal五。
      • alasoo K.
      • 阿什福德S.
      • 巴拉斯。
      • Bensaddek D.
      • Casale F.P.
      • Culley O.J.
      • DaneCek P.
      • Faulconbridge A.
      • 哈里森P.W.
      • 凯瑟里亚A.
      • 麦卡锡D.
      • 麦卡锡S.A.
      • Meleckyte R.
      • Memari Y.
      • Moens N.
      • 飙升
      • 曼A.
      • 街头I.
      • AGU C.A.
      • Alderton A.
      • 纳尔逊r.
      • 哈珀斯。
      • Patel M.
      • 白色A.
      • Patel S.R.
      • 克拉克L.
      • 哈莱R.
      • 基尔顿下午
      • Kolb-Kokocinski A.
      • Beales P.
      • Birney E.
      • Danovi D.
      • Lamond A.I.
      • Ouwehand W.H.
      • Vallier L.
      • 瓦特下午
      • 德国R.
      • 铁灯o.
      • gaffney d.j.
      常见的遗传变异驱动人IPSC中的分子异质性。
      )。对于这些雌性供体特异性批次,将分配给Y染色体特异性基因的任何肽被排除在分析之外。额外的批次Pt6388显示出不规则行为,因此也从后分析中丢弃。使用65岁特异性肽的最终子集进行该分析(见 列表的补充数据)。

       肽雄性与记者离子干扰比率

      肽比比较男性通道 相对 女性渠道, MPR.,经过不同的报告离子干扰条件, 条件,每10-plex tmt批量计算, b,对于肽, q,使用复制归一化强度:
      mprb,qmedian(RNIb,male,q)median(RNIb,cond,q)RNIb,male,q={rnib,c,q:malechannels,c},RNIb,cond,q={rnib,c,q:condchannels,c},为了b{1,2,24}cond{基本的RII.,中学RII.,双倍的RII.,RII.}.


      将雄性复制到不同的报告离子干扰条件的盒子图使用这些肽批量比并使用“GGPLOT2”版本3.0.0(
      • 威克姆H.
      )。

       肽报告者离子干扰比率

      肽比例, 美国国家公共电台,比较不同的报告离子干扰(RII)条件, 条件,在女性渠道到没有记者离子干扰的女性通道, 诺伊,在每个10-plex tmt批处理中计算, b,对于肽, q,使用复制归一化强度。
      nprb,qmedian(RNIb,cond,q)median(RNIb,noRII,q)RNIb,cond,q={rnib,c,q:condchannels,c},RNIb,noRII,q={rnib,c,q:noRIIchannels,c},为了b{1,2,24}cond{基本的RII.,中学RII.,双倍的RII.}.


      这些结果由全球中值分层,其中具有大于或等于全球中位数的中位数的肽被认为是“高强度”,低于全球中位数被认为是“低强度”。将不同的报告离子干扰条件与通过报道离子干扰影响的重复相比,使用这些肽批量比将不同的报告离子干扰条件进行比较,并使用“GGPLOT2”版本3.0.0(
      • 威克姆H.
      )。

      结果

       TMT.中缺少值

      使用TMT的已知优点是在单个TMT批处理中存在的缺失值的低索引。最近的研究报告结果低于<蛋白质水平的1%缺失值(
      • O'Connell J.D.
      • 保罗J.A.
      • o'brien J.J.
      • Gygi S.P.
      两种常见蛋白质定量方法的蛋白质全组评估。
      ),通常没有在肽水平报告数据。
      我们通过分析IPSC 10-Plex TMT数据,了解每个TMT批次内蛋白质水平的缺失值的数量(Fig. 1A)。初步结果与以前的报告一致, IE。 24种不同的10-Plex TMT批量显示的92%<蛋白质水平的1%缺失值,只有1个异常值,蛋白质值缺失>1.5%。这是实验Pt6388,它以红色突出显示(Fig. 1A1B)。此外,当我们在肽水平分析数据时,对蛋白质数据非常密切的一致,其中92%的24种不同的10-Plex TMT批次<5%缺失的肽值,但是异常批料具有加剧的效果,并在肽水平上显示9%缺失值。因此,我们从其他分析中排除了PT6388。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1蛋白质和肽缺失值: A,在蛋白质水平计算的每个TMT批次的缺失值百分比。 B,在肽水平计算的每个TMT批次的缺失值百分比。 C,盒图显示蛋白质缺失值的结果作为10-Plex TMT批次数量的函数(参见方法)。 D,框图显示肽缺失值的结果作为10-Plex TMT批次数量的函数(参见方法)。对彼此而言 CD 下铰链和上部铰链代表了第1和第3四分位数。上晶须从铰链从铰链延伸到从铰链的1.5 * IQR进一步不超过1.5 * IQR,下晶须从铰链延伸到最小的铰链1.5 * IQR的最小值。
      这些以前的结果没有解决将数据与多个独立的10-Plex TMT批量集成到单一分析中的数据。要研究数据集成的影响,我们增加了所选批次的数量,从2到22开始,重新计算出现的缺失值的数量(Fig. 1C1D;请参阅方法)。在蛋白质水平时,缺失值的中值数量从0.19%增加,10-Plex TMT批量增加到6.35%,当集成了第二个10-Plex TMT批次的数据(Fig. 1C)。当我们将数据从5种不同的10-Plex TMT批次集成时,蛋白质水平的缺失值的中位数升级至〜10%。
      当在肽水平进行分析时,这种情况加剧了(Fig. 1D)。在从只有两个10-Plex TMT批量集成数据时,缺失的肽值的中值数是>23%。甚至更突出,它只需要将数据从5种不同的10-Plex TMT批次集成到肽水平上产生〜40%的缺失值。数据表明批次之间不可重复检测到肽,但它只是低丰度肽?
      基于这些结果,我们决定对缺失值的抗胀速率进行更深入的分析。我们观察到,在每种10-plex tmt批次内鉴定的肽数相对恒定(Fig. 2A),但不同批次的变量相当变化。每批定鉴定的肽数为84,046,标准偏差为11,354。为了进一步分析这些肽水平数据,我们首先向归一化所有细胞系中所有肽的MS3强度(参见方法)。日志10 中位数标准化的MS3强度跨越6个数量级(参见方法; Fig. 2B)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2肽标识和强度: A,在所有TMT通道中,用MS3强度识别的肽数大于零,由TMT批次彩色。 B,中值归一化肽强度的直方图(参见方法)。 C,堆叠密度图显示由中值标准化肽强度四分位数分组的肽及其在所有TMT通道上的检测百分比。 D,堆叠密度图显示每个肽的识别率的四分位数及其相应的日志10 标准化的MS3强度。
      接下来,基于日志,我们接下来分析了Quartiles集的肽数据10 中位数归一化强度值(Fig. 2C)。第一个四分位数代表了25%最少的肽和第四四分位数,25%最丰富的肽。在所有TMT通道中检测到的第一个四分位数内只有11个肽,并且只有603个肽>90%的TMT通道。由于DDA在MS1扫描期间选择达到质谱仪的N最丰富的离子(
      • 胡阿。
      • 贵族W.S.
      • 狼雅德林A.
      蛋白质组学技术进步:数据独立收购的新发展。
      ) (在哪里 n 通常是10-30),这种偏差是可预测的。但是,当我们分析来自第四个四分位数(最丰富的肽)的结果时,我们看到这些肽中的26%仅在其中检测到<50%的TMT通道。在不到一半的所有通道中检测到的这些高强度肽具有0.32的中值归一化强度,代表了第84百分位数。此外,在所有TMT通道中检测到第4四分位数的24%的肽。总共存在12,140个肽,其在所有TMT通道中检测到,无论强度分类如何,占所有肽的6.81%。
      接下来,我们通过比较识别四分位数来分析数据,这些识别四分位数由检测到的TMT通道百分比组织(Fig. 2D)。第一个四分位数代表了至少经常检测到的肽的25%, IE。 在不到29个TMT频道(见 补充数据)。这些肽>29%的中位数归一化强度高于全球中值(参见方法; -0.184),突出显示甚至相对丰富的肽未始终识别。总体而言,检测到〜50%的肽<所有TMT通道的40%。

       10-Plex TMT批次之间的变化

      多项研究记录了TMT,作为产生精确定量的方法,在某些情况下具有比可比标签的可比性数据低的变异系数(CV)〜3x(
      • O'Connell J.D.
      • 保罗J.A.
      • o'brien J.J.
      • Gygi S.P.
      两种常见蛋白质定量方法的蛋白质全组评估。
      )。这些研究中的大多数都集中于分析单个TMT批量内的定量精度,并且不会探索将数据与多个TMT批次集成到一个分析中的效果。然而,涉及多个细胞系和/或条件的大规模蛋白质组学分析的项目需要在单个实验中使用多个TMT批次(
      • Hennrich M.L.
      • 罗马诺夫N.
      • 喇叭P.
      • Jaeger S.
      • Eckstein V.
      • 尖顶V.
      • 你好
      • 丁X.
      • Poisa-Beiro L.
      • 赖M.C.
      • 郎B.
      • Boultwood J.
      • luft t.
      • Zaugg J.B.
      • Pellagatti A.
      • Bork P.
      • aloy p.
      • Gavin A.c.
      • 何A.D.
      人骨髓细胞特异性蛋白质组分析揭示年龄依赖性功能下降的分子特征。
      )。
      我们计算了230 IPSC复制的蛋白质拷贝数,其中包括208个生物重复和23个控制IPSC线(Bubh_3)的技术复制,跨越23个单独的10-Plex TMT批次(PT6388再次从分析中取出)。然后,我们继续计算LIN的一致性相关系数,该系数测量两个变量之间的协议,并提出评估可重复性(
      • 林L.I.
      一种相应的相关系数来评估再现性。
      )。这是针对每个TMT 10-Plex批量内的每个IPSC线路执行,以及控制线的所有技术复制,通道TMT10 126,跨越23个10-plex tmt批次。
      每个10-Plex TMT批处理中的一致性系数非常高,(中位值98%的一致性),突出显示每批次定量的精度。然而,当相同的计算应用于跨越23个相应批次的控制IPSC线的技术复制时,中值的一致系数下降到81%。
      要进一步探索这种情况,我们计算了日志的简历10 转化的蛋白质拷贝数(
      • 居星E.
      • 斯塔尔W.
      • ABBT M.
      跨科学的日志正态分布:键和线索。
      )(参见方法),都在每个10-plex tmt批处理中,以及跨越23个控件(Fig. 3A)。当我们在每次10-Plex TMT批次内分别计算蛋白质CV时,中值为1.72,所有10-PLEXES显示中值蛋白质CV<2.5。因此,数据显示,对于每批,具有CV的蛋白质>7.5被认为是异常值(Fig. 3A)。这些数据在每个单独的多路复用实验中显示了高精度。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3变化: A,显示在每个10-Plex TMT批料中检测到的所有蛋白质的蛋白质拷贝数系数的盒图以及在所有参考线中检测到的所有蛋白质(所有批次中的TMT通道126c)。 B,显示100个最丰富的蛋白质的蛋白质拷贝数,其变异系数大于或等于7.5的蛋白质​​拷贝数,在所有参考线上重复(所有批次中的TMT通道126c)。对于两个Boxpots,下铰链和上部铰链代表了第1和第3四分位数。上晶须从铰链从铰链延伸到从铰链的1.5 * IQR进一步不超过1.5 * IQR,下晶须从铰链延伸到最小的铰链1.5 * IQR的最小值。
      类似地,为了评估精度,我们计算了参考IPS细胞系的所有技术复制的CV,Bubh_3在通道TMT中分析10 126在每10-plex tmt批次中。在技​​术复制中检测到的所有蛋白质的中位CV,是11.03,即比批次内的中值高6.4倍。在技​​术复制中的所有蛋白质中超过80%的CV将被视为批次内10-Plex TMT分析中的异常值。
      通常存在于蛋白质组学研究中,其变异主要影响低强度蛋白和肽。我们决定测试这种假设并专注于极其丰富的蛋白质。我们将分析专注于23个参考线复制,并选择了CV大于7.5的前100个最丰富的蛋白质,并根据所有参考线数据的副本编号创建盒块(Fig. 3B)。
      我们选择突出5例; 60s核糖体蛋白L35a(RPL35a;以蓝色突出显示),组蛋白H1.2(HIST1H1C;以绿色突出显示),ATP酶抑制剂,线粒体(ATP5if1;以灰色突出显示),Peptydyl-ollyl CIS-Trans异构酶H(PPIH;在紫色突出显示)和谷胱甘肽S-转移酶OMEGA-1(GSTO1;突出显示在粉红色)。 RPL35A在~16,786,000至约185,000份的表达中,用10个独特的+剃须刀(URP)鉴定。 Hist1H1C从〜4,84,000拷贝的范围为〜4,8,000拷贝,并用6个URP鉴定,从〜4,825,000到〜84,000拷贝鉴定,并用6个URP鉴定,PPIH从〜4,180,000到〜45,000份拷贝,并用14个URP和GSTO1鉴定,来自〜3,920,000 〜115,000,并用16个URP鉴定。所有这5种蛋白质都是非常丰富的,中位数副本数量>在参考线的23个技术复制中获得了500,000,已被确定为>6 URP,但它们在不同的多路复用实验之间急剧差异,突出显示变化不限于低丰度蛋白。
      我们还注意到,虽然本研究中的大多数IPSC线条来自健康的捐赠者,但其中一些TMT批次,例如PT6390,含有来自稀有遗传疾病的健康供体和供体的IPSC线的混合物,包括“迎来综合征” “,”单身糖尿病“和”Bardet-Biedl综合征“。尽管如此,PT6390中的中值蛋白CV仍然低于分析Bubh_3技术重复的CV的〜10倍,表明TMT批量效应对蛋白质组学数据具有比健康的更大的影响 相对 diseased physiology.
      我们的结果突出显示,尽管多重TMT是定量蛋白质组学的有用而精确的方法,但重要的是要注意其潜在的局限性,特别是在分析来自多个TMT批次的数据时。值得注意的是,副本号已经提供了一层归一化(
      • wisniewski J.R.
      • 嘿m.y.
      • Cox J.
      用于蛋白质拷贝数和浓度估计的“蛋白质组学标尺”,没有尖峰标准。
      )但是,它证明不足以处理批次变化。这些发现强调,在进行多个TMT批次上进行非常大的蛋白质组学分析时,必须了解批量变化影响数据质量的可能性。为了减少批量效应,提出了几种方法,来自蛋白质表达推理(
      • Schwacke J.H.
      • 山一盏。
      • 克鲁格e.l.
      • Comte-Walters S.
      • Schey K.L.
      IQualtitator:使用ITRAQ的蛋白质表达推理的工具。
      ),标准参考线(
      • 赫布里奇
      • COLE R.N.
      • 西JR,K.P.
      • Schulze K.
      • Yager J.D.
      • Grapman J.D.
      • 基督教P.
      • 吴L.
      • o'meally r.n.
      • 可以D.H.
      • McIntosh M.W.
      • Ruczinski I.
      在不使用共同参考标准的情况下,来自多个ITRAQ实验的统计推断。
      )。在这里,我们使用参考IPSC线的技术复制作为内部参考标准来控制批次之间的变化(参见方法)。使用这种归一化方法,在所有细胞系和技术复制方面提供了2.96%的中值CV,使得结果接近针对每个内部分析所获得的度量。

       误报

      IPSC数据集(
      • 勃朗斯A.
      • Bensaddek D.
      • Hukelmann J.L.
      • afzal五。
      • Lamond A.I.
      IPSC蛋白质组学纲要。
      ,
      • Kilpinen H.
      • roncalves a。
      • Leha A.
      • afzal五。
      • alasoo K.
      • 阿什福德S.
      • 巴拉斯。
      • Bensaddek D.
      • Casale F.P.
      • Culley O.J.
      • DaneCek P.
      • Faulconbridge A.
      • 哈里森P.W.
      • 凯瑟里亚A.
      • 麦卡锡D.
      • 麦卡锡S.A.
      • Meleckyte R.
      • Memari Y.
      • Moens N.
      • 飙升
      • 曼A.
      • 街头I.
      • AGU C.A.
      • Alderton A.
      • 纳尔逊r.
      • 哈珀斯。
      • Patel M.
      • 白色A.
      • Patel S.R.
      • 克拉克L.
      • 哈莱R.
      • 基尔顿下午
      • Kolb-Kokocinski A.
      • Beales P.
      • Birney E.
      • Danovi D.
      • Lamond A.I.
      • Ouwehand W.H.
      • Vallier L.
      • 瓦特下午
      • 德国R.
      • 铁灯o.
      • gaffney d.j.
      常见的遗传变异驱动人IPSC中的分子异质性。
      )为我们提供了研究多重Plex TMT批次内误报的发病率的绝佳机会。该研究使用了在此处分析的二十四个10-Plex TMT批量中的二十二批次内源自雄性和女性供体的IPSC线。因为只有男性供体的线条应包括专门在Y染色体上由基因编码的蛋白质,这有效地提供了一组内源性的“穗状花序”肽,我们可以用来监测假阳性的存在以及探索效果TMT通道与基准干扰(CII)之间的报告离子干扰(RII)。
      数据集检测到11种蛋白质,该蛋白质特异于Y染色体。相应地,衍生自这些蛋白质的所有独特肽应该仅存在于具有雄性细胞系的TMT通道中,并且理论上,应在具有母细胞系的TMT通道中不存在。为了避免来自共用肽产生的不匹配,我们将我们的分析重点分析了69个肽的子集,其拟拟合以下Y染色体特异性基因; “cdy1 ,:”cdy2a ,:“ddx3y ,:”eif1ay:“kdm5d ,:”nlgn4y ,:“pcdh11y ,:”rps4y1 ,:“tbl1y ,:”usp9y ,:“uty。”另外,由于分析的10-Plex TMT批次中的两种(PT6384和PT7422)仅具有雌性细胞系,所以将在这些批次中检测到的任何潜在的Y染色体特异性肽被处理被认为是错误的注释并从进一步分析中丢弃。此外,批量Pt6388也被认为是一个异常,而不包括进一步分析。结果,我们专注于65个独特的Y染色体编码肽,其被用作“男性特异性”峰值的参考文献,用于分析前面提到的21 TMT批次内的假阳性。
      我们通过探索各个雌性TMT通道量频率从Y染色体特异性肽量化信号(Fig. 4)。令人惊讶的是,这表明在这里考虑的所有二十一六个Plex TMT批次,并且在含有雌性细胞系的所有报告通道中,批次内鉴定的最少40%的Y染色体特异性肽也有信号女性渠道。值得注意的是,在所有这些批次,在含有含有雌性细胞系的TMT通道中定量了在每批中定量的89%的Y染色体特异性肽的中值。 Y染色体肽不应存在于任何雌性线中,因此提到前面提到的检测水平是出乎意料的。我们推G在含有母细胞系的通道中的Y染色体特异性肽的信号的出现可能是由Coisolation和报告离子干扰的组合产生的。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4Y染色体肽在女性通道中: 散点图显示21 TMT批次及其报告离子质量标签的假阳性的性别/发病率。雄性细胞系显示为灰色方形,母细胞系由圆形表示。阴性线(圆圈)被阴影,以指示在每个TMT批次内在其通道中检测到的Y染色体特异性肽的百分比。

       记者离子干扰和配合干扰

      记者离子干扰,也称为交叉标记同位素杂质,可以由制造液体杂质和实验误差产生(
      • ow s.y.
      • Salim M.
      • 诺里尔J.
      • 埃文斯C.
      • rehman我。
      • 赖特P.C.
      ITRAQ低估了简单而复杂的混合物:“好,坏和丑陋”。
      )。 Coisolation干扰是由在隔离窗口中选择的多个标记肽引起的效果(
      • muntel J.
      • Kirkpatrick J.
      • 布鲁德尔R.
      • 黄T.
      • Vitek O.
      • ori a。
      • 重新勒
      用固定仪器时间对复杂背景中蛋白质定量的比较。
      )。为了研究这两个条件,我们专注于前面提到的y染色体特异性肽,因为这些肽仅存在于阳信势中并且在雌性通道中不存在,因此在雌性通道中检测到的任何信号应该是人为的。我们使用了Y染色体肽来评估雄性和母线之间的复制标准化肽强度(参见方法)的差异,遍布所有二十一度10 -Plex TMT批次(Fig. 5A)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5TMT.通道泄漏分析: A,箱图显示横跨21TMT批次的母细胞和雄性细胞系的Y染色体特异性肽的中值归一化强度。 B,比较男性通道的Y染色体特异性肽的盒子曲线图 相对 受不同报道离子干涉型影响的女性通道。 C,框图的Y染色体特异性肽的比例,由中值归一化强度分层,比较受不同类型的报告离子干扰影响的雌性通道 相对 未经记者离子干扰的女性渠道。对于所有3个Boxplots,下铰链和上部铰链代表了第1和第3四分位数。上晶须从铰链从铰链延伸到从铰链的1.5 * IQR进一步不超过1.5 * IQR,下晶须从铰链延伸到最小的铰链1.5 * IQR的最小值。
      分析结果揭示了TMT批次之间的显着变化。例如,某些批次,例如Pt6379和PT6386,具有17倍和65倍的雄性和母通道之间的强度差异,例如由于配合干扰而简化了误报的检测。但是,其他批次, 例如 PT7430和PT6391仅显示2.5和4.4倍的差异,分别检测误报问题。我们说明先前提到的批次显示低强度肽,因此低信噪比,使女性通道更容易受到基准干扰。
      为了评估配合离子干扰,我们选择了没有初级或次要报告离子干扰的雌性通道(无横向标记同位素杂质;参见方法),可能的基准干扰的例子(
      • 保罗J.A.
      • O'Connell J.D.
      • Gygi S.P.
      一种三重敲除(TKO)蛋白质组学标准,用于诊断因果性标记实验中的离子干扰。
      )。与不受记者离子干扰影响不影响的女性通道相比,雄性通道中的肽显示出9.43倍的重复归一化强度(参见方法)。然而,效果根据肽强度阈值而变化。高强度肽,其中阳性跨越阳性的常规肽强度大于或等于全球中值(-0.184;参见方法),呈现12.8倍的强度。低强度肽,其中雄性线的中值归一化肽强度低于全球中值,只显示2.14倍的强度,揭示了对匹配干扰的更高脆弱性。
      我们还检查了报告离子干扰(RII)的潜在效果。对于这种分析,我们计算了每个条件的肽特定比率(参见方法),首先比较男性通道 相对 在女性通道中存在的不同类型的报告离子干扰。当男通道通过同位素杂质(雄性126c至凹形127c)的同位素杂质+ ​​1da阴道影响时发生的“初级RII”。当相同同位素的同位素杂质(雄性127c至母126c)的同位素杂质-1da阴道产生-1da阴道时,发生“二次RII”。当女性通道受到男性渠道的“初级RII”和“二级RII”影响时,会发生“双重RII”。不受初级或二级RII影响的频道被标记为“无RII”。比较男性对先前条件的比率用于产生盒子图(Fig 5B)。
      雄性线的中值高于由记者离子干扰(“NO RII”)不影响的女性通道高9.43倍,但比经受初级和次级报告离子干扰(“双RII”)的女性通道仅高4.9倍。最小的效果是由比母线高8.94倍的“二次RII”引起的,表明“原发性RII”是同位素杂质的主要来源,并解释为什么我们在“主要RII”之间看到的差异很小。 “双重RII”条件。我们注意到,对于“主RII”和“双RII”,误报在8倍的增加/减少范围内 善意 在蛋白质组学数据集中经常检测到蛋白质/肽表达水平的变化(
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      为了量化肽丰度类别的初级和次级报告离子干扰之间的差异,我们现在将受记者离子干扰影响的女性通道进行比较(“原发性RII”,“二次RII”,“二次RII”和“双RII”)对未受记者不影响的女性通道离子干扰(Fig. 5C;请参阅方法)。我们还通过中位数的肽强度分析了这种分析,具有大于或等于全球中值的高强度值,低强度低于全球中位数。在分析中,我们证实,最小的效果是由“二级RII”引起的;对于高强度Y染色体特异性肽,与不受记者离子干扰的通道相比仅显示1.05倍的增加,并且在低丰度肽的几乎没有变化(Fig 5C)。 “初级RII”显示出更明显的效果,中位数在高强度肽中增加1.57倍,低强度肽1.10倍。初级和次级RII的组合产生了高强度肽增加1.7倍的增加,低强度肽的中值较小。
      这些结果表明低强度肽主要受到匹配干扰的影响,因为报告离子干扰几乎没有对它们的比率影响,但是报告离子干扰可能对高强度肽的定量具有深远的影响。这提供了重要的实际信息,有助于TMT实验的设计,以帮助最小化交叉条件/人口报告离子干扰的数据量化的潜在影响。

       优化实验设计

      对于所有基于单个多Plex TMT批次的研究,我们提倡至少一个相关的内部参考样品,每个批处理中应包括在通道126c或127n中。这些通道避免了同位素杂质的主要原因,并且仅受“二次RII”的影响,这仅导致强度增加2.2%。相反,将参考线放置在通道131n处,或131c通过将它们暴露于“主RII”来增加报告离子干扰的影响。
      我们的结果还显示了TMT实验设计,可以帮助最小化不同群体/条件之间的初级和次级报告离子干扰的影响。例如,在10-Plex TMT研究中,当分析两个条件时,每个有5个生物复制,5-5个分组的布局会导致多个通道受交叉口/条件报告离子干扰影响( Fig. 6A)。最佳设计将涉及交替10个通道的两个条件(Fig. 6B)。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6报道离子干扰分析的TMT实验设计: A,5-5分组为10-Plex TMT批次的分组布局,其中2个群体和5个重复。两种通道受交叉口初级和次要报告离子干扰的影响。 B,具有2个群体的10-Plex TMT批次的最佳布局,每次重复,没有交叉口初级或次级报告离子干扰。 C,对于3个群体的最佳11-Plex配置,每个3种群体都重复。通过留下两个空渠道,它消除了交叉口报告者离子干扰。 D,3个群体的最佳11-Plex配置,其中3个群体复制,其中一个空通道和一个参考线通道。只有两个通道遭受初级和次级报告的离子干扰。
      如果包括控制,或者用于研究三份分析3种不同的条件(例如 三个时间点,或控制和两个不同的扰动等),我们建议使用TMT 11-Plex作为所有10-Plex TMT设置涉及交叉口/条件报告器离子干扰。 11-Plex TMT设置在3条条件/群体之间没有记者离子干扰的设计,但需要在129C和130N处需要两个空通道来实现这一(Fig. 6C)。如果包括控制信道,则如主张,那么它应该放置在信道126c中,同时将空通道定位到位置tmt11 130N在交替的实验条件和第3条条件的最终重复之间(Fig. 6D)。所有建议的设置旨在减少交叉条件/人口报告离子干扰,从而通过同位素杂质避免量化精度降低。

      讨论

      使用TMT标签的定量蛋白质组学分析已成为当前使用的最受欢迎的DDA方法之一,由于其复用功能,可扩展性,低缺失值指数和精度,当分析单个多路复用批次时。但是,当执行需要使用多个并行TMT批次的大型研究(
      • plubell d.l.
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      串联质量标签(TMT)标记的扩展复用揭示了小鼠附睾脂肪组织中的年龄和高脂肪饮食特异性蛋白质组变化。
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      Constand:受约束优化的异源标记光谱的归一化方法。
      ),情况变得更加复杂。在这里,我们使用了从20多个,10-Plex TMT批次集成的数据分析,以研究在非常大规模的蛋白质组学实验中的精度,缺失值,假阳性,基准干扰,报告离子干扰和实验设计。我们专注于源自人体IPS细胞系分析的模型数据集,来自雄性和女性捐赠者(
      • Kilpinen H.
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      • afzal五。
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      常见的遗传变异驱动人IPSC中的分子异质性。
      )。
      所得到的数据证实,单批多重PLEX TMT实验最小化蛋白质组学中的典型缺失值问题,其在蛋白质和肽水平处具有数据依赖性采集(DDA)。但是,这一情况随着来自两个或多个单独的多页主TMT批次的数据而变化。随着多个批次组合,缺失值索引迅速膨胀。这种效果在肽水平上特别引人注目,其中仅来自两种不同批次的数据集成数据导致缺失的值增加到 <2%至〜24%。即使蛋白质水平的充气率较低,第二批次的整合也推动缺失的蛋白质值<0.5% to >6%。这种通胀效应可以降低从大规模实验导出的结果的准确性,该大规模实验比较了从多个TMT批次产生的数据。一个潜在的解决方案是使用基于MS2的TMT定量,因为这已据报道,产生更多的肽识别(
      • 迈尔斯S.A.
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      基于仪表平台的串联质量标签(TMT)的晚期前体测定评价。
      )但是,没有保证,这将在批量批次中更可重复地检测肽/蛋白。此外,基于MS2的TMT定量将加强配合干扰的破坏性效果。
      虽然单个TMT批次可以在多路复用实验中提供显着的精确结果,但我们发现这通常不会在多个批次上再现。为了学习可重复性,我们使用蛋白质组学标尺归一化数据(
      • wisniewski J.R.
      • 嘿m.y.
      • Cox J.
      用于蛋白质拷贝数和浓度估计的“蛋白质组学标尺”,没有尖峰标准。
      )对于每种蛋白质,我们计算了参考线的23个技术复制的变异系数(CV),以及10-Plex TMT批次中的每一个。技术复制的中位拷贝数CV比在同一10-Plex TMT批次内分析的不同供体的数据高度高度为6.4倍。
      这还强调了批量效应的重要性,在我们的情况下,通过每个TMT批次内的常见控制样品允许客观数据归一化以最小化批量效应,如图所示(
      • 刘P.
      • 啤酒l.a.
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      • Barnhart K.T.
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      用TMT10PLEX标记进行大量人血浆样品的定量比较。
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      • Levey A.I.
      • seyfried n.t.
      阿尔茨海默氏症和帕金森病中人脑蛋白质组的全局定量分析。
      )。复制数字应用一层归一化,但我们的数据突出显示它们不足以解决批处理效果。我们表明,通过在每个TMT批处理中引入至少一个合适的控制(参考线),可以有效地归一化批量效应。该挑战在于识别适当的控制,真正代表在实验中比较大多数蛋白质,并且在所有TMT批次上创建高度可重复的控制。
      本研究还强调了假阳性,记者离子干扰和基准干扰的问题。我们选择的数据集提供了一个理想的设置,以分析这些因素,因为它包含了来自男性和女性捐赠者的IPSC线。因此,通过鉴定一组唯一地映射到雄性特异性Y染色体的肽,这些提供了一种方便的内部控制,以监测误报的表达。数据表明,即使对于仅具有两个公共通道的10-Plex TMT批次(PT6380),剩余的8个雌性通道仍然量化了在该批次中检测到的所有Y染色体特异性肽的97.5%。这意味着在多路复用实验中的雌性通道中存在误报的假阳性,这表明在分析同一TMT批次内的异构群体时存在严重的限制。这个问题我们主要归因于Coisolation干扰,我们注意到该问题已经减少,但没有完全消除,具有较新的一代orbitrap MS仪器,其中改进的源增强了信噪比(
      • 保罗J.A.
      • O'Connell J.D.
      • Gygi S.P.
      一种三重敲除(TKO)蛋白质组学标准,用于诊断因果性标记实验中的离子干扰。
      )。此外,已经开发出新的等因素标记方法,其声称是免费的(
      • 弗莱拉冬季S.
      • 梅尔F.
      • Wichmann C.
      • Cox J.
      • Meissner F.
      EASI标签可实现准确的基于多路复用和无干扰MS2的蛋白质组量化。
      ),然而,它们的多路复用能力目前限于6-plex。
      我们使用前面提到的Y染色体肽在具有不同数量的雄性和女性衍生细胞系以及不同的通道组合中研究不同的报告离子干扰(RII)条件。该数据突出显示原发性(公路同位素污染到+ 1DA阴道)和次级(公路同位素污染到-1DA女性通道中的次型癌)的影响报告离子干扰。受初级和次级报告离子干扰影响的记者通道显示出高强度肽的中值信号增加1.7倍,与未经过记忆离子干扰的通道相比。这被发现主要由“主要RII”引起的,因为数据也表明“二次RII”与没有报道离子干扰的通道相比,只有中位数1.02倍的增加。为了最佳避免报告离子干扰的影响,我们使用这些数据提出了优化的实验组,用于将样品分配给可以最小化或消除(当可能)的特定通道,初级和次级报告离子干扰之间的效果/人群。尽管如此,我们再次突出显示在TMT批量内混合显着不同的群体,例如IPSC和终端分化的体细胞,将在数据中引入误报,如在所有雌性细胞系中检测到的Y染色体特异性肽所示。
      对于这种大规模实验,对具有严格的质量控制(质量QC)程序来说也至关重要,以评估和维持仪器内的恒定性能。在我们的情况下,TMT批次之一(PT6388)揭示了QC运行中的性能差(见 补充数据)。在运行样本之后,未检测到失败的QC运行,在该批次内产生差的结果。因此,我们建议执行大规模的TMT,在实验开始之前应该在实验开始之前置于真正的QC程序。
      总之,TMT是DDA分析的有价值的方法,其增加可扩展性并产生精确的定量,使其成为高通量蛋白质组学研究的合理普遍的方法。在这里,我们提供了对影响来自基于大规模TMT的蛋白质组学分析的高质量定量数据的参数的参数进行了深入的,实际评估,并且我们突出了计划这些实验时应仔细考虑的一些限制。我们希望所产生的信息对于改善实验设计并导致许多未来蛋白质组学项目的数据质量有用。

      数据可用性

      用于此分析的原始文件可用于Proteomexchange(
      • VizCaino J.A.
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      • 王R.
      • Csordas A.
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      • APWEILER R.
      • OPENN G.S.
      • 玛特L.
      • 琼斯A.R.
      • Hermjakob H.
      Proteomexchange提供全球协调的蛋白质组学数据提交和传播。
      )通过骄傲的存储库(
      • VizCaino J.A.
      • Csordas A.
      • Del-Toro N.
      • 戴安斯J.A.
      • 怜悯J.
      • Lavidas I.
      • Mayer G.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • Ternent T.
      • 徐Q.W.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      2016年更新自豪数据库及其相关工具。
      )与数据集标识符PXD010557以及完整的MaxQuant(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      ) 输出。

      致谢

      我们要感谢HIPSCI联盟的成员,为洞察力讨论提供IPSCS和Lamond实验室的成员。

      补充材料

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