SER / THR蛋白激酶彩易福彩 - 彩易福彩彩易福彩相互作用图 玉米菌菌*

  • 范林吴
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    Systems Biomedicine(教育部)重点实验室(教育部),上海焦塘大学系统生物医学中共生物医学中心,800东川路,上海200240;

    上海交通大学癌肠和相关基因国家重点实验室,上海200240;
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  • 尹刘
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    Systems Biomedicine(教育部)重点实验室(教育部),上海焦塘大学系统生物医学中共生物医学中心,800东川路,上海200240;

    上海交通大学癌肠和相关基因国家重点实验室,上海200240;
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  • 何伟江
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    Systems Biomedicine(教育部)重点实验室(教育部),上海焦塘大学系统生物医学中共生物医学中心,800东川路,上海200240;

    上海交通大学癌肠和相关基因国家重点实验室,上海200240;
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  • y钊栾
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    孙中山大学眼科与视觉科学,广东省关键实验室,广东广州大学,广州500040
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  • 海南张
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    Systems Biomedicine(教育部)重点实验室(教育部),上海焦塘大学系统生物医学中共生物医学中心,800东川路,上海200240;

    上海交通大学癌肠和相关基因国家重点实验室,上海200240;
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  • 湘乡
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    Systems Biomedicine(教育部)重点实验室(教育部),上海焦塘大学系统生物医学中共生物医学中心,800东川路,上海200240;

    上海交通大学癌肠和相关基因国家重点实验室,上海200240;

    上海交通大学生物医学工程学院,上海,200240;
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  • 赵伟徐
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    Systems Biomedicine(教育部)重点实验室(教育部),上海焦塘大学系统生物医学中共生物医学中心,800东川路,上海200240;

    上海交通大学癌肠和相关基因国家重点实验室,上海200240;
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  • 景李某
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    上海交通大学的现实分析中心,上海200240;
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  • 李云吉
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    Systems Biomedicine(教育部)重点实验室(教育部),上海焦塘大学系统生物医学中共生物医学中心,800东川路,上海200240;
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  • Zhi谢
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    孙中山大学眼科与视觉科学,广东省关键实验室,广东广州大学,广州500040
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  • Daniel M. Czajkowsky.
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    上海交通大学生物医学工程学院,上海,200240;
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  • 魏艳
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    Systems Biomedicine(教育部)重点实验室(教育部),上海焦塘大学系统生物医学中共生物医学中心,800东川路,上海200240;
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  • 娇宇邓
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    中国科学院武汉病毒学研究所病毒学国家重点实验室,武汉430071;
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  • 李军碧
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    北京100101,北京100101,北京100101,北京100101,北京100101北京100101;

    佛山大学口腔医学学院,佛山市广东省佛山528000;

    广东省TB系统重点实验室生物学与翻译医学,佛山528000
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  • 张先生张
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    北京100101,北京100101,北京100101,北京100101,北京100101北京100101;
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  • 盛乐陶
    一致
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    Systems Biomedicine(教育部)重点实验室(教育部),上海焦塘大学系统生物医学中共生物医学中心,800东川路,上海200240;

    上海交通大学癌肠和相关基因国家重点实验室,上海200240;
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      结核分枝杆菌(MTB)是结核病的致病因子,所有传染病中死亡的主要原因。 MTB中有11种真核状丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Stpks),被认为在细胞生长,信号转导和发病机制中发挥枢轴作用。但是,他们的潜在行动机制仍然很大程度上是无表情的。在本研究中,使用MTB彩易福彩组微阵列,我们全局鉴定了所有STPK的MTB中的结合蛋白,并构建了包括492个结合蛋白和1,027个相互作用的第一个STPK彩易福彩相互作用(KPI)地图。生物信息学分析表明,相互作用蛋白反映了各种功能,包括双组分系统中的作用,转录,彩易福彩降解和细胞壁完整性。功能性研究证实,PKNG通过肽聚糖(PG)生物合成的关键组分调节细胞壁完整性,例如Murc。这里构建的全球STPK-kPIS网络预计将作为理解MTB中的关键信令途径的丰富资源,从而促进药物开发和对MTB的有效控制。
      结核病(TB)1 现在是传染病死亡的主要原因,2014年刚刚超过150万人死亡(
      • WHO
      2015年全球结核病报告。
      )。 2014年有近1000万个新鉴定的病例,以及多药抗性(MDR)的快速出现和广泛的耐药性(XDR)株 结核分枝杆菌 (MTB),结核病的致病剂,这种疾病对全世界公共卫生的威胁继续大幅增长(
      • Horsburgh Jr,C.r.
      • 巴里3,C.E.
      • Lange C.
      治疗结核病。
      )。因此,迫切需要有效的疫苗和药物来减少全球TB的负担。
      发现和表征适当疫苗候选物和药物目标进展缓慢的最显着原因之一是MTB中基本生物途径的普遍缺乏知识以及它们如何受到监管。
      磷酸化被广泛认识到在真核生物和原核生物中的许多途径中发挥着重要作用(
      • 纽曼r.h.
      • 胡锦涛
      • Rho H.S.
      • 谢Z.
      • 树林C.
      • Neiswinger J.
      • 库珀C.
      • Shirley M.
      • 克拉克H.M.
      • 胡斯
      • Hwang W.
      • 河东J.s.
      • 吴G.
      • 林J.
      • 高X.
      • Q.
      • Goel R.
      • 夏S.
      • 吉H.
      • 达尔比k.n.
      • Birnbaum M.J.
      • COLE P.A.
      • Knapp S.
      • Ryazanov A.G.
      • zack d.j.
      • 黑人S.
      • Pawson T.
      • Gingras A.c.
      • Desiderio S.
      • Pandey A.
      • 土耳其人B.E.
      • 张继夫
      • 朱H.
      • 钱J.
      基于人类活动的磷化网络的构建。
      )。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(StPK)是真核生物中的主要彩易福彩激酶之一。与许多广泛研究的细菌病原体和模型生物相比,具有少数或没有STPK但许多双组分系统,MTB基因组编码11个Stpks(
      • dworkin J.
      SER / THR磷酸化作为细菌的调节机制。
      )。根据它们的序列相似性,这些StPK已被分组为五个片状,即CLADE I(PKNA,PKNB,PKN1),CLADE II(PKND,PKNE,PKNH),CLADE III(PKNF,PKNI,PKNJ),CLADE IV(PKNG )和Clade V(PKNK)(
      • Narayan A.
      • Sachdeva P.
      • Sharma K.
      • Saini A.K.
      • Tyagi A.K.
      • 辛格y.
      分枝杆菌属的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶:系统发育功能。
      )。众所周知,这些Stpk在适应各种环境条件时发挥关键作用(
      • ortega c.
      • 廖R.
      • 安德森L.N.
      • Rustad T.
      • ollodart a.r.
      • 赖特A.T.
      • 谢尔曼D.R.
      • Grundner C.
      结核分枝杆菌 Ser/Thr protein kinase B mediates an oxygen-dependent replication switch.
      ),细胞壁合成(
      • 汗科
      • Nagarajan S.N.
      • Parikh A.
      • Samantaray S.
      • 辛格A.
      • Kumar D.
      • 罗伊r.p.
      • Bhatt A.
      • nandicoori v.k.
      Enoyl-酰基载体蛋白还原酶Inha的磷酸化影响分枝杆菌生长和生存。
      ), 细胞分裂 (
      • Jani C.
      • EOH H.
      • 李j.j.
      • 哈莎K.
      • Sahana M.B.
      • 汉J.S.
      • nyayapathy s。
      • Lee J.-Y.
      • Suh J.-w.
      • 李S.H.
      • rehse s.j.
      • Crick D.C.
      • 康C.-M.
      猕猴桃磷酸化在分枝杆菌中的极性肽聚糖生物合成。
      )和致病性(
      • Wolff K.A.
      • de la pena a.h.
      • nguyen h.t.
      • PHAM T.H.
      • amzel l.m.
      • Gabelli S.B.
      • nguyen L.
      一种氧化还原调控系统,对巨噬细胞和生物膜发育中的分枝杆菌生存至关重要。
      )。但是,除了几个相对良好的STPK之外,例如PKNA,PKNB(
      • Gee C.L.
      • Papavinasasundaram K.G.
      • 布莱尔S.R.
      • Baer C.E.
      • Falick上午
      • 国王D.S.
      • 格里芬J.E.
      • Venghatakrishnan H.
      • Zukauskas A.
      • Wei J.R.
      • Dhiman R.K.
      • Crick D.C.
      • 鲁宾e.j.
      • Sassetti C.M.
      • Alber T.
      一种磷酸化的伪转油酶复合体对细菌中的细胞壁合成控制。
      ,
      • 康下午
      • nyayapathy s。
      • Lee J.Y.
      • Suh J.W.
      • Husson R.N.
      WAG31,细胞分裂蛋白分裂的同源物,调节分枝杆菌的生长,形态和极性细胞壁合成。
      )和pkng(
      • Walburger A.
      • 熊A.
      • 法拉利G.
      • nguyen L.
      • prescianotto-baschong c。
      • Huygen K.
      • Klebl B.
      • 汤普森C.
      • Bacher G.
      • Pieters J.
      来自致病性分枝杆菌的蛋白激酶G促进巨噬细胞内的存活。
      ),这些Stpks表现不佳。此外,这些Stpks如何在系统范围内函数完全未知。
      为了系统地理解StPK的作用,高效的第一步是涉及STPK的全局彩易福彩 - 彩易福彩相互作用(PPI)的表征。虽然MTB中存在少数已知的STPK-彩易福彩相互作用(KPI),但是 例如 PknG and GarA (
      • o'hare h.m.
      • Duran R.
      • Cervenansky C.
      • Bellinzoni M.
      • Wehenkel上午
      • Pritsch O.
      • OBAL G.
      • Baumgartner J.
      • Vialaret J.
      • 约翰逊K.
      • Alzari下午
      蛋白激酶在分枝杆菌中调节谷氨酸代谢。
      )调节三羧酸循环和谷氨酸合成,PKNB和WAG31(
      • 哈莎K.
      • Sahana M.B.
      • Jani C.
      • nyayapathy s。
      • 康下午
      • rehse s.j.
      可见波长拉曼光谱法研究了WAG31磷酸化对细胞和细胞包围突变体的细胞和细胞包络分数。
      ),细胞分裂,PKNB和麦白核糖基转移酶凝视的组分(
      • leiba J.
      • 康顿K.
      • 巴隆尼亚G.
      • Zanella-Cleon I.
      • K a lscheuer R.
      • 克雷梅勒L.
      • 孕育州S.
      • Molle V.
      结核分枝杆菌 maltosyltransferase GlgE, a genetically validated antituberculosis target, is negatively regulated by Ser/Thr phosphorylation.
      )。这些已知的KPI甚至很少,以实现对STPK在MTB中的角色的系统范围内。
      彩易福彩微阵列是一种强大的彩易福彩组织研究工具(
      • 朱H.
      • Bilgin M.
      • Bangham R.
      • 大厅D.
      • Casamayor A.
      • Bertone P.
      • LAN N.
      • Jansen R.
      • BidlingMaier S.
      • Houfek T.
      • 米切尔T.
      • 米勒P.
      • Dean R.A.
      • Gerstein M.
      • 斯奈德米
      彩易福彩组芯片的全局分析彩易福彩活性。
      ),包括那些描绘全球PPI的人(
      • FasoLo J.
      • 八字架A.
      • 太阳m.g.
      • yu h.
      • 陈R.
      • 沙龙D.
      • kim p.m.
      • Gerstein M.
      • 斯奈德米
      通过彩易福彩微阵列鉴定的不同蛋白激酶相互作用揭示了细胞过程之间的新型连接。
      ,
      • 陈Y.
      • 杨L.N.
      • 程L.
      • 涂点。
      • 郭S.J.
      • Le H.Y.
      • 熊Q.
      • 莫R.
      • 李C.Y.
      • 济杰克斯。
      • 姜L.
      • 黑人S.
      • BI L.J.
      • 朱H.
      • Tao S.C.
      • GE F.
      BCL2相关的奥斯基烯3互乱结果分析揭示了调节蛋白酶体活性的新作用。
      )。为了加速我们对MTB和结核病的理解,携带大部分MTB蛋白的MTB彩易福彩组微阵列最近被构建,特别是PPI的表征(
      • 邓杰。
      • BI L.
      • 周L.
      • 郭S.J.
      • 弗莱明J.
      • 姜H.W.
      • 周Y.
      • 顾J.
      • 钟Q.
      • 王Z.X.
      • 刘Z.
      • 邓R.P.
      • 高J.
      • 陈T.
      • 李W.
      • 王J.F.
      • 王X.
      • 李H.
      • GE F.
      • 朱G.
      • 张H.N.
      • 顾J.
      • wu f.l.
      • 张Z.
      • 王D.
      • 李Y.
      • 程L.
      • 他X.
      • Tao S.C.
      • 张X.E.
      结核分枝杆菌 proteome microarray for global studies of protein function and immunogenicity.
      )。
      在此,我们应用MTB彩易福彩组微阵列以识别MTB STPK在系统范围内的角色。总体而言,我们获得了492个结合蛋白和1027个相互作用的KPIS网络,其代表了MTB中的第一个和最全面的PPI网络。生物信息分析表明,该网络中的细胞壁相关的活性高度富集,而功能分析证实了这种观察结果,并证明PKNG可以通过与MUR连接酶MURC的相互作用来调节MTB细胞壁生物发生。我们认为,这里展示的Stpk-kpis网络将成为MTB的未来生物学和临床研究中的宝贵资源。

      实验步骤

       KPI.筛选MTB彩易福彩组微阵列

      玉米菌菌 本研究使用含有约4200个全长GST融合蛋白的彩易福彩微阵列(
      • 邓杰。
      • BI L.
      • 周L.
      • 郭S.J.
      • 弗莱明J.
      • 姜H.W.
      • 周Y.
      • 顾J.
      • 钟Q.
      • 王Z.X.
      • 刘Z.
      • 邓R.P.
      • 高J.
      • 陈T.
      • 李W.
      • 王J.F.
      • 王X.
      • 李H.
      • GE F.
      • 朱G.
      • 张H.N.
      • 顾J.
      • wu f.l.
      • 张Z.
      • 王D.
      • 李Y.
      • 程L.
      • 他X.
      • Tao S.C.
      • 张X.E.
      结核分枝杆菌 proteome microarray for global studies of protein function and immunogenicity.
      )。在室温下封闭微阵列,在阻塞缓冲液中摇动(pH7.4,5%BSA,0.1%Tween-20)。纯化的V5标记的激酶探针在探测缓冲液(1×PBS,0.1%Tween-20,1%BSA)中稀释。封闭后,将微阵列在3ml稀释的激酶库中以10-50μg/ ml的终浓度在4℃下在4℃下孵育过夜。然后将阵列洗涤3次,在室温下在25mL PBST(pH7.4,0.1%吐温-20)缓冲液中,在室温下在60rpm下振荡,将阵列中的3次。然后将微阵列用1mL抗V5抗体(Sigma-Aldrich,Saint Louis,Mi)探测,在室温下在PBST缓冲液中以260ng / ml的浓度浓缩1小时。在抗体检测之后,用Cy5缀合的抗体(杰克逊免疫研究,West Grove,PA)探测微阵列,在室温下在PBST缓冲液中以260ng / ml的浓度浓度探测。将微阵列用25mL的PBST缓冲液洗涤3次10分钟并空气干燥。使用4200al微阵列扫描仪(Molecular Devices,Abingdon,UK)记录微阵列结果。使用Genepix软件(分子器)处理图像文件。

       彩易福彩微阵列数据过程分析

      数据分析过程包括四个步骤:(1)背景校正,(2)归一化,(3)识别正击,(4)去除非特异性相互作用。第一步是背景校正,对降低背景噪声至关重要。接下来,我们通过划分中值背景的前景强度来量化阵列上每种彩易福彩的信号强度。为了识别微阵列对微阵列的阳性点击,我们估计了与信号强度分布的标准偏差,如前所述(
      • 胡斯
      • 谢Z.
      • Onishi A.
      • yu x.
      • 姜L.
      • 林J.
      • Rho H.S.
      • 树林C.
      • 王H.
      • 河东J.s.
      • 长S.
      • 他X.
      • 跋涉H.
      • 黑人S.
      • 钱J.
      • 朱H.
      分析人蛋白-DNA蛋白组揭示ERK2作为干扰素信号传递的转录压缩机。
      )。在本研究中选择了平均值的四个标准偏差的截止。由于每种彩易福彩印刷一式两份,只有在相同彩易福彩的两个斑点显示出高于针对该微阵列实验所确定的截止值的信号强度的斑点时,才会被彩易福彩被刻划为阳性击中。

       Biolayer干涉测量分析

      使用Fortebio 70八位级系统测量激酶和它们的交流剂的结合动力学。使用EZ-Link Colfo-NHS-LC-Biotin蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白生物素蛋白(Thermo Scientific,Bremen),PKNG,PKNG,PKNN,PKNG,PKNG纯化的激酶PKNB,PKNG,PKND和PKNH。将生物素化的激酶在链霉蛋白涂覆的传感器的尖端表面上系。 S.D的结合伙伴。然后将缓冲液(1×PBS,pH7.4具有0.02%Tween-20和0.1%BSA)暴露于束缚生物素化的激酶,并通过干涉图案的重合变化测量结合。 SSA提示(Pall Fortebio,Menlo Park,NJ)在S.D上进行了预借。缓冲器,它作为固定化的背景缓冲区。这涉及建立稳定的基线(60秒),加载50μg/ ml激酶(300秒),平衡尖端与S.D。缓冲器(60秒),与500米的关联m 底物(溶解在S.D.缓冲液中)(300秒),然后用S.D洗脱非特异性结合。缓冲(300秒)。最终的固定水平为1.0±0.2nm。使用Fortebio数据分析软件7进行分析数据。数据适合于1:1结合模型以计算关联和解离率,并且使用该比率计算KD kd./K a .

       酵母 - 双杂交(Y2H)分析

      将PKNG编码ORF序列和PKNB,PKND,PKNH激酶结构域序列克隆到诱饵载体pGBKT7中,以及将序列编码成捕食载体PGADT7,其被修改为网关系统。从我们的MTB BP克隆文库中选择具有BP克隆的相互作用彩易福彩的基因质粒,并用一步的LR反应直接连接到捕食载体。使用Matchmaker 2-Hybrid系统(Takara Bio,Tokyo,Japan)根据制造商的说明进行Y2H相互作用测定。将两种重组质粒为酵母菌(AH109),并在S.D./-leu,-TRP的培养基上生长,用于选择阳性转化体。然后使用S.D./-leu,-trp,-his,-ade介质选择互动器。

       分枝杆菌彩易福彩互补测定

      如上所述进行分枝杆菌蛋白片段互补(MPFC)测定(
      • 辛格A.
      • 迈D.
      • Kumar A.
      • steyn a.j.
      Dissecting virulence pathways of 结核分枝杆菌 through protein-protein association.
      )。将感兴趣的基因扩增并克隆到Puab300中,将PKNB和PKND克隆到Puab400中,而Puab100(表达MDHFR片段F1,2)和PUAB200(表达MDHFR片段F3)被设定为阳性对照。 M. Smegmatis. (MSM)与质粒都是COTRANSFORMED;在7H10琼脂平板上选择转化体,其中25μg/ mL卡那霉素和50μg/ mL氢霉素,并在补充有20μg/ ml TrimethOlim(TMP)的7H10 Kanamycin /潮霉素平板上测试4天。

       实验设计与统计理由

       用其相互作用蛋白纯化StPK

      将四个激酶(PKNB,PKND,PKNG和PKNG)克隆到PET28a并表达 大肠杆菌 BL21(DE3)。虽然使用网关系统用载体PDEST15构建相互作用彩易福彩(15个底物/激酶)并表达 大肠杆菌 BL21(DE3)。用ni纯化stpks和互动彩易福彩2+ 根据制造商的指示,分别根据制造商的教学分别进行了Sepharose珠粒和GST-Sepharose珠子。用银染色量化彩易福彩(Beyotime,Nantong,中国)。

       体外激酶磷酸化

      体外 如上所述进行磷酸化(
      • leiba J.
      • 康顿K.
      • 巴隆尼亚G.
      • Zanella-Cleon I.
      • K a lscheuer R.
      • 克雷梅勒L.
      • 孕育州S.
      • Molle V.
      结核分枝杆菌 maltosyltransferase GlgE, a genetically validated antituberculosis target, is negatively regulated by Ser/Thr phosphorylation.
      )。简而言之,反应由200μl激酶缓冲液中的50μg底物组成(50米m Tris-HCl,pH 7.0,1米m DTT, 5 mm MgCl2, 2 mm MnCl2)5米m 对于每种选定的KPI,包括ATP和10μg激酶,并包括没有ATP的对照磷酸化测定。作为总和,对激酶反应进行60个底物,然后用60例对照反应进行。将反应在37℃下进行2小时。然后通过免疫印迹用抗SER / THR磷酸化抗体(Abcam,Cambridge,USA)读出磷酸化事件。实验进行了两次。

       溶液胰蛋白酶消化和富集磷酸肽与TiO2 Resin

      在磷酸化反应后,获得MS分析的高效率,>将10个样品分组为一个。总共准备8组。将分组的样品浓缩成彩易福彩吸附膜(Pall,华盛顿州,NY),用50米洗涤m 碳酸氢铵在4°C以10,000×离心3次 g 20分钟,并在60℃下在羧基酰胺甲基中减少30分钟。在37℃下用测序级修饰的胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)在37℃下消化彩易福彩16小时。用50米从膜中洗脱胰蛋白酶消化的蛋白样品m 碳酸氢铵2次,然后通过冻干干燥。根据制造商的指示,通过使用磷酸富集富集TiO2 Mag Sepharose(GE Healthcare Life Sciences,Parramatta,澳大利亚)来富含消化肽的磷酸肽。简而言之,在含有1的200μlTiO 2磷酸磷酸铝结合缓冲液中重新溶解干燥的肽 m 乙醇酸在80%乙腈,5%三氟乙酸中,然后与50μLTiO 2磷光结合树脂混合。孵育1小时后,弃去上清液,用洗涤缓冲液(80%乙腈,1%三氟乙酸)洗涤TiO 2树脂3次。之后,通过加入50μL洗脱缓冲液(5%氢氧化铵,pH〜12)洗脱磷酸肽。将洗脱的级分合并并通过冻干干燥,并以20μl0.1%的0.1%甲酸(FA)重构,用于LC-MS / MS分析(
      • 杨米克。
      • 乔Z.X.
      • 张W.Y.
      • 熊Q.
      • 张继夫
      • 李T.
      • GE F.
      • 赵J.D.
      全局磷蛋白酶分析揭示了丝氨酸模型SneCeChococcus Sp模型中丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸化的各种功能。菌株PCC 7002。
      )。

       质谱分析

      通过在Q辐射加高胶石壁图质谱仪(Thermo Fisher Scientific)上在线纳米氟液相色谱串联质谱(LC-MS / MS)分析磷酸化肽。在0.1%HCOOH /水(缓冲液A)中以1μl/ min的流速将样品(1μl)加载到2cm填充的前柱(75μmID×360μmod)上以1μl/ min的流速5分钟。分析分离在15cm包装柱(75μmid x360μmod)上以300 nl / min进行,越来越多的CH 3CN(缓冲B,0.1%HCOOH / CH3CN)。普雷柱(5μm直径,200埃孔径)和分析柱(3μm直径,孔径为100埃孔径)填充C.18 - 使用压力炸弹,重放相二氧化硅(Dikma-Inspireetm)。在样品加载之后,缓冲B迅速增加3%至6%超过5分钟,然后浅至32%超过36分钟,然后超过9分钟,然后在3分钟内快速增加至95%,并保持7分钟为95%。持续时间持续60分钟。调查全扫描MS谱(m/z 350-1800)以70 000分辨率(m/z 200)在将离子累积到3×10后6 基于先前全扫描的预测AGC的目标值。动态排除设置为60秒。

       质谱数据处理

      使用LC / MS软件数据分析4.0(Bruker Compass软件)处理原始文件。为了改善磷酸肽的鉴定,使用吉祥物2.3分析所有MS / MS样品(
      • 傅y.
      • 杨Q.
      • 太阳r.
      • 李德。
      • 曾R.
      • 凌c.x.
      • 高W.
      利用核心串联通过串联质谱来将肽鉴定的片段离子相关联。
      )。吉祥物被设置为从SwissProt搜索M.Tuberculosis数据库的数据库(http://web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html)含有2067个注释的彩易福彩序列。搜索标准如下:胰蛋白酶消化;将氨基甲酰亚胺甲基化(CYS)设定为固定改性,而氧化(M),磷酸(ST)和磷酸(Y)被认为是可变的改性;允许两个错过的乳沟。允许的最大质量偏差为前体离子的0.4Da(单异位缺陷),并且片段最大质量偏差为0.6Da(单同步率)。对于搜索来说,根据公式:FDR = 2 [ndecoy + ntarget)](:)基于1%错误发现率(FDR)的得分阈值,过滤肽频谱匹配(PSM)。
      • MACEK B.
      • Mijakovic I.
      • 奥尔森J.V.
      • GNAD F.
      • Kumar C.
      • Jensen P.R.
      模型芽孢杆菌枯草芽孢杆菌的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷脂体。
      )。而且,根据离子MH + -80的中性损失,手动评估并鉴定分配给相应彩易福彩的磷酸化肽的所有磷酸化肽。最后,为了确定所鉴定的肽内的实际磷酸化位点,通过使用彩易福彩发现软件(Thermo)的荧光粉分析来计算磷酸化位点的定位概率。占用概率占用的磷酸化位点>将0.95鉴定为磷酸化位点。

       Coimmunoprecipipitation.

      含有Ptetint-PKNG的细菌,PGRNA-Murc PGRNA-MURC在37℃下生长,在200℃下摇动过夜至OD600 = 0.6。然后在20ng /μl的浓度下用Anhydrote-Tracycline(ATC)诱导24小时以收获。将上清液用PBS重悬,并通过高压裂解器(Union-Biotech,中国)裂解。离心裂解物以分离可溶性和不溶性级分。可溶性级分用于COIMMUNPORECIPITIPITITITITIP。简而言之,将小鼠抗标志抗体(Sigma-Aldrich,St.LOUIS,MO)加入到2mg可溶性裂解物(1:100稀释)中,并将混合物在4℃下振动过夜。然后将Affi-Gel蛋白G琼脂糖树脂(Roche,Basel,瑞士)加入到裂解物中,并在4℃下振荡孵育4小时,以与抗体 - 抗原复合物结合。然后,将树脂用PBST洗涤6次,并加入SDS-PAGE加载缓冲液(Beyotime,Nantong,中国)。将得到的样品在SDS-PAGE上溶解并转移到硝酸纤维素膜上,用于用兔抗PKNG抗体进行彩易福彩印迹分析。

       Murc酶测定

      Murc反应混合物(100μl)含有50米m BIS-TRIS丙烷缓冲液(pH 7.0),10米m MgCl2, 10 mm KCl, 1 mm UDP-GlcNAc, 1 mm PEP, 1 mm NADPH, 2 mm l-ala,2米m ATP和200μg细胞裂解物。将反应在37℃下进行1小时,并通过加入500μl甲醇进行质谱鉴定。

       用质谱法测量MURC的活性

      如前所述进行LC-HRMS(Vogliardi 等等。,2011)在水域上的Uplc系统上配备了二进制溶剂交付管理器和样品管理器,配备了配备有电喷雾接口(Waters Corporation,Milford,MA)的水域Micromass Q-Tof Premier质谱仪。简而言之,LC在Syncronis Hilic柱上进行(50×2.1mm,1.7μm)。用200米洗脱柱子m 在30℃下以0.30ml / min的流速在梯度模式下甲酸水溶液和乙腈。 MS使用负极性进行,2.4kV毛细管电压,30 V采样锥,4EV碰撞能量,110°C的源温度,以及350°C的脱溶解温度。 DESOLVATION气体的流速设定为600升/小时。扫描范围设置为M / Z 50~1000,扫描时间为0.3秒,间隙时间为0.02秒。

       酸快STAin

      将MSM菌株生长为对象相,将100μl培养物涂布到载玻片上。将载玻片在100℃下加热2分钟,将10%福尔马林浸入30分钟,使用Tb荧光染色套件(BD,富兰克林湖,NJ)或TB染色试剂盒(BD)染色。制造商的说明。

       生物膜形成

      对于在液体培养基上生长的生物膜培养物,10mL具有90×15mm PVC PVC培养皿中的改性版M63的生物膜培养基,用10μL饱和培养物接种,并在30℃下孵育而没有干扰(
      • Ojha A.
      • 阿兰姆。
      • Bhatt A.
      • 克雷梅勒L.
      • Jacobs JR,W.R.
      • HATFULL G.F.
      GROEL1:在分枝杆菌的生物膜形成过程中涉及霉菌酸生物合成的专用伴侣。
      )。

      结果

       使用MTB彩易福彩组微阵列的KPI全局鉴定

      本研究的整体设计显示在 Fig. 1A。简而言之,该研究由4份:MTB彩易福彩组微阵列和功能性激酶的制备组成(Fig. 1B),在微阵列和验证上筛选KPI(Fig. 1C),生物信息学分析和KPI地图建设(Fig. 1D)和选择,新发现的KPI的功能研究。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1Stpk.-KPI网络建设的工作流程和示例。 A,基于彩易福彩组微阵列的全局STPK-KPIS识别和所有11个StPK的网络结构的一般程序。 B-D.是KPIS研究的一个例子。使用酵母的11个符号的表达和纯化。在自动骨髓化后用抗SER / THR磷酸化抗体验证激酶的活性(B)。在激酶探测后,从MTB彩易福彩组微阵列获得的阳性KPI(C)。使用KPI生成代表网络(D)。
      为了系统地鉴定STPK-KPI,我们使用新构建的MTB彩易福彩组微阵列,其含有4262个独特的MTB蛋白(
      • 邓杰。
      • BI L.
      • 周L.
      • 郭S.J.
      • 弗莱明J.
      • 姜H.W.
      • 周Y.
      • 顾J.
      • 钟Q.
      • 王Z.X.
      • 刘Z.
      • 邓R.P.
      • 高J.
      • 陈T.
      • 李W.
      • 王J.F.
      • 王X.
      • 李H.
      • GE F.
      • 朱G.
      • 张H.N.
      • 顾J.
      • wu f.l.
      • 张Z.
      • 王D.
      • 李Y.
      • 程L.
      • 他X.
      • Tao S.C.
      • 张X.E.
      结核分枝杆菌 proteome microarray for global studies of protein function and immunogenicity.
      )。新鲜制备彩易福彩组微阵列以确保其质量。为了促进表达和纯化,将所有11mTB的STPK克隆到表达载体PEGH-A中,用另外的C末端V5表位。然后通过N-末端GST标签纯化激酶。银染色清楚地表明,所有11个茎秆都具有正确尺寸和成功纯化(Fig. 1B。为了验证表达的激酶是活性的,我们对每个激酶的ATP进行了自动磷酸化测定(
      • leiba J.
      • 康顿K.
      • 巴隆尼亚G.
      • Zanella-Cleon I.
      • K a lscheuer R.
      • 克雷梅勒L.
      • 孕育州S.
      • Molle V.
      结核分枝杆菌 maltosyltransferase GlgE, a genetically validated antituberculosis target, is negatively regulated by Ser/Thr phosphorylation.
      ),也包括没有ATP的控制。然后使用抗丝氨酸/苏氨酸磷酸化抗体读出反应(Fig. 1B。对于来自ATP反应的大部分激酶,与无ATP的反应相比,观察到显着更高的信号,表明纯化的激酶具有良好的活性。对于活性较低的激酶, IE。 PKNF,PKNJ和PKN1,将这些激酶的浓度相对较高用于探测MTB彩易福彩组微阵列。对于每个激酶,我们探测2微阵列,除了没有激酶之外的相同探测过程之后的阴性对照。
      为了鉴定阳性KPI,通过Gene-Pix 6.1提取微阵列结果,并通过旨在测量每个彩易福彩孢子的相对信号强度的算法进行评分。 (
      • 胡斯
      • 谢Z.
      • Onishi A.
      • yu x.
      • 姜L.
      • 林J.
      • Rho H.S.
      • 树林C.
      • 王H.
      • 河东J.s.
      • 长S.
      • 他X.
      • 跋涉H.
      • 黑人S.
      • 钱J.
      • 朱H.
      分析人蛋白-DNA蛋白组揭示ERK2作为干扰素信号传递的转录压缩机。
      )。在每个芯片内的归一化以消除空间伪影之后,如前所述应用于平均强度的四个标准偏差的截止值(
      • 胡斯
      • 谢Z.
      • Onishi A.
      • yu x.
      • 姜L.
      • 林J.
      • Rho H.S.
      • 树林C.
      • 王H.
      • 河东J.s.
      • 长S.
      • 他X.
      • 跋涉H.
      • 黑人S.
      • 钱J.
      • 朱H.
      分析人蛋白-DNA蛋白组揭示ERK2作为干扰素信号传递的转录压缩机。
      )。最后,我们获得了1,027kPis涉及492个彩易福彩的MTB Stpks(Fig. 1D, 补充表S1)。

       Stpks-KPI的系统分析

      初步分析表明,每个激酶的相互作用蛋白的数量范围为49至193,平均每激酶为93个彩易福彩(补充表S1)。更具体地,超过53%(262/492)的彩易福彩特异性与一个激酶,22%(109/492),13%(64/492)和12%(62/492)与之相互作用分别为2,3和3个以上的激酶(补充表S1)。这些结果表明,Stpks不仅具有唯一性,而且还保持某些彩易福彩组的共性,这是先前报道的现象(
      • Ptacek J.
      • Dovgan G.
      • michaud g.
      • 朱H.
      • 朱克。
      • FasoLo J.
      • 郭H.
      • 乔纳G.
      • Breitkreutz A.
      • SOPKO R.
      • McCartney R.R.
      • Schmidt M.C.
      • Rachidi N.
      • 李S.J.
      • Mah A.S.
      • 孟尔。
      • Stark M.J.
      • 斯特恩D.F.
      • deVigilio C.
      • 泰尔斯米
      • 安德鲁斯B.
      • Gerstein M.
      • Schweitzer B.
      • predki p.f.
      • 斯奈德米
      酵母彩易福彩磷酸化的全局分析。
      )。据我们所知,这项研究是MTB Stpks最全面的KPIS研究。为了证明这些StPK的作用,在网络中示出了StPK结合蛋白的功能分集(Fig. 2A),基于与David的信号传导相关的富集的基因本体(分子函数,生物学过程和细胞区间)分组相互作用彩易福彩(
      • 黄,达W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
      )。在生物过程中,最显着的富集组是氧化还原,而其他富集的方法包括基因表达,大分子生物合成和氮化合物代谢过程。去分析还表明膜相关彩易福彩高度富集(p 价值:0.016),涉及84/492。由于11个STPK中的9个是膜蛋白,因此许多相互作用的彩易福彩是相关的膜并不令人惊讶。这些结果表明,StPK在调节细胞代谢和膜相关功能中起重要作用。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2Stpk.结合蛋白在功能上具有多样化。 A,基因本体(GO)分析所有STPK结合蛋白。结果通过Cytoscape进行了可视化 p value <0.05. B,基于功能多样性的StPK分类。通过生物过程分析StPK-KPIS数据库,用r串进行分析,用R语言绘制热线图。
      由于我们拥有最全面的MTB STPK-KPIS集,我们接下来确定我们是否可以根据他们的GO生物过程[GO-BP]分类来分类11个StPK。 Stpks在调节细胞代谢和发展方面具有重要作用,并不令人惊讶的是,Stpks在大分子生物合成过程中具有功能(
      • o'hare h.m.
      • Duran R.
      • Cervenansky C.
      • Bellinzoni M.
      • Wehenkel上午
      • Pritsch O.
      • OBAL G.
      • Baumgartner J.
      • Vialaret J.
      • 约翰逊K.
      • Alzari下午
      蛋白激酶在分枝杆菌中调节谷氨酸代谢。
      ),核酸代谢过程(
      • 邓杰。
      • BI L.
      • 周L.
      • 郭S.J.
      • 弗莱明J.
      • 姜H.W.
      • 周Y.
      • 顾J.
      • 钟Q.
      • 王Z.X.
      • 刘Z.
      • 邓R.P.
      • 高J.
      • 陈T.
      • 李W.
      • 王J.F.
      • 王X.
      • 李H.
      • GE F.
      • 朱G.
      • 张H.N.
      • 顾J.
      • wu f.l.
      • 张Z.
      • 王D.
      • 李Y.
      • 程L.
      • 他X.
      • Tao S.C.
      • 张X.E.
      结核分枝杆菌 proteome microarray for global studies of protein function and immunogenicity.
      )和羧酸代谢过程(
      • MACEK B.
      • Mijakovic I.
      • 奥尔森J.V.
      • GNAD F.
      • Kumar C.
      • Jensen P.R.
      模型芽孢杆菌枯草芽孢杆菌的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷脂体。
      )。意外地,我们的结果还表明,STPK可能涉及响应刺激(
      • 邓杰。
      • BI L.
      • 周L.
      • 郭S.J.
      • 弗莱明J.
      • 姜H.W.
      • 周Y.
      • 顾J.
      • 钟Q.
      • 王Z.X.
      • 刘Z.
      • 邓R.P.
      • 高J.
      • 陈T.
      • 李W.
      • 王J.F.
      • 王X.
      • 李H.
      • GE F.
      • 朱G.
      • 张H.N.
      • 顾J.
      • wu f.l.
      • 张Z.
      • 王D.
      • 李Y.
      • 程L.
      • 他X.
      • Tao S.C.
      • 张X.E.
      结核分枝杆菌 proteome microarray for global studies of protein function and immunogenicity.
      )和基因表达(
      • o'hare h.m.
      • Duran R.
      • Cervenansky C.
      • Bellinzoni M.
      • Wehenkel上午
      • Pritsch O.
      • OBAL G.
      • Baumgartner J.
      • Vialaret J.
      • 约翰逊K.
      • Alzari下午
      蛋白激酶在分枝杆菌中调节谷氨酸代谢。
      )。除了监管中的常见功能外,STPKS基于分层聚类具有多样化的功能,它们分为四个主要课程(Fig. 2B)。在PKNI,PKNF,PKNH和PKNK类中,他们在本土化和运输的函数中富集。同时,另一组PKNB,PKN1和PKNA在调节氨基酸和脂质代谢中起着显着的作用。有趣的是,通过去分析的STPK分类与已知的5种子的STPK的5种分析相似(
      • Narayan A.
      • Sachdeva P.
      • Sharma K.
      • Saini A.K.
      • Tyagi A.K.
      • 辛格y.
      分枝杆菌属的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶:系统发育功能。
      )除了PKNH之外,对PKNK和PKNJ的轻微不一致。例如,在CLADE I(PKNA,PKNB和PKN1)中,已知这些激酶的功能与细胞分裂和生长相关,我们的结果与这些知识一致。

       通过生物层干涉测量(BLI)和酵母 - 双杂交(Y2H)测定验证KPIS

      我们在MTB彩易福彩组微阵列上随机选择了大约80 KPI,用于验证。这组KPI由4个STPK(PKNB,PKND,PKNG和PKNH)和75个相互作用蛋白组成(补充表S2 N-末端GST标记的载体,而4激酶被克隆到C末端6×他的标记向量中,所有彩易福彩均表达 大肠杆菌 并通过亲和纯化分离。经过几轮纯化后,可以溶解所有相互作用的彩易福彩。使用BLI检查纯化的彩易福彩及其相应的相互作用STPK。将清除BLI结合被观察到这些彩易福彩的70%(53/75)(图。 3.A, 3 C3E,补充图。 S2和S3,补充表S2)。 PKNB,PKND,PKNG,PKNH的成功率分别为66%(12/18),77%(14/18),75%(15/20)和63%(12/19)。将RV1827(GARA)包含为阳性对照,因为已知与PKNB结合(
      • Villarino A.
      • Duran R.
      • Wehenkel A.
      • Fernandez P.
      • 英格兰P.
      • BRODIN P.
      • COLE S.T.
      • ZIMNY-ARNDT U.
      • Jungblut p.r.
      • Cervenansky C.
      • Alzari下午
      M.结核蛋白激酶基质的彩易福彩组学鉴定:PKNB通过活化环介导的相互作用来募集含FHA域域的彩易福彩。
      )虽然GST被称为阴性对照(补充图S2)。我们注意到该方法还确定了那些特别强大的相互作用(kd. 价值小于10−7 m)(
      • gowthaman r.
      • 米勒S.A.
      • 罗杰斯S.
      • khowsathit J.
      • LAN L.
      • 白氏
      • 约翰逊D.K.
      • 刘C.
      • 徐L.
      • anbanandam A.
      • Aube J.
      • 罗伊A.
      • K a ranicolas J.
      DARC:通过射线铸造绘制表面形貌,用于在彩易福彩相互作用位点进行有效的虚拟筛选。
      )。通过这种方式,我们发现彩易福彩和StPK之间的许多相互作用确实强烈,包括PKNB - Echa7,PKND - FTSx,PKNG - PhOH2和PNNH-ACCD6。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3通过双层干涉测量和酵母 - 双杂种验证STPK-KPI。 A-B.,BLI验证PKNB的KPI(A)和y2h(B)。 光盘,BLI验证PKND的KPI(C)和y2h(D)。对于BLI,通过在干涉图案中的重合变化来测量结合。对于Y2H,所有菌株都可以在S.D.-LW培养基上生长,而只有阳性菌株可能会在S.D.-Lwha媒体上生长。 “+”表示阳性相互作用,“++”表示强烈的相互作用。 (E)。 BLI和Y2H验证的成功率。共有75千卡通过BLI和Y2H验证了4个代表Stpks, IE。 PKNB,PKND,PKNG和PKNH。
      为了进一步验证KPI,我们将Y2H应用于同一组KPI(补充表S2)作为BLI验证的验证。共有75个基因被成功地构建到携带DNA活化域作为牺牲者的PGADT7载体中。在4个STPK,PKNB,PKND和PKNH中是膜蛋白,而PKNG是A不是。由于已知膜蛋白不适用于传统的Y2H(
      • Uetz P.
      • 爱情L.
      • Cagney G.
      • Mansfield T.A.
      • 犹太森r.s.
      • 骑士J.R.
      • 洛克森D.
      • Narayan V.
      • Srinivasan M.
      • Pochart P.
      • Qureshi-Emili A.
      • 李Y.
      • Godwin B.
      • Conover D.
      • kalbfleisch t.
      • Vijayadamodar G.
      • 杨米
      • 约翰斯顿M.
      • 领域S.
      • Rothberg J.M.
      综合分析酿酒酵母中彩易福彩 - 彩易福彩相互作用。
      ),仅克隆PKNB,PKND和PNNH的激酶活性结构域。具有DNA结合结构域的载体PGBKT7用于将4激酶克隆为诱饵。 Y2H结果表明,y2h可以验证52%(39/75)的KPI(图。 3B., 3D, 和 3E, 补充图S4, 补充表S2)。具体地,PKNB,PKND,PKNG和PNNH的成功率分别为44%(8/18),55%(10/18),70%(14/20)和37%(7/19)(Fig. 3E)。由于可能需要膜结构域以支持激酶主要的正确构象。因此,膜激酶的较低的Y2H成功率可能是因为缺乏支撑膜结构域,与PKNG的缺失相比。 PKND和PKNG的成功率明显高于PKNB和PNKH,有趣的是,在彩易福彩组微阵列上,PKND和PKNG的KPIS信号通常高于PKNB和PNKH。因此,总的来说,来自BLI和Y2H的结果非常一致(Fig. 3E),BLI和Y 2 H成功验证了33种彩易福彩的KPI。为了进一步验证激酶 - 彩易福彩相互作用,施加MDHFR的M-PFC蛋白 - 彩易福彩测定,MDHFR的互补碎片[F1,2]和[F3]的重新组装。将GCN4-GCN4包含为阳性对照。结果清楚地表明,大多数Y2H验证的激酶 - 蛋白对可以在7H10琼脂平板上恢复分枝杆菌生长,进一步证实它们的互动 体内 (补充图S5)。因此,这些发现表明使用彩易福彩组微阵列发现的KPI是可靠的。

       Stpks可以磷酸化它们的许多相互作用的彩易福彩

      众所周知,彩易福彩激酶通常磷酸化其相互作用的彩易福彩(
      • FasoLo J.
      • 八字架A.
      • 太阳m.g.
      • yu h.
      • 陈R.
      • 沙龙D.
      • kim p.m.
      • Gerstein M.
      • 斯奈德米
      通过彩易福彩微阵列鉴定的不同蛋白激酶相互作用揭示了细胞过程之间的新型连接。
      ,
      • Varjosalo M.
      • Keskitalo S.
      • van derogen A.
      • Nurkkala H.
      • vichakevski A.
      • Aeberberold R.
      • Gstaiger M.
      人CMGC激酶组的彩易福彩相互作用景观。
      )。为了测试本研究中发现的STPK-KPI是否也是如此,测试了几种激酶的激酶基质关系(KSRS)。我们调查了与验证(PKNB,PKND,PKNG和PKNH)相同的4个Stpk。选择总共60kPis用于通过质谱法测定磷酸化位点。将所选择的彩易福彩与它们相应的相互作用的STPK和ATP一起温育 体外 磷酸化。表达相互作用的彩易福彩和纯化亲和力 大肠杆菌 使用N末端GST标记。由于这些彩易福彩也可以是内源性磷酸化的,但是对于每个选定的KPI,包括无ATP的对照磷酸化测定。通过将磷酸化位点与ATP且无ATP的反应进行比较,我们发现一些相互作用的彩易福彩实际上是它们相应的STPK的底物和磷酸化肽/非磷酸化肽的比率范围为37%〜75% ,这些结果表明,通过丝氨酸/苏氨酸激酶对这些彩易福彩的强烈磷酸化 体外。具体而言,PKNB,PKND,PKNG和PNNH的成功率为33%(5/15),20%(3/15),20%(3/15)和28%(4/15)(Fig. 4, 补充图S6, 补充表S3)。确认已知的磷酸化位点用于几个基底,例如Echa8和ClPB(
      • 策略S.
      • Dankwa S.
      • 施瓦茨D.
      • Chou m.f.
      • locasale J.W.
      • 康下午
      • Bemis G.
      • 教堂。
      • 斯丁H.
      • Husson R.N.
      Extensive phosphorylation with overlapping specificity by 结核分枝杆菌 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶s.
      )但虽然大多数网站和KSR都是新颖的。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4Stpk.相互作用蛋白也是相应激酶的基板。 通过添加STPK和纯化的相互作用蛋白来进行磷酸化反应。四个代表性的Stpks, IE。 包括PKNB,PKND,PKNG和PKNH,用2个用于每种STPK的2个随机选择的相互作用蛋白进行磷酸化反应。没有ATP的反应也被称为阴性对照。然后进行彩易福彩进行质谱分析以确定磷酸化的丝氨酸/苏氨酸位点。
      交叉谈话在激酶中很常见(
      • 纽曼r.h.
      • 胡锦涛
      • Rho H.S.
      • 谢Z.
      • 树林C.
      • Neiswinger J.
      • 库珀C.
      • Shirley M.
      • 克拉克H.M.
      • 胡斯
      • Hwang W.
      • 河东J.s.
      • 吴G.
      • 林J.
      • 高X.
      • Q.
      • Goel R.
      • 夏S.
      • 吉H.
      • 达尔比k.n.
      • Birnbaum M.J.
      • COLE P.A.
      • Knapp S.
      • Ryazanov A.G.
      • zack d.j.
      • 黑人S.
      • Pawson T.
      • Gingras A.c.
      • Desiderio S.
      • Pandey A.
      • 土耳其人B.E.
      • 张继夫
      • 朱H.
      • 钱J.
      基于人类活动的磷化网络的构建。
      ,
      • 策略S.
      • Dankwa S.
      • 施瓦茨D.
      • Chou m.f.
      • locasale J.W.
      • 康下午
      • Bemis G.
      • 教堂。
      • 斯丁H.
      • Husson R.N.
      Extensive phosphorylation with overlapping specificity by 结核分枝杆菌 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶s.
      )。我们还发现了四个Stpks中的串扰。例如,rmla可以通过pknb和pkng在同一地点进行磷酸化(补充表S3)。我们的数据显示,苏氨酸磷酸化比丝氨酸更丰富,与早期的工作一致(
      • 策略S.
      • Dankwa S.
      • 施瓦茨D.
      • Chou m.f.
      • locasale J.W.
      • 康下午
      • Bemis G.
      • 教堂。
      • 斯丁H.
      • Husson R.N.
      Extensive phosphorylation with overlapping specificity by 结核分枝杆菌 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶s.
      )但在真核生物中,丝氨酸磷酸化可能占全磷酸化位点的80-90%(
      • 曼宁G.
      • 唠叨D.B.
      • 马丁内斯·
      • 猎人T.
      • sudarsanam s.
      人类基因组的蛋白激酶补体。
      )。还鉴定酪氨酸磷酸化,例如通过PKNB的WBBL2(补充表S3),也与以前的工作一致(
      • Kusebauch U.
      • ortega c.
      • ollodart A.
      • 罗杰斯R.S.
      • 谢尔曼D.R.
      • 莫里茨R.L.
      • Grundner C.
      结核分枝杆菌 supports protein tyrosine phosphorylation.
      )。

       重点生物学功能富集在STPK-kpis地图中

      为了系统地理解11 StPK的彩易福彩相互作用,本研究中鉴定的所有KPI均经受进一步的生物信息学分析。所有STPK与其相互作用蛋白之间的关系都显示在用Cytoscape确定的地图中(补充图S7)。大多数功能彩易福彩在地图的内部区域,根据字符串分析(
      • Szklarczyk D.
      • Franceschini A.
      • 蜡厂
      • Forslund K.
      • Heller D.
      • Huerta-Cepas J.
      • Simonovic M.
      • 罗斯A.
      • Santos A.
      • Tsafou K.P.
      • Kuhn M.
      • Bork P.
      • Jensen L.J.
      • von mering c.
      字符串v10:彩易福彩 - 彩易福彩相互作用网络,整合在生命之树上。
      ),而颜色代表不同的生物过程。从该分析来看,我们发现Stpks在代谢过程中发挥着重要作用,并调节许多未知功能的彩易福彩,这可能是发现这些彩易福彩的功能的良好开始。
      许多MTB蛋白的生物学作用根据最新版本的TBDB(
      • 猥亵吉..
      • K a popoulou A.
      • 琼斯L.M.
      • COLE S.T.
      结核小区 - 10年后。
      )。为了以更具生物学上有意义的方式理解KPI地图,选择具有透明功能注释的相互作用蛋白进行进一步分析。只有这些彩易福彩的相应的STPK-KPI进行网络分析,用弦和细胞张表达进行网络分析,并产生紧凑的STPK-KPI网络(Fig. 5)。根据该网络,许多彩易福彩涉及细胞壁脂质生物合成,例如用于肽聚糖(PG)的RMLA,LIPR和FADB2用于氰酸形成,氨基酸代谢酶,如SERS,ARGH,HISH和PROA,核苷酸生物合成包括ADOK,PRYE,EPIA和HPT的过程,这与Stpks在调节细胞生长和划分方面发挥关键作用的概念一致(
      • Parikh A.
      • Verma S.K.
      • 汗科
      • Prakash B.
      • nandicoori v.k.
      PKNB介导的新型底物的磷酸化N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷转移酶,调节其乙酰转移酶活性。
      ,
      • 格里芬J.E.
      • Gawronski J.D.
      • dejesus m.a.
      • Ioerger T.R.
      • Akerley B.J.
      • Sassetti C.M.
      高分辨率表型分析定义了对分枝杆菌生长和胆固醇分解代谢至关重要的基因。
      )。同时,在这些网络中也富集了一些类似MMPL13B,ESPG1和PE-PGRS33等彩易福彩的彩易福彩。此外,该分析鉴定了25个与转录相关彩易福彩,包括三种σ因子(Sigk,Sigf和Siga)和四种双组分系统蛋白(TCSS)(Narl,Regx3,Nusa和RV1816)。这些彩易福彩参与感测各种信号,并使新陈代谢适应环境提示,并在压力期间保持细胞包络的完整性(
      • Barik S.
      • Squka K.
      • Mukherjee P.
      • Basu J.
      • 隆都M.
      RseA, the SigE specific anti-sigma factor of 结核分枝杆菌, is inactivated by phosphorylation-dependent ClpC1P2 proteolysis.
      • hatzios s.k.
      • Baer C.E.
      • Rustad T.R.
      • Siegrist M.S.
      • 庞杰。
      • ortega c.
      • Alber T.
      • Grundner C.
      • 谢尔曼D.R.
      • Bertozzi C.R.
      Osmosensory signaling in 结核分枝杆菌 mediated by a eukaryotic-like Ser/Thr protein kinase.
      ,
      • 公园S.J.
      • kim j.h.
      • Ha T.S.
      • Shin J.I.
      大肠杆菌败血症和系统性狼疮发作之间是否存在联系?评论:重叠青少年特发性关节炎和系统性红斑狼疮:案例报告(Rheumatol Int。2011年5月; 31(5):695-698)。
      )。 STPK可能通过改变彩易福彩转录过程来调节细胞生长和对宿主的反应。令人惊讶的是,还富集了蛋白水解过程的彩易福彩,即CLPB和CLPP。以前的工作表明,完整的CLP复合体系列是不可或缺的 玉米菌菌 growth (
      • vaubourgeix J.
      • 林G.
      • Dhar N.
      • Chenouard N.
      • 江X.
      • Botella H.
      • 卢比尔T.
      • Mariani O.
      • 杨G.
      • Ouerfelli O.
      • 不二人
      • Schnappinger D.
      • 麦金尼J.
      • Nathan C.
      强调分枝杆菌使用伴侣CLPB在细胞内和在细胞之间不可逆转地氧化彩易福彩。
      ,
      • Raju r.m.
      • Jedrychowski M.P.
      • Wei J.R.
      • Pinkham J.T.
      • 公园A.。
      • 奥布莱恩K.
      • REHREN G.
      • Schnappinger D.
      • Gygi S.P.
      • 鲁宾e.j.
      Post-translational regulation via Clp protease is critical for survival of 结核分枝杆菌.
      )。这些结果强烈表明CLP蛋白酶复合物的活性和密切相关的生物学过程可以通过StPK进行紧密调节。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5根据基于STPK-KPI图谱的GO分析,富集了各种生物学功能。 选择具有透明功能注释的百分之百和二十八个Stpks进行彩易福彩进行GO和网络分析。然后使用Cytoscape进一步分析和可视化网络分析结果。
      ATP依赖性MUR连接酶是肽聚糖(PG,细胞壁合成的关键成分)生物合成途径的关键酶。我们的结果包括2个MUR连接酶(即MURC和MURE),表明StPK可以通过与MUR连接酶的相互作用来调节细胞壁合成。
      总之,构建交互映射 玉米菌菌 Stpk允许在STPK-KPI之间准备识别高度连接的相互作用。该网络强调了StPK在调节细胞代谢,生长,划分和蛋白水解方面的重要作用,从而延长了我们对涉及Stpks的临界蜂窝功能范围的理解。

       PKNG通过与MUR连接酶的相互作用来调节细胞壁生物生物发生

      已发现PKNG通过直接干扰主机信令级联来发挥其活动(
      • Walburger A.
      • 熊A.
      • 法拉利G.
      • nguyen L.
      • prescianotto-baschong c。
      • Huygen K.
      • Klebl B.
      • 汤普森C.
      • Bacher G.
      • Pieters J.
      来自致病性分枝杆菌的蛋白激酶G促进巨噬细胞内的存活。
      )。此外,PKNG在调节可能间接影响毒力的谷氨酸代谢过程中(
      • o'hare h.m.
      • Duran R.
      • Cervenansky C.
      • Bellinzoni M.
      • Wehenkel上午
      • Pritsch O.
      • OBAL G.
      • Baumgartner J.
      • Vialaret J.
      • 约翰逊K.
      • Alzari下午
      蛋白激酶在分枝杆菌中调节谷氨酸代谢。
      )。由于其潜在的功能性意义,我们接下来选择PKNG以进行更详细的功能检查。在PKNG相互作用蛋白中,细胞壁生物发生相关彩易福彩高度富集,包括SIGA,SIGF和用于合成细胞壁组分,MURC,MURE,ECHA和FABG的酶(Fig. 5)。 PKNG与MUR连接酶的物理相互作用是新颖的。 Pg作为细菌细胞壁的独特组分,提供了一种刚性支撑件,其使细胞具有其形状并保持其完整性(
      • kieser k.j.
      • Baranowski C.
      • Chao M.C.
      • 长J.E.
      • Sassetti C.M.
      • Waldor M.K.
      • Sacchettini J.C.
      • Ioerger T.R.
      • 鲁宾e.j.
      Peptidoglycan synthesis in 结核分枝杆菌 is organized into networks with varying drug susceptibility.
      )。在 玉米菌菌,MUR连接酶是形成PG的中央酶(Fig. 6A)。 PKNG和MURC的相互作用由BLI成功验证 体外 (Fig. 6B)。并确定了PKNG的Murc磷酸化 体外 (Fig. 6C)。为了进一步验证PKNG与MURC的相互作用 体内,PKNG和MURC在MSM中共用,MURC与C末端标记标签融合。在共表达菌株中存在透明条带,抗PKNG抗体抗体,而使用抗标岛缀合的磁珠()通过免疫沉淀从对照菌株中发现信号(Fig. 6D)。为了进一步探讨Murc和PKNG之间的相互作用的影响,通过质谱法监测Murc对PKNG的过表达,MURC或CORC的过表达的活性和MURC的活性。通过质谱法监测。 Murc催化 l - alanine和udp-murnac到udp-murnac-l - alanine,然后测量衬底 l - alanine和产品Udp-murnac-l - 质谱法通过质谱。 udp-murnac的生产显着增加 - l - 与野生型菌株的PKNG过表达和PKNG和MURC的菌株中的菌株和PKNG和MURC的菌株(Fig. 6E)另外基材 l - alanine在很大程度上被消耗(补充图S8)。这些结果证实,PKNG促进了MURC的活性。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6PKNG通过与Murc的互动来调节Murc酶活性 体内. A,用MUS酶形成PG形成的示意图。 B, 体外 BLI验证PKNG和MURC互动。 C, 体外 PKNG的Murc磷酸化。 MURC和PKNG的纯化在激酶缓冲液中用2:1混合(50米m Tris.HCl, 5 mm MgCl2, 2 mm MnCl2, 1 mm DTT, 5 mm ATP)并在37℃下孵育2小时。 D, 体内 验证PKNG和MURC互动。标记标记MURC和PKNG在MSM与ATC诱导中表达,然后用MURC与MURC相互作用的PKNG使用抗标绳抗体免疫沉淀。抗PKNG和腹股沟抗体是加载对照。 E,PKNG增强了Murc活性。使用UDP-GLCNAC,PEP和PEP和MURC活性测定 l-ala作为基质。这种反应的主要产物,Udp-murnac-l - 通过超级性液相色谱法与质谱法一起测量。
      PG.在稳定细胞壁结构中起重要作用,这是细胞壁外部的氰酸的接头。我们试图通过与Murc的相互作用来确定PKNG是否改变细胞壁生物生物。为了检查PKNG过表达的表型影响,用PKNG过表达的MSM菌株进行培养并进行酸 - 快染料和生物膜形成分析,用空载体作为对照。首先使用Aurmine和Kinyoun染料通过酸快染色分析菌株,并发现随着PKNG过表达,在相同条件下与野生型菌株相比,通过两种染料更容易染色细菌(Fig. 7A)。这表明PKNG可以促进细胞壁的厚度。由于生物膜形成与细胞壁组分的变化密切相关(
      • Ojha A.
      • 阿兰姆。
      • Bhatt A.
      • 克雷梅勒L.
      • Jacobs JR,W.R.
      • HATFULL G.F.
      GROEL1:在分枝杆菌的生物膜形成过程中涉及霉菌酸生物合成的专用伴侣。
      ,
      • K a tsivela E.
      • bonse d。
      • 克鲁格A.
      • STROMP C.
      • Livingston A.
      • Wittich r.m.
      工业废水中1,3-二氯丙烯降解的萃取膜生物膜反应器。
      ),我们接下来测试了PKNG过度表达对生物膜形成的影响。接种两个MSM菌株10时5 CFU,每24小时记录结果。在第2天,MSM细胞增长形成均匀的薄膜。在第3天,表面传统,包括脊和低谷。在第5天,出现了一些让人想起微杉木的小结构。与对照相比,PKNG过度表达的细胞形成了较大的斑块,并且在第3天开始,它们也增长了更快(Fig. 7B)。这些结果强烈表明PKNG可以通过MURC的激活增加细胞壁组分的含量。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7PKNG调节细胞壁形成。 A,对MSM进行酸快染料,具有PKNG过度表达,包括野生型MSM作为阴性对照。在玻璃载玻片上固定培养物后,使用Bd Tb Auramine试剂盒或Kinyoun染色试剂盒在固定涂片上进行酸快染色。 B,生物膜形成。液体空气表面生物膜发育的时间过程。用MSM MC接种含有液体生长培养基的菜肴2155或MSM MC2155-PKNG,并且在30℃下使生物膜在30℃下发生5天。

      讨论

      通过使用我们独特的MTB彩易福彩组微阵列,我们构建了MTB中的完整曲目的最全面的KPI映射。该网络由492激酶相互作用蛋白和1027个二元相互作用组成。相互作用蛋白涉及各种重要的细胞功能,包括脂质生物合成和细胞壁分裂。更详细的功能研究表明,PKNG通过与MURC相互作用来调节MTB细胞壁组合物。
      作为一种强大的工具,彩易福彩组微阵列已经被广泛应用于发现新的彩易福彩 - 彩易福彩相互作用(
      • FasoLo J.
      • 八字架A.
      • 太阳m.g.
      • yu h.
      • 陈R.
      • 沙龙D.
      • kim p.m.
      • Gerstein M.
      • 斯奈德米
      通过彩易福彩微阵列鉴定的不同蛋白激酶相互作用揭示了细胞过程之间的新型连接。
      ,
      • 陈Y.
      • 杨L.N.
      • 程L.
      • 涂点。
      • 郭S.J.
      • Le H.Y.
      • 熊Q.
      • 莫R.
      • 李C.Y.
      • 济杰克斯。
      • 姜L.
      • 黑人S.
      • BI L.J.
      • 朱H.
      • Tao S.C.
      • GE F.
      BCL2相关的奥斯基烯3互乱结果分析揭示了调节蛋白酶体活性的新作用。
      )。它具有与其他技术的几个优点。首先,一旦靶蛋白和微阵列获得,彩易福彩宽的PPI鉴定只需要几个小时。在这项研究中,所有11个Stpks的发现阶段花了不到1周。其次,因为彩易福彩组微阵列上的所有彩易福彩被单独纯化,所鉴定的PPI是直接相互作用。二进制交互也有助于后续验证,正如我们在本研究中所示的那样。
      尽管如此,这种方法的特征可以改善。彩易福彩组微阵列的PPI调查的一个缺点在于它是它是一个 体外 筛选等结合可能是假阳性的。为了排除这种可能性,我们对具有75个相互作用蛋白的四个激酶(PKNB,PKND,PKNG和PNNH)的相互作用进行了基于BLI的动力学分析,以及Y2H验证。我们发现大多数人通过这两种方法成功验证:70%(53/75)和52%(39/75)( 补充表S2), 分别。与用于验证相互作用可靠性的其他技术相比,例如质谱法,这些值低于观察到更稳定的PPI(如抗脂体相互作用)(
      • 黑格尔A.
      • kamburov A.
      • 格罗斯曼A.
      • Sourlis C.
      • Wowro S.
      • Weimann M.
      • 将c.l.
      • Pena V.
      • Luehrmann R.
      • Stelzl U.
      人脾脏的动态彩易福彩 - 彩易福彩相互作用布线。
      )。然而,它比与同步IP测定的其他代表性PPI集报告的验证率相比较(
      • 布劳恩P.
      • 塔森米
      • 德莱兹M.
      • 崎岖杆菌M.
      • lemmens我。
      • yu h.
      • 萨哈莉准。
      • 默里r.r.
      • roncari l.
      • de Smet A.S.
      • Venkatesan K.
      • 有害J.F.
      • Vandenhaute J.
      • Cusick M.E.
      • Pawson T.
      • 山D.E.
      • Tavernier J.
      • Wrana J.L.
      • 罗斯f.p.
      • vidal m.
      实验衍生的二元彩易福彩 - 彩易福彩相互作用的信心评分。
      ,
      • Weimann M.
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      • Oezkan Z.
      • 出生P.
      • Meierhofer D.
      • 贝纳拉斯人n。
      • 瓦洛瓦卡T.
      • Timmermann B.
      • Wanker E.E.
      • Sauer S.
      • Stelzl U.
      Y2H-SEQ方法定义了人蛋白甲基转移酶蛋白酶。
      )。
      在本研究之前,只有一个有关MTB Stpks的系统研究,其中包括其基材(
      • 策略S.
      • Dankwa S.
      • 施瓦茨D.
      • Chou m.f.
      • locasale J.W.
      • 康下午
      • Bemis G.
      • 教堂。
      • 斯丁H.
      • Husson R.N.
      Extensive phosphorylation with overlapping specificity by 结核分枝杆菌 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶s.
      ),少数已知的KPI,例如PKNB和INHA(
      • 汗科
      • Nagarajan S.N.
      • Parikh A.
      • Samantaray S.
      • 辛格A.
      • Kumar D.
      • 罗伊r.p.
      • Bhatt A.
      • nandicoori v.k.
      Enoyl-酰基载体蛋白还原酶Inha的磷酸化影响分枝杆菌生长和生存。
      ),PKND和MMPL(
      • 佩雷斯J.
      • 加西亚R.
      • Bach H.
      • De Waard J.H.
      • Jacobs JR,W.R.
      • AV-Gay Y.
      • Bubis J.
      • Takiff H.E.
      结核分枝杆菌 transporter MmpL7 is a potential substrate for kinase PknD.
      ),pknh和elcom(
      • alderwick l.j.
      • Molle V.
      • 克雷梅勒L.
      • Cozzone A.J.
      • Dafforn T.R.
      • BESRA G.S.
      • 浮动器K.
      分子structure of EmbR, a response element of Ser/Thr kinase signaling in 结核分枝杆菌.
      )。在该研究中,我们确定了492个Stpks结合蛋白,包括已知KPI的21%(6/28),例如KASB,Murc,SaHH,MMPL,DOSR和RV1747。因此,这些KPI中的大多数是新颖的。基于这些互动,我们产生了最全面的,并向我们的知识,是第一个MTB STPK-kpis地图。该网络可以作为未来MTB功能研究的丰富资源。 MTB目前是一个非常糟糕的病原体,1957年,其预测彩易福彩编码基因中的4346个被称为“功能未知”,“假设”或“可能”根据最新版本的TBDB(http://tuberculist.epfl.ch/)。在符号的情况下,只有一些相对良好的研究,包括PKNB,PKND和PKNG,而其他的功能尚不清楚。使用我们的Stpk-kpis网络,我们可以将新功能分配给所学习的Stpks,并识别第一次为潜在的实验基于实验的函数。
      通常发现激酶结合蛋白也是激酶的基质(
      • Varjosalo M.
      • Keskitalo S.
      • van derogen A.
      • Nurkkala H.
      • vichakevski A.
      • Aeberberold R.
      • Gstaiger M.
      人CMGC激酶组的彩易福彩相互作用景观。
      ,
      • Breitkreutz A.
      • Choi H.
      • 莎草J.R.
      • 鲍克尔L.
      • Neduva V.
      • 拉森B.
      • 林Z.Y.
      • Breitkreutz B.J.
      • 斯塔克C.
      • 刘G.
      • Ahn J.
      • 德瓦尔达克D.
      • 温典州T.
      • 唐X.
      • Almeida R.
      • 秦Z.S.
      • Pawson T.
      • Gingras A.c.
      • nesvizhskii a.i.
      • 泰尔斯米
      酵母中的全球蛋白激酶和磷酸酶相互作用网络。
      )。在本作用磷酸肽富集和质​​谱中也发现了这一点,以在与同源激酶孵育后直接鉴定磷酸化的苏氨酸或丝氨酸。其中,在我们的交流剂中存在36种磷酸化彩易福彩,其先前在质谱磷酸化数据库中(
      • 策略S.
      • Dankwa S.
      • 施瓦茨D.
      • Chou m.f.
      • locasale J.W.
      • 康下午
      • Bemis G.
      • 教堂。
      • 斯丁H.
      • Husson R.N.
      Extensive phosphorylation with overlapping specificity by 结核分枝杆菌 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶s.
      )。然而,我们还发现了几种新型磷酸化蛋白,例如pknb, 例如 ECHA7和WBBL2。获得可靠的激酶基质信息是新型调节途径模型的发展中的主要挑战,以阐明菌株生长和免疫的细胞调节。我们的数据强烈建议StPK可以通过磷酸化调节相互作用蛋白的功能。
      这些“真核状”Stpks旨在通过在细菌细胞内发信号通信来发挥生长,毒力,持久性和再活化的基本作用。在我们的互动者列表中,大多数彩易福彩都参与了细胞生长。根据发表的工作,只有少数底物与生长有关,例如PKNB基板,KASA和KASB(
      • Molle V.
      • 布朗A.K.
      • BESRA G.S.
      • Cozzone A.J.
      • 克雷梅勒L.
      The condensing activities of the 结核分枝杆菌 type II fatty acid synthase are differentially regulated by phosphorylation.
      ),PKNA底物inha(
      • 汗科
      • Nagarajan S.N.
      • Parikh A.
      • Samantaray S.
      • 辛格A.
      • Kumar D.
      • 罗伊r.p.
      • Bhatt A.
      • nandicoori v.k.
      Enoyl-酰基载体蛋白还原酶Inha的磷酸化影响分枝杆菌生长和生存。
      )和ftsz(
      • Thakur M.
      • chakraborti p.k.
      由于其通过真核型Ser / Thr激酶,PKNA的转磷酸化,分枝杆菌FTSZ的GTPase活性受损。
      ,
      • Schultz C.
      • Niebisch A.
      • Schwaiger A.
      • viets u.
      • 梅尔伯格S.
      • Bramkamp M.
      丝氨酸/苏氨素蛋白激酶PKNA,PKNB,PKNG和PKN1的遗传和生化分析谷氨酰胺:非基本度的证据和多发性激酶的ODHI和FTSZ磷酸化。
      )和pkng衬底ODHI(
      • Schultz C.
      • Niebisch A.
      • Schwaiger A.
      • viets u.
      • 梅尔伯格S.
      • Bramkamp M.
      丝氨酸/苏氨素蛋白激酶PKNA,PKNB,PKNG和PKN1的遗传和生化分析谷氨酰胺:非基本度的证据和多发性激酶的ODHI和FTSZ磷酸化。
      )。我们的结果指出了PKNG通过与细胞壁相关彩易福彩的相互作用来调节细胞生长的显着作用。
      细胞壁是潜在的药物靶标,因为它在细菌获取或获得基本营养素,持续性,转录调节和能量代谢的能力中起着重要作用(
      • Sharma K.
      • Chopra P.
      • 辛格y.
      Recent advances towards identification of new drug targets for 结核分枝杆菌.
      )。 MTB细胞壁由三个主要成分组成,即PG,AG和MAS。除了与PKNG相互作用的细胞壁相关蛋白外,我们还发现我们的KPIS许多其他彩易福彩,这些彩易福彩涉及细胞壁形成。 UDP-Murnac在UDP-GLCNAC下的PG生物合成的第二步中发挥作用。已经鉴定了该过程中涉及许多酶,包括Mura-B和Murc-F。在这些酶中,已知Murc仅被PKNA磷酸化(
      • FIUZA M.
      • Canova M.J.
      • Patin D.
      • Letek M.
      • Zanella-Cleon I.
      • Becchi M.
      • mateos l.m.
      • Mengin-Lecreulx D.
      • Molle V.
      • GIL J.A.
      肽聚糖生物合成的MURC连接酶是由甘氨酸氨基杆菌的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PKNA调节。
      )。根据我们的结果,我们发现了与激酶相互作用的3个酶(Murc,Mure和Murf),并鉴定了Murc和Mure上的磷酸化位点。 e总之,彩易福彩磷酸化和与Stpks相互作用在调节MTB细胞壁生物合成的关键过程中的重要性,以及这些酶的小分子抑制剂的设计和开发的广泛专业知识,使其具有高度吸引力的新的发展目标抗结核病药剂。
      一起参加,利用我们新建的MTB彩易福彩组微阵列(
      • 邓杰。
      • BI L.
      • 周L.
      • 郭S.J.
      • 弗莱明J.
      • 姜H.W.
      • 周Y.
      • 顾J.
      • 钟Q.
      • 王Z.X.
      • 刘Z.
      • 邓R.P.
      • 高J.
      • 陈T.
      • 李W.
      • 王J.F.
      • 王X.
      • 李H.
      • GE F.
      • 朱G.
      • 张H.N.
      • 顾J.
      • wu f.l.
      • 张Z.
      • 王D.
      • 李Y.
      • 程L.
      • 他X.
      • Tao S.C.
      • 张X.E.
      结核分枝杆菌 proteome microarray for global studies of protein function and immunogenicity.
      ),我们为所有MTB标志构建了第一和最全面的KPIS网络,代表了广泛的生物功能。可以将新的注释分配给几个较差的STPK,例如PKNE参与调节细胞分裂和运输过程,碳水化合物生物合成的PKNI和核苷酸生物合成过程中的PKNJ。我们还添加了良好的STPK的功能作用,例如PKNB在细胞壁形成中,氰酸合成的PKND,以及具有核苷酸生物合成的PKNG,氨基酸合成和脂质生物合成。功能研究表明,其中一个KPI,PKNG和MURC在MTB细胞壁生物合成中起着关键作用。这里产生的STPK-kPIS网络预计将作为旨在描绘MTB途径的规定和功能活动的研究,尚未通过提供有前途的新药靶标的途径的途径和功能性活动。

      数据安全性

      质谱彩易福彩组学数据已被沉积在骄傲档案中(http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/)通过自豪的合作伙伴存储库(
      • VizCaino J.A.
      • 科特兰特。
      • Csordas A.
      • 戴安斯J.A.
      • Fabregat A.
      • 抚养金。
      • 怜悯J.
      • alpi E.
      • Birim M.
      • Contell J.
      • o'kelly g.
      • SchoEnegger A.
      • Ovelleiro D.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • 里奥斯D.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      彩易福彩组学标识(骄傲)数据库和相关工具:2013年的状态。
      )数据集标识符PXD006389和10.6019 / PXD006389。

      致谢

      我们感谢Kaixia Mi博士,Jianping谢博士,Peifu Zhou博士,以及Adrie J. C. Steyn博士提供分枝杆菌蛋白片段互补系统。

      补充材料

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