识别胎盘转化生长因子-β和Bikunin代谢产物作为蛋白质组学技术药物人绒毛膜促制剂的污染物*

  • Sotiris Malatos.
    隶属关系
    米德尔斯X大学社会与健康研究所生物医学科学,英国enfield en3 4SA

    威廉森实验室,圣巴塞洛缪斯和伦敦皇家医学和牙科学院,伦敦玛丽大学,伦敦Ec1a 7be,英国
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  • 作者脚注
    ‖伦敦大学的收件人在这项研究过程中的奖学金奖学金。
    Hendrik Neubert.
    脚注
    ‖伦敦大学的收件人在这项研究过程中的奖学金奖学金。
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    伦敦伦敦国王大学药物管制中心,英国伦敦9六
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  • 安德鲁T. Kicman.
    一致
    可以解决对应的通信。
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    伦敦伦敦国王大学药物管制中心,英国伦敦9六
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  • 射线K. Iles.
    一致
    可以解决对应的通信:生物医学科学,Inst。作者:王莹,米德尔斯X大学社会与健康研究,ENFIELD EN3 4SA。
    隶属关系
    米德尔斯X大学社会与健康研究所生物医学科学,英国enfield en3 4SA

    威廉森实验室,圣巴塞洛缪斯和伦敦皇家医学和牙科学院,伦敦玛丽大学,伦敦Ec1a 7be,英国
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  • 作者脚注
    ‖伦敦大学的收件人在这项研究过程中的奖学金奖学金。
    *这项工作是由圣巴塞洛缪医院博士学博士学位的联合研究委员会提供支持。学生(到S. M.)。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      据报道,在药物尿人绒毛膜促性腺制剂中发现的污染蛋白复合物具有抗人免疫缺陷病毒相关的Kaposi的肉瘤活性。本研究的目的是通过蛋白质组学方法分离和表征该蛋白质复合物。尺寸排阻色谱用于分离这些人绒毛膜促性腺激素相关碎片。十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳显示出在还原条件下解离蛋白质复合物的蛋白质复合物。该络合物的基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱仪在〜6.2,11.4和15.8kDa下显示出三种多肽。肽质量映射和N-末端氨基酸测序确定了两种多肽,作为胎盘转化生长因子-β(11.4kDa)和Bikunin(15.8kDa)的代谢物。随后的基质辅助激光解吸/电离飞行时间的抗人免疫缺陷病毒相关的Kaposi的肉瘤活性制剂CG-10(Sigma),妊娠(CONSORON)和PREMASI(SERONO)揭示了存在的存在胎盘转化生长因子-β的代谢产物在三个中;在这些制剂中没有观察到其他非人绒毛膜促性腺激素相关的蛋白质。我们的研究结果呈现了尿液转化生长因子-β的代谢物污染的证据表明,胎儿转化生长因子-β的代谢物污染,这可能具有转化的生长因子-β激动剂作用以及Bikunin的代谢物,这是一种蛋白酶抑制剂。组合这些分子可能对这些尿液人绒毛膜促性腺制剂表现出的抗人类免疫缺陷病毒相关的Kaposi的肉瘤活性。
      人绒毛膜促性腺激素(HCG)
      使用的缩写是:HCG,人绒毛膜促性腺激素; HAF,人绒毛膜促性腺激素相关碎片; HCGα,人绒毛膜促性腺激素α-亚基; HCGβ,人绒毛膜促性腺激素β-亚基; HCGβCF,人绒毛膜促性腺培养蛋白β芯片段;艾滋病毒,人类免疫缺陷病毒; Ks,Kaposi的肉瘤; M-BIK,Bikunin代谢物; MIC-1,巨噬细胞抑制细胞因子-1; M-PTGF-β,胎盘转化生长因子-β代谢物; nesi,nano-esi; PTGF-β,胎盘转化生长因子-β; TATI,肿瘤相关胰蛋白酶抑制剂; TGF-β,转化生长因子-β。
      1使用的缩写是:HCG,人绒毛膜促性腺激素; HAF,人绒毛膜促性腺激素相关碎片; HCGα,人绒毛膜促性腺激素α-亚基; HCGβ,人绒毛膜促性腺激素β-亚基; HCGβCF,人绒毛膜促性腺培养蛋白β芯片段;艾滋病毒,人类免疫缺陷病毒; Ks,Kaposi的肉瘤; M-BIK,Bikunin代谢物; MIC-1,巨噬细胞抑制细胞因子-1; M-PTGF-β,胎盘转化生长因子-β代谢物; nesi,nano-esi; PTGF-β,胎盘转化生长因子-β; TATI,肿瘤相关胰蛋白酶抑制剂; TGF-β,转化生长因子-β。
      是概念的主要荷尔蒙产品,并负责发挥人类妊娠的孕产性识别。最近,据报道,在妊娠期间抑制母体血细胞中的人免疫缺陷病毒(HIV)复制,并从淋巴细胞传递到滋养细胞(
      • Bourinbaiar A.S.
      • Nagorny R.
      人绒毛膜促性腺激素(HCG)对从淋巴细胞对滋养细胞的HIV-1传递的抑制作用。
      )。后来提出,通过自由β-亚基(HCGβ)测定血细胞中HCG的抗病毒活性(
      • Bourinbaiar A.S.
      • 李 - 黄S.
      人绒毛膜促性腺激素(βHCG)亚基的抗HIV效应 体外。.
      )。 HIV相关的Kaposi的肉瘤(KS)中还注意到HCG和HCGβ的抗HCV效应(
      • McNamee D.
      β-HCG抑制Kaposi的肉瘤。
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      人妊娠激素阻断免疫缺陷小鼠肿瘤Kaposi的肿瘤细胞系瘤瘤和转移。
      • 郎M.E.
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      • 博克G.
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      • Feichtinger H.
      • 施瓦茨S.
      诱导人绒毛膜促性腺激素亚基籽粒血管细胞培养细胞凋亡。
      • 巴特勒S.A.
      • 勒克斯。
      通过上皮肿瘤和HCGβ诱导诱导Kaposi的肉瘤凋亡的异位HCGβ分泌:是否有连接?
      • Darzynkiewicz Z.
      Butler做到了:在人绒毛膜促性腺激素的制剂中搜索Kaposi的肉瘤细胞的杀手。
      )。 Ks通常呈现为由梭形细胞的聚集体组成的病变,其与内皮衬里通道相互作用,这仍然限制在皮下皮肤层上。人肝炎病毒-8是KS的主要致病因子,但HIV感染导致完全不同的表现;病变遍布身体,但特别影响口腔和鼻子的脸部和湿粘膜(
      • Boshoff C.
      • Weiss R.A.
      Kaposi肉瘤相关疱疹病毒的流行病学和发病机制。
      )。 HIV诱导的Ks是感染病毒的患者中最常见的肿瘤,患SARCOMA的风险增加了20,000倍,以获得的免疫缺陷综合征患者(
      • Boshoff C.
      • Weiss R.A.
      Kaposi肉瘤相关疱疹病毒的流行病学和发病机制。
      )。 HCG的抗HIV-ks活性最初注意到艾滋病毒相关KS的男性性别偏差意义的调查的一部分:Kaposi观察到偏见为15:1的偏见,在他的初步研究中进行这种情况(有关审查,请参阅参考文献。
      • Wahman A.
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      • 波特J.D.
      经典,非洲和免疫抑制的Kaposi肉瘤的流行病学。
      )。 Lunardi-Iskandar. 等等。 (
      • Lunardi-Iskandar Y.
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      • Gallo R.C.
      人妊娠激素阻断免疫缺陷小鼠肿瘤Kaposi的肿瘤细胞系瘤瘤和转移。
      )在NCI,国家卫生研究院(Bethesda,MD)注意到那些诱导KS的老鼠被孕妇进入肿瘤缓解。他们继续描述HCG和HCGβ的准备方式如何杀死KS细胞 体外体内,显然是细胞凋亡。“该效果最初归因于酸素激素/ HCG受体活化,但是小鼠在怀孕期间不具有绒毛膜促性腺激素β基因或表达当量的促性腺激素(
      • 伯杰P.
      • Dirnhofer S.
      Kaposi在孕妇的肉瘤。
      )。进行各种临床试验;其中大多数使用粗糙的HCG制剂。在大多数研究中,HCG给药导致各种程度的KS病变缓解(
      • 哈里斯P.J.
      Kaposi的肉瘤和艾滋病与人绒毛膜促性腺激素的其他表现。
      • 哈里斯P.J.
      Kaposi的肉瘤内部人绒毛膜促性腺激素。
      • 鳃P.S.
      • Lunardi-Iskandar Y.
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      • Tulpule A.
      • 郑涛
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      • 赫尔曼P.
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      • 布莱恩特J.L.
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      人绒毛膜促性腺激素的制备对艾滋病相关Kaposi的肉瘤的影响。
      • 鳃P.
      • 蔡Y.
      • Rao A.P.
      • 琼斯P.
      Kaposi的赛马场克隆品。
      • 鳃P.S.
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      • 西斯纳光明。
      • Tulpule A.
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      • lunardi- iskandar y。
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      I阶段I研究人绒毛膜促性腺激素皮下给予患有患者免疫缺陷综合征相关的粘液菌肉瘤的患者。
      • 赫尔曼P.
      • Clumeck N.
      • 皮卡德o.
      • van vooren J.P.
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      艾滋病相关的Kaposi的肉瘤患者的内脏表现。对人绒毛膜促性腺激素制剂的反应。
      • Tavio M.
      • Nasti G.
      • Simonelli C.
      • 录音机E.
      • de paoli p.
      • Giaccca M.
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      人绒毛膜促性腺激素治疗艾滋病毒相关的Kaposi肉瘤。
      )。 krown(
      • 克镇S.E.
      Kaposi的SARCOMA_是人类绒毛膜促性腺激素与它有关吗?
      )评论了HCG准备质量的变化; HCG的自由亚基和HCG,HCGβ核碎片(HCGβCF)的尿代谢物是常见的污染物。 rabkin. 等等。 (
      • rabkin c.s.
      • Chibwe G.
      • Muyunda K.
      • 穆萨巴e.
      Kaposi在孕妇的肉瘤。
      )表明怀孕尿液HCG中存在的污染物因子必须在怀孕小鼠中解释肿瘤回归。阿尔米尼 。 (
      • Albini A.
      • Paglieri I.
      • Orengo G.
      • 卡尔隆斯。
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      • Mantovani A.
      • Carozzi F.
      • Donini S.
      • Benelli R.
      人绒毛膜促性腺激素的β-核心片段抑制了Kaposi的肉瘤衍生细胞的生长和一种新的永生化的Kaposi的肉瘤细胞系。
      )结论是活性化合物是HCGβCF。然而,其他分馏抗HIV-ks活性HCG制剂表明,抗HIV-KS活性是由于小污染分子,其在尺寸排除柱上靠近HCGβCF洗脱(
      • kachra z.
      • guo w.x.
      • Sairam M.R.
      • antakly t.
      低分子量组分但不是二聚体HCG抑制Kaposi的肉瘤细胞中的生长和下调AP-1转录因子。
      )。现在已经从整齐的妊娠尿液和尿HCG制剂中分离出各种低分子量成分,用抗HIV-KS活性分离。这些已被各种类样地描述为抗病毒溶菌酶C和抗病毒RNases(
      • 格里菲斯S.J.
      • Bramley T.A.
      • Menzies G.S.
      • 亚当斯D.J.
      来自人类尿液和置换核糖核酸酶和人绒毛膜促性腺激素β-核心蛋白的共纯化 125I-Lugul Luteinizing激素来自 念珠菌白葡萄酒 核糖核酸酶的结合位点。
      • 格里菲斯S.J.
      • 亚当斯D.J.
      • Talbot S.J.
      Ribonuclease抑制了Kaposi的肉瘤。
      • 李 - 黄S.
      • 黄P.L.
      • 太阳y.
      • 黄P.L.
      • Kung H.
      • Blithe D.L.
      • 陈H.
      Lysozyme和RNase作为人绒毛膜促性腺激素的β-核心制剂中的抗HIV分量。
      )。然而,没有明确鉴定并最好被描述为未识别的蛋白质复合物称为“HCG相关碎片”(HAF)(
      • Lunardi-Iskandar Y.
      • 布莱恩特J.L.
      • blatter w.a.
      • 挂C.L.
      • 弗拉偶L.
      • 鳃P.
      • 赫尔曼P.
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      女性尿因素在妊娠早期对HIV-1,SIV和相关疾病的影响。
      ,
      • Samaniego F.
      • 布莱恩特J.L.
      • 刘恩
      • Karp J.E.
      • Sabichi A.L.
      • Thierry A.
      • Lunardi-Iskandar Y.
      • Gallo R.C.
      通过制备人绒毛膜促性腺激素诱导Kaposi的肉瘤细胞中编程细胞死亡。
      )。
      我们之前被隔离并纯化了尿HCG制剂的污染物综合体,其在我们分离HCGβCF中似乎共同洗脱(
      • 李C.L.
      • 勒克斯。
      • 牧羊女J.H.
      • 哈德森C.N.
      • Chard T.
      尿液中人绒毛膜促性腺素β-核心片段放射免疫分析的纯化与发展:应用作为妇科癌症妇科癌症的标志物。
      )。我们现在通过SDS-PAGE,N-末端测序和质谱报告该蛋白质复合物的表征,并确认其在发现具有抗HIV-KS活性的尿HCG制剂中的存在。

      实验步骤

       试剂 -

      使用了三种临床级HCG制剂:CG-10(Sigma),妊娠(Cosson,Cambridge,UK)和Profasi(Serono,Feltham,UK)。 MARDI-TOF MS级矩阵α-氰基-4-羟基氨基和2,5-二羟基苯甲酸获得来自Fluka(UK)。除非另有说明,否则所有其他化学物质均可从Merck获得。

       尺寸排除色谱 -

      HAF通过Sephadex G-100柱(Amersham Biosciences)的尺寸排阻色谱法从CG-10中分离出来,如前所述(
      • 李C.L.
      • 勒克斯。
      • 牧羊女J.H.
      • 哈德森C.N.
      • Chard T.
      尿液中人绒毛膜促性腺素β-核心片段放射免疫分析的纯化与发展:应用作为妇科癌症妇科癌症的标志物。
      )。简要将材料溶解在0.01中 m 在色谱中磷酸盐缓冲盐水。然后用上述缓冲液洗脱柱。

       测定 -

      通过使用Bradford染料(0.5mg / ml Coomassie蓝色G 25%乙醇,42.5%浓磷酸)测量总蛋白质。通过使用EL311SX MictiroTer Blate Reader(Anachem,Luton,UK),在570nm读取吸光度。
      S781多克隆抗体被用作捕获抗体的完整HCG,而S752单克隆抗体被用作免受游离HCGβ的捕获抗体(
      • 李C.L.
      • 勒克斯。
      • 牧羊女J.H.
      • 哈德森C.N.
      • Chard T.
      尿液中人绒毛膜促性腺素β-核心片段放射免疫分析的纯化与发展:应用作为妇科癌症妇科癌症的标志物。
      )。 M107单克隆抗体(
      • 李C.L.
      • 勒克斯。
      • 牧羊女J.H.
      • 哈德森C.N.
      • Chard T.
      尿液中人绒毛膜促性腺素β-核心片段放射免疫分析的纯化与发展:应用作为妇科癌症妇科癌症的标志物。
      )与辣根过氧化物酶(达科,伊氏,英国)缀合,随后用作两种测定中的检测抗体。
      Inn112单克隆抗体被用作β的捕获抗体13 HCGβCF上的表位; Inn112抗体是Peter Berger教授(生物医学研究所,Innsbruck,奥地利)的礼物。 S504多克隆抗体(
      • 李C.L.
      • 勒克斯。
      • 牧羊女J.H.
      • 哈德森C.N.
      • Chard T.
      尿液中人绒毛膜促性腺素β-核心片段放射免疫分析的纯化与发展:应用作为妇科癌症妇科癌症的标志物。
      )被用作HCGβCF的一次检测抗体,并且使用驴抗羊 - 辣根过氧化物酶单克隆抗体(Jackson Immunoresearch Inc.,West Grove,PA)作为二次检测抗体。

       SDS-PAGE-

      使用20%丙烯酰胺分离凝胶和5%堆叠凝胶进行一维SDS-PAGE。在还原和非还原条件下运行之前,在100℃下在100℃下变化5分钟。在Tris-甘氨酸缓冲液中在15 mA的恒定电流中进行电泳。用50%甲醇,10%乙酸的25%Coomassie蓝(W / V)染色凝胶过夜,并用50%甲醇,10%乙酸饮用。

       原位还原,烷基化和消化 -

      如前所述,用二硫醇和碘乙酰胺进行染色蛋白质的还原和烷基化(
      • Jeno P.
      • 迷你T.
      • Moes S.
      • Hintermann E.
      • 霍斯特米
      来自聚丙烯酰胺凝胶中消化的蛋白质的内部序列。
      )。短暂染色的蛋白质带从凝胶中切除,并进一步抵抗25米m 碳酸氢铵,50%乙腈,减少并用10米烷基化m Dithiothreitol和55米m 碘乙酰胺。在50米的溶液中以12.5ng /μl胰蛋白酶(sigma)的浓度进行胰蛋白酶消化m 碳酸氢铵,5米m calcium chloride.

       MALDI-TOF MS-

      使用具有600μm亲水锚的MALDI靶板的样品制备方案(ACHORCHIP™600,Bruker Daltonics,Coventry,英国)(
      • Schuerenberg M.
      • Luebbert C.
      • eickhoff h.
      • Kalkum M.
      • Lehrach H.
      • Nordhoff E.
      不良MALDI-MS样品支持。
      )。使用c脱谷物所有蛋白质制剂和凝胶胰蛋白酶摘要18 Ziptips(Millipore)。用1μl1%三氟乙酸酸化样品的等分试样,以增强C上的肽结合18 树脂。根据制造商的建议进行调理,装载和洗涤步骤。从C洗脱蛋白质和肽18 用2μl乙腈,0.1%三氟乙酸水溶液(50:50,v / v)直接呈α-氰基-4-羟基氨基酸晶体的薄层,由0.3μl的α-α- -Cyano-4-羟基氨基酸(丙酮,0.1%三氟乙酸水溶液; 97:3)或薄层2,5-二羟基苯甲酸晶体,由0.5μl的5mg / ml的2,5-二羟基苯甲酸溶液形成0.5μl (乙腈,0.1%三氟乙酸水溶液; 1:2)。干燥后,将含α-氰基-4-羟基氨基酸的制剂用0.3μl乙醇,丙酮,0.1%三氟乙酸(6:3:1)重结晶。
      在AutoFlex(Bruker Daltonics,Coventry,UK)上获得MALDI-TOF质谱,使用337nm的氮激光在正离子模式下在正离子模式下进行。以线性模式获取蛋白质质谱,而在反射模式下记录消化谱以提高质量分辨率。为避免探测器饱和度,低质量材料偏转。检测电压为1.75 kV。所有其他参数设置为优化的质量分辨率。通常,来自200个激光射击的质谱是平均的。使用来自牛胰岛素的信号,牛泛素,马细胞色素的信号,外部校准线性Maldi-Tof Mass Spectra c和牛α乳白蛋白。胰蛋白酶摘要的MALDI光谱使用胰蛋白酶自析碎片进行内部质量校正。

       PSD MALDI-TOF MS-

      对于PSD MALDI分析,将脉冲离子偏转器设置为允许在±5 -DA质量窗口中选择前体离子。 80ns的脉冲离子提取用于增强的光谱分辨率。根据前体离子的质量在最多18个区段中,反射器电压从最大的前体离子的质量达到0.59kV,以聚焦检测器上的亚稳态片段。在每个反射器电压设置下获得的光谱在Xmass TM中使用来自肾上腺皮质激素夹18-39的PSD片段的校准文件粘贴在一起。使用PSD光谱的注释宏在XMASS TM中进行片段的质量分配。

       nano(n)-esi-ms-

      使用c脱盐肽样品18 如上所述的Ziptips除去甲酸代替三氟乙酸作为离子配对剂。将样品直接注入LCQ Deca XP离子阱质谱仪(Thermo Finnigan,CA)使用Picotip纳米粉(新目标,Woburn,MA)。每个离子物种都被隔离为MS 2 实验使用2-3质量单位的隔离宽度,并且归一化碰撞能量设定在30%至40%之间。

       Edman劣化的N末端测序 -

      使用Procise 494个气相/液体脉冲序列(Applied Biosystems,CA)作为利兹大学的蛋白质测序设施的蛋白质测序设施的蛋白质测序设施的蛋白质测序设施博士提供N-末端序列。

       碳水化合物染色 -

      为了鉴定SDS-PAGE后的碳水化合物,根据制造商推荐的程序使用糖蛋白检测试剂盒(SIGMA)。

      结果

       孤立的haf-

      在先前的研究中,我们将蛋白质分子从尿HCG制备CG-10(Sigma)进行分离,其中HCG首先洗脱,HCGβCF出现在后水分中。未识别的蛋白质复合物(HAF)与HCGβCF紧密孵育(先前出版物所示的数据)(
      • 李C.L.
      • 勒克斯。
      • 牧羊女J.H.
      • 哈德森C.N.
      • Chard T.
      尿液中人绒毛膜促性腺素β-核心片段放射免疫分析的纯化与发展:应用作为妇科癌症妇科癌症的标志物。
      )。将这些级分合并在一起并测定总蛋白质(530μg/ ml),HCG(未检测到,<1%交叉反应性),HCGβ(未检测到,<1%的交叉反应性)和HCGβCF(1,200pmol / mL,〜2%的交叉反应性)。 HAF的SDS-Page在非还原条件下显示27,19和10kDa的蛋白质带;在还原条件下,在15和10kDa观察两个带(Fig. 1)。
      图缩略图GR1.
      图。1。SDS-PAGE和HAF准备的MALDI-TOF MS。 SDS-PAGE在非减少和减少条件下进行 盒装区域 表示随后对MALDI-TOF MS进行的切除条带。 A-C.,由MALDI-TOF MS测定的洗脱完整蛋白质。 D-F.,具有标记的所有识别信号的胰蛋白酶摘要MS的MALDI-TOF。可以在群众标签的编码中找到 。通过从还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶洗脱的多肽(数据未显示)获得相同的结果。 P,M-PTGF-β片段; B,m-bik碎片; ,氧化; T,胰蛋白酶自溶片段。

       HAF-的分子鉴定

      从非还原和还原条件下产生的单个凝胶带洗脱多肽并进行MALDI-TOF MS。从非减少SDS页频带洗脱的完整HAF组件的分析显示了27-KDA凝胶带的MALDI信号,两个信号 m/z 19-KDA带的15,770.5(单充电离子)和7,887.1(双重带电离子),以及两个信号 m/z 11,361.5(单充电离子)和10-KDA带的5,684.0(双重带电离子)(图1,A-C)。在非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶上的分离的HAF组分的凝胶胰蛋白酶分解,然后是MALDI-TOF MS和吉祥物数据库搜索(www.matrixscience.com.)确定了两种包含胎盘转化生长因子-β(PTGF-β)和Bikunin的27-KDA凝胶带内包含的两种多肽,并且将在此称为代谢物(M)-ptGF-β和代谢物 - Bikunin(m -bik)分别(图。1D)。此外,19-KDA凝胶带仅包含M-BIK(~15.8kDa,Maldi-Tof MS)(图1E.),而10-KDA凝胶带含有M-PTGF-β(MALDI-TOF MS的〜11.4kDa)(图。1F.)。可以看到胰蛋白酶映射的细节 表I., 和 Fig. 2 显示M-BIK和M-PTGF-β的全氨基酸序列。在不降低条件下的19-和10-KDA凝胶带中的相同结果是从减少15和10kDa的降低Sds-聚丙烯酰胺凝胶带洗脱的多肽(数据未示出)。
      T有能力的 I鉴定HAF的胰蛋白酶碎片
      肽没有。范围氨基酸序列[m + h]+批准准确性
      计算观察到的
      PPM.
      M-Bik.
       B11–3vtk.347.23
       B24–4K147.11
       B35–23EDSCQL.gysagpcmgmtsr.2,106.832,106.830
       B424–52yfyngtsmacetfqyggcmgngnnfvtek.3,347.35
       B553–59Eclqtcr.966.41966.42+10
       B6
      a 在27-KDA凝胶带中,来自非还原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(图。1D)。
      60–70TVAACNLPIVR.1,213.671,213.69+16
       B771–74GPCR.489.22
       B875–86afiqlwafdavk.1,408.76
       B987–88 GK. 204.13
       B1089–103cvlfpyggcqgnk.1,670.741,670.71−18
       B11104-108Fysek.673.32
       B12109-111eCR.464.19
       B13
      a 在27-KDA凝胶带中,来自非还原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(图。1D)。
      112-126.EycGVPGDGDEELLR.1,708.75.1,708.77+12
       B14127-129FSN.367.16
       B2
      b 表示错过的裂解。
      B3
      4–23kedscqlgysagpcmgmtsr.2,234.93.2,234.92−4
       B11
      b 表示错过的裂解。
      B12
      a 在27-KDA凝胶带中,来自非还原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(图。1D)。
      104-111fysekecr.1,118.491,118.51.+18
      m-ptgf-β
       P11–2 AR. 246.16
       P23–13ngdhcplg.PGR.1,179.53
       P314–16CCR.495.18
       P417–21lhtvr.625.38625.37
      c 低分子量离子未显示 Fig. 1.
      +16
       P5
      a 在27-KDA凝胶带中,来自非还原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(图。1D)。
      22–37aslylgwadwvlspr.1,814.91.1,814.90−6
       P6
      a 在27-KDA凝胶带中,来自非还原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(图。1D)。
      38–53evqvtmcigacpsqfr.1,882.871,882.89+11
       P754–62AANMHAQIK.983.51983.50−10
       P863–67TSLHR.613.34613.31
      c 低分子量离子未显示 Fig. 1.
      −49
       P9
      a 在27-KDA凝胶带中,来自非还原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(图。1D)。
      68–91lkpdtvpapccvpasynpmvliqk.2,698.342,698.35.+4
       P10
      a 在27-KDA凝胶带中,来自非还原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(图。1D)。
      92–107tdtgvslqtydlak.1,739.871,739.88+6
       P11108-112Dchci.704.25704.26
      c 低分子量离子未显示 Fig. 1.
      +14
       P10
      b 表示错过的裂解。
      P11
      92–112tdtgvslqtyddlakdchci.2,425.102,425.09−4
      a 在27-KDA凝胶带中,来自非还原的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(图。1D)。
      b 表示错过的裂解。
      c 低分子量离子未显示 Fig. 1.
      图缩略图GR2.
      图2。M-BIK和M-PTGF-β的氨基酸序列。A,m-bik(129个氨基酸); B,M-PTGF-β(112个氨基酸)。 数字 表示前体蛋白质上的氨基酸位置。 灰色区域 代表鉴定的胰蛋白酶肽 . 斜斜体,n末端序列; *, N - 链接糖基化位点。
      使用一些选定的胰蛋白酶碎片进行PSD MALDI-TOF和NESI-MS以确认肽鉴定。例如,PSD MALDI-TOF MS通过产生主要肽离子的特征碎片来确认在19-KDA(非还原SDS-PAGE)和15-KDA(减少SDS-PAGE)凝胶带内的M-BIK存在 m/z 1,213.6 (Fig. 3)。此外,NESI-MS确认了10-KDA凝胶带内的M-PTGF-β的一些胰蛋白酶肽(非减少和减少SDS-PAGE)的特性肽的同一性,例如在 m/z 1,814.9 (Fig. 4)。
      图缩略图GR3.
      图3。PSD MALDI-TOF MS的M-BIK。 1,213.6 -Da M-Bik胰蛋白酶B6()被选择为PSD Maldi-ToF MS。仅标记Y和B离子系列,并且在序列串中指示离子覆盖物 最佳 of the figure.
      图缩略图GR4.
      图4。M-PTGF-β的NESI-MS。 1,814.9-DA M-PTGF-β胰蛋白肽P5 选择了NESI-MS。序列在 最佳 该图表示肽的离子覆盖。仅在光谱中标记Y和B离子。
      为了确定HAF组分的N-末端位置,对由还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶洗脱的多肽进行EDMAGAM降解实验。获得所获得的N-末端序列标签进行蛋白质BLAST搜索(www.ncbi.nlm.gov/blast.)对于蛋白质和基因数据库的短而几乎精确匹配。它们产生了与Bikunin和PTGF-β的显着序列比对,用于分别在15和10kDa中从还原SDS-聚丙烯酰胺带洗脱的多肽(表二)。
      T有能力的 IIM-BIK和M-PTGF-β的N-末端序列
      凝胶带分子量n末端序列多肽
      kda.
      15vtkkeds(S/C)QL.M-Bik.
      10 AR. NGD(D/H)Xplm-ptgf-β

       HAF准备的碳水化合物检测 -

      已知Bikunin和PTGF-β含有碳水化合物结构(
      • 炸薯条E.
      • 勃洛上午
      Bikunin_not只是一种血浆蛋白酶抑制剂。 int。 J. Biochem。
      ,
      • bootcov m.r.
      • Bauskin A.r.
      • Valenzuela S.M.
      • 摩尔盖。
      • 淘尘硕
      • 他x.Y.
      • 张H.P.
      • 唐尼伦米
      • 马哈勒S.
      • 普赖尔K.
      • 沃尔斯B.J.
      • Nicholson R.C.
      • Fairlie W.D.
      • POR S.B.
      • 罗宾斯金。
      • Breit S.N.
      MIC-1是一种新型巨噬细胞抑制细胞因子,是TGF-β超家族的发散构件。
      )。研究了它们对M-BIK和M-PTGF-β的存在,尽管没有预期在M-PTGF-β上发现碳水化合物部分(见“讨论”)。在非降低条件下运行的SDS-PAGE带上检测到碳水化合物。对应于19kDa的M-BIK的SDS-PAGE蛋白条带呈碳水化合物积极染色,而所有其他乐队都是负的(Fig. 5)。 M-BIK的胰蛋白酶摘要MALDI-TOF分析M-BIK导致氨基酸224和352之间的Bikunin结构的不完整地图(图2A)。特别地,跨越氨基酸247-275的序列(其中包括糖基化位点ASN250)在光谱中未观察到。这可能表明糖基化结构仍然存在,因此有助于M-BIK(15.8kDa)的总质量。进一步的研究是确定整个结构的必要条件。这与M-PTGF-β形成鲜明对比,其中几乎通过肽质量映射鉴定氨基酸197和308之间的整个结构(图。2B)。
      图缩略图GR5.
      图5。碳水化合物在HAF制备中检测。 在非还原条件下,在HAF的SDS-PAGE后进行碳水化合物检测。 品红 乐队对于糖部分是阳性的。 A,标记; B,HAF准备; C,辣根过氧化物酶。

       尿妊娠HCG制剂的质谱分析 -

      抗HIV-KS活性临床级尿HCG制剂CG-10(Sigma),妊娠(CONSORON)和PREMASI(SERONO)进行MALDI-TOF MS,并与HAF的MALDI光谱相比(Fig. 6)。在低分子质量范围内(m/z 6-18,000),所有商业制剂均得到由糖族异质性引起的HCG(HCGα)的α-亚基的分辨信号模式。此外,还观察到双重电荷的HCGα信号(图6,A和C.)。此外,妊娠制剂表现出相当大的HCGβCF。所有准备工作都包含大约的信号 m/z 11,400。大约一个信号 m/z 15,800只在HAF准备中存在;然而,由于它的低丰度,它可能在其他HCG制剂的MALDI光谱中抑制,其中存在更多的总蛋白质(主要是HCG)(图6,A-C)。此外大约有强烈的信号 m/z HAF制剂中的6,200也被观察为具有妊娠的主要物种,作为具有CG-10的低丰度信号,但它不存在于profasi中。
      图缩略图GR6.
      图6。MALDI-TOF MS不同的HCG制剂。A,CG-10(Sigma); B,妊娠(有机); C,profasi(serono); D,haf准备。光谱聚焦在6至18 kda之间的质量区域。观察到HCGβ A, B, 和 C 但是在这里省略了清楚起见。群众区域从8.5到15 kda B is expanded 10×.

      讨论

      已显示与妊娠尿液和HCG制剂相关的蛋白质减少 念珠菌白葡萄酒 发病机制,诱导KS细胞中的细胞凋亡,抑制HIV复制(
      • 格里菲斯S.J.
      • Bramley T.A.
      • Menzies G.S.
      • 亚当斯D.J.
      来自人类尿液和置换核糖核酸酶和人绒毛膜促性腺激素β-核心蛋白的共纯化 125I-Lugul Luteinizing激素来自 念珠菌白葡萄酒 核糖核酸酶的结合位点。
      • 格里菲斯S.J.
      • 亚当斯D.J.
      • Talbot S.J.
      Ribonuclease抑制了Kaposi的肉瘤。
      • 李 - 黄S.
      • 黄P.L.
      • 太阳y.
      • 黄P.L.
      • Kung H.
      • Blithe D.L.
      • 陈H.
      Lysozyme和RNase作为人绒毛膜促性腺激素的β-核心制剂中的抗HIV分量。
      • Lunardi-Iskandar Y.
      • 布莱恩特J.L.
      • blatter w.a.
      • 挂C.L.
      • 弗拉偶L.
      • 鳃P.
      • 赫尔曼P.
      • Birken S.
      • Gallo R.C.
      女性尿因素在妊娠早期对HIV-1,SIV和相关疾病的影响。
      • Samaniego F.
      • 布莱恩特J.L.
      • 刘恩
      • Karp J.E.
      • Sabichi A.L.
      • Thierry A.
      • Lunardi-Iskandar Y.
      • Gallo R.C.
      通过制备人绒毛膜促性腺激素诱导Kaposi的肉瘤细胞中编程细胞死亡。
      )。以前报道了活性蛋白质组分是一种与嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素紧密同源的18-KDA RNase(
      • 格里菲斯S.J.
      • Bramley T.A.
      • Menzies G.S.
      • 亚当斯D.J.
      来自人类尿液和置换核糖核酸酶和人绒毛膜促性腺激素β-核心蛋白的共纯化 125I-Lugul Luteinizing激素来自 念珠菌白葡萄酒 核糖核酸酶的结合位点。
      ,
      • 格里菲斯S.J.
      • 亚当斯D.J.
      • Talbot S.J.
      Ribonuclease抑制了Kaposi的肉瘤。
      ),14 kda人溶菌酶c(
      • 李 - 黄S.
      • 黄P.L.
      • 太阳y.
      • 黄P.L.
      • Kung H.
      • Blithe D.L.
      • 陈H.
      Lysozyme和RNase作为人绒毛膜促性腺激素的β-核心制剂中的抗HIV分量。
      ),RNaseA(23kDa)和尿RNase U(~18kDa)(
      • 李 - 黄S.
      • 黄P.L.
      • 太阳y.
      • 黄P.L.
      • Kung H.
      • Blithe D.L.
      • 陈H.
      Lysozyme和RNase作为人绒毛膜促性腺激素的β-核心制剂中的抗HIV分量。
      )。在某些情况下,它简单地被描述为名为HAF的蛋白质复合物,其由15-30-30-4-4-kda多肽(
      • Lunardi-Iskandar Y.
      • 布莱恩特J.L.
      • blatter w.a.
      • 挂C.L.
      • 弗拉偶L.
      • 鳃P.
      • 赫尔曼P.
      • Birken S.
      • Gallo R.C.
      女性尿因素在妊娠早期对HIV-1,SIV和相关疾病的影响。
      ,
      • Samaniego F.
      • 布莱恩特J.L.
      • 刘恩
      • Karp J.E.
      • Sabichi A.L.
      • Thierry A.
      • Lunardi-Iskandar Y.
      • Gallo R.C.
      通过制备人绒毛膜促性腺激素诱导Kaposi的肉瘤细胞中编程细胞死亡。
      )。已知尿HCG制剂CG-10(Sigma)富含这些HCG相关的生物活性多肽。本研究的目的是使用现代质谱法来鉴定污染HCG的药物制剂的这些尿HCG相关蛋白已知具有抗HIV-KS活性(
      • Lunardi-Iskandar Y.
      • 布莱恩特J.L.
      • blatter w.a.
      • 挂C.L.
      • 弗拉偶L.
      • 鳃P.
      • 赫尔曼P.
      • Birken S.
      • Gallo R.C.
      女性尿因素在妊娠早期对HIV-1,SIV和相关疾病的影响。
      ,
      • Samaniego F.
      • 布莱恩特J.L.
      • 刘恩
      • Karp J.E.
      • Sabichi A.L.
      • Thierry A.
      • Lunardi-Iskandar Y.
      • Gallo R.C.
      通过制备人绒毛膜促性腺激素诱导Kaposi的肉瘤细胞中编程细胞死亡。
      )。
      MALDI-TOF MS,PSD MALDI-TOF MS,NESI-MS和N-末端测序的胰蛋白酶谱系鉴定了两种多肽,其是PTGF-β(M-PTGF-β,11.4kDA)和Bikunin( M-BIK,15.8 KDA)(图。 1, 3, 4, 和 6表I. II )。没有证据表明RNase A,RNase U,嗜酸性粒细胞衍生的神经毒素或溶菌酶C.
      PTGF-β也称为巨噬细胞抑制细胞因子-1(MIC-1),生长分化因子-15,胎盘骨形态发生蛋白,前列腺分化因子和Neuregulin-1。它具有12.5 kda的成熟完整的多肽质量(瑞士 - Prot条目Q99988, www.expasy.ch.)通过对其他TGF-βS的同源性,形成二硫化物连接的同型二聚体蛋白(
      • Fairlie W.D.
      • 摩尔盖。
      • Bauskin A.r.
      • 拉塞尔P.K.
      • 张H.P.
      • Breit S.N.
      MIC-1是与巨噬细胞激活相关的新型TGF-ν超家族细胞因子。
      )。 PTGF-β首先出现在文献中作为MIC-1,巨噬细胞的自分泌调节分子(
      • bootcov m.r.
      • Bauskin A.r.
      • Valenzuela S.M.
      • 摩尔盖。
      • 淘尘硕
      • 他x.Y.
      • 张H.P.
      • 唐尼伦米
      • 马哈勒S.
      • 普赖尔K.
      • 沃尔斯B.J.
      • Nicholson R.C.
      • Fairlie W.D.
      • POR S.B.
      • 罗宾斯金。
      • Breit S.N.
      MIC-1是一种新型巨噬细胞抑制细胞因子,是TGF-β超家族的发散构件。
      )。稍后显示人胎盘产生MIC-1,母体血清中发现的升高(
      • 摩尔盖。
      • 棕色D.A.
      • Fairlie W.D.
      • Bauskin A.r.
      • 布朗P.K.
      • Munier M.L.C.
      • 拉塞尔P.K.
      • Salamonsen L.A.
      • 华莱士伊米。
      • Breit S.N.
      转化生长因子-β超家族细胞因子巨噬细胞抑制细胞因子-1在孕妇血清中存在高浓度。
      )。 PTGF-β的抗umorigenic活性首先得到Li 。 (
      • 李p.x.
      • Wong J.
      • Ayed A.
      • ngo D.
      • br
      • arrowsmith c.
      • 奥斯汀R.C.
      • Klamut H.J.
      胎盘转化生长因子-β是肿瘤细胞生长停滞和凋亡反应的下游介质,对DNA损伤和P53过表达。
      据发现,其过表达可以诱导细胞周期停滞和乳腺肿瘤细胞的凋亡 体外。随后的研究表明,其下调可降低人类乳腺癌细胞中细胞周期停滞和细胞凋亡(
      • Graichen R.
      • 刘德克斯。
      • 太阳y.
      • 李克。
      • Lobie P.E.
      自分泌人生长激素抑制胎盘转化生长因子-β基因转录,以预防凋亡,允许人类乳腺癌细胞的细胞周期进展。
      )增加良性前列腺增生的发病率(
      • Kakehi Y.
      • Segawa T.
      • wu x.x.
      • Kulkarni P.
      • Dhir R.
      • getzenberg r.h.
      巨噬细胞抑制细胞因子-I /前列腺衍生因子在良性前列腺增生中的下调。
      )。 体外 癌细胞的实验表明,PTGF-β可以降低细胞粘附,然后降低细胞脱离,诱导细胞凋亡(
      • 刘涛。
      • Bauskin A.r.
      • Zaunders J.
      • 棕色D.A.
      • Pankurst S.
      • 罗素P.J.
      • Breit S.N.
      巨噬细胞抑制细胞因子1减少细胞粘附并诱导前列腺癌细胞中的细胞凋亡。
      ,
      • 杨H.
      • 菲律宾Z.
      • 棕色D.
      • Breit S.N.
      • Vassilev L.T.
      巨噬细胞抑制性细胞因子-1:一种新型生物标志物,用于P53途径激活。
      )。然而,一些研究提出了直肠癌PTGF-β表达与肿瘤进展之间的正关系(
      • 棕色D.A.
      • 病房r.l.
      • 巴克夫尔P.
      • 刘涛。
      • 罗马人K.E.
      • 霍金斯N.J.
      • Bauskin A.r.
      • Kinzler K.W.
      • Vogelstein B.
      • Breit S.N.
      MIC-1血清水平和基因型:与结肠直肠癌的进展和预后的关联。
      )以及胃肿瘤组织(
      • 李D.H.
      • 杨Y.
      • 李S.J.
      • 金库克。
      • koo t.h.
      • 胫骨
      • 歌K.S.
      • 李雅。
      • Kim Y.
      • 李j.j.
      • Choi I.
      • 李杰。
      巨噬细胞抑制性细胞因子-1通过上调尿激酶型纤溶酶原激活剂体系来诱导胃癌细胞的侵袭性。
      )。这与TGF-β的双官能作用一致,其诱导间皮细胞生长,同时诱导上皮细胞凋亡(
      • 巴特勒S.A.
      • 勒克斯。
      通过上皮肿瘤和HCGβ诱导诱导Kaposi的肉瘤凋亡的异位HCGβ分泌:是否有连接?
      )。
      重要的是要记住,在这些尿HCG制剂中检测到的是PTGF-β单体的片段,而不是成熟蛋白质。因此,任何抗HIV-ks活性都不可能是通过受体激活,但最可能通过拮抗机制。有趣的是,这与先前的建议一致,即HCGβ片段通过与TGF-β的半胱氨酸结生长因子结构同源性阻断TGF-β受体复合物(
      • 巴特勒S.A.
      • 勒克斯。
      通过上皮肿瘤和HCGβ诱导诱导Kaposi的肉瘤凋亡的异位HCGβ分泌:是否有连接?
      )。显然如果这种情况,PTGF-β的高水平单体片段将具有更大的拮抗性质。然而,高度可能的是,这些制剂的抗HIV-ks活性不仅是由于M-PTGF-β。临床研究已经清楚地表明,当抗病毒复制剂与蛋白酶抑制剂组合使用时,才能实现有效的抗HIV-KS治疗(
      • Sgadari C.
      • Monini P.
      • 巴里拉里G.
      • Ensoli B.
      使用HIV蛋白酶抑制剂阻止Kaposi的肉瘤和肿瘤生长。
      )。
      Bikunin是含有两个Kunitz结构域的蛋白酶抑制剂(
      • 炸薯条E.
      • 勃洛上午
      Bikunin_not只是一种血浆蛋白酶抑制剂。 int。 J. Biochem。
      )。它具有各种同义词:α-胰蛋白酶抑制剂轻链,尿胰蛋白酶抑制剂,酸稳定胰蛋白酶抑制剂,Mingrin,尿嘧啶和乌纳替肽。它最初表示为α1-microglobulin / bikunin前体,其翻译后修饰以含有天冬酰胺(N - ) - 连接糖基化部分和一个非常大的软骨素链。未修饰的氨基酸链的质量为16.0kDa(瑞士 - Prot条目编号P02760,www.expasy.ch),而其完整的质量是25-26kDa,具体取决于翻译后软骨素的结构和 N - 链接糖基化链(
      • 炸薯条E.
      • 勃洛上午
      Bikunin_not只是一种血浆蛋白酶抑制剂。 int。 J. Biochem。
      )。除了其已建立的蛋白酶抑制剂活性外,Bikunin还用作成纤维细胞的生长因子,作为炎症急性期标记蛋白(
      • 炸薯条E.
      • 勃洛上午
      Bikunin_not只是一种血浆蛋白酶抑制剂。 int。 J. Biochem。
      )。一项研究表明,某些重组形式的Bikunin可以对HIV-1感染性具有抑制作用 vitro (
      • Brinkmann T.
      • Schafers J.
      • Gurtler L.
      • Kido H.
      • Niwa Y.
      • Katunuma N.
      • Tschesche H.
      抑制胰蛋白酶TL2 from human T4+ 重组抑肽蛋白和比克诺同源物的H9细胞中HIV-1复制的淋巴细胞和抑制作用。
      )。在癌症中,人胶质母细胞瘤细胞的表达会导致抑制肿瘤侵袭(
      • Hamasuna R.
      • KataOka H.
      • 蒙友。
      • itoh H.
      • 莫里亚·塔
      • Wakisaka S.
      • Koono M.
      减少人胶质细胞瘤中肝细胞生长因子活化剂抑制剂型-2 /胎盘双尼蛋白(Hai-2 / Pb)的表达:对Hai-2 / Pb在胶质母细胞瘤细胞中的抗侵袭作用的影响。
      ),而添加Bikunin对人类软骨肉瘤细胞培养物阻断细胞扩散(
      • Suzuki M.
      • Kobayashi H.
      • 福建M.
      • Nishida T.
      • Takigawa M.
      • Kanayama N.
      • Terao T.
      Kunitz型蛋白酶抑制剂Bikunin破坏了含有表位V9的CD44变体同种型的Phorbol酯诱导的低聚,随后抑制了人软骨肉瘤细胞中尿激酶型纤溶酶原激活物的表达。
      )。
      虽然我们只在这些制剂中检测到Bikunin(M-Bik)的片段,但很可能仍然是活性蛋白Kunitz抑制剂结构域。大型M-BIK 15.8-KDA片段包含Bikunin的Kunitz域,域I是唯一包含的域 N - 链接的碳水化合物结构(前体分子上的氨基酸位置250)(
      • 炸薯条E.
      • 勃洛上午
      Bikunin_not只是一种血浆蛋白酶抑制剂。 int。 J. Biochem。
      一个 她- 由二糖重复单元组成的链接软骨素链附着在Bikunin的N-末端延伸上,但在M-BIK(前体分子的氨基酸位置215)中未发现(
      • 炸薯条E.
      • 勃洛上午
      Bikunin_not只是一种血浆蛋白酶抑制剂。 int。 J. Biochem。
      )。在本研究中,M-BIK显示为糖基化。相反,虽然PTGF-β包含一个 N - 在完整前体分子的氨基酸位置70下延伸糖基化位点(
      • bootcov m.r.
      • Bauskin A.r.
      • Valenzuela S.M.
      • 摩尔盖。
      • 淘尘硕
      • 他x.Y.
      • 张H.P.
      • 唐尼伦米
      • 马哈勒S.
      • 普赖尔K.
      • 沃尔斯B.J.
      • Nicholson R.C.
      • Fairlie W.D.
      • POR S.B.
      • 罗宾斯金。
      • Breit S.N.
      MIC-1是一种新型巨噬细胞抑制细胞因子,是TGF-β超家族的发散构件。
      ),没有证据存在于M-PTGF-β上存在的任何碳水化合物结构(Fig. 5)。这与M-PTGF-β一致的是在前体多肽上截断M-PTGF-β,而M-BIK在前体多肽上的氨基酸224处被截短;因此M-BIK保留了可能代谢的 N - 在氨基酸位置250时的糖基化(图2A)。 Bikunin碳水化合物在确定其功能方面发挥着核心作用,因此M-Bik可能保留其Kunitz结构域蛋白酶抑制性质(
      • 卓L.
      • Salustri A.
      • Kimata K.
      血清蛋白多糖碧酮蛋白的生理功能:硫酸软骨素部分的核心作用。
      )。
      它对HAF的MARDI-TOF MS分析也很重要(图6D.)显示存在于6.2-KDA胰蛋白酶抗性组分的存在,该组分未在凝胶上可视化。由于其在SDS-PAGE期间大规模变性后的质量相似和损失,这可能是单独组成的kunitz结构域II的Bikunin的进一步降解片段。其前体蛋白质的氨基酸285和340之间的Bikunin Kunitz结构域II片段的理论物质为6,176Da,因此将未知的肽与在大规模准确度的1Da内匹配。替代候选胰蛋白酶抑制剂存在于文献中。从卵巢癌的患者的尿液中分离出一种6.2-KDA多肽蛋白(
      • Huhtala M.L.
      • Pesonen K.
      • Kalkkinen N.
      • Stenman U.H.
      卵巢癌患者尿液中肿瘤相关胰蛋白酶抑制剂的纯化和表征。
      )。它被称为肿瘤相关的胰蛋白酶抑制剂(TATI),但也称为胰腺分泌胰蛋白酶抑制剂(
      • Stenman U.H.
      肿瘤相关胰蛋白酶抑制剂。
      )。 Tati的完整质量为6,247 da(瑞士 - Prot条目编号P00995,www.expasy.ch),从而观察到的多肽 m/z 本研究中的6,175(图6D.)可以是Tati的代谢产物。它的表达也已在怀孕中注意到,TATI在与癌症条件相似的水平(
      • Kolho K.L.
      • Huhtala M.L.
      • Jalanko H.
      • Rauramo I.
      • Stenman U.H.
      胰腺分泌胰蛋白酶抑制剂来自人羊水和胎儿和新生儿尿液:浓度和物理化学表征。
      )。
      显然,该研究与先前的数据冲突,该数据提出了RNase和溶菌酶分子作为妊娠尿液和泌尿HCG制剂的活性抗HIV-KS污染物组分(
      • 格里菲斯S.J.
      • Bramley T.A.
      • Menzies G.S.
      • 亚当斯D.J.
      来自人类尿液和置换核糖核酸酶和人绒毛膜促性腺激素β-核心蛋白的共纯化 125I-Lugul Luteinizing激素来自 念珠菌白葡萄酒 核糖核酸酶的结合位点。
      • 格里菲斯S.J.
      • 亚当斯D.J.
      • Talbot S.J.
      Ribonuclease抑制了Kaposi的肉瘤。
      • 李 - 黄S.
      • 黄P.L.
      • 太阳y.
      • 黄P.L.
      • Kung H.
      • Blithe D.L.
      • 陈H.
      Lysozyme和RNase作为人绒毛膜促性腺激素的β-核心制剂中的抗HIV分量。
      )。在一家关于Darzynkiewicz(
      • Darzynkiewicz Z.
      Butler做到了:在人绒毛膜促性腺激素的制剂中搜索Kaposi的肉瘤细胞的杀手。
      )指出了先前报告的尿酸症患者在泌尿HCG制剂中发现的抗KS因子研究的相当大的方法和理论缺陷。事实上,他表示鉴定HCG的这种抗KS因子的鉴定对于HCG的临床应用进一步进展至关重要。在该研究中使用的蛋白质组学质谱技术比其他报告中使用的免疫印迹和催化酶测定相比的歧化性更大。实际上,在任何检查的HCG制剂中都没有观察到先前提出的分子。
      1998年Lunardi-Iskandar出版物 等等。 (
      • Lunardi-Iskandar Y.
      • 布莱恩特J.L.
      • blatter w.a.
      • 挂C.L.
      • 弗拉偶L.
      • 鳃P.
      • 赫尔曼P.
      • Birken S.
      • Gallo R.C.
      女性尿因素在妊娠早期对HIV-1,SIV和相关疾病的影响。
      )表示,来自临床级妊娠尿液HCG制剂的HAF的活性部分(IE)的鉴定是启动临床试验的高优先级之一,其中可以研究公认的组分的生物学性质。我们现在已经确定了抗HIV-KS蛋白与HCGβCF密切合作,从妊娠尿HCG制剂CG-10(Sigma),妊娠(CONSORON)和PREMIS(SERONO)为M-PTGF-β,M-BIK并且可能是Tati的代谢产物。一般来说,这种同意Lunardi-Iskandar的原始研究 等等。 (
      • Lunardi-Iskandar Y.
      • 布莱恩特J.L.
      • blatter w.a.
      • 挂C.L.
      • 弗拉偶L.
      • 鳃P.
      • 赫尔曼P.
      • Birken S.
      • Gallo R.C.
      女性尿因素在妊娠早期对HIV-1,SIV和相关疾病的影响。
      )他们提出了HAF,由几种从2-30kDa的多肽组成。现在我们已经鉴定了商业HCG制剂中的污染蛋白,抗HIV-KS活性,HCG在HIV-KS治疗中的可能作用可以彻底研究。

      致谢

      我们感谢Mireia FernandezOcaña进行支持,以获取纳米电子普雷电离质谱和斯蒂芬管家,以了解方法论有用的评论。

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