整合细胞核和蛋白质组学*

  • Tytus Bernas.
    隶属关系
    Cytometry Laboratories,Purdue University,西拉斐特,印第安纳州47907-2064
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  • GéraldGrégori.
    隶属关系
    Laboratoirede Microbiologie,Géochimie等伊斯洛伊岛,CNRS UMR 6117,163 Avenue De Luminy,Case 901,BatîmentTPR1,13288MarseilleCedex 9,法国
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  • Eli K. esem.
    隶属关系
    普瑞丁大学兽医学院,西拉斐特,印第安纳州47907-2064
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  • J. Paul Robinson.
    一致
    应解决对应的通信:Cytometry Laboratories,Hansen Life Sciences Research Bldg。,RM。 B050,普渡大学,201南大学圣,西拉斐特,47907-2064
    隶属关系
    Cytometry Laboratories,Purdue University,西拉斐特,印第安纳州47907-2064
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  • 作者脚注
    *本文的出版成本部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白'广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      系统生物学以及现在被分类为细胞核科的优秀机会为细胞术进行了综合的研究,其中期望复合细胞混合物中功能蛋白质的鉴定。具有快速蛋白质分析平台的细胞分选的组合提供了一种自动化和快速的技术,可提高透明度,准确性和效率鉴定蛋白质表达差异的蛋白质表达差异。细胞分选措施纯化细胞群的整合开辟了蛋白质组学分析的新区域。本文概述了一种方法,其中定义了明确的细胞分析和分离工具集成到核心实验室内的蛋白质组学计划中。此外,我们介绍了流式细胞术分选的概念,以证明能够使用流式细胞术作为细胞分离技术的重要性以识别和收集纯化的细胞群。数据证明了这种基于流式细胞术的细胞分离和蛋白质分离和随后的分析的这种组合的速度和多功能性,从纯化的分选细胞中的蛋白质地图的实例,并显示了整个过程的分析。很明显,使用特定表型特征将细胞分选以分离异质群体的细胞的力量增加了快速自动蛋白质分离技术的力量。
      细胞是任何生物体中最小的生物单元,其结构和形态经常确定功能。在不同的条件下,细胞可以或可能不表达功能标记。尽管可能很好地认识到鉴定的基因用于携带特定蛋白质的代码,但该基因的调节表达导致产生与该表型相关的蛋白质。从基因组到蛋白质组的翻译是必要的,以了解细胞核的功能水平。 cytomes. 可以定义为有机体的蜂窝系统和子系统和功能组分。细胞核科是研究细胞在基因组和蛋白质组学发现范围内的作用。它被定义为对异质性的研究 cytomes. 或者更确切地说是由基因型和暴露导致的分子单细胞表型与详尽的生物信息知识提取(
      • VALET G.K.
      • hoeffkes h.g.
      细胞核科学的个性化弥漫性大型B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者的个体化普拉克鉴定的数据模式分析。
      )。
      目前理解生物体功能多样性优先争取系统方法的方法,从而在尝试进行蛋白质组学分析之前实现了特异性细胞核的表型分类。这种方法的基础是在多年来对细胞系统的研究中得到了很好的成熟,并且当与先进的蛋白质组学方法相结合时,这种方法可以快速和具体地鉴定生物标志物与复杂生物中的功能作用之间的直接联系。
      蛋白质组学是指蛋白质组的研究,即基因组的总蛋白质补充剂。目前被认为是蛋白质表达全球分析的关键技术,并在后核形式时代理解基因功能和调节。蛋白质组学的范围广泛;它包括细胞,组织和生物流体中蛋白质的鉴定和定量;正常蛋白质表达变化分析 相对 患病细胞或在不同条件下种植的细胞;翻译后修改的特征;蛋白质 - 蛋白质相互作用的研究。蛋白质组学研究的目标包括澄清治疗细胞过程,复杂蛋白质网络的表征及其扰动,生物标志物蛋白的发现,用于检测和诊断疾病的鉴定,以及鉴定药物治疗的目标(
      • Beranova-Giorgianni S.
      二维凝胶电泳和质谱法的蛋白质组分析:强度和限制。
      ,
      • 帕特森D.S.
      • Aeberberold R.H.
      蛋白质组学:第一个十年及以后。
      )。许多不同的技术已经仍在开发中以收集蛋白质的性质中所含的信息(Fig. 1 )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1蛋白质组学技术的现状。 列出了通常收集在蛋白质组学研究和可用技术中的不同数据。蛋白质组学技术和其他关键发现科学工具的相对成熟度是显而易见的,从图中的各个技术的位置显而易见。被帕特森和阿伯尔德的许可转载(
      • 帕特森D.S.
      • Aeberberold R.H.
      蛋白质组学:第一个十年及以后。
      )(自然出版集团, www.nature.com. )。
      以下三种特征是显而易见的。首先,没有单一平台可以完成所需的蛋白质组学测量。其次,测量越近的蛋白质功能,该技术的成熟越少。第三,“真实”蛋白质组学技术尚未到达成熟。
      在本文中,我们提出了一种与快速发展的蛋白质分离技术一体化的综合细胞识别和分离技术。这些方法的组合提供了生物系统中蛋白质分析的独特敏感和准确的方法。它是可重复的,相对较快,强大的,三种有价值的资产,在解决任何解决方案的模式中。

      蛋白质组学的细胞组成方法

      将细胞喻将细胞核分泌成蛋白质组学的驱动力是需要从多种生物环境中发现的异质和高度集成的混合物产生纯种细胞群。该系统的第一个组成部分是使用非常具体的单细胞分析工具,具体流式细胞术。流式细胞仪已经成为成熟的技术超过30年,于20世纪60年代后期和70年代初开发。
      流式细胞仪是一种对细胞生物学和临床医学产生重大影响的技术,以及其他几个相关领域( 例如 微生物学和生物工程)。流式细胞术的原理是悬浮在液体流内的单个颗粒在短时间内照亮(
      • Beranova-Giorgianni S.
      二维凝胶电泳和质谱法的蛋白质组分析:强度和限制。
      • 帕特森D.S.
      • Aeberberold R.H.
      蛋白质组学:第一个十年及以后。
      • Shapiro h.m.
      多学型多面脉管流量细胞计数:批判性评论和理由。
      • 罗宾逊J.P.
      多光谱细胞测定法:下一代。
      • 罗宾逊J.P.
      • 杜拉克G.
      • Kelley S.
      流式细胞术数据收集和分析在单个文件中产生相关多样化分析的创新。
      • Bassoe C.f.
      • 李恩
      • Ragheb K.
      • 劳德勒G.
      • Sturgis J.
      • 罗宾逊J.P.
      使用荧光探针研究人性化粒细胞中吞噬体,线粒体和酸性颗粒。
      • Moldavan A.
      用于计数显微镜电池的光电技术。
      • Papanicolaou G.N.
      • Traut R.
      阴道涂片在子宫癌中的诊断价值。
      • 浣熊A.H.
      • Creech H.J.
      • 琼斯·罗
      含有荧光基团的抗体的免疫特性。
      通常)在通过聚焦在非常小的区域内的光源(也称为询问体积)的μs。然后,颗粒将散射光并且如果含有天然荧光染料或用荧光染料染色,则可以发出天然或诱导荧光。然后将从颗粒发出的光学信号作为光谱带,主要在可见光谱(400至900nm)内。这些信号代表了主要基于荧光的各种化学或生物组分的检测。因为流式细胞计可以分析单个颗粒/细胞,所以可以基于可以在每个颗粒/细胞的电流流式细胞仪上测量的5-20个变量中的任何一种统计差异将颗粒/细胞分离成簇。可以使用多变量分析技术将基于统计分析的统计分析以电子方式分离这些群体。
      流式细胞术中的大多数分类基于使用荧光分子特异性标记感兴趣的颗粒/细胞。如果颗粒是诸如白细胞的电池,例如,荧光探针可能是膜结合或细胞质结合,或者它可以附着在核材料上。识别细胞上的特异性受体的单克隆或多克隆抗体是因为它们的特异性而用作初级差异标记。可以通过将荧光分子与它们缀合来监测这些共轭抗体的位置和数量。只要它们在合理的尺寸范围内,就可以通过流式细胞术评估几乎任何性质的颗粒或细胞。它们可以非常小,甚至低于可见光的分辨率限制( IE。 病毒)因为它们仍然可以被其荧光签名检测到。类似地,通过改变仪器的流体系统的性质,可以研究和分离大约几千微米的颗粒。
      流式细胞仪的实际优点是可以在非常短的时间内评估大量颗粒。一些系统例如可以分析高达100,000颗粒/ s的速率,同时从每个颗粒收集10-20个同时参数。最后,流式细胞术中细胞分选的原理允许该技术与混合群体物理地分离单个颗粒/细胞。因此,单个颗粒可以在无菌条件下物理沉积到定定的位置,以进一步分析或培养。如果细胞是罕见的事件(1:100,000或更高),可以识别它并物理隔离这种稀有群体,尽管可能难以在合理的时间内物理地收集足够数量的这种稀有细胞。因此,显然,流式细胞术技术在任何系统中具有独特的优势,其中存在异质性,因为大量变量的收集允许在随后纯化这些细胞的微小差异的群体。
      20多年前,夏皮罗(
      • Shapiro h.m.
      多学型多面脉管流量细胞计数:批判性评论和理由。
      )注意到,由于商业仪器的可用性,多道马腔流式细胞仪现在是该领域的现实。该领域已经扩展到当时被认为是可能的任何东西。今天的仪器具有与各种散点信号同时测量10-20个光谱带的能力。最新的下一代仪器将能够完全谱分析和分类(
      • 罗宾逊J.P.
      多光谱细胞测定法:下一代。
      )。先进的计算分析使得可以使用足够的时间来执行复杂的Multiparametric分析,以在进行测量后进行分类决策。这些类型的分析经常用于细胞测量仪领域(
      • 罗宾逊J.P.
      • 杜拉克G.
      • Kelley S.
      流式细胞术数据收集和分析在单个文件中产生相关多样化分析的创新。
      ),目前的计算能力正在快速推进场景。该技术的结果是,现在可以从诸如人血等样品的复杂的异质混合物迅速生成临床诊断信息(
      • Bassoe C.f.
      • 李恩
      • Ragheb K.
      • 劳德勒G.
      • Sturgis J.
      • 罗宾逊J.P.
      使用荧光探针研究人性化粒细胞中吞噬体,线粒体和酸性颗粒。
      )实时执行此项(
      • 罗宾逊J.P.
      • 杜拉克G.
      • Kelley S.
      流式细胞术数据收集和分析在单个文件中产生相关多样化分析的创新。
      )。

       流式细胞术的简要历史 -

      流式细胞学的基本原理基于使用先前由Reynold定义的层流程的原则()在20世纪早期产生的一些非常古老的想法
      • Reynolds O.
      确定水的运动的实验调查是直接还是蜿蜒,以及平行渠道的抵抗律。
      )在19世纪末。 50年后,摩尔多瓦(
      • Moldavan A.
      用于计数显微镜电池的光电技术。
      )公布了可以使用显微镜和光电探测器识别单个细胞的仪器的设计,并且本文被认为是单细胞分析的最早尝试之一。在20世纪40年代Papanicolaou和Traut(
      • Papanicolaou G.N.
      • Traut R.
      阴道涂片在子宫癌中的诊断价值。
      )证明他们可以通过观察通过具有特异性设计污渍所获得的染色模式来识别来自宫颈癌的癌细胞。此时,对于明亮场显微镜,已经有很少的染料来确定,用于鉴定细胞异常。 1941年之前没有特异性荧光染料当核心之前 等等。 (
      • 浣熊A.H.
      • Creech H.J.
      • 琼斯·罗
      含有荧光基团的抗体的免疫特性。
      )用荧光素直接标记抗体的技术。随后证明了基于计算机和成像技术能力差的差的分析技术,从而使流式细胞仪与图像处理和识别技术相反,导致单细胞分析的运动。
      在20世纪60年代,Louis Kamentsky设计并建造了一个单细胞分析仪。 Kamentsky在IBM的Watson实验室工作,涉及使用光学字符识别技术来鉴定癌细胞。由于当时缺乏计算能力,因此kamentsky很清楚
      L. Kamentsky,个人沟通。
      他的努力更加集中在单细胞分析和设计中测量吸收和散射而不是基于图像的技术的培训(
      • Kamentsky L.A.
      • M0.R.
      • Derman H.
      分光光度计:UltraRAPID细胞分析的新仪器。
      )。此后不久,他添加了使用流体切换对单元格进行分类的能力(
      • Kamentsky L.A.
      • M0.R.
      分光光度法细胞分选机。
      )。在同一时间段内,富裕的人试图解决使用Los Alamos的单细胞分析系统研究红细胞生成的问题。由于使用新开发的Coulter体积的阻抗测量,因此已经提出了一种红细胞的双峰分布。这表明已经检测到两种不同类型的红细胞。富裕人士认识到,需要物理分离这些“不同”细胞。他以前看过Richard Sweet使用静电液滴发电的高速图表录像机的发展(
      • 甜蜜的r.g.
      高频录制呈静电墨水喷射。
      )并在Marvin Van Dilla的指导下在Los Alamos追求这项技术。 Fulwyler(
      • Fulwyler M.J.
      通过体积的生物细胞的电子分离。
      )访问了理查德甜蜜的实验室,并修改了他的新发明的喷墨录音技术,以设计和构建细胞分拣机以分离红细胞。一旦仪器设计和测试,迅速得出结论,双峰分布与空间取向有关,而不是固有的红细胞变异性。
      M. J. Fulwyler,个人沟通。
      惊人地这一发现巨大意义从未正式发布,并且立即显而易见的是,白细胞排序是有机会进行调查。细胞分类开发的完整历史是Shapiro(
      • Shapiro h.m.
      实际流式细胞仪。
      ,
      • Shapiro h.m.
      实际流式细胞仪。
      )。因此,细胞分拣机的发展成为1965年的现实。

       流式细胞术原理 -

      流式细胞计仅在液体悬浮液中用颗粒操作。在一次分析一次之前,细胞必须是单个细胞形式而不是聚集或组织。大多数流式细胞计通过使用鞘流系统操作。细胞悬浮在一个培养基中,而另一种介质用作鞘液。两者都可以是相同的流体,如盐水。如果将细胞分类在静电分配器上,则必须确实必须由诸如盐水的电离液体构成,以如上所述传导电荷。基于其他不操作的机械系统存在其他分类技术,但它们很少罕见,大多数非常慢(小于300个细胞/秒)。
      一旦细胞在悬浮液中,将它们通过喷嘴注入流式细胞仪。通过在样品顶部施加的空气压力被驱动到仪器中,或者通过精密电机控制的注射器(汉密尔顿型)注入仪器中。然后将颗粒驱动到流动池,这是流动含细胞仪的梯形(Fig. 2 )。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2流动池的方案和流体动力学聚焦原理,其中细胞在单一文件中对齐,以通过激光基散射和荧光检测进行后续分析。
      鞘液填充流动电池并逐渐加速,因为它通过流动池的圆锥形尖端。颗粒在该圆锥面积的基座的流动池内注射。一旦颗粒从注射喷嘴出现,它就会立即加速并以周围的流体护套居中。这种现象,也称为流体动力聚焦,负责通过围绕样品芯的鞘流体制成的射流内的颗粒的分离,对准和定心。然后每种粒子被拦截,因为它通过固定光源流动,通常是激光束(Fig. 3 )。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3当单个粒子通过激发源(激光束)时,通过一系列光电探测器检测发射。 显示是流式细胞计光学的一般方案。散射光和特定的荧光发射带通过发射过滤器在各个探测器处分离。
      在大多数流式细胞计中,记录了两种类型的散射:前向角度和直角散射。向前角光散射是以小角度散射的光量(<10°)相对于激光束的方向的向前方向。已知向前角光散射与颗粒的尺寸有关。
      还记录了相对于入射激光束以90°(或直角光散射)散射的光子。直角光散射强度主要取决于细胞结构和粒度。
      还记录了激光束激励后发射的细胞荧光。该荧光可以是来自诸如光合色素的分子的天然(自发荧光),或者可以通过加入样品中的荧光染料诱导。该染料在适当的波长激发时发出荧光信号,从而有助于通过鉴定一些表型特征来鉴定感兴趣的细胞。
      散射和荧光信号彼此分离,并通过一组二向色镜和滤波器送到特定的光电探测器,该滤波器在光谱波长范围内分离光学信号(Fig. 3)。对于每个测量的参数,然后在个人计算机上获取数据。因此,流式细胞仪在单细胞水平下提供多体分析。
      数据可以以单尺寸(直方图)或两个维度(Cytogram)显示。直方图显示用于任何特定参数的粒子的频率分布,而CyTogram以两维显示数据。直方图和细胞图将代表从大量细胞或颗粒(几万)接收的荧光和散射信号的人口分布。对这些数据的高级统计评估对于建立分离标准来分类或分析至关重要。
      可以在流式细胞仪中同时使用多种荧光染料。这允许被称为“多游艇计分析”。使用这种复杂的能力,可以分离非常复杂的细胞或颗粒混合物,使得非常特异性的颗粒可以以电子方式识别,然后在物理上被鉴定,然后如下所述。显示了几种荧光直方图的一个例子 Fig. 4。在该图中,可以看出,多种染料的相对复杂,因此需要应用高级数学分析,以将实际荧光信号与来自混合信号的每个染料分离。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4同时使用几种荧光有机染料时发生的光谱重叠的例子。 线 表示流式细胞术中使用的可用激光源的常见激发波长。 Au. ,吸光度单位。

       细胞分选 -

      如上提到的细胞分选原理是由Fulwyler开发的(
      • Fulwyler M.J.
      通过体积的生物细胞的电子分离。
      )排序红细胞。 Kamentsky(
      • Kamentsky L.A.
      • M0.R.
      分光光度法细胞分选机。
      )和Dittrich和Gohde(
      • Dittrich W.
      • 戈德W.
      悬浮液中单细胞的脉冲荧光测定法。 Z. naturforsch。.
      )还规定了细胞分离技术以分析感兴趣的细胞。静电技术已经成熟并演变为几乎所有当前商业细胞分选仪的首选技术。邦纳实施了与蜂窝种群的荧光检测相关的大部分技术 等等。 (
      • Bonner W.A.
      • Hulett H.R.
      • 甜蜜的r.g.
      • Herzenberg L.A.
      荧光活性细胞分选。
      )在20世纪70年代初。
      静电分选的原理基于识别感兴趣的细胞的能力,以高精度地识别其在喷射器中的物理位置,将喷射器分成液滴,在精确的时间将电荷放在流上以充电含有感兴趣的细胞的液滴,最后将含有所需细胞的带电液滴偏转到容器中( Fig. 5 )。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5基于液滴形成的静电细胞分选原理。 含有颗粒或细胞的带电液滴被偏转为特定容器。挠曲的标准基于先前定义的表型表征。因此可以获得单个表型的纯种。
      van den engh最近定义了高速排序技术(
      • van den engh g.
      高速细胞分选。
      )并详细讨论了涉及的复杂问题。排序的速度和准确性基于几个关键因素。首先,对于细胞分选,必须使用压电装置振动流以产生液滴。但如在初步讨论中所述,仍然需要完全稳定的层流程来准确分析。因此,必须匹配喷嘴直径,鞘流速(压力)和液滴生成频率以及高速电子器件,以获得稳定的液滴生成,从而获得高速电池分类。 kachel. 等等。 (
      • Kachel V.
      • Kordwig E.
      • Glossner E.
      通过由流动力引起的系统的扁平颗粒的均匀横向取向。
      )表征了治理液滴产生的原理,其中波长是波长是λ= v/f 其中λ是波长波长, v 流速度,和 f 是调制频率。
      当λ= 4.5时,系统针对最大液滴进行了优化d (d =退出孔口=流直径)。因此,最佳发电频率由 f = v/4.5d。如果系统可以容纳这种最佳液滴形成,如Pinkel和Stovel所示(
      • Pinkel D.
      • 炉灶r.
      流量室和样品处理。
      ),喷射速度与喷射压力的平方根成比例。因此,如果最佳系统对20,000个事件(20,000Hz)进行分类,使得每个液滴通过4.5流直径分开并以10m / s流动,这意味着滴度彼此分开200μm。当然,随着所产生的液滴数量的数量增加,液滴的直径必须减少,并且结论是高速分选机的速度最终将部分地调节待分类的颗粒的尺寸和流可以的速度在不损害粒子/细胞的情况下进行。这对于脆弱的细胞尤其重要。然而,通常,定期分拣程序对细胞造成损害。在过去的40年中,细胞分选已被用于分离功能正常的细胞。该流式细胞术的这种特征对于确保蛋白质分析中的表型不同群体的分离是至关重要的,没有优先损害某些细胞,结果是异形群体仅代表鲁棒细胞。
      高速分拣机基本上是分拣机,旨在以22,000-100,000粒子/ s的排序速度运行。为了实现这种分拣速率,必须在样品和鞘流上施加更高的压力。当超过40,000个单元/秒的分选率时,关键问题变为分析时间,这成为限制因素,因为复杂分析必须在排序决策之前。因此,主要问题是必须用于创造非常高速液滴形成的高压,如van den engh(
      • van den engh g.
      高速细胞分选。
      )。例如,产生250,000 / s的液滴频率需要射流压力接近500 p.I.I.,其值明显更高,而不是在大多数系统中安全地设计。因此,对于大约100pm的限制。,大约100,000 / s的液滴速率更接近逼真的最大值。这是对当前高速排序系统的实际限制。
      如前所述,流式细胞术用于分析单个颗粒。这意味着粒子必须通过询问点在单个文件中流动。因此,确保在两个电池或更多时通过询问点在同一时间或接近或接近时,不进行测量是至关重要的。 Poisson Statistics此时输入了等式,因为当任何粒子将通过询问点时无法准确预测到完全是不可能的。然而,存在粒子浓度和重合检测事件之间的关系。基于当前可用的技术,可以对非常大量的单元进行分类和净化并净化(106–108)在合理的时间(小时)中复杂混合物。流式细胞术是一种成熟,明确的技术,是分离存在复杂表型的细胞混合物的理想选择。

      蛋白质组学原则

      尽管该领域已经提出了许多变化,但典型的蛋白质组学研究包括以下步骤(Fig. 6 )。
      • 来自样品(组织或细胞群)的蛋白质的溶解。
      • 使用2D的蛋白质混合物的分馏
        使用的缩写是:2D,二维; 2DE,二维凝胶电泳。
        凝胶电泳(2DE)或多维LC。
        3使用的缩写是:2D,二维; 2DE,二维凝胶电泳。
      • 计算机辅助分析蛋白质模式(地图)和MS的鉴定和数据库MS谱的搜索鉴定。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6用2D凝胶电泳或色谱,MS和数据库搜索的蛋白质组分析的一般策略。 Q-IT,四极孔离子阱。
      我们将简要讨论这些步骤以使用细胞学方法概述当前蛋白质组织技术的限制以及其扩张的可能性。

       溶解 -

      生物样品的处理涉及细胞裂解或另一种破坏性步骤,得到细胞,细胞器或亚细胞结构片段的悬浮液。用化学物质的组合从该悬浮液中提取蛋白质(
      • 赫伯特B.
      二维电泳的蛋白质溶解研究进展。
      ,
      • rabilloud t.
      • Chevallet M.
      溶液在2D电泳中的蛋白质中溶解。
      )。洗涤剂( 例如 CHAPS,SDS和TWEEN)用于帮助溶解膜蛋白及其与液体的分离。 chasropes( 例如 添加尿素和胍)以溶解疏水性蛋白质。还原剂( 例如 二硫代利酚和巯基乙醇)有助于防止氧化和断裂二硫键。酶( 例如 DNase和RNase)可用于分解污染核酸,脂质和碳水化合物。加入蛋白酶抑制剂以防止内源性蛋白酶的蛋白质降解。所得提取物可以代表分析的生物样品的总蛋白质组成。或者,萃取步骤可用于预先分泌蛋白质混合物并消除不需要的组分。使用2DE或LC对提取物的等分试样进行分离(或分馏)。

       蛋白质分离和分馏 -

      2DE是一种强大的分离技术,允许同时分辨成千上万的蛋白质。 2DE的高分辨率能力源于第一和第二尺寸基于两个独立的蛋白质特征。 2DE的第一尺寸是IEF,在此期间,基于其等电点分离蛋白质。在第二尺寸中,根据其分子量,蛋白质通过SDS-PAGE分离。分离后,通过染色,通常用Coomassie蓝色染色,或用改性的银色染色来可视化2D凝胶中的蛋白质,或与随后的MS分析相容(
      • Liebler D.C.
      蛋白质组学介绍:新生物学的工具。
      ,
      • 舍甫琴科A.
      • 威尔m。
      • vorm o.
      银染料聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的质谱序列。
      )。 2D凝胶被数字化,并且通过专门的软件程序定性和定量地分析所得到的凝胶图像。以这种方式,可以量化蛋白质,并且可以匹配和比较多个凝胶中的点图案。可以对凝胶组的特征(斑点)组进行统计分析,并且可以评估变化,差异和相似度。 LC构成蛋白质和肽混合物分离的2DE技术的替代方案。最广泛使用的变体是HPLC。该技术的优点是可用的分离模式的分集。这些包括以下内容:反相和疏水相互作用色谱,其根据其疏水性分离蛋白质;强阳离子和阴离子交换,利用净正面或负电荷分离蛋白质;和尺寸排除,其根据其分子量(尺寸)分离蛋白质。可以串联组合不同的分离模式以提高蛋白质混合物的分辨率。这种“Tandem HPLC”是分析蛋白质组学中最有效的工具之一。在分离蛋白质,用UV吸光度检测。 HPLC和凝胶电泳蛋白分离技术的概述在中 表I. .
      T 有能力的 I蛋白质分离/分馏技术概述
      技术最佳蛋白质质量范围检测动态范围分数/斑点数量技术问题
      kda.
      2DE10-200(蛋白质)10003000低可重复性和困难量化
      自动化2D HPLC.>5(蛋白质和肽)1002500限于UV吸收检测(除非与MS连接)

       鉴别-

      通过2DE或HPLC分解的蛋白质可以基于MS测量的唯一属性来识别。根据感兴趣的蛋白质的蛋白水解消解产生的肽的分析确定这些属性。蛋白质消化最常用的酶是胰蛋白酶,其在赖氨酸和精氨酸的C末端侧切割蛋白质。通过蛋白水解消化的MS分析可以获得两种特定的蛋白质属性。第一蛋白质属性是所谓的肽质量指纹。肽质量指纹识别涉及测定消化中所有肽的质量。第二属性包括质谱仪内的选定肽的碎片成一系列序列诊断产物离子。从这些产物离子中,可以推导出肽的一部分肽(“序列标签”);或者,未解释的产物离子光谱可直接用于蛋白质鉴定。

       问题-

      具有HPLC或2DE的蛋白质组学分析涉及从细胞群中提取蛋白质含量。一个人应该注意,由于给定细胞类型中的90%左右的蛋白质肿块来自蛋白质的10%,所以需要超敏技术甚至检测其水平非常低但其生物效力可能高的蛋白质作为G蛋白偶联的受体,转录因子和激酶(
      • Gabor Miklos G.L.
      • Maleszka R.
      用功能性蛋白质组学融合分子药物:现实和期望。
      )。人类,小鼠和苍蝇中的许多蛋白质可以减少到它们的野生型水平的几个百分比,而不使表型后果,并且各种蛋白质的量可以在不同的野生型个体之间显着变化。这种自然之间的各种变异有助于表型的程度并不充分记录。因此,考虑到分馏技术的分辨率至少106 细胞是构建可靠的蛋白质组剖面所必需的。然而,随着细胞裂解,显然,这些实验的读出是对细胞群体的蛋白质活化状态的平均值。这种平均可能会模糊重要的生物学,例如可能在癌症中。这种疾病虽然通常被归类为遗传,是在功能性的情况下,蛋白质组学;基因突变可以修饰蛋白质信号传导途径,从而为电池产生生存优势,因为它们强制它忽略负抑制信号或永久地发送假正信号。
      人们应该注意,肿瘤组织是具有不同细胞类型和蛋白质存在的复杂系统。例如,实体瘤可包含血清蛋白,血管和血细胞,以及间充质,内皮和上皮细胞以及坏死材料(
      • Sarto C.
      • DEON C.
      • 多洛克
      • Hochstrasser d.f.
      • Mocarelli P.
      • 桑切斯J.C.
      蛋白质组学对锰超氧化物歧化酶重点肾细胞癌分子分析的贡献。
      )。此外,肝纤维化等一些肿瘤的发展可能取决于某些细胞类型与细胞外基质的相互作用(
      • 弗里德曼S.L.
      肝纤维化的分子调节,综合细胞响应对组织损伤。
      )。遗憾的是,来自肿瘤的活检材料通常由不同细胞类型的混合物组成(
      • 硕士J.R.
      • Lakhani S.R.
      如何用微阵列诊断可以帮助癌症患者。
      )。使用激光捕获微散切除可以缓解该问题以提取所需类型的细胞(
      • 帕特森D.S.
      • Aeberberold R.H.
      蛋白质组学:第一个十年及以后。
      )。然而,使用该方法可以仅隔离几千个细胞。此外,激光捕获微碎裂依赖于视觉(组织病理学)鉴定细胞,因此可能产生模糊的结果。另一种方法是使用细胞系(
      • Sarto C.
      • DEON C.
      • 多洛克
      • Hochstrasser d.f.
      • Mocarelli P.
      • 桑切斯J.C.
      蛋白质组学对锰超氧化物歧化酶重点肾细胞癌分子分析的贡献。
      )。但是,必须注意确定 体外 细胞培养物对应于一个 体内 situation.
      细胞蛋白质组不仅根据细胞微环境而且是细胞周期的不断波动。大多数目前的癌症治疗剂是针对蛋白质靶标。因此,若干这样的药剂的效率并不令人惊讶( 例如 Bleomycin,顺铂,依托泊苷和血管内)取决于循环的阶段(
      • HütterG.
      • Sinha P.
      研究癌细胞的蛋白质组学和化学抗性的发展。
      )。可以想到,恶性细胞对化疗的反应取决于其循环的不同阶段的蛋白质组学特征。

      蛋白质组学的细胞组细胞方法的实例:HepG2细胞的研究

      肝细胞癌是全世界最常见的癌症之一,以及非洲和亚洲死亡原因(
      • schafer d.f.
      • Sorrell M.F.
      肝细胞癌。
      )。这些肿瘤主要由两种病毒:乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒引起。其他肝癌包括黄曲霉毒素(
      • Seong T.C.
      • 梁R.C.
      • LeoW C.K.
      • Chung M.C.
      肝细胞癌:从床边到蛋白质组学。
      )。已经进行了几项这些癌症中蛋白质表达的研究(
      • Kudofuku T.
      • 撒托T.
      高分辨率二维电泳检测再生大鼠肝细胞蛋白质的变化。
      ,
      • Zeindl-Eberhart E.
      • rabes h.m.
      通过高分辨率二维凝胶电泳(2DE)测定的肝脏和转化的肝细胞系的变体蛋白质图案。
      )。这项工作导致了检测几种转化和增殖相关的蛋白质变体,但是无法识别并因此将功能分配给这些蛋白质(
      • Zeindl-Eberhart E.
      • rabes h.m.
      通过高分辨率二维凝胶电泳(2DE)测定的肝脏和转化的肝细胞系的变体蛋白质图案。
      )由于无法分离足够的蛋白质以进行微量序列。使用基于IEF-IPG的制备凝胶电泳克服了该问题,与SDS-PAGE相结合(
      • Seong T.C.
      • 梁R.C.
      • LeoW C.K.
      • Chung M.C.
      肝细胞癌:从床边到蛋白质组学。
      ,
      • WIRTH P.J.
      • Hoang T.N.
      • 本杰明T.
      微丙原制备固定的pH梯度二维电泳与蛋白质微序列分析人肝蛋白的分析。
      )。已经确定,正常肝脏和每个转化的细胞系,HepG2,焦点,Huh-7和SK-Hep1(
      • WIRTH P.J.
      • Hoang T.N.
      • 本杰明T.
      微丙原制备固定的pH梯度二维电泳与蛋白质微序列分析人肝蛋白的分析。
      ,
      • 桑切斯J.C.
      • Appel R.D.
      • 戈尔兹O.
      • Pasquali C.
      • 拉维尔F.
      • Bairoch A.
      • Hochstrasser d.f.
      在瑞士-2dpage数据库内。
      )。例如,Caveolin的表达在HepG2细胞中调节,而细胞色素P450还原酶被下调。高分辨率凝胶电泳与质谱相结合的应用导致了几种形式的肝细胞癌的综合蛋白质地图(
      • Seong T.C.
      • 梁R.C.
      • LeoW C.K.
      • Chung M.C.
      肝细胞癌:从床边到蛋白质组学。
      )。尽管如此,这些研究没有考虑细胞周期的不同阶段。为了说明这一因素对蛋白质组研究的重要性,我们比较了G中HepG2细胞的蛋白质地图1 /G 0 和 G2/ m细胞周期阶段。如前所述培养细胞(
      • 伯尔尼斯T.
      • ZareBski M.
      • 煮p.r.
      • Dobrucki J.W.
      在结合染色质的荧光探针的共聚焦显微镜期间最小化光博:缺氧和光子通量的作用。
      )并以对数生长阶段收获。将细胞悬浮在PBS(pH7.4)中,使用溴化乙锭(10μg/ ml终浓度)染色,并根据其DNA含量使用EPIC Altra(Beckman Coulter)进行分选。裂解HepG2细胞的两种群体(Beckman Coulter方案)以溶解总蛋白质含量。典型的排序产生5×106 cells in G0 /G 1 phase and 1 × 106 cells in G2/ m相分别。将这两种HepG2细胞群体溶解在含有椎间壳滴(尿素和硫脲)和非离子洗涤剂的低渗缓冲液中裂解(n - 辛基吡喃葡萄糖苷)以溶解总蛋白质含量(如蛋白质分级系统的制造商推荐)。使用在商业蛋白质分级系统(PF2D,Beckman Coulter)中实施的HPLC分离溶解的蛋白质。分馏分两步执行。首先,使用染色刺激(线性pH梯度为8.5至4.0,室温)根据其Pi分离蛋白质。其次,使用反相(在水,55℃下的0至100%乙腈中的线性疏水性梯度在染色体核聚焦后收集的蛋白质级分。通过214nm的吸光度测量测定第二步后收集的级分中的蛋白质的量。 g的结果0 /G 1 ( 图7A )和G. 2 / gm( 图7B. )细胞群以2D蛋白质地图的形式显示(疏水性 相对 pI).
      图缩略图GR7.
      Fig. 7g中的hepg2细胞蛋白质地图0 /G 1 (相互作用, A ) G 2/ m(有丝分裂, B )。 吸光度显示在灰度下 黑色的 代表0和 白色的 代表0.2单位。这两个型材的总(整体)吸光度(214nm)标准化为13.5×103 units.
      人们可以注意到,对应于循环的不同阶段的细胞对应的蛋白质地图是相似的。然而,在对应于低PI蛋白(5.5-4.0 pH单位)的区域中的相似性似乎不同于高和中性PI(8.5-5.5 pH单位)的区域。为了验证此概念,在蛋白质地图的标准化后构建差异配置文件(Fig. 8, AB )。
      图缩略图Gr8a.
      Fig. 8G型蛋白质组谱比较G中HEPG2细胞的谱0 /G 1 ( 红色的 , 剩下 )和G. 2 / m( 绿色 , 正确的 )。 差分地图( 中间 )显示在这两个群体中不同量存在的蛋白质(用它们各自的颜色表示)。完整的地图显示在 A, 然而 B (下一页)显示检测到最高差异的区域。
      图缩略图GR8B.
      Fig. 8G型蛋白质组谱比较G中HEPG2细胞的谱0 /G 1 ( 红色的 , 剩下 )和G. 2 / m( 绿色 , 正确的 )。 差分地图( 中间 )显示在这两个群体中不同量存在的蛋白质(用它们各自的颜色表示)。完整的地图显示在 A, 然而 B (下一页)显示检测到最高差异的区域。
      蛋白质,其特征在于低,中性,高pi代表了g中总蛋白质含量的相似部分0 /G 1 和 G2/ m细胞(表二)。对应于高中和中性Pi区域中的蛋白质的吸光度峰的数量和特征在这两种细胞中具有相似的相似。然而,在低PI区域中,这些人群的峰值的数量和位置不同( 图8B. 表二)。值得注意的是,这些蛋白质的特征在于高疏水性( 图8B. )。尚未建立这些数据的生物学意义。尽管如此,可能会假设考虑这些差异可能会改善癌症病因和药物发现研究的有效性。然而,清楚的是细胞或优先的细胞的表型或功能分离的重要性。
      T 有能力的 IIGEPG2细胞蛋白质地图的比较0 /G 1 和 G2/ m细胞周期的阶段
      PI.
      高(8.5-7.0)中度(7.0-5.5)低(5.5-4.0)
      rel。 ABS。rel。 ABS。rel。 ABS。
      G0 /G 1330.10280.05480.85
      G2 / M. 290.15260.10420.75
      G0 /G 1 和 G2/ m(匹配)280.22250.12251.10

      前景

      已经进行了巨大的努力,以制定淋巴蛋白质组简档的数据库。该数据库包含与未刺激的成熟T细胞的多肽成分和未成熟的胸腺细胞的多肽成分,培养的T细胞和细胞系,通过用多种构造或用特定剂,单细胞处理来操纵,所述胸腺系和细胞系衍生的T和B细胞克隆,从淋巴抑制性疾病和白血病患者获得的细胞以及各种其他相关细胞群。数据库在其包含的2D模式中遇到了大量扩展,目前编号为9167个单个2D模式(
      • HütterG.
      • Sinha P.
      研究癌细胞的蛋白质组学和化学抗性的发展。
      )。
      除了已经可用的药物靶标,尚不清楚蛋白质组学谱的组分在不同个体中的人类疾病网络中是生物学相关的,或者是给定疾病的优异治疗靶标。因此,第一任务是诊断:获得正常和患病组织的蛋白质组学谱,并生物学上确定哪两个类别在个人的特定遗传背景中的关键贡献者。作为利用该通信中鉴定的技术的中间步骤,有必要在临床研究和药物发现的背景下将表型与蛋白质组学显示器相关联。这将需要鉴定与重要过程相关的特定官能分子,例如细胞周期或细胞凋亡或例如各种信号分子。鉴定临床重要的蛋白质将推动细胞核和蛋白质组学之间的联系。一旦鉴定了这些相关标记,需要其他技术,例如复用,蛋白质微阵列和蛋白质识别工具,以促进与表型分类的功能关系。
      利用磷酸特化抗体和流式细胞术术策略的磷蛋白网络单细胞分析的研制在最近的研究中描述了Irish 等等。 (
      • 爱尔兰的准
      • 霍维兰罗
      • Krutzik P.O.
      • Perez O.D.
      • Bruserud O.
      • gjertsen b.t.
      • Nolan G.P.
      癌细胞中具有增强磷蛋白网络的单细胞分析。
      )代表我们使用分子标记以创造个性化分子药物的思维的重要概念进展。理想的肿瘤标志物应特异于此特定类型的癌症,仅由其产生而不是由任何非正常条件产生。流式细胞术与蛋白质组学联合可以有助于识别和验证这些标记。

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