一种高通量方法,用于检测微克尺度的金属蛋白*

  • 马丁Högbom.
    一致
    可以解决对应的通信。电话:46-18-4715062;传真:46-18-530396;
    隶属关系
    细胞和分子生物学,生物医学中心,乌普萨拉大学,Box 596,SE-75124乌普萨拉,瑞典
    搜索本作者的文章
  • Ulrika B.爱立信
    隶属关系
    斯德哥尔摩大学生物化学与生物物理学系,SE-10691斯德哥尔摩,瑞典
    搜索本作者的文章
  • 罗伯特林
    隶属关系
    Affinium Pharmaceuticals,100楼大道,10楼,南塔,多伦多,安大略省M5J 1V6,加拿大
    搜索本作者的文章
  • M. Amin Bakali H.
    隶属关系
    斯德哥尔摩大学生物化学与生物物理学系,SE-10691斯德哥尔摩,瑞典
    搜索本作者的文章
  • Ekaterina Kuznetsova
    隶属关系
    Toronto大学的Banting和最佳医学系,112 College St.,Toronto,Ontario M5G 1L6,加拿大
    搜索本作者的文章
  • Pärnordlund.
    隶属关系
    斯德哥尔摩大学生物化学与生物物理学系,SE-10691斯德哥尔摩,瑞典
    搜索本作者的文章
  • Deborah B. Zamble.
    一致
    可以解决对应的通信。 Tel./fax:416-978-3568;
    隶属关系
    加拿大多伦多80圣乔治圣,加拿大大酒店,多伦多,多伦多,加拿大安大略省,多伦多
    搜索本作者的文章
  • 作者脚注
    *这项工作是由加拿大自然科学和工程研究委员会(NSERC)(D. B.Z.)的赠款支持,瑞典的结构生物网络(对M. H.)和瑞典研究理事会(P. N.);由NSERC的工业研究奖学金(R. L.);并且来自多伦多中心的结构蛋白质组学资金。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白' 广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      结合过渡金属的蛋白质构成大部分蛋白质组,并且蛋白质中的金属辅因子的鉴定可以极大地促进其功能分配,并帮助将其放在已知的细胞途径的背景下。用于检测金属蛋白的现有方法通常消耗大量的蛋白质,需要昂贵的设备,或者是非常劳动密集的,使它们不适合在高通量蛋白质组学举措中使用。在这里,我们提出了一种用于鉴定含有铁,铜,锰,钴,镍和/或锌的金属蛋白的方法,可以用标准实验室设备进行敏感,快速,鲁棒,廉价的锌。测定基于化学发光和比色检测方法的组合,它通常仅消耗10μg蛋白质,并且蛋白质溶液的最常见化学成分不会干扰金属检测。将52个蛋白质样品进行分析,与电感耦合等离子体原子发射光谱法的结果进行比较,以验证该方法的准确性和灵敏度。该测定以384孔格式进行,完成约3小时,包括2-H等;因此,可以在几天内测定全部蛋白质含量的金属含量。
      蛋白质组学是由细胞产生的所有蛋白质和变体的生物化学和生理特征,并且包括测定每种蛋白质的结构和功能,其与其他细胞因子的相互作用,空间和时间位置和调节(
      • 凤仙芹。
      • Bastiaens p.i.h.
      • 朱H.
      • 斯奈德米
      • 领域S.
      蛋白质组学规模的蛋白质分析。
      ,
      • 泰尔斯米
      从基因组学到蛋白质组学。
      )。现在,这种倡议现在可以是前所未有的规模,并激励开发技术和应用的挑战,以实现系统的高吞吐量分析(
      • 凤仙芹。
      • Bastiaens p.i.h.
      • 朱H.
      • 斯奈德米
      • 领域S.
      蛋白质组学规模的蛋白质分析。
      ,
      • 萨利A.
      • Glaeser R.
      • 认真T.
      • Baumeister W.
      从结构蛋白质组学中的文学到文学。
      )。一个测定是对现有蛋白质组学协议电池的一个非常有用的补充是一种快速而简单的高吞吐量(HTP)的方法
      使用的缩写是:HTP,高吞吐量; ICP-AES,电感耦合等离子体原子发射光谱法; par,4-(2-pyridylazo)间苯二酚; eq,摩尔等价物。
      1使用的缩写是:HTP,高吞吐量; ICP-AES,电感耦合等离子体原子发射光谱法; par,4-(2-pyridylazo)间苯二酚; eq,摩尔等价物。
      鉴定过渡金属蛋白质。目前的估计表明,金属蛋白组成约三分之一的蛋白质组(
      • Holm R.H.
      • kennepohl p.
      • 所罗门e.i.
      生物学中金属位点的结构和功能方面。
      ,
      • rosenzweig a.c.
      Metallochaperones:捆绑和交付。
      ),因此鉴定金属辅因子将促进蛋白质的功能分配,并在已知的细胞途径的背景下帮助将其放置(
      • Bertini I.
      • 罗萨托A.
      在后一组中的生物卟啉化学。
      )。此外,这些信息对于选择高吞吐量结构基因组努力的吸引人目标是有用的(
      • 萨利A.
      • Glaeser R.
      • 认真T.
      • Baumeister W.
      从结构蛋白质组学中的文学到文学。
      ,
      • Brenner S.E.
      一段结构基因组学。
      )由于金属辅助因子通常可以通过异常分散方法对X射线晶体测量进行相相,并且可以解决蛋白质结构而无需进行二次实验,例如含Selenomethionine的蛋白质或重金属浸泡的蛋白质晶体(
      • Dodson E.
      这是令人伤心的吗?
      • 秋千u.a.
      • Dauter M.
      • Dauter Z.
      甜锰在两种晶体形式的葡萄糖异构酶。
      • Dauter Z.
      • Dauter M.
      • Dodson E.
      快乐悲伤。
      • Guss J.M.
      • Merritt E.A.
      • Phizackerley R.P.
      • Hedman B.
      • 村田M.
      • Hodgson K.O.
      • 弗里曼H.C.
      由黄瓜的碱性蓝铜​​蛋白的多波长X射线衍射晶体结构相确定。
      )。
      当前可用的蛋白质金属分析方法不适合常规HTP努力。这些技术,例如原子吸收光谱法,电感耦合等离子体与原子发射光谱(ICP-AES)或质谱(ICP-MS),或同步荧光光谱或延伸X射线吸收细结构等同步荧光技术(Exafs)要么消耗大量的蛋白质,要么需要专门的设备,可以非常昂贵(
      • Szpunar J.
      通过连字技术的生物无机形态分析。
      • Sanz-Medel A.
      • Montes-BayónM.
      • FernándezSánchezM.L.
      大型生物分子中ICP-MS的痕量元素形态及其对蛋白质组学的潜力。
      • 哈斯纳斯。
      后基因组时代的金属蛋白和人类疾病的同步rotron技术。
      • Jakubowski N.
      • Lobinski R.
      • Moens L.
      金属聚焦。生命的基础,原子光谱的挑战。
      • atanassova A.
      • 林R.
      • zamble d.b.
      一种用于测定蛋白质中过渡金属含量的高效液相色谱法。
      )。理想情况下,为此目的的测定应该是敏感的,以便消耗最小量的蛋白质,便宜,快速,适应大量样品,以及与公共实验室设备可行的。在这里,我们描述了检测含有生物系统中最常见的过渡金属的蛋白质的这种方法:铁,铜,锰,钴,镍和锌(
      • 灰色H.B.
      21世纪初生物无机化学。
      )。开发了这种稳健的测定以满足上面列出的所有要求,并基于用发光和比色检测方法分析的两个连续反应。
      第一次试验依赖于熟知的鲁米诺在某些催化剂存在下,将在与碱和氧化剂混合时产生化学发光( Fig. 1)。这种敏感反应通常由犯罪场景中的法医科学家使用,以检测少量血液,因为血红蛋白中的血红素是这种反应的非常有效的催化剂(
      • Sprecht W.
      Die ChemiluminesenzdesHämins,Ein Hilfsmittel Zur Auffindung und Erkennung Forensisch Wichturger Blutspuren。
      )。许多其他过渡金属也催化该反应(例如,参见参考文献。
      • 奶精J.I.
      • quickenden t.i.
      • Apanah M.v.
      • Kerr K.A.
      • 罗伯逊P.
      血液法医鲁米诺试验的工业,国内和环境干扰综合实验研究。
      • 黄湾
      • 李j.-j.
      • 张L.
      • 程J.K.
      毛细管离子分析的在线化学发光检测。
      • Alwarthan A.A.
      • Townshend A.
      通过基于与鲁米诺的反应的流动注射分析来测定铁(II)和钛(III)的化学发光测定。
      • Imdadullah.
      • Fujiwara T.
      • Kumamaru T.
      从反转胶束中氯娃酸酸反应的化学发光。
      • Imdadullah.
      • Fujiwara T.
      • Kumamaru T.
      铑(III)对反胶束化学发光的催化作用及其分析应用。
      • theingikyaw.
      • kumooka s。
      • 好的amoto Y.
      • Fujiwara T.
      • Kumamaru T.
      逆转胶束介导的鲁米诺化学发光与双(乙酰丙酮)氧化钒(IV)的化学发光反应。
      • Parejo I.
      • Petrakis C.
      • Kefalas P.
      在螯合剂存在下,过渡金属增强型鲁米诺化学发光。
      • 肖C.
      • 国王D.W.
      • 帕尔默D.A.
      • Wesolowski D.J.
      Ng / L范围中Cr(III)化学发光方法的增强效应研究。
      • 肖C.
      • 帕尔默D.A.
      • Wesolowski D.J.
      • Lovitz S.B.
      • 国王D.W.
      二氧化碳对鲁米诺和1,10菲咯啉化学发光的影响。
      )。第二种测试基于螯合剂4-(2-吡啶氧基)间苯二酚(Par)的螯合剂4-(2-吡啶基)的金属配合物的分光光度检测。将彩色复合物与几种金属形成彩色复合物,最大吸光度约为500 nm(
      • Jezorek J.R.
      • 弗利士H.
      4-(吡啶基)基于间痕量金属离子的基于间基的连续检测系统。
      • 狩猎J.B.
      • Neece S.H.
      • 吉斯堡A.
      使用4-(2-吡啶基)间苯二酚在锌释放的研究中 大肠杆菌 天冬氨酸转基因氨基酰键。
      • mccall K.A.
      • 菲尔克C.A.
      用于定量过渡金属的微摩尔浓度的比色和荧光测定。
      )。
      图缩略图GR1.
      图。1。发光的鲁米诺反应。 某些过渡金属可以充当该反应的催化剂。
      整个测定以384孔格式进行约3小时,包括2-H等待,使该方法真正高的吞吐量。为了验证该方法的准确性,我们检查了通过ICP-AES分析的52个蛋白质样品,这是金属分析和量化的标准方法(
      • Szpunar J.
      通过连字技术的生物无机形态分析。
      ),两种方法的结果之间存在良好的一致性。还测试了许多常用的蛋白质溶液组分,并且这些蛋白质溶液的蛋白质溶液组分似乎不会干扰测定信号。由于其高容量和简单性,并且可以在标准缓冲液中对微克数量的蛋白质进行的事实,该测定是用于分析现在通过蛋白质组学管道的许多未知和未分类蛋白质的方法的有价值的补充。

      实验步骤

       化学品 -

      鲁米诺,甲酸,尿素,牛碳酸酐酶,牛铜锌超氧化物歧化酶,牛心脏细胞色素 c,所有金属盐都是从西格玛购买的。 H2O2 从默克购买了。所有样品都用毫Q水,18.2兆兆姆姆 - CM电阻(Millipore)制备。用Chelex-100(Bio-rad)处理缓冲溶液,以最小化痕量金属污染。用于验证该方法的蛋白质来自斯德哥尔摩大学和多伦多大学的结构基因组举措。

       金属分析 -

      尿素(4μlAn8 m 用光学底部(Nunc)将溶液加入非透明,384孔板的孔中。在不超过2μl溶液中加入一个蛋白质(10μg),然后加入10μl新制备的鲁米诺溶液(11米 m luminol, 500 mm Na2CO.3,230米m H2O2)到所有的井。在几分钟内在Bio-rad Fluor-S多电缆上获得第一发光数据,曝光时间为10-100秒,尽管采集时间将在仪器之间变化。随后1μl2米m 将溶液加入每个孔中,重复发光读数。将板在室温下温育2小时,然后以3000×离心 g 2分钟以最小化n的干扰2 由鲁米诺反应产生的气泡。在Flyostar Galaxy Blane Reader(BMG Labtech)上测量492nm处的吸光度;由于与黄色至清晰的阴性样品相比,该测试中的阳性样品也可通过目视检查来区分。
      ICP-AES分析是对PerkinElmer Life Sciala Optima 3000 DV系统进行了GemTip横流雾化器,配备有斯科特双通喷雾室,带有分段阵列,电荷耦合器件检测器。等离子体气体流速为15升/分钟,辅助气体流速为0.5升/分钟,雾化器气体压力为0.8×105 帕斯卡尔。使用的软件是ICP Win Lab版本3.将样品稀释至~10μm 在Chelex治疗的20米m HEPES,pH 7.5和50米m NACL。对于一些样品,5%甘油(v / v)用于最小化沉淀;我们以前对标准金属解决方案的研究表明,这种甘油的浓度不会影响ICP-AES的定量(
      • atanassova A.
      • 林R.
      • zamble d.b.
      一种用于测定蛋白质中过渡金属含量的高效液相色谱法。
      )。

      结果

       金属测定 -

      为了检测与蛋白质结合的过渡金属,开发了一组连续试验,用于分析384孔板中的样品。当形成特定金属配合物形成时,通过两种信号表示过渡金属的存在,该信号催化的浓醇发光和鉴定溶液的颜色变化。在相同的样本上以连续的方式进行测试,不仅提供了关于金属的存在,而且提供了它们的身份。
      为了确定这些测试的金属选择性,首先将它们应用于纯二价金属盐的水溶液。在加入鲁米诺,1nmol铁,铜或钴时,每个产生非常明亮的信号,而锰,锌和镍没有(图2A)。锰和镍行的顶部明显明显 图2A 是由于这些位置旁边的孔的极明钴信号的光污染。偶然地添加PAR对不同金属的发光信号的影响:它淬灭铜信号但激活锰发光,允许清楚地识别这些金属(图。2B)。 492nm的光谱分析显示铜,锰,钴,镍和锌的强吸收信号,但不是铁(图2C.)。对金属配合物的最大吸收在490和510nm之间略微不同(
      • mccall K.A.
      • 菲尔克C.A.
      用于定量过渡金属的微摩尔浓度的比色和荧光测定。
      );我们选择在492nm处监测吸收,因为它是识别镍和锌的适当波长,这两种金属在鲁米诺测试中未检测到。基于这些顺序测试的结果,除了镍和锌之间的区别之外,可以确定每个过渡金属的同一性。 Fig. 3 示出了可以遵循的流程图,以确定各个金属的身份。还分析了镁,但在测定的任何步骤中没有产生信号。应该提到的是,两种测试的结果对于Fe是相同的2+ 和 Fe3+ as well as for Mn2+ 和 Mn7+.
      图缩略图GR2.
      图2。纯金属盐溶液系列稀释液。A,发光测试。 B,用par孵育后的发光测试。特别注意铜信号的消失和锰信号的外观与 A. C,在相同样品的492 nm处吸光度 B;镍和锌给出了最强的信号。
      图缩略图GR3.
      图3。用于基于测定的三个部分的结果来确定金属标识的流程图。 在样品中只有一种金属的简单情况下,可以区分除镍和锌之外的所有金属。
      对于蛋白质组学分析的HTP生成纯化蛋白,通常仅生产少量蛋白质(
      • 凤仙芹。
      • Bastiaens p.i.h.
      • 朱H.
      • 斯奈德米
      • 领域S.
      蛋白质组学规模的蛋白质分析。
      )。理想情况下,个体生化测定应该仅消耗每个样品的小部分,因此需要高度灵敏度。为了检查金属测定的敏感性,测试纯金属股的连续稀释液(Fig. 2)。在比色试验中,清楚地检测到除铁之外的每个过渡金属的0.1nmol,并且10pmol铜,钴和锰和50pmol铁足以用发光检测。

       蛋白质分析 -

      Fig. 4 显示五种不同蛋白质的测定。将每个测试中的样品的分配(正面或阴性)与ICP-AES确定的金属含量进行比较(表I.);根据预期是否预期在每个测试中产生信号进行分组。蛋白质A是38-KDA蛋白,其结合为1.2当量的锰和0.15当量的铁,如ICP-AES确定;在第一次测试中,少量铁产生弱发光信号,并且通过在比色测试中的第二发光试验中的信号和正信号中清楚地识别锰。蛋白B是含有0.81当量的铁和0.11当量的锌的43-KDA蛋白质;低量的锌不会通过两种测试中的强发光信号识别铁,并且在比色测试中仅是弱信号。不可忽略不可计量的PAR信号表明存在少量的第二金属。蛋白C是含有0.85当量锌和0.15℃的铁的15kDa蛋白质;铁产生发光信号,而锌导致比色试验中的强信号。蛋白质D是一种31-KDA蛋白,含有2.0当量的铜和2.0当量的锌;通过第一发光测试中的亮信号清楚地识别铜,但不在第二中,并且比色测试中的强信号表示存在镍或锌。最后,蛋白质E是18kDa蛋白,任何金属的0.01当量小于0.01℃,并在每个步骤中产生阴性结果。这些数据表明,尽管所有金属遵守了在测定的单独部分中为正面或负信号建立的规则,但金属的某些组合将产生可以以多种方式解释的信号。通过蛋白质C的分析清楚地说明了这种弱点。铁和锌的组合在测试中产生强烈的发光信号和强的比色信号,与单独的钴产生的相同的信号模式。因此,测定的主要强度是确定过渡金属是否与蛋白质结合而不是鉴定存在哪种金属,但这可以在许多情况下实现。
      图缩略图GR4.
      图4。对蛋白质连续稀释液进行的测定。A,发光测试。 B,加入par后的发光测试。 C,比色测试。 D,吸光度在492 nm的数据中所示的数据 C。由ICP-AES测定的蛋白质的分子量和金属含量为:38-KDA蛋白,具有1.2当量的锰和0.15当量的铁(A),一种43 kda蛋白,具有0.81当量的铁和0.11当量的锌(B),一种15-KDA蛋白,锌的0.85当量和0.15当量的铁(C),具有2.0当量铜和2.0当量锌的31kDa蛋白(D)和18 kda蛋白质,含有小于0.01当量的任何金属(E)。 0 表示没有蛋白质存在。
      T有能力的 I测定蛋白质稀释液
      测定样本
      A(38 KDA)B(43 KDA)C(15 KDA)D(31 KDA)E(18 KDA)
      Lum1Lum2colLum1Lum2colLum1Lum2colLum1Lum2colLum1Lum2col
      结果
      a 括号内的加号显示弱正信号。
      (+)++++(+)+++++
      金属等同物
      b 由ICP-AES决定。如果预计,则在每次测试下列出金属,如此 Fig. 3.
      铁0.15锰1.2锰1.2铁0.81铁0.81锌0.11铁0.15铁0.15锌0.85铜2.0锌2.0
      铁0.15铜2.0
      a 括号内的加号显示弱正信号。
      b 由ICP-AES决定。如果预计,则在每次测试下列出金属,如此 Fig. 3.
      这些蛋白质的连续稀释揭示,如果金属含量为0.85和2当量的金属的金属蛋白质之间,则观察到发光试验中的信号,只需少于0.1μg蛋白质,尤其是在增加背景之后并允许检测不太强烈的信号(图4,A和B.)。如前所述,吸光度测试较少,但在蛋白质接近完全装载金属的情况下,只需1μg蛋白质就足以获得可检测的正信号(图4,C和D.)。然而,鉴于我们经验中的大多数重组金属蛋白含有少于1当量的金属,我们表明,如果要进行比色对准测试,则应用于发光测试和10μg的蛋白质。应该提到的是,与黄色到透明的底片相比,阳性样品中的阳性样品的红颜色实际上比用板读分光光度计更容易地检测到。这是由于几种影响板中任何特定样品的吸光度的因素。例如,如果存在泡泡或沉淀物,则难以区分背景噪声难以区分。此外,蛋白质的存在将基线升高至0.1至0.2的吸光度单位(图4D),因此应将信号与负蛋白质对照进行比较,而不是不含任何​​蛋白质的井。在该实验中使用的蛋白质是 氨基杆菌氨 核糖核苷酸还原酶R2在锰补充培养基(a)中, 大肠杆菌 核糖核苷酸还原酶R2(b), 大肠杆菌 甲硫氨酸亚砜还原酶B(c),牛铜 - 锌超氧化物歧化酶(D),和 大肠杆菌 Lactoylglutathione Lyase,Apo形式(E)。

       干扰 -

      许多蛋白质纯化方案包括用于稳定蛋白质的各种试剂。因此,向该测定中加入几种常见的蛋白质溶液组分以确定它们是否干扰过渡金属的检测。在加入鲁米诺之前,在加入含甘油之前,在含蛋白质的孔中加入1μl以下溶液不会干扰测定(数据未显示):10米m CaCl2, 10 mm MgCl2, 20 mm DTT, 50 mm β-巯基乙醇,20%我2那么,200米m 硫酸铵,100米m Tris, 100 mm HEPES, 100 mm Na2HPO.4和100米m 咪唑。强金属螯合剂EDTA(1μl20米m 溶液)抑制所有金属的反应; EGTA(1μl20米m 溶液)也仍然存在分析,尽管仍然可以在鲁米诺试验中鉴定铁(但不是铜,锰和钴),并且在比色试验中仍可识别铜,镍和锌(但不是锰和钴) 。因此,如果在蛋白质缓冲液中存在EDTA或EGTA,则应在分析之前除去。然而,较弱的螯合剂柠檬酸酯不会干扰(1μla100米m 添加到样品中的溶液)。以前的研究表明,其他几种金属可以在该测定中产生信号;例如,据报道,黄金,铑,铬,钒和钛催化鲁米诺反应(
      • Alwarthan A.A.
      • Townshend A.
      通过基于与鲁米诺的反应的流动注射分析来测定铁(II)和钛(III)的化学发光测定。
      • Imdadullah.
      • Fujiwara T.
      • Kumamaru T.
      从反转胶束中氯娃酸酸反应的化学发光。
      • Imdadullah.
      • Fujiwara T.
      • Kumamaru T.
      铑(III)对反胶束化学发光的催化作用及其分析应用。
      • theingikyaw.
      • kumooka s。
      • 好的amoto Y.
      • Fujiwara T.
      • Kumamaru T.
      逆转胶束介导的鲁米诺化学发光与双(乙酰丙酮)氧化钒(IV)的化学发光反应。
      ,
      • 肖C.
      • 国王D.W.
      • 帕尔默D.A.
      • Wesolowski D.J.
      Ng / L范围中Cr(III)化学发光方法的增强效应研究。
      )和铌,钒,镉,钛,银,铀,锡和铅也是已知用PAR产生颜色变化。然而,这些金属在大多数生物中没有常见,并且尚未检查尚未检查是否与本测定的敏感性,最佳的检测波长。

       测定的准确性 -

      为了评估该测定,从斯德哥尔摩大学和多伦多的持续结构基因组举措中收集52种不同的蛋白质样品。有些是因为疑似金属含量(由于颜色或其他指示剂),有些是随机选择的。还从Sigma购买了一些已知的金属蛋白(在“实验程序”下列出)。植物的蛋白质浓度在5-20mg / ml之间变化。在384孔板中重复于10μg每种蛋白质样品上进行测定。还通过所建立的ICP-AE方法进行样品进行分析,以验证测定结果。结果总结如下。每个样品在两个测试中被评为正面或阴性。仅在施加阳性之前或之后检测鲁米诺试验(如锰和铜的情况)计数为阳性。通过492nm和眼睛的吸光度测量来鉴定PAR比色试验中的正信号;如上所述,可以通过眼睛鉴定更多的阳性。每种样品的金属含量由ICP-AES独立地确定,并且所有应在任何一个测试中给出信号的所有过渡金属的量加入。例如,具有0.15当量的铁,0.80当量的铜和0.10当量的锌的复杂样品导致0.95(0.80±0.15)Q的金属,应给出发光信号和0.90(0.8±0.10)的金属应该给出吸光度信号。然后在与ICP-AES确定的每个样品中的相同图表上绘制测定结果(正或阴性)在与每个样品中的相同金属的量绘制。
      Fig. 5 显示两个图表,一个用于发光测试,一个用于比色测试。数据也概述了 表IIIII。这些结果表明,对于发光测试,在这些试验中检测含有超过0.2当量的金属的所有蛋白质产生阳性信号,并且所有蛋白质为0.02平等或更少的表现出没有信号。落入0.03和0.2当量之间的“灰色区域”的样品产生混合结果。比色测试敏感,并且对于我们的数据,相应的灰色区域为0.08-0.58平等(表二)。简而言之,含有接近化学计量金属的样品在所有情况下产生阳性信号,并且含有少于几个金属百分之一的样品总是具有负面结果。
      图缩略图GR5.
      图5。将在测定中观察到的正面或负信号与ICP-AES检测到的金属量相关的曲线图在分析52蛋白时。A,鲁米诺测试。 B,比色测试。 钻石 (♦)表示由ICP-AES确定的样品的金属等同物,以及 灰色方块 ()指示样品在各个测试中是否给出了正或负信号。用于评估每个样品的标准描述于“结果”下描述。
      T有能力的 II基于金属等同物的正信号分布
      发光测试
       Metal equivalents0.02或以下0.03-0.19.0.2或以上
       Total samples261313
       Assigned positive0813
       Percentage062100
      比色测试
       Metal equivalents0.07或以下0.08-0.580.59或以上
       Total samples30913
       Assigned positive0513
       Percentage056100
      T有能力的 III基于样品中金属总量的正信号分布
      发光测试
       Metal amount (pmol)6或以下7–2930或以上
       Total samples241216
       Assigned positive0516
       Percentage042100
      比色测试
       Metal amount (pmol)21或以下22–149150或以上
       Total samples281410
       Assigned positive0810
       Percentage057100
      刚描述的分析类型是偏置的,因为蛋白质的分子量不同,但是测定在恒定质量的蛋白质(10μg)上运行。因此,即使两种蛋白质具有相同的金属化学计量,较大蛋白质的样品也会含有比较小蛋白质更少的金属。我们仍然以这种方式展示了数据,因为我们认为这是运行测定的最实用的方法。如果考虑蛋白质的大小,结果如下。在含有30pmol或更多的金属的蛋白质样品的发光试验中始终检测到阳性信号,并且具有少于6μmol的样品总始终出现阴性,因此“灰色”范围在6到30pmol之间。对于比色测试,相应的数字是21和150pmol(表III)。存在这种灰色区域的一个主要原因可能是金属在产生的信号的强度中变化;例如,发光试验的灰色区域中的所有五个阴性样品都具有铜作为其主要金属组分,这对于比色测试的灰色区域中的四个阴性样品中的三个也是如此。

      讨论

      由于涉及蛋白质金属含量的许多参数,金属分析本质上是困难的,并且任何方法都会具有强度和劣势(
      • atanassova A.
      • 林R.
      • zamble d.b.
      一种用于测定蛋白质中过渡金属含量的高效液相色谱法。
      )。现有方法的一些常见缺点包括大量蛋白质的消耗,方案的复杂性,以及专业和昂贵的设备(
      • Szpunar J.
      通过连字技术的生物无机形态分析。
      • Sanz-Medel A.
      • Montes-BayónM.
      • FernándezSánchezM.L.
      大型生物分子中ICP-MS的痕量元素形态及其对蛋白质组学的潜力。
      • 哈斯纳斯。
      后基因组时代的金属蛋白和人类疾病的同步rotron技术。
      • Jakubowski N.
      • Lobinski R.
      • Moens L.
      金属聚焦。生命的基础,原子光谱的挑战。
      )。这些缺点使得它们特别不适合在较小实验室中的常规分析中的HTP蛋白质组努力和有问题。在这里,我们提出了一种用于金属蛋白识别的方法,其具有敏感,快速,稳健,便宜的优点,可以用标准实验室设备进行。该方法基于以多相形式进行的连续发光和比色测试,其通常用于HTP蛋白质组学分析,并且可用于机器人操纵(
      • 凤仙芹。
      • Bastiaens p.i.h.
      • 朱H.
      • 斯奈德米
      • 领域S.
      蛋白质组学规模的蛋白质分析。
      )。在发光试验中检测到铁,铜,锰和钴,并在比色对准测试中检测到镍,锌,锰,铜和钴。该测定针对检测蛋白质中的金属进行了优化,但它非常坚固,少量观察到的干扰,因此它也可以用于其他类型的样品。许多研究检测了利用Luminol用于检测过渡金属;然而,所用方法或条件下没有均匀性,显然各种因素会检测到这些金属的金属或甚至哪种氧化状态(
      • Imdadullah.
      • Fujiwara T.
      • Kumamaru T.
      铑(III)对反胶束化学发光的催化作用及其分析应用。
      ,
      • Parejo I.
      • Petrakis C.
      • Kefalas P.
      在螯合剂存在下,过渡金属增强型鲁米诺化学发光。
      ,
      • 肖C.
      • 帕尔默D.A.
      • Wesolowski D.J.
      • Lovitz S.B.
      • 国王D.W.
      二氧化碳对鲁米诺和1,10菲咯啉化学发光的影响。
      )。因此,必须对每套新条件进行标准的实证分析。本测定似乎与金属的氧化状态相当独立;这至少部分可能是由于循环金属离子氧化状态在过氧化氢存在下的芬顿反应。确实是Fe.2+ 和 Fe3+ 在测定中给出相同的行为,而且Mn也是如此2+ 和 Mn7+.
      已经鉴定了条件,其允许依次在相同的蛋白质样品上依次进行测试以最小化所需的蛋白质。化学发光测试更敏感,在大多数情况下,1μg蛋白质足以清除结果。基于彩色的PAR-金属配合物的测试有些敏感性较小,并且如果需要来自该测试的附加信息,特别是镍和锌的检测以及熨斗和钴之间的区别,需要5-10μg蛋白质为了可靠的结果。
      该测定分为三个步骤,每个步骤提供有关存在的金属类型的不同且有时互补信息。原则上,除了镍和锌外,检查的所有金属也可以单独鉴定。但是,因为蛋白质有时含有几种金属的混合物,所有情况下都可能无法清晰的鉴定。因此,该测定的主要优点是通过仅使用少量样品来快速识别大量未知的金属蛋白。此外,如本文所述,该方法不适用于未知蛋白质中的金属的精确定量。其主要原因是,如果样品包含不同的金属,则它们的信号可以如前所述在测定中“覆盖”。此外,尽管包括尿素以使蛋白质变性,但金属释放可能不定量,并且变性蛋白质可以与反应竞争。然而,该方法适合作为将已知蛋白质的样品的金属含量与以不同方式制备的已知蛋白质的样品的金属含量进行比较。
      从蛋白质组学的角度来看,本方法对金属蛋白检测的现有手段具有相当大的优点,主要益处是低蛋白质消耗和能够廉价地分析几百个样品的能力。测定可以直接在标准蛋白质纯化缓冲液中的蛋白质样品上进行,不需要进一步样品制备。这些功能与高吞吐量和自动化方法的兼容性相结合,使其成为金属蛋白科领域的强大工具。在实践中,可以在几天内测定全蛋白质含量的金属含量。这种研究无疑将产生丰富的信息,这些信息可以有几种应用程序,从而促使个体蛋白质的功能分配到映射有机体中的金属稳态途径,以选择结构基因组努力的成功目标。方法关于金属鉴定的方法可能导致对某些应用的阳性样品进一步分析,但是将样品的数量从整个蛋白质组减少到所需的金属蛋白。

      致谢

      本研究中使用的一些蛋白质样本由Alexei Savchenko博士和Pål·斯滕克马克博士慷慨提供。我们还感谢Aled Edwards博士进行建议。

      参考

        • 凤仙芹。
        • Bastiaens p.i.h.
        • 朱H.
        • 斯奈德米
        • 领域S.
        蛋白质组学规模的蛋白质分析。
        自然。 2003; 422: 208-215
        • 泰尔斯米
        从基因组学到蛋白质组学。
        自然。 2003; 422: 193-197
        • 萨利A.
        • Glaeser R.
        • 认真T.
        • Baumeister W.
        从结构蛋白质组学中的文学到文学。
        自然。 2003; 422: 216-225
        • Holm R.H.
        • kennepohl p.
        • 所罗门e.i.
        生物学中金属位点的结构和功能方面。
        化学。录 1996; 96: 2239-2314
        • rosenzweig a.c.
        Metallochaperones:捆绑和交付。
        化学。 BIOL。 2002; 9: 673-677
        • Bertini I.
        • 罗萨托A.
        在后一组中的生物卟啉化学。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2003; 100: 3601-3604
        • Brenner S.E.
        一段结构基因组学。
        NAT。录 2001; 2: 801-809
        • Dodson E.
        这是令人伤心的吗?
        Acta Crystallogr。教派。 D生物。 Crystallogr。 2003; 59: 1958-1965
        • 秋千u.a.
        • Dauter M.
        • Dauter Z.
        甜锰在两种晶体形式的葡萄糖异构酶。
        Acta Crystallogr。教派。 D生物。 Crystallogr。 2003; 59: 868-875
        • Dauter Z.
        • Dauter M.
        • Dodson E.
        快乐悲伤。
        Acta Crystallogr。教派。 D生物。 Crystallogr。 2002; 58: 494-506
        • Guss J.M.
        • Merritt E.A.
        • Phizackerley R.P.
        • Hedman B.
        • 村田M.
        • Hodgson K.O.
        • 弗里曼H.C.
        由黄瓜的碱性蓝铜​​蛋白的多波长X射线衍射晶体结构相确定。
        科学。 1988; 241: 806-811
        • Szpunar J.
        通过连字技术的生物无机形态分析。
        分析师。 2000; 125: 963-988
        • Sanz-Medel A.
        • Montes-BayónM.
        • FernándezSánchezM.L.
        大型生物分子中ICP-MS的痕量元素形态及其对蛋白质组学的潜力。
        肛门。生物丹纳尔。化学。 2003; 377: 236-247
        • 哈斯纳斯。
        后基因组时代的金属蛋白和人类疾病的同步rotron技术。
        J. Synchrotron Radiat。 2004; 11: 7-11
        • Jakubowski N.
        • Lobinski R.
        • Moens L.
        金属聚焦。生命的基础,原子光谱的挑战。
        J.肛门。在。光谱。 2004; 19: 1-4
        • atanassova A.
        • 林R.
        • zamble d.b.
        一种用于测定蛋白质中过渡金属含量的高效液相色谱法。
        肛门。生物学习。 2004; 335: 103-111
        • 灰色H.B.
        21世纪初生物无机化学。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2003; 100: 3563-3568
        • Sprecht W.
        Die ChemiluminesenzdesHämins,Ein Hilfsmittel Zur Auffindung und Erkennung Forensisch Wichturger Blutspuren。
        angew。化学。 1937; 50: 155-157
        • 奶精J.I.
        • quickenden t.i.
        • Apanah M.v.
        • Kerr K.A.
        • 罗伯逊P.
        血液法医鲁米诺试验的工业,国内和环境干扰综合实验研究。
        发光。 2003; 18: 193-198
        • 黄湾
        • 李j.-j.
        • 张L.
        • 程J.K.
        毛细管离子分析的在线化学发光检测。
        肛门。化学。 1996; 68: 2366-2369
        • Alwarthan A.A.
        • Townshend A.
        通过基于与鲁米诺的反应的流动注射分析来测定铁(II)和钛(III)的化学发光测定。
        肛门。 ch acta。 1987; 196: 135-140
        • Imdadullah.
        • Fujiwara T.
        • Kumamaru T.
        从反转胶束中氯娃酸酸反应的化学发光。
        肛门。化学。 1991; 63: 2348-2352
        • Imdadullah.
        • Fujiwara T.
        • Kumamaru T.
        铑(III)对反胶束化学发光的催化作用及其分析应用。
        肛门。 ch acta。 1994; 292: 151-157
        • theingikyaw.
        • kumooka s。
        • 好的amoto Y.
        • Fujiwara T.
        • Kumamaru T.
        逆转胶束介导的鲁米诺化学发光与双(乙酰丙酮)氧化钒(IV)的化学发光反应。
        肛门。 SCI。 1999; 15: 293-297
        • Parejo I.
        • Petrakis C.
        • Kefalas P.
        在螯合剂存在下,过渡金属增强型鲁米诺化学发光。
        J. Pharmacol。毒素。方法。 2000; 43: 183-190
        • 肖C.
        • 国王D.W.
        • 帕尔默D.A.
        • Wesolowski D.J.
        Ng / L范围中Cr(III)化学发光方法的增强效应研究。
        肛门。 ch acta。 2000; 415: 209-219
        • 肖C.
        • 帕尔默D.A.
        • Wesolowski D.J.
        • Lovitz S.B.
        • 国王D.W.
        二氧化碳对鲁米诺和1,10菲咯啉化学发光的影响。
        肛门。化学。 2002; 74: 2210-2216
        • Jezorek J.R.
        • 弗利士H.
        4-(吡啶基)基于间痕量金属离子的基于间基的连续检测系统。
        肛门。化学。 1979; 51: 373-376
        • 狩猎J.B.
        • Neece S.H.
        • 吉斯堡A.
        使用4-(2-吡啶基)间苯二酚在锌释放的研究中 大肠杆菌 天冬氨酸转基因氨基酰键。
        肛门。生物学习。 1985; 146: 150-157
        • mccall K.A.
        • 菲尔克C.A.
        用于定量过渡金属的微摩尔浓度的比色和荧光测定。
        肛门。生物学习。 2000; 284: 307-315