巨噬细胞迁移抑制因子暴露于TIO的蛋白质组学鉴定2 Particles*

  • myung-hwa cha
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    冬季春海大学医院,令人漏洞大学医院的基因组研究中心,韩国,庆龙岛 - DO 420-853
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  • 太太芦
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    冬季春海大学医院,令人漏洞大学医院的基因组研究中心,韩国,庆龙岛 - DO 420-853
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  • Kyung Hun Kim
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    冬季春海大学医院,令人漏洞大学医院的基因组研究中心,韩国,庆龙岛 - DO 420-853
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  • An-Soo Jang
    一致
    可以解决谁的通信:div。内科冬季医学部的过敏与呼吸系统,凌晨春度大学医院,1174韩国议员,朝鲜共和国。电话:82-32-621-5105;传真:82-32-621-5018
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    冬季春海大学医院,令人漏洞大学医院的基因组研究中心,韩国,庆龙岛 - DO 420-853
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  • 年轻ki paik
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    Yonsei蛋白质组研究中心,首尔,120-749,韩国
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  • Choon-Sik Park
    一致
    可以解决谁的通信:div。内科冬季医学部的过敏与呼吸系统,凌晨春度大学医院,1174韩国议员,朝鲜共和国。电话:82-32-621-5105;传真:82-32-621-5018
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    冬季春海大学医院,令人漏洞大学医院的基因组研究中心,韩国,庆龙岛 - DO 420-853
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  • 作者脚注
    *本研究由韩国卫生部21韩国卫生部第21章研发项目,大韩民国和授予R01授予奖金01-PJ10-PG6-01GN14-0003和03-PJ10-PG6-GP01-0002的支持来自韩国科学与工程基础基本研究计划的-2003-000-0041-0。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
    §这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
      吸入颗粒物质会加剧慢性气道疾病患者的呼吸系统症状,但是这种反应的基础的机制仍然明显。我们使用蛋白质组学方法来检查这种现象。用BSA涂层二氧化钛治疗上皮细胞(TiO2)颗粒在二维凝胶上改变了20个蛋白质斑点,然后通过纳米LC-MS / MS分析这些蛋白质点。这些蛋白质包括与防御相关的,细胞活化和细胞骨骼蛋白,以及对氧化应激的反应有关的细胞骨架蛋白。根据其表达模式的时间过程将蛋白质分为四组。对于验证,对提取物进行RT-PCR体外TIO.2-treated细胞和TiO的肺问题2通过免疫组织化学染色和酶免疫测定分析过的大鼠。 TIO.2发现治疗增加巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的mRNA的量。 MIF主要在上皮中表达,并在肺组织和TiO的支气管肺泡灌洗液中升高2 - 与假处理大鼠相比,治疗大鼠。炭黑和柴油排气颗粒还诱导上皮细胞中MIF蛋白的表达。
      增加流行病学证据表明吸入空气颗粒物质(PM)
      使用的缩写是:PM,颗粒物质; TIO.2, 二氧化钛; 2-D,二维; MIF,巨噬细胞迁移 - 抑制因子; IL,白细胞介素; ROS,反应性氧气物种; GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶; EIA,酶免疫测定; PCNA,增殖细胞核抗原; Vim,Vimentin。
      1使用的缩写是:PM,颗粒物质; TIO.2, 二氧化钛; 2-D,二维; MIF,巨噬细胞迁移 - 抑制因子; IL,白细胞介素; ROS,反应性氧气物种; GAPDH,甘油醛-3-磷酸脱氢酶; EIA,酶免疫测定; PCNA,增殖细胞核抗原; Vim,Vimentin。
      与不良健康结果有关,例如呼吸和心脏死亡率和发病率(
      • 码头D.W.
      • 教皇Sr.,C.A.
      • 徐X.
      • Spengler J.D.
      • 洁具J.H.
      • Fay M.E.
      • Ferris Jr.,B.G.
      • Speizer F.E.
      六个美国城市的空气污染与死亡率之间的关系..
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      • 贝尔米尔。
      • SAMET J.M.
      • 多米尼加F.
      颗粒物的时间序列研究..
      )。慢性阻塞性肺病患者的肺功能在与在低污染区域的区域相比,生活在暴露于高水平的空气污染的社区的患者中下降更快(
      • 教皇C.A.
      • Kanner R.E.
      PM10污染对轻度至中等慢性阻塞性肺病的吸烟者肺功能的急性作用。
      )。环境颗粒的水平也与哮喘的加剧相比呈正相关(
      • 施瓦茨J.
      • 斯莱特D.
      • Larson T.V.
      • Pierson W.E.
      • Koenig J.Q.
      颗粒状空气污染和医院急诊室在西雅图哮喘访问..
      )。在过去十年中,发达国家的空气污染组成从古典类型的1变动,由此组成2 和现代II型的大型粉尘颗粒,其特征在于氮,有机化合物,臭氧和超细颗粒的氧化物(
      • Schafer T.
      • 环J.
      过敏性疾病的流行病学
      )。
      空气颗粒物质的空气动力学直径小于10μm(PM10)是含有硫酸盐的有机和无机化合物和各种金属如铝,钙,铜,铁,铅,镁,钛和锌(
      • 异教徒I.
      • Costa D.L.
      • McGee J.K.
      • 理查兹J.H.
      • 染料J.A.
      金属模仿气道上皮损伤 体外 暴露于犹他州谷环境颗粒物质提取物..
      )。临床上PM10颗粒被认为通过刺激加剧肿瘤患者在易感个体中加剧肺病的介质(
      • 施瓦茨J.
      • 斯莱特D.
      • Larson T.V.
      • Pierson W.E.
      • Koenig J.Q.
      颗粒状空气污染和医院急诊室在西雅图哮喘访问..
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      • Seaton A.
      • 麦肯W.
      • Donaldson K.
      • 戈登D.
      微粒空气污染和急性健康效果..
      )。该假设基于实验证据,即直接滴注或吸入PM10颗粒的滴注,然后在动物模型中进行气道炎症(
      • 李X.Y.
      • 吉尔穆尔第P.S.
      • Donaldson K.
      • 麦肯W.
      自由基活性和颗粒空气污染的促炎作用(PM10) 体内体外..
      )。
      TIO.2 颗粒是在涉及矿物质矿石金红石的破碎和研磨的行业中发现的PM10组件(
      • Templeton D.M.
      钛。
      )。百分之五十的TIO2 - 散步的工人伴有肺功能减少的呼吸症状(
      • 古罗巴德D.H.
      • 精细l.j.
      • 奥利弗C.
      • 伯恩斯坦L.
      • Peters J.M.
      钛金属生产工人肺功能和胸膜疾病的异常。
      )。因为急性和慢性暴露于tio2 颗粒还诱导炎症反应在大鼠的肺泡和肺泡空间中(
      • ahn m.h.
      • 康下午
      • 公园C.S.
      • 公园S.J.
      • rhim t.
      • yoon p.o.
      • 昌H.S.
      • 金S.H.
      • Kyono H.
      • 金克。
      二氧化钛颗粒诱导的狗丝细胞增生:与肥大细胞和IL-13相关联..
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      • 康下午
      • jang A.S.
      • ahn m.h.
      • Shin J.A.
      • kim j.h.
      • 崔Y.。
      • rhim t.y.
      • 公园C.S.
      白细胞介素-25和白细胞介素-13通过肺泡巨噬细胞产生响应粒子。
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      • ghio a.j.
      • effros r.m.
      • Morrisey J.
      • Almagro U.A.
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      二氧化硅或二氧化钛滴注后大鼠羟基自由基生产和肺损伤 体内。.
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      • 汉森J.F.
      • Yuen I.S.
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      • snajdr s.i.
      • Hartsky M.A.
      在大鼠中吸入高浓度的低毒性粉尘导致肺部间隙机制和持续炎症受损。
      ),TiO.2-Treated大鼠是对PM10颗粒的人性上皮反应研究的良好模型。
      这些精细和超细颗粒直接刺激巨噬细胞和上皮细胞,以产生炎症细胞因子,例如肿瘤坏死因子-α,转化生长因子-β1,粒细胞 - 巨噬细胞菌落刺激因子,血小板衍生的生长因子,IL-6和IL-8和反应性氧(ROS)(
      • Becker S.
      • Soukup J.M.
      • gilmour m.i.
      • Devlin R.B.
      城市空气颗粒的刺激人和大鼠肺泡巨噬细胞:对氧化自由基产生和细胞因子生产的影响。
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      • 富士T.
      • Hayashi S.
      • Hogg J.C.
      • 文森特R.
      • 范eeden s.f.
      颗粒物质诱导人支气管上皮细胞中的细胞因子表达。
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      • 汉密尔顿Jr.,R.F.
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      石棉和城市颗粒物质的比较 体外 人肺泡巨噬细胞抗原呈递细胞功能的修饰。
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      • Blackford Jr.,J.A.
      • 琼斯W.
      • Dey R.D.
      • Castranova V.
      大鼠肿瘤,煤,羰基铁或大鼠二氧化钛肿瘤滴注后诱导型一氧化氮合酶基因表达及肺炎的比较..
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      • 李X.Y.
      • 吉尔穆尔第P.S.
      • Donaldson K.
      • 麦肯W.
      体内体外 粒状空气污染的促炎作用(PM10)..
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      • Churg A.
      • 吉尔克斯B.
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      大鼠气管外科植体的纤细和超细二氧化钛诱导纤纤介质。
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      • 范eeden s.f.
      • 晒黑
      • Suwa T.
      • Mukae H.
      • Terashima T.
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      • qui d.
      • 文森特R.
      • Hogg J.C.
      患有暴露于颗粒物气污染物(PM(10))诱导的全身炎症反应的细胞因子..
      )。我们之前报道的是,粒子暴露导致抗原致敏的肺有利于IL-13和IL-25过量生产的TH2环境(
      • ahn m.h.
      • 康下午
      • 公园C.S.
      • 公园S.J.
      • rhim t.
      • yoon p.o.
      • 昌H.S.
      • 金S.H.
      • Kyono H.
      • 金克。
      二氧化钛颗粒诱导的狗丝细胞增生:与肥大细胞和IL-13相关联..
      ,
      • 康下午
      • jang A.S.
      • ahn m.h.
      • Shin J.A.
      • kim j.h.
      • 崔Y.。
      • rhim t.y.
      • 公园C.S.
      白细胞介素-25和白细胞介素-13通过肺泡巨噬细胞产生响应粒子。
      )。然而,尚未进行对通过粒子刺激的上皮细胞产生的介质的综合检查。
      蛋白质组学提供了一种分析表达基因组的独特手段,并且已成功地用于检查细胞水平的氧化应激的产生(
      • 萧G.G.
      • 王米
      • 李恩
      • lo j.a.
      • nel a.e.
      蛋白质组学的用途证明在巨噬细胞系中对柴油机颗粒化学品的分层氧化应激反应。
      )。除了揭示蛋白质修饰外,这种方法还可用于看蛋白质表达水平的变化(
      • Blackford Jr.,J.A.
      • 琼斯W.
      • Dey R.D.
      • Castranova V.
      大鼠肿瘤,煤,羰基铁或大鼠二氧化钛肿瘤滴注后诱导型一氧化氮合酶基因表达及肺炎的比较..
      )。在这项研究中,我们采用了一种蛋白质组学方法,以确定上皮细胞中发生的蛋白质变化,以应对BSA涂层的TiO2 粒子。通过RT-PCR验证二维电泳数据,然后使用动物模型证明数据。

      材料和方法

       细胞培养与T​​IO刺激2 Particles—

      从美国型文化收集(ATCC),Manassas,VA中获得人支气管上皮细胞系(BEA-2B)。将细胞维持在Dulbecco的改性Eagle的培养基/ F-12营养混合物火腿中,含有10%热灭活的胎牛血清,青霉素(100单位/ ml)和37℃的链霉素(100μg/ ml),以5% CO.2 孵化器。对于实验性处理,将BEA-2B细胞接种成T-75组织培养烧瓶(2×105 细胞/ ml)并在RPMI 1640培养基(Invitrogen)中培养,其补充有10%热灭活的胎牛血清,青霉素(100个单元/ ml)和37℃的链霉素(100μg/ ml),在5%的CO以下2。播种后一天,用各种浓度的BSA涂层TiO处理细胞 2 颗粒然后在37℃下在潮湿的CO中培养2 孵化器。精细金红石TiO.2 如前所述制备颗粒(平均直径=0.29μm)(
      • 康下午
      • jang A.S.
      • ahn m.h.
      • Shin J.A.
      • kim j.h.
      • 崔Y.。
      • rhim t.y.
      • 公园C.S.
      白细胞介素-25和白细胞介素-13通过肺泡巨噬细胞产生响应粒子。
      )。

       二维(2-D)电泳和图像分析 -

      通过离心收获BEA-2B细胞,然后破坏含有5米的裂解缓冲液m Tris-HCl(pH 7.4),100米m NaCl,1%Triton X-100和2米m PMSF。细胞裂解物以12,000×离心 g 30分钟,收集上清液级分。使用BCA测定试剂盒(Pierce)测定蛋白质浓度。 Imobiline Drystrips(Amersham Biosciences)用于等电聚焦,其在IPGphor系统(Amersham Biosciences)上用1mg提取的蛋白质进行。在IEF分离后,通过SDS-PAGE在第二维中分离蛋白质。
      对于图像分析,根据制造商的说明,用Coomassie辉煌的蓝色G-250可视化凝胶。用映射模式用图像扫描器(Amersham Biosciences)扫描2-D凝胶。使用ImageMaster 2D 5.0(Amersham Biosciences)执行现货检测和匹配。使用ImageMaster程序分析数字化图像以通过将光学密度集成在光斑区域(点“音量”)和标准化来计算二维点强度。该值被标准化,然后导出到SPSS 8.0以进行统计分析。

       纳米LC-MS / MS和数据库搜索的蛋白质识别 -

      差异表达的蛋白质斑点(参见细节的统计分析)从2-D凝胶切割成较小的块,并如前所述用胰蛋白酶(Promega)消化(
      • 舍甫琴科A.
      • 威尔m。
      • vorm o.
      银染料聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的质谱测序。
      )。使用Agilent纳米射线蛋白质组学溶液进行所有LC-MS / MS实验,其具有用于通过正交纳米普通离子源耦合到Agilent 1100系列LC / MSD捕集XCT离子阱质谱仪的MS / MS的Agilent 1100系列纳米-LC系统。纳米LC系统用Zorbax300β-C18富集柱(0.3×50mm,5μm)在样品富集/脱盐模式中操作。使用Zorbax 300sb-C18(75-μm×150mm)纳米柱进行色谱法。用梯度从梯度开始洗脱,从等于3%溶剂B(乙腈中0.1%甲酸)和97%溶剂A(0.1%甲酸在水中)5分钟。然后将梯度混合物在5分钟内(从5至10分钟)改变为10%B,以45%B超过45%B(10-50分钟),至90%B(等物)5分钟(55-60分钟),并在1分钟内(60-61分钟),最后用3%B洗涤10分钟。
      LC / MSD陷阱XCT在独特的肽扫描自动MS / MS模式下操作。电离模式是具有安蛋白正交源的正纳米电子涂布。在300℃的温度下,干燥气体在5升/分钟下流动。 VCAP通常为1800-1900V,在30V下略微1,毛细管出口在75 V时偏移。陷阱驱动器设定为85 V,平均为一两个。离子电荷控制在最大累积时间为150ms,智能目标为125,000,MS扫描范围为300-2200。在超自然模式下进行自动MS / MS,具有父母2的数量,平均为2,碎片幅度为1.15 V,SmartFrag ON(30-200%),主动排除(在两个光谱后1分钟后),更喜欢+ 2 ON,MS / MS扫描范围为100-1800,而UltraScan On。使用Spectrum Mill软件对非冗余蛋白序列数据库进行搜索每个获取的MS / MS谱。

       半定量RT-PCR-

      从2×10分离出总RNA7 根据制造商的说明,使用Trizol试剂(Invitrogen)培养的BEA-2B细胞。为了从样品中消除基因组DNA,将DNase I处理(QIAGEN)包含在RNA分离程序中。使用上标II试剂盒(Invitrogen)制备cDNA,并用作PCR分析基因表达的模板。使用Genefisher软件设计用于所选基因的引物和探针(
      • Giegerich R.
      • 迈耶F.
      • Schleiermacher C.
      Genefisher-软件支持检测假设基因..
      )。使用以下引物序列(显示5'→3'):甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH):CGTCT TCACC ACCAT GGAGA(前进)和CGGCC ATCAC GCCAC AGTTT(反向); Transaldolase(Taldo1):Ctaca Aggaa GCTGG GATC(前进)和CAACC AACGG AAAGA CTTC(反向);氯化物细胞内通道1(CLIC1):CAATG TTACC ACCGT TGAC(正向)和TAGGC ATTGC TCAAG TAC(反向);巨噬细胞迁移抑制因子(MIF):CCATC ATGCC GATGT TC(前进)和CGAAG GTGGA GTTGT TC(反向)。在六种独立的BEA-2B细胞培养物中测量基因表达,并一式两份进行所有测量。

       MIF.表达的Western印迹分析 -

      在20μg/ ml TiO的存在下培养BEA-2B细胞2,炭黑或柴油排气颗粒8或48小时。如上所述获得粗细胞提取物,如上所述,对于2-D电泳,并且根据拖布方法进行蛋白质印迹分析 等等。 (
      • 拖布H.
      • Staehelin T.
      • 戈登J.
      聚丙烯酰胺凝胶中蛋白质的电泳转移到硝酸纤维素片:程序和一些应用..
      )。蛋白质由15%SDS-PAGE分馏并转移到硝酸纤维素膜(Amersham Biosciences)中。在含有1%BSA的PBS中封闭膜1小时,然后在室温下与多克隆大鼠抗人MIF抗体(1:2000稀释)孵育2小时。除去未结合的初级抗体,在含有0.01%(v / v)的非型p-40的PBS中用三种10分钟洗涤。然后将膜与过氧化物酶 - 缀合的抗大鼠IgG(Sigma)一起温育30分钟。 MIF的ECL检测是根据制造商的指示(Roche应用科学)进行的。

       TIO.肺组织MIF表达分析2 - 通过免疫组织化学染色和eia-的大鼠

      一个tio.2 - 如我们以前的出版物所述制备的制备的大鼠模型(
      • ahn m.h.
      • 康下午
      • 公园C.S.
      • 公园S.J.
      • rhim t.
      • yoon p.o.
      • 昌H.S.
      • 金S.H.
      • Kyono H.
      • 金克。
      二氧化钛颗粒诱导的狗丝细胞增生:与肥大细胞和IL-13相关联..
      ,
      • 康下午
      • jang A.S.
      • ahn m.h.
      • Shin J.A.
      • kim j.h.
      • 崔Y.。
      • rhim t.y.
      • 公园C.S.
      白细胞介素-25和白细胞介素-13通过肺泡巨噬细胞产生响应粒子。
      )使用7周龄的男性Sprague-Dawley大鼠。大鼠收到4毫克TiO2 通过腹腔内滴注或假处理在0.2ml无毒素的水中。进行免疫组织化学以检查MIF的分泌。用0.3%H处理四微米组织段载玻片2O2 - 甲烷醇30分钟阻断内源过氧化物,然后与生物素化的抗山羊MIF抗体(1:100稀释,Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA)孵育过夜。用Tris缓冲盐水洗涤后,将载玻片与抗生物素蛋白 - 生物素过氧化物酶复合物(ABC试剂盒,载体实验室,伯格拉姆,CA)一起温育。通过用3,3'-二氨基苯并氯化氨酸(Zymed Laboratories Inc.,San Francisco,CA)染色来开发颜色。
      TIO.支气管肺泡灌洗液中MIF蛋白的量2 - 或假处理的大鼠由EIA测定。所有EIA程序根据制造商的协议(Chemicon International,Inc。)进行。测定间方差的间隙系数小于10%。

       统计分析-

      使用SPSS 8.0软件进行统计分析。使用非参数kruskal-wallis在三个独立组或样品之间比较了2-D凝胶上点强度的差异 H 测试连续数据。如果发现差异显着,曼恩惠特尼 U 将测试(两种样品秩和测试)应用于两组密度和MIF浓度的差异。所有数据都表示为中位数(间隔率范围),并且定义了重要性 p < 0.05.

      结果

       2-D电泳和蛋白质识别 -

      用20μg/ mL BSA涂覆的TiO在处理BEA-2B细胞系后,确定蛋白质组学方法来确定蛋白质的蛋白质蛋白质的差异表达2 粒子。通过差动离心获得细胞溶质级分,然后在每次处理的六个重复凝胶中分离2-D电泳。处理前的BEA-2B细胞蛋白质组学分布的代表性图像 Fig. 1。在每个凝胶上检测到总共650(中位数,652;范围,635-693)蛋白质点。所有已识别的斑点都在PI 3-10范围内定位,分子量范围为10-150kDa。该2-D凝胶图像用作主凝胶和参考图。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1BEA-2B细胞裂解物蛋白的二维电泳。 由未处理细胞的裂解物的2-D页面图像用作主凝胶和参考图。 TIO.2 治疗引起20个斑点在8或48小时的8或48小时变化超过2倍。 MALDI-TOF MS识别的蛋白质点()标志着他们 发现数字.
      从TIO的2-D.提取物2-Treated细胞显示出在处理后8或48小时的20倍以上改变的20个斑点。这些斑点从凝胶中切除并与胰蛋白酶一起孵育,以通过LC-MS / MS分析凝胶中的蛋白质。该分析的结果总结在 表I..
      T有能力的 I由LC-MS / MS分析鉴定的蛋白质列表
      不。蛋白质名称缩写加入否。氨基酸序列PI /分子量(DA)
      第1组
      1ATPase,H.+-Transporting.ATP6V1B2.19913428(k)avvqvfegtsgidak(k)5.4 / 55,401.6
      2角蛋白6a.K6A15559584(k)adtltdeinflr(a)8.09 / 60,018.2
      3巨噬细胞迁移 - 抑制因子MIF.30583135(k)llcgllaer(l)7.73 / 12,476.4
      第2组
      4热休克60-KDA蛋白1HSPD131542947(k)vgevivtkdddamllk(g)5.7 / 61,055.0.
      5ruvb样2RUVBL25730023(r)alesdmapvlimatnr(g)5.49 / 51,156.8
      6增殖细胞核抗原PCNA.33239451(r)dlshigdavviscak(d)4.57 / 28,769.0
      7Transaldolase 1TALDO116307182(k)Alagcdfltispk(L)9.07 / 35,329.0
      8氯化物细胞内通道1CLIC114251209(k)Laalnpesntagldifak(F)5.09 / 259,229
      第3组
      9复制许可因子MCM7MCM720981696(r)tqrpadvifatvr(e)6.08 / 81,281.4
      10卡尔皮恩1CAPN112408656(r)dmetigfavyevppelvgqpavhlkr(d)5.49 / 81,890.5.
      11核糖核酸酶/血管生成素抑制剂RNH115029922(k)elslagnelgdegar(L)4.83 / 48,368.0
      12vvim.62414289(k)fadlseaanr(n)5.00 / 52,438.6
      1326 S蛋白酶体亚基9PSMD92150046(r)diqendeeavqvk(e)6.08 / 47,448.0
      14肌动蛋白相关蛋白2ACTR215778930(k)Hivlsggstmypglpsr(L)6.29 / 44,761.0
      1526秒的蛋白酶组合PAD1同源物PSMD145031981(r)avavvvdpiqsvk(g)6.06 / 34,577.3.
      第4组
      16PRP19 / PSO4前mRNA处理因子19同源物PRP197657381(r)qelshalyqhdaacr(v)6.14 / 55,181.1.
      17核糖体蛋白P0.RPLP012654583(k)Tsffqalgittk(i)5.42 / 34,274
      18热休克27-KDA蛋白1HSPB14504517(r)lfdqafglpr(l)5.98 / 22,782.6
      19磷酸甘油酸酯酸酯1PGAM138566176(r)vliaahgnslr(g)6.68 / 28,520.1.
      20血小板活化因子乙酰水溶液pafah1b3.4505587(r)vvvlgllpr(g)6.33 / 25,734.4

       聚类分析-

      20个蛋白质的表达谱具有重要意义(p <0.05)使用分层聚类算法可视化差异表达式(DCHIP软件(
      • 李C.
      • 黄W.H.
      基于模型的寡核苷酸阵列分析:表达指标计算和异常检测。
      )))。可以从集群中识别出四种基本型材模式:不断增加(图2A, 第1组),瞬时增加(图。2B, 第2组),持续减少(图2C., 第3组),瞬时减少(图2D, 第4组)。总结了每组中的蛋白质 表I.。 H.+-Transporting ATPase(ATP6V1B2),角蛋白6a(K6a)和MIF组在第1组中包含.60-KDA热休克蛋白1(HSPD1),Ruvbl2 ATP酶/螺旋酶,增殖细胞核抗原(PCNA),Taldo1,和Clic1在组中,CAM7,CALPAIN 1(CAPN1),核糖核酸酶/血管生产病菌抑制剂(RNH1),VIMENTIN(VIM),26秒蛋白酶体亚基9(PSMD9)和肌动蛋白相关蛋白的连续减少3. PRP19 / PSO4前mRNA处理因子19同源物(PRP19),核糖体蛋白P0(RPLP0),27-KDA热冲击蛋白1(HSPB1),磷酸性蛋白酶1(PGAM1)和血小板活化的瞬时降低在第4组中观察到因子乙酰水溶液,同种型IB(PAFAH1B3)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2具有重要差异表达20蛋白的聚类分析(>2倍的变化)由TiO引起的8或48小时2 治疗BEA-2B上皮细胞。 通过聚类分析对单个蛋白质的表达谱进行分类。每个群集都会显示蛋白质名称(国家生物技术信息(NCBI))。

       通过TiO治疗增加MIF mRNA的表达2 Particles—

      通过半定量的RT-PCR评估一种上调蛋白(MIF)和两个瞬时诱导蛋白质(TALDO1和CLIC1)的mRNA表达水平。使用GAPDH mRNA的表达作为对照。如图所示 Fig. 3,用TiO治疗后,MIF mRNA表达在8和48小时内增加2 粒子。在对GAPDH mRNA表达的归一化之后,TALDO1和CLCA1 MRNA的数据没有揭示重大变化。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3塔尔多1,CLIC1和MIF mRNA表达的半定量RT-PCR分析。 在用TIO刺激的BEA-2B细胞的提取物中估计了TALDO1,CLIC1和MIF的mRNA水平2 particles (20 μg/105 细胞)。通过密度测定法测定表达水平并标准化为GAPDH mRNA的水平。

       鉴定TIO中的MIF表达上皮细胞2 - 治疗大鼠肺 -

      确定后肺组织中的MIF表达是否升高 体内 stimulation with TiO2 颗粒,我们灌输了TiO2 如前所述的大鼠中的颗粒(
      • ahn m.h.
      • 康下午
      • 公园C.S.
      • 公园S.J.
      • rhim t.
      • yoon p.o.
      • 昌H.S.
      • 金S.H.
      • Kyono H.
      • 金克。
      二氧化钛颗粒诱导的狗丝细胞增生:与肥大细胞和IL-13相关联..
      )。通过免疫组织化学染色检查MIF蛋白在颅内支气管中的表达。盐水滴注后四十八小时,未检测到MIF蛋白质(图4A, 剩下),但滴注TIO后48小时2 在支气管和支气管的上皮细胞中检测到颗粒,MIF(图4A, 正确的)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4MIF.在TIO的肺组织中的表达2-Treated和假处理的大鼠。A,来自Tio的肺组织2-treated(下面的面板)和假处理(上面面板)将大鼠与生物素化的抗山羊MIF抗体(1:100稀释)一起温育。使用抗毒素 - 生物素过氧化物酶复合试剂盒检测MIF,并用3,3'-二氨基苯并丁烷四氯化氨酸(Zymed Laboratories Inc.)用苏木精染色作为占有杂志。 MIF蛋白表达在肺上皮层中显着较高( )来自Tio.2 - 从虚张理的大鼠那里的治疗大鼠。 B,Sham-或TiO的肺细胞提取物的Western印迹分析2-treated大鼠。来自TIO的肺细胞中的MIF表达2 - 来自来自假处理大鼠的肺细胞中的大鼠高等大鼠。 尺度条,100μm。
      假手和TiO的匀浆蛋白质印迹分析2-Treated大鼠肺裂解物(100μg蛋白质/泳道)表明,来自TIO的肺部MIF蛋白显着增加 2 - 从未经处理的大鼠比较大鼠(图4B.)。当MIF浓度在假和TIO的支气管血管灌洗液中测量时2 - 用ELISA的治疗大鼠,它们在后一种比前者在后面显着更高(Fig. 5)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5TIO.中支气管肺泡灌洗液中MIF水平的比较2 - 和假处理的大鼠(n = 8 for each group). 所示值表示平均值±S.E.每组。

       BEA-2B细胞生产MIF蛋白质,用不同类型的粒子刺激 -

      确定上皮细胞对TIO的响应的特异性2 用20μg/ ml TiO处理颗粒,BEA-2B细胞处理2,炭黑或柴油排气颗粒作为兴奋剂。在细胞裂解物的蛋白质中,MIF信号强度在刺激TIO后在8和48小时内增加2,用炭黑或柴油排气粒子刺激后观察到类似的变化模式(Fig. 6)。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6用20μg/ mL TiO刺激的BEA-2B细胞细胞质级分中MIF蛋白的蛋白质印迹检测2, 碳黑 (CB.)或柴油排气粒子()8和48小时。

      讨论

      虽然含有重质金属环境颗粒的空气污染增加了慢性气道疾病患者的发病率和死亡率(
      • 教皇C.A.
      • Kanner R.E.
      PM10污染对轻度至中等慢性阻塞性肺病的吸烟者肺功能的急性作用。
      ,
      • 施瓦茨J.
      • 斯莱特D.
      • Larson T.V.
      • Pierson W.E.
      • Koenig J.Q.
      颗粒状空气污染和医院急诊室在西雅图哮喘访问..
      ),颗粒状诱导的气道阻塞的机制细节不明白。上皮细胞,其是要暴露于吸入颗粒的第一类细胞,通过产生几种细胞因子,趋化因子和小分子介质来响应颗粒暴露,导致气道炎症和其他生理变化(
      • Templeton D.M.
      钛。
      ,
      • 古罗巴德D.H.
      • 精细l.j.
      • 奥利弗C.
      • 伯恩斯坦L.
      • Peters J.M.
      钛金属生产工人肺功能和胸膜疾病的异常。
      ,
      • ahn m.h.
      • 康下午
      • 公园C.S.
      • 公园S.J.
      • rhim t.
      • yoon p.o.
      • 昌H.S.
      • 金S.H.
      • Kyono H.
      • 金克。
      二氧化钛颗粒诱导的狗丝细胞增生:与肥大细胞和IL-13相关联..
      )。然而,缺乏对颗粒的上皮细胞反应的整体模式的清晰图像。为了更好地理解这种反应的分子发病机制,我们采用了蛋白质组学方法。使用2-D电泳作为筛选工具,我们能够识别几种在未经处理的和TiO中表现出差异表达的蛋白质2-Treated Beas-2b细胞 体外然后,我们在转录层面上验证了这一结果,并在 体内 模型。我们认为,本报告是第一个使用蛋白质组学发展的单一地图,显示在用颗粒物质刺激后在上皮细胞的细胞质中差异表达的蛋白质。
      我们之前发表过的(
      • 康下午
      • jang A.S.
      • ahn m.h.
      • Shin J.A.
      • kim j.h.
      • 崔Y.。
      • rhim t.y.
      • 公园C.S.
      白细胞介素-25和白细胞介素-13通过肺泡巨噬细胞产生响应粒子。
      )和未发表的
      M.-h. Cha,T. rhim,K. H. Kim,A.-S. jang,y. -k。 Paik和C.-s.公园,未发表的数据。
      流式细胞术数据表明,TIO后8小时的侧散射的值表明内吞作用最大2 治疗并返回48小时内的碱基水平。 TiO的最佳浓度2 对于这种效果为每10次为20μg/ ml5 细胞(数据未显示)。支气管上皮细胞的凋亡在至少10μg/ ml的浓度下发生(
      • 李恩
      • 王米
      • oberley t.d.
      • Sempf J.M.
      • nel a.e.
      有机柴油机排气颗粒化学品在支气管上皮细胞和巨噬细胞中的促氧化和促炎效应的比较。
      )。因此,我们治疗了105 BEA-2B细胞8和48小时,具有20μg/ ml TiO2,柴油排气或炭黑颗粒。
      确定颗粒对上皮细胞的影响的因素之一是氧化应激(
      • 李X.Y.
      • 吉尔穆尔第P.S.
      • Donaldson K.
      • 麦肯W.
      自由基活性和颗粒空气污染的促炎作用(PM10) 体内体外..
      ,
      • Templeton D.M.
      钛。
      ,
      • 康下午
      • jang A.S.
      • ahn m.h.
      • Shin J.A.
      • kim j.h.
      • 崔Y.。
      • rhim t.y.
      • 公园C.S.
      白细胞介素-25和白细胞介素-13通过肺泡巨噬细胞产生响应粒子。
      ,
      • 沙拉那里
      • ghio a.j.
      • effros r.m.
      • Morrisey J.
      • Almagro U.A.
      • 道森C.A.
      • 黑客A.D.
      二氧化硅或二氧化钛滴注后大鼠羟基自由基生产和肺损伤 体内。.
      )。细胞稳态取决于正在进行的ROS和抗氧化剂防御之间的平衡。当ROS生产压倒抗氧化防御系统时,发生氧化应激(
      • Bowler R.P.
      • Crapo J.D.
      过敏性呼吸系统疾病中的氧化胁迫..
      )。氧化应激可以引发一系列细胞反应,其效果范围从保护性造成伤害;更具破坏性的反应包括启动炎症和程序性细胞死亡的激活。微粒暴露更可能是支气管上皮细胞的细胞毒性,而不是巨噬细胞(
      • 李恩
      • 王米
      • oberley t.d.
      • Sempf J.M.
      • nel a.e.
      有机柴油机排气颗粒化学品在支气管上皮细胞和巨噬细胞中的促氧化和促炎效应的比较。
      )。有趣的是,我们鉴定为受TiO的影响的20个蛋白质2 基于其已知功能可以合理地将颗粒暴露分为三类:防御相关的蛋白质,细胞活化蛋白和细胞骨架蛋白,所有这些蛋白质可以与对氧化应激的反应相关联。
      Taldo1是磷酸磷酸盐途径的必需酶,产生降低等同物,以保护由于反应性氧中间体引起的损伤免受损伤的直接性(
      • 银行K.
      • 休闲E.
      • gonchoroff n.j.
      • Perl A.
      艾滋病毒诱导的细胞凋亡中的分子序排序。氧化应激,胱天蛋白酶的活化和细胞存活是调节酶的调节。
      )。 TiO的效果2 对PGAM1的表达谱的处理,糖酵解途径的酶,与其对Taldo1蛋白的影响相反。治疗后八小时,Taldo1表达增加,而PGAM1表达减少,治疗后48小时,前者降低,后者增加了。这些数据表明,上皮细胞利用葡甘油生成的机械,以防止颗粒后颗粒的有害作用,并且糖酵解途径越过葡糖生成在暴露后的后续时间。
      ATP6V1B2.,真空ATPase的组分,介导真核细胞内细胞器的酸化,这是蛋白质分选,酶活性,受体介导的内吞作用,并且通过突触囊泡产生质子梯度的产生(
      • Nishi T.
      • arageac m.
      真空(h+) - 自然最通用的质子泵..
      )。在我们的研究中,ATP6V1B2的水平持续增加,表明这些细胞内方法中的至少一些是积极持续的。
      防御相关热休克蛋白Hspd1和Hspb1的水平(
      • Alexandrov P.N.
      • 赵玉。
      • pogue a.i.
      • Tarr M.A.
      • Kruck T.P.
      • Percy M.E.
      • Cui J.G.
      • Lukiw W.J.
      铁和铝对原发性人神经细胞应激相关基因表达的协同作用..
      ,
      • Pfister G.
      • stroh c.m.
      • Perschinka H.
      • kind
      • Knoflach M.
      • hinterdorfer p.
      • 威克G.
      用原子力和共聚焦显微镜检测应激人内皮细胞膜表面上的HSP60。
      )分别在暴露后8和48小时增加。该结果可能是通过几种不同的热休克蛋白对抗氧化应激的增强防御的指示。由于氧化应激而产生的氧化蛋白质衍生物倾向于聚集,这些聚集体的积累可能导致细胞死亡(
      • Poppek D.
      • 文格T.
      氧化蛋白修饰的蛋白酶体防御..
      )。为了防止这种发生,选择性地识别氧化蛋白以及改性核苷酸,并被蛋白质组途径修复或降解(
      • Poppek D.
      • 文格T.
      氧化蛋白修饰的蛋白酶体防御..
      )。 26 s蛋白质组亚基9(PSMD9)和26秒的蛋白质组相关PAD1同源物(
      • 姚T.
      • 科恩r.e.
      隐秘蛋白酶对蛋白酶组合脱氮和降解。
      )用TiO刺激细胞后持续减少2 颗粒,表明某些防御机制可能在颗粒暴露后分解。
      CAPN1,VIM和肌动蛋白相关的蛋白2(ACTR2)对于细胞结构和运动是必不可少的,在细胞迁移和分化中发挥关键作用(
      • Potter D.A.
      • Tirnauer J.s.
      • janssen r.
      • 克罗尔D.E.
      • 休斯C.N.
      • FIACCO K.A.
      • 米尔J.W.
      • Maki M.
      • 赫尔曼伊。
      Calpain在细胞扩散过程中调节Actin改造..
      ,
      • 哎呀B.
      • Colucci-Guyon E.
      • 斯莫达H.
      • 罗德斯。
      • 巴比斯C.
      • Krieg T.
      • 马丁P.
      胚胎和成人小鼠缺乏平衡的伤口愈合受损..
      ,
      • Machesky L.M.
      • Reeves E.
      • Wientjes F.
      • mattheyse f.j.
      • Grogan A.
      • totty n.f.
      • 伯灵名A.L.
      • Hsuan J.J.
      • Segal A.W.
      哺乳动物肌动蛋白相关的蛋白2/3复合物定位于层叠突起的区域,由进化保守的蛋白质组成。
      );他们还防止细胞免受氧化应激(
      • Dalle-Donne I.
      • 罗西R.
      • Milzani A.
      • Di Simplicio P.
      • 科伦坡R.
      对氧化剂的肌动蛋白细胞骨架反应:从小的热休克蛋白磷酸化到肌动蛋白本身的氧化还原状态的变化。
      )。这些蛋白质的时间依赖性降低表明上皮细胞在用TiO刺激后失去了细胞内配套结构2。响应于压力刺激的诸如伤害的压力刺激(
      • WOJCIK S.M.
      • Bundman D.S.
      • roop d.r.
      角蛋白6a敲除小鼠延迟伤口愈合..
      )。因为一个tio.2 刺激可以诱导脚卵细胞或上皮细胞的表型变化(
      • ahn m.h.
      • 康下午
      • 公园C.S.
      • 公园S.J.
      • rhim t.
      • yoon p.o.
      • 昌H.S.
      • 金S.H.
      • Kyono H.
      • 金克。
      二氧化钛颗粒诱导的狗丝细胞增生:与肥大细胞和IL-13相关联..
      ),TiO2 - 诱导这些蛋白质的增加可以理解为表型的总体变化的一部分。 RNH1和RPLP0蛋白对MRNA营业额的控制至关重要(
      • Zneimer S.M.
      • Crawford D.
      • 施耐德N.R.
      • 贝德勒B.
      将人核糖核酸酶抑制剂基因(RNH)定位为染色体11p15 原位 hybridization..
      ),Ruvbl2和MCM7蛋白质应对应力并参与DNA损伤的修复(
      • CHO S.G.
      • 河源A.
      • Broday L.
      • 伊万诺夫V.
      • 罗森斯坦B.
      • ronaiz.
      TIP49B,一种激活转录因子2的调节剂对应力和DNA损伤的反应。
      ,
      • Tsao C.C.
      • Geisen C.
      • 亚伯拉罕·克拉特。
      复制检查点信令需要人MCM7和RAD17蛋白之间的相互作用。
      )。因此,在颗粒暴露后观察到这些蛋白质水平的变化可能表明暴露破坏转录,翻译和细胞活化。
      基于我们的蛋白质组学数据,我们推测氧化蛋白的蛋白水解,或抗氧化剂活性,Taldo1,ATP6V1B2,HSPD1,HspB1,PSMD9和PoH1蛋白是抗氧化应激的初始防御的一部分。如果这些抗氧化和排毒机制未降低氧化应激,则会发生更具破坏性的反应,包括引发炎症和程序性细胞死亡的激活。此外,颗粒暴露可以改变RNH1,RPLP0,Ruvbl2和MCM7基因的表达,从而影响转录,翻译和细胞活化作为愈合或凋亡过程的一部分。因此,上皮细胞可以开始表达与表型变化有关的基因,例如PCNA,CLIC1和K6a的基因。随着所有这些过程进行,上皮细胞合成炎症介质,如pafah1b3和mif(
      • nothwang h.g.
      • 金H.G.
      • Aoki J.
      • Geisterfer M.
      • Kubart S.
      • Wegner R.D.
      • van Moers A.
      • Ashworth L.K.
      • 哈夫T.
      • 贝尔J。
      • ARAI H.
      • Tommerup N.
      • 绳索H.H.
      • WIRTH J.
      pafah1b3.的功能性嗜血体因女性迟滞的雌性PAFAH1B3-CLK2融合基因,Ataxia和脑萎缩。
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      • 伯纳赫·J.
      • 卡兰拉T.
      • Mitchell R.A.
      • 马丁斯。
      • Tracey K.J.
      • Vopert W.
      • Manogue K.R.
      • Cerami A.
      • Bucala R.
      MIF.是一种垂体衍生的细胞因子,其增强了致命的内毒性血症..
      )。我们没有评估这些蛋白质表达的改变是否特异于颗粒状暴露。据我们所知,本发明研究提供了关于上皮对颗粒的响应的第一组高级和综合数据。
      在我们识别的20个蛋白质中,我们选择了三个,Taldo1,MIF和Clic1,因为这些蛋白质参与了代谢和炎症(
      • 银行K.
      • 休闲E.
      • gonchoroff n.j.
      • Perl A.
      艾滋病毒诱导的细胞凋亡中的分子序排序。氧化应激,胱天蛋白酶的活化和细胞存活是调节酶的调节。
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      • 伯纳赫·J.
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      • Mitchell R.A.
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      MIF.是一种垂体衍生的细胞因子,其增强了致命的内毒性血症..
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      • Valenzuela S.M.
      • 马丁D.K.
      • POR S.B.
      • 罗宾斯金。
      • 沃尔顿K.
      • bootcov m.r.
      • Schofield P.R.
      • 坎贝尔T.J.
      • Breit S.N.
      细胞核氯离子通道的分子克隆和表达..
      )。确定TIO的效果2 在转录或翻译的水平下发生这些蛋白质表达的颗粒,我们进行了半定量的RT-PCR以估计mRNA水平。我们发现MIF mRNA的水平升高了TIO的3-7倍2 - 与未处理的细胞相比 - 治疗细胞(Fig. 3)。这一结果同意我们免疫印迹的结果(Fig. 5)和2-D电泳。相比之下,TALDO1和CLIC1的mRNA水平与TIO没有变化2 treatment (Fig. 4),暗示通过TALDO1和CLIC1 mRNA和/或蛋白质的稳定性后转录变化引起了观察到的TALDO1和CLIC1蛋白水平的改变。
      因为据报道MIF是一种促炎细胞因子,抵消了内源性糖皮质激素的抗炎作用(
      • 伯纳赫·J.
      • 卡兰拉T.
      • Mitchell R.A.
      • 马丁斯。
      • Tracey K.J.
      • Vopert W.
      • Manogue K.R.
      • Cerami A.
      • Bucala R.
      MIF.是一种垂体衍生的细胞因子,其增强了致命的内毒性血症..
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      • Metz C.N.
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      • Cerami A.
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      MIF.作为糖皮质激素诱导的细胞因子生产调节剂..
      ),其在人类和实验性哮喘中的作用已经证明。血清和人类哮喘痰中的MIF水平显示出明显高于年龄和性匹配的对照科目(
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      支气管哮喘巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)
      )。此外,在MIF的基因组学研究中,均为-173g / c和-794(catt)5–8 MIF启动子区域的重复多态性与MIF基因转录的改变水平有关 体外。此外,一个病例控制的分析表明,这些启动子多态性对日本人群中的特性和哮喘的发育施加了遗传影响(
      • h瓦
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      巨噬细胞迁移抑制因子和Atopatic的启动子区域功能多态性。
      )。证据表明,MIF在哮喘发育中发挥作用也已经使用卵磷崩溃的过敏性过敏性哮喘模型获得。具有由遗传改变或中和抗体引起的MIF缺乏的小鼠表现出较少的肺炎,较低的免疫反应,低于遗传匹配,野生型对照的较低的气道超响应性(
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      巨噬细胞迁移抑制因子在大鼠卵霉含蛋白诱导的气道炎症中的作用..
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      支气管哮喘巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)
      )。然而,最近的免疫组织化学研究揭示了MIF在支气管上皮中的MIF阳性免疫染色,即使在非敏化大鼠中,在卵闭致癌后的增强的MIF染色(
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      )。这些数据与我们的吻合吻合良好,因为它们表明上皮细胞也表达了MIF。有趣的是MIF已被证明可以调节对内毒素的先天免疫应答(
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      )部分通过调节Toll样受体4表达(
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      巨噬细胞迁移抑制因子在大鼠卵霉含蛋白诱导的气道炎症中的作用..
      )表明,MIF在不管气道损伤类型的情况下作为气道炎症的共同诱导剂发挥着重要作用。
      总之,我们确定了20种蛋白质,其表达水平在响应TiO的响应时改变了BEA-2B细胞系的表达水平2 粒子暴露。这些蛋白质包括与防御相关的,细胞活化和细胞骨架蛋白,以及响应于氧化应激的响应,并且它们可以根据其TiO的图案分为四组2 - 随着时间的推移而导致表达的变化。通过刺激三种不同颗粒分子中的任何一种,通过刺激细胞在转录水平上诱导这些蛋白质MIF之一,并且在TiO的肺部增加MIF蛋白的表达2-alstilled大鼠。这些结果表明,这些蛋白质中的一些可以用作由暴露于PM引起的气道疾病的介质或标记。

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