乳腺癌生物标志物的血清血清方法* s

      因为已知蛋白质的糖基化在乳腺癌的发育过程中肿瘤细胞发生变化,因此这里使用含有血糖方法来寻找相关的乳腺癌的相关生物标志物。已知这些糖基化变化与增加肿瘤负荷和预后差相关。基于癌症生物标志物的基于目前的抗体的免疫化学测试,卵巢(CA125),乳腺(CA27.29或CA15-3),胰腺,胃,结肠和癌(CA19-9)靶向高糖基化粘蛋白蛋白。然而,这些测试缺乏在早期检测中使用的特异性和敏感性。这种含有乳腺癌聚糖生物标志物的糖类方法包括化学切割来自血糖化蛋白质的寡糖(聚糖),所述糖基化蛋白质被抑制或被乳腺癌肿瘤细胞系分泌。通过MALDI-FT-ICR MS分析所得的游离甘草物种。通过使用串联质谱法,可以在FTMS中使用红外多选择性解离来进行聚糖的进一步结构分析。为每个细胞系产生聚糖型材并进行比较。然后使用这些方法分析从乳腺癌小鼠模型获得的血清和从被诊断患有乳腺癌或没有已知乳腺癌历史的患者获得的人类患者获得的少量血清样本。除了在小鼠中检测到的小鼠乳腺癌的糖基化变化之外,发现糖基化谱的发现足够不同,以区分患有癌症的患者而没有。虽然到目前为止分析的少数患者样品不充分,以便在此时做出任何合法的要求,但这些有希望但非常初步的结果表明聚糖型材可能含有与聚糖“癌症签名”相对应的明显的聚糖生物标志物。
      乳腺癌是女性中癌症死亡率的第二个最常见的原因。美国癌症会估计2005年疾病的侵入性癌症和40,410人死亡患者。在其早期阶段检测到的乳腺癌是可治疗的,但目前没有美国食品和药物管理局批准的血清测试,用于早期检测疾病。由于乳腺癌的早期症状有时不存在或不认识到,当癌症最终被诊断时,它通常处于进展和无法治疗的先进阶段。因此,需要一种能够寻找存在于患者血清中存在的可靠生物标志物的方法。
      已知蛋白质的糖基化改变乳腺和其他类型的癌症(
      • Hakomori S.
      肿瘤相关的碳水化合物抗原定义肿瘤恶性肿瘤:抗癌疫苗的发展基础..
      ,
      • Hakomori S.
      糖基化定义癌症恶性肿瘤:旧瓶中的新葡萄酒..
      ,
      • hollingsworth m.a.
      • Swanson B.J.
      癌症中的粘蛋白:保护和控制细胞表面..
      )。糖基化的改变会影响肿瘤的生长,分化,转化,粘附,转移和免疫监测(
      • Choudhury A.
      • 单斋二。
      • Ulrich A.B.
      • 小学生。
      • 主体J.
      • 倒下午
      • 士班S.J.
      • hollingsworth m.a.
      • Aubert J.P.
      • Batra S.K.
      人类胰腺肿瘤中的MUC4粘蛋白表达受器官环境的影响:TGFβ2的可能作用..
      )。在乳腺癌中,存在增加高糖基化蛋白(粘蛋白)和糖基化的其他变化的存在与肿瘤负荷增加和预后差(
      • hollingsworth m.a.
      • Swanson B.J.
      癌症中的粘蛋白:保护和控制细胞表面..
      )。 O - 由于粘蛋白糖基化的变化,乳腺的乳腺糖基化也被众所周知在恶性肿瘤中发生变化(
      • Burchell J.M.
      • Mungul A.
      • Taylor-Papadimitriou J.
      乳腺中的O-连接的糖基化:恶性肿瘤期间发生的变化。
      )。
      患有乳腺癌的血清生物标志物是粘蛋白1(MUC1),
      使用的缩写是:muc,mucin; IRMPD,红外多波旋塞解离; Pymt,PolyoMa中间T抗原; SPE,固相提取; PCA,主成分分析; PCR,主要成分回归; GCC,石墨碳碳粉盒;十六进制,hexose;六克, N - 乙酰己糖胺; CM,条件介质; FBS,胎牛血清。
      1使用的缩写是:muc,mucin; IRMPD,红外多波旋塞解离; Pymt,PolyoMa中间T抗原; SPE,固相提取; PCA,主成分分析; PCR,主要成分回归; GCC,石墨碳碳粉盒;十六进制,hexose;六克, N - 乙酰己糖胺; CM,条件介质; FBS,胎牛血清。
      癌胚抗原和Mammaglobin(
      • 达菲M.J.
      乳腺癌中的血清肿瘤标志物:它们是临床价值吗?
      ,
      • 伯恩斯坦J.L.
      • Godbold J.H.
      • Raptis G.
      • Watson M.A.
      • Levinson B.
      • Aaronson S.A.
      • 弗莱明T.P.
      乳腺素鉴定乳腺癌新型血清标志物..
      )。批准用于乳腺癌的唯一血清测试是MUC1(CA27.29或CA15-3)和癌丙烯抗原的免疫测定试验。不幸的是,这些测试缺乏用作早期检测乳腺癌的筛选试验的敏感性和特异性,并且不被临床肿瘤学家协会推荐(
      • 达菲M.J.
      乳腺癌中的血清肿瘤标志物:它们是临床价值吗?
      )仅批准用于监测乳腺癌患者的治疗。 MUC1被称为多晶型上皮粘蛋白,也是胰腺,肝癌和结肠癌(CA19-9)测试的靶标。多态性上皮粘蛋白的多态性或“异质性”在很大程度上是由于大量的 O - 在分子的细胞外羧基末端存在的串联重复元素的糖基化(
      • Taylor-Papadimitriou J.
      • Burchell J.
      • miles d.w.
      • Dalziel M.
      muc1和癌症..
      )。使用抗体,CA27.29和CA19-9测试检测对应于不同类型的癌症的不同MUC1抗原表位。还存在许多这些蛋白质和抗体可检测的蛋白质 N - 链接的低聚糖(聚糖);这是一种不同形式的糖基化,其也涉及癌症(
      • Kobata A.
      • amano J.
      改变恶性细胞产生的蛋白质的糖基化,以及用于肿瘤的诊断和免疫疗法的应用。
      )。
      作为当前免疫化学或蛋白质组学方法的替代方法,用于在患者血清中寻找乳腺癌生物标志物,正在开发出从其蛋白质核心切割的全球分析方法(
      • Cancirla M.T.
      • Penn S.G.
      • lebrilla c.b.
      寡糖的碱性降解与基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换质谱分子:寡糖的测序方法。
      )。通过质谱法直接分析所得的游离甘油物种,从而产生聚糖的概况,其中一些是乳腺癌的生物标志物。该方法寻求直接鉴定与从肿瘤和/或循环肿瘤细胞分泌或脱落的任何糖基化蛋白相关的聚糖组,而不知道它所绑定的蛋白质核心。因为这种方法不关注蛋白质的分析,所以诸如白蛋白和免疫球蛋白如白蛋白和免疫球蛋白的丰富血清蛋白不会干扰聚糖分析。仅注意到使用高分辨率质谱法识别与肿瘤细胞相关的异常癌聚糖。
      用于本研究的仪器是具有MALDI源的FT-ICR质谱仪。该仪器以高质量精度众所周知(<5 ppm外部校准)和高分辨率( >半高100,000个全宽)。糖甘油仅基于其质量并通过其碎片模式证实。本研究旨在应用最先进的质谱,直接临床诊断。这种方法的另一个优点是可以在不纯化蛋白质的情况下在样品中直接检查聚糖。这里示出的是,可以在乳腺癌小鼠模型的血清中鉴定乳腺癌肿瘤细胞系的条件培养基中的聚糖型材,以及少量患者样品。

      实验步骤

       材料-

      细胞培养基购自Invitrogen。硼氢化钠和二羟基苯甲酸来自Sigma,其他试剂来自Fisher Scientific。

       乳腺癌肿瘤细胞系的生长 -

      乳腺癌肿瘤细胞系在Dulbecco的改良鹰培养基中生长,补充有10%胎牛血清。 MCF-10A细胞系在克隆中获得的乳腺上皮生长培养基(无血清)并补充有100ng / ml霍乱毒素(CALBIOCHEM)。从每个细胞系中收获条件培养基(CM),浓缩(vivascience浓缩器,7000或10,000分子量截止),在4°C(刺穿滑动-a-lyzer,7000或10,000分子量截止),冷冻和冻干。

       小鼠血清样品的制备 -

      用于该研究的小鼠是近亲FVB菌株小鼠。它们在5周龄的时间内移植,源于乳腺癌的多瘤中T抗原(Pymt)小鼠模型的乳腺癌(
      • GUY C.T.
      • 加卡迪夫R.D.
      • Muller W.J.
      通过多马病毒中间T癌基因表达诱导乳腺肿瘤:转移性疾病的转基因小鼠模型。
      )。这些小鼠在实验室动物科学设施中心一起安置在一起。他们都是喂养的标准饮食。
      在移植到同源FVB / N小鼠的乳腺脂肪垫中后,通过小鼠从小鼠渗出血液样品(
      • Borowsky A.D.
      • Namba R.
      • 年轻的L.J.
      • 猎人K.W.
      • Hodgson J.G.
      • TEPPER C.G.
      • McGoldrick E.T.
      • Muller W.J.
      • 加卡迪夫R.D.
      • 格雷格J.P.
      同源小鼠乳腺癌细胞系:两个密切相关的细胞系具有发散的转移行为..
      )。在这些小鼠的疗程中发育乳腺癌,拉伸额外的血液样品。将所有血液样品立即加工成血清(血清分离器,SST®365967,BD Biosciences)并在-20℃下冷冻。将每个样品解冻(20-30μl血清)并直接进行化学切割(见下文)。

       患者血清样品的制备 -

      来自个人的血清样本,没有已知的癌症史(n = 4)已经测试了CA27.29的预先存在的患者血清样本(n = 4)来自特种化学单位,UC戴维斯医疗中心临床实验室。使用化学发光微粒免疫测定(Bayer Advia Centaur)测试Ca27.29的血清样品,然后在-20或-70℃下冷冻直至使用。在化学切割反应中使用两百微升血清(见下文)。 表I. 显示为本研究中使用的患者获得的医疗信息。
      T有能力的 I人类患者的医疗信息
      患者不。年龄诊断CA27.29
      a 从UC Davis医疗中心临床实验室获得CA27.29值(化学发光微粒免疫颗粒,拜耳Advia Centaur)。
      癌症类型附加信息治疗
      yr.
      162乳腺癌的历史,假瘤腹膜腹膜27导管癌佐剂化疗
      361乳腺癌101未知
      468转移性乳腺癌8小叶癌姑息治疗
      846转移性乳腺癌24导管癌复发佐剂化疗
      正常没有。年龄诊断CA125
      b 从UC Davis医疗中心临床实验室获得CA125值(Abbott IMX癌抗原CA-125测定)。
      yr.
      124未知64
      254未知12
      655未知13
      853未知15
      a 从UC Davis医疗中心临床实验室获得CA27.29值(化学发光微粒免疫颗粒,拜耳Advia Centaur)。
      b 从UC Davis医疗中心临床实验室获得CA125值(Abbott IMX癌抗原CA-125测定)。

       来自糖基化蛋白的低聚糖的化学切割 -

      称量约2mg透析和冻干的细胞系上清液,或者将200μl人血清的体积转移到15ml锥形聚丙烯管中。通过使用氢氧化钠硼氢化钠处理在消除β-消除聚糖通过氢氧化钠(
      • Cancirla M.T.
      • Penn S.G.
      • lebrilla c.b.
      寡糖的碱性降解与基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换质谱分子:寡糖的测序方法。
      )。在优化条件下硼氢化钠主要是释放 O - 链接的聚糖,但也可能释放部分 N - 链接的聚糖。碱硼氢化物溶液(200μl,混合物1.0 m 硼氢化钠和0.1 m 加入氢氧化钠),将混合物在42℃下在水浴中孵育18小时。反应后,1.0 m 将冷盐酸溶液缓慢加入冰浴中的样品中,以中和过量的硼氢化钠,直至氢气进化停止(pH = 3-5)。

       通过固相萃取寡糖纯化 -

      通过使用石墨化碳盒(GCC)(Alltech,Deerfield,IL)通过固相萃取(SPE)纯化通过还原消除释放的寡糖。用纳米水洗盒用纳米水洗涤,然后在80%ACN中进行0.05%(v / v)TFA2O(v / v),再次与纳米水。将释放的寡糖的溶液加载到盒中。随后,用约1ml / min的流速用纳米水洗涤盒以除去盐。细胞系中的聚糖逐步用10%ACN逐步洗脱2O(v / v)和40%的acc在0.05%tfa中2o(v / v)。血清样品中的聚糖逐步用10%ACN逐步洗脱2o(v / v),h中的20%ACN2o(v / v)和40%ACN在0.05%TFA中2o(v / v)。收集每个级分并浓缩 真空 在MS分析之前。使用蛋白酶对来自小鼠和人类的血清样品进行消化,以除去任何未通过SPE除去的残留肽。

       质谱分析 -

      用配备有7.0-Tesla磁体的外部源(Hiresmaldi,IonsPec Corp.,Irvine,CA)记录质谱。 Hiresmaldi的来源利用脉冲Nd:YAG(钕掺杂的钇铝石榴石)激光器(266nm)进行电离。使用2,5-二羟基苯甲酸作为基质(5mg /100μl,在50%ACN中的5mg /100μl2o(v / v))。在H中的50%ACN中的NaCl饱和溶液2O(v / v)用作阳离子掺杂剂。将寡糖溶液(1μl)施加到MALDI探针,然后用基质溶液(1μl)。在质谱分析之前,将样品在空气流下干燥。

       使用红外多光子解离结构的结构测定 -

      通过红外线多相解离(IRMPD)来确定几种寡糖的一般结构(
      • 谢Y.
      • lebrilla c.b.
      碱金属配位低聚糖的红外多光子解离。
      )。这允许特定离子物种的综合碎片。使用任意波形发生器容易地从ICR电池中的其他离子中选择感兴趣的离子和分离。连续波视差有限公司2 在磁体的后部安装具有20瓦最大功率和10.6μm波长的激光(Waltham,MA),并为IRMPD提供红外光子。由制造商规定的激光束直径为6毫米,借助于2×光束扩展器(Synrad,Mukilteo,WA)将其扩展至〜12mm),以确保通过实验过程完全照射离子云。激光通过BAF对齐并导向ICR细胞的中心2 窗口(Bicron Corp.,Newbury,OH)。优化光子照射时间,以产生最大数量和丰度的片段离子。激光在~13瓦的输出处运行。

       分析光谱 -

      分析质谱而不首先校正由于变化的样品载荷引起的相对较小的强度差异。使用ADIC™概率数据重建方法(正概率有限,ISLEHAM,UK)进行解码,给出一组峰表总结当前的特征。然后使用专门写入的计算机程序组合峰值表,该计算机程序识别两个或多个表共用的特征,考虑到光谱之间的任何小校准差异。所得表的主成分分析(PCA)在定心后进行。
      进行主要成分回归(PCR)以预测使用指标变量(为癌症患者施用1的癌症患者的癌症状态)。作为测试该预测的有效性的尝试,在不恰当地重新分配指示器变量后重复回归次数。

      结果

       乳腺癌细胞上清液聚糖的分析 -

      从细胞系上清液中收获聚糖,以确定是否可以获得足够量的材料进行MS分析。使用以前开发的方法进行了分析聚糖(
      • Cancirla M.T.
      • Penn S.G.
      • lebrilla c.b.
      寡糖的碱性降解与基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换质谱分子:寡糖的测序方法。
      ,
      • 谢Y.
      • lebrilla c.b.
      碱金属配位低聚糖的红外多光子解离。
      )从培养中乳腺癌肿瘤细胞系的生长获得的厘米。以这种方式分析乳腺癌肿瘤细胞系(从ATCC获取),包括乳腺癌肿瘤细胞系BT 474,最初从乳房的固体侵入性导管癌中分离; MDA-MB-453,从具有转移性癌的患者源自转移部位(心包积液); MDA-MB-361,从腺癌患者患者的脑转移中分离出来;和MDA-MB-468,源自乳腺癌患者与腺癌的胸腔积液(
      • Cailleaul R.
      • 橄榄米
      • 十字架Q.v.
      长期人乳腺癌细胞转移起源:初步表征..
      )。
      从每个细胞系中获得Cm,使用用氢氧化钠中的硼氢化钠处理通过β - 消除化学释放聚糖(参见“实验程序”详细信息)。然后将释放的寡糖与GCCs进行固相萃取,并在三个分离的级分中洗脱10,20和40%乙腈,其允许中性从阴离子寡糖分离并除去大多数肽。在正模式下通过MALDI-FT-ICR MS分别分析每个级分(
      • 谢Y.
      • Schubothe K.M.
      • lebrilla c.b.
      傅里叶变换质谱中离子的红外激光隔离..
      )。 Fig. 1 显示GCC 10%的代表性谱(Fig. 1, 最佳)和GCC 40%的分数(Fig. 1, 底部)对于细胞系MDA-MB-468。 GCC 10%馏分主要显示基质和肽,而GCC 40%馏分显示聚糖的存在(填充圈子)。这些聚糖与卵巢癌细胞系中也发现的群体相同(
      • 一个H.J.
      • Ninonuevo M.
      • 阿奎兰J.
      • 刘H.
      • lebrilla c.b.
      • Alvarenga L.S.
      • Mannis M.J.
      泪液分析催泪液,用于诊断检测眼睛rosacea ..
      )。作为聚糖的峰值验证主要是通过峰之间的间隔获得的,这恰好对己糖(六角)或的差异相对应 N - 乙酰己糖胺(六烷基)。然而,质量与碱硼氢化钠释放的聚糖的寡糖醛醇不对应于寡糖醛醇。群众也不对应于醛的对应。相反,它们似乎是具有未知头组的寡糖。我们还在追求这些寡糖的身份;然而,它们与在卵巢癌细胞系中观察到的那些相同(
      • 一个H.J.
      • 米亚塔托斯。
      • 兰卡斯特K.S.
      • Kirmiz C.
      • 李b.
      • 林K.S.
      • LieSerowitz G.S.
      • lebrilla c.b.
      血清中聚糖的谱分析卵巢癌潜在生物标志物..
      )。使用IRMPD进一步表征这些物种中的几种。一个物种的一个例子 m/z 712从卵巢癌细胞中获得,该细胞也检测到乳腺癌细胞系MDA-MB-468(Fig. 1,40%)显示在 图2A。基于该频谱,所提出的结构如图所示 图。2B.
      图缩略图GR1.
      Fig. 1来自乳腺癌细胞系MDA-MB-468的MALDI-FT-ICR MS谱。最佳,GCC 10%分数; 底部,GCC 40%的级分(聚糖用A标记 圆圈 仅在40%的GCC分数中)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2聚糖的结构分析。a,甘草的IRMPD谱 m/z 712说明连续的碳水化合物损失; b,使用IRMPD确定乳腺癌和无癌症患者样品中的甘草结构。这 盒子 相当于 N - 乙酰己糖胺,和 对应于己糖。
      除MCF-10A和BT 474外,所有细胞系中存在的独特甘草群体是一系列~14种似乎有关。包含最丰富的峰值 m/z 388,509,550,712,772,874,915,1077,1443和1503.这些聚糖通过己糖(162个质量单位)的单位彼此不同 N - 乙酰己酯(203个质量单位),所有这些主要由己糖组成 N - 乙酰己糖胺残留物。但是,还有60个单位的差异。这些聚糖的几种可能的序列(每个残留物的连接)(m/z 使用IRMPD从串联质谱数据中衍生712,915和1077),并提供 图。2B。这些聚糖的来源有几种可能性。他们可能是 O - 用一个未知的头组链接。它们也可能是碎片,可能是碎片 N - 链接或更大 O - 引起的聚糖,由剥离反应引起。越多的可能性是这些离子是由MALDI工艺产生的片段,已知可以产生能量离子,并且可能引起亚稳定的解离,其中包含长检测时间的质量分析仪(
      • Cancirla M.T.
      • Penn S.G.
      • lebrilla c.b.
      寡糖的碱性降解与基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换质谱分子:寡糖的测序方法。
      ,
      • Mechref Y.
      • 康P.
      • Novotny M.v.
      通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间/飞行时间串联质谱法分化唾液酸化聚糖的结构异构体。
      )。由IRMPD确定时的结构似乎是碎片 N - 与粉末核心完好无损的链接复合型低聚糖。 60个质量单位最有可能对应于来自MALDI激光电离步骤的横环切割的碎片(
      • Cancirla M.T.
      • Penn S.G.
      • lebrilla c.b.
      寡糖的碱性降解与基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换质谱分子:寡糖的测序方法。
      ,
      • Muzikar J.
      • Mechref Y.
      • 黄扬
      • Novotny M.v.
      通过转化为氨基衍生物,增强了源极衰减和横环碎裂的寡糖。
      ,
      • Mechref Y.
      • Novotny M.v.
      • 克里希纳C.
      使用MALDI-TOF / TOF串联质谱法的寡糖结构表征。
      )导致寡糖基团,其中一组CH2(哦)ch2(哦) (图。2B)。这种类型的裂解也可能是剥离反应的结果(
      • Cancirla M.T.
      • Penn S.G.
      • lebrilla c.b.
      寡糖的碱性降解与基质辅助激光解吸/电离傅里叶变换质谱分子:寡糖的测序方法。
      ,
      • 康P.
      • Mechref Y.
      • Klouckova I.
      • Novotny M.v.
      聚糖的固相渗透水解分析。
      )在碱性释放程序期间。因此似乎切割反应也在产生 N - 延伸的低聚糖和马尔迪的电离产生横环切割碎片。交叉环碎片可以产生关于这些聚糖的相关结构信息,这可能是特定的 N - 从癌细胞产生的寡糖。
      用于富含聚糖的方法相对较快,不需要HPLC分离。释放和处理12个样品通常需要48小时,额外的质谱分析所需的额外时间。目前仅需1.0μl的GCC级分,相当于50ng的血清,得到低聚糖型材。在使用上述过程之前,分离来自四种乳腺癌细胞系和一种乳腺癌细胞系和一个乳腺上皮细胞系的聚糖,并在分析之前从CM纯化。本研究中使用的癌细胞系是BT 474,MDA-MB-468,MDA-MB-361和MDA-MB-453。非致瘤上皮细胞系为MCF-10A。 Fig. 3 显示了所有五种细胞系的40%GCC分数的比较。一些有趣的比较可以制作。三种MDA-MB细胞系(361,468和453)都在其光谱中具有相似的甘油模式。 BT 474(其他癌细胞系)具有非常不同和独特的质谱。这可能是通过这种细胞系是导管癌细胞系的事实来解释,并且比其他三个更癌,允许在质谱中的图案变化。在补充图4中提供了五种细胞系中存在的最丰富的群体的概述。一些甘油群(m/z 347-1563)可以在所有癌细胞系中看到(MDA-MB-468,MDA-MB-361和MDA-MB-453)和卵巢癌ES-2细胞系,但似乎并不存在于癌前血症中细胞系(BT 474)或上皮细胞系(MCF-10A)。细胞系之间聚糖的差异可能是特征性,可用于区分细胞系和可能不同形式的乳腺癌。我们观察到MCF-10A非致瘤上皮细胞没有显示我们在肿瘤细胞系中检测到的聚糖。 MCF-10A上皮细胞系在定义的培养基中生长,而另一个乳腺癌细胞系在含有10%牛血清白蛋白的培养基中生长,因此不同的介质可能是缺乏这些聚糖的原因。然而,我们已经分析了胎牛血清(FBS)和含FBS的培养基,并且没有检测到肿瘤相关的聚糖(数据未显示),因此我们知道肿瘤细胞系中的聚糖不存在于含FBS中媒体。进一步证明MCF-10A细胞系不使用相同的所有细胞系的生长条件产生这些聚糖正在进行。以往分析从存在于卵巢癌肿瘤细胞系ES-2,SKOV3,OVCAR和CAOV的条件培养基中存在的糖基化蛋白质中获得的聚糖显示出一些这些相同的聚糖的存在(
      • 一个H.J.
      • 米亚塔托斯。
      • 兰卡斯特K.S.
      • Kirmiz C.
      • 李b.
      • 林K.S.
      • LieSerowitz G.S.
      • lebrilla c.b.
      血清中聚糖的谱分析卵巢癌潜在生物标志物..
      )。在这些研究期间,通过分析来自ES-2肿瘤细胞的40%GCC级分的三份样品来检查MALDI-FTICR MS的聚糖分析的可变性,这些数据包括在补充图中。再现性在10中%,并且离子似乎具有相同的质量和每个样品的相对强度。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3来自四种乳腺癌细胞系和乳腺上皮细胞系中的调节培养基的MALDI光谱比较。 来自乳腺癌细胞系BT 474,MDA-MB-468,MDA-453和MDA-MB-361和上皮细胞系,MCF-10A获得的40%GCC分数的MALDI光谱。

       小鼠血清中聚糖的分析 -

      除了测量乳腺癌肿瘤细胞的条件培养基中的聚糖外,我们还希望确定这些糖料方法是否可用于测量转移乳腺癌的小鼠模型中的早期糖基化变化。为此目的,使用了最初来自转移乳腺癌的Pymt小鼠模型的乳腺癌的可移植乳腺癌模型(
      • GUY C.T.
      • 加卡迪夫R.D.
      • Muller W.J.
      通过多马病毒中间T癌基因表达诱导乳腺肿瘤:转移性疾病的转基因小鼠模型。
      )。本发明最初通过将小鼠乳腺肿瘤病毒的调节插入小鼠(
      • GUY C.T.
      • 加卡迪夫R.D.
      • Muller W.J.
      通过多马病毒中间T癌基因表达诱导乳腺肿瘤:转移性疾病的转基因小鼠模型。
      )。这些小鼠开发了乳腺上皮的广泛转化,并快速生产多焦乳腺癌,具有高肺部转移到肺部。随后通过来自Pymt小鼠(Met-1细胞)的乳腺肿瘤的初级培养物产生可移植的乳腺肿瘤小鼠模型,其可在标准细胞培养物中生长或连续移植到FVB雌性小鼠的乳腺脂肪垫中(
      • Borowsky A.D.
      • Namba R.
      • 年轻的L.J.
      • 猎人K.W.
      • Hodgson J.G.
      • TEPPER C.G.
      • McGoldrick E.T.
      • Muller W.J.
      • 加卡迪夫R.D.
      • 格雷格J.P.
      同源小鼠乳腺癌细胞系:两个密切相关的细胞系具有发散的转移行为..
      )。这些小鼠发育乳腺肿瘤,使其转移到肺部(
      • Jessen K.A.
      • 刘S.Y.
      • TEPPER C.G.
      • 卡拉姆J.
      • McGoldrick E.T.
      • Rosner A.
      • Munn R.J.
      • 年轻的L.J.
      • Borowsky A.D.
      • 加卡迪夫R.D.
      • 格雷格J.P.
      多马病毒中霉菌中转移的分子分析:骨桥蛋白的作用..
      )。为了建立我们是否可以使用我们的方法在形成肿瘤的形成期间检测小鼠血清中的糖基化变化,在其肿瘤生长过程中从四只小鼠中获得血清样品,用GCC裂解聚糖并进行固相萃取,并用GCC进行固相萃取通过MALDI-FTICR MS分析级分(参见“实验程序”)。在其乳腺肿瘤的发育期间,从每只小鼠获得三个单独的时间点的光谱。从一只鼠标(鼠标1128)的光谱示例显示在 Fig. 4 在数周0,2和6期间采用血清样品。光谱在离子丰度方面归一化到三个光谱中最强烈的信号。一些峰, m/z 离子509,548和617存在于小鼠1128的所有三个光谱中,并且在几乎每种小鼠获得的每种血清样品中存在(Fig. 5)。一些人 m/z 在第0周不存在对应于寡糖(聚糖)质量的离子,但在第2周出现并在第6周内进一步增加。这些与峰值相对应 m/z 772,915,1078和1443。该 m/z 观察到峰值772和1078离子在其他三只小鼠中变化 m/z 观察到峰916和1443,以改变四只小鼠中的两个(Fig. 5)。其他 m/z 在第4周,观测到四只小鼠中两只小鼠的峰值的峰值为874和1138.这些大部分 m/z 离子对应于聚糖 m/z 离子存在于乳腺癌细胞系的条件培养基中,似乎对应于最丰富的甘草物种。虽然相似 m/z 离子似乎存在于小鼠血清样品中,迄今为止迄今为止我们观察到这些糖粉的任何结论。需要更严格的鼠标研究,然后在乳腺肿瘤的发育过程中测定我们在鼠标血清中检测到的糖粉变化,并表明存在乳腺癌的存在。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4来自乳腺癌的Pymt小鼠模型的小鼠血清样品的MALDI光谱。 同一周从小鼠植入乳腺癌肿瘤的血清Maldi光谱比较(最佳),植入后2周(中间),植入后6周(底部示出了显示在植入后稍后的糖类差异。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5图表的图表 m/z 在第0,2,4或6周的四只小鼠中核心在血清中鉴定在血清中,通过时间段组合在一起。 总数 m/z 总结了每个点的群众,×ד展示柱子 如果有两个或更多 m/z 群众存在于一个组中。

       人血清中聚糖的分析 -

      使用该方法分析了一种小样本的人血清样品,前面测试的四种患者血清样品,以前测试了来自癌症的患者的四种血清样品。为这些样本提供有限的医疗信息( 表I.)。已经测试了这些样品的Ca27.29,其是有时用于监测乳腺癌患者的治疗的免疫测定试验,并且该测试的结果包括在内 表I. 比较。以前描述的方法制备乳腺癌肿瘤细胞系和小鼠血清样品用于患者血清样品。 Fig. 6 显示癌症患者与转移性乳腺癌和没有癌症的患者的所有三种分数的比较。 10,20和40%的GCC级分都表示,无癌症和乳腺癌患者之间的变化可以看到。在乳腺癌细胞系中发现的聚糖肿块和小鼠模型也似乎存在于血清中。此外,在癌症和无癌症患者中存在10%部分中存在的几种新系列。这些低聚物有丰富的峰值 m/z 617,815,1013等,恰好是198.015质量单位。该质量对应于六尿酸的残余物质量,其中酸性质子已被钠离子取代,当MALDI样品掺杂氯化钠时常见的发生。尚未报告六尿素的低聚物;然而,据报道,单体患有癌症患者和糖尿病的人(
      • Stancakova A.
      • vajo J.
      血清六羧酸和单糖水平与尿液受试者和糖尿病患者的尿液尿酸和皮质排泄的关系与糖尿病患者和动脉粥样硬化外周血疾病。
      )。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6MALDI光谱比较乳腺癌患者与无癌症患者的比较。 乳腺癌患者( 黑线) 是个 最佳 (直立)光谱和无癌症患者(光线) 是个 底部 () 光谱。这 顶面板 是GCC 10%的分数。这 中间伙计 是GCC 20%的分数。这 底部面板 是GCC 40%的分数。
      在20%的GCC级分中,癌症患者的光谱具有与在癌症细胞系和癌症细胞系中观察到的肿块的峰值,并在以后的时间(m/z 712,772,915,1077等)。 表二 列出血清中发现的群体,其对应于细胞系。这些群众在癌症患者的20%GCC分数中表现为一系列,也出现在无癌症患者中,但在后期的40%GCC级分中。这种现象的一个解释是,在MALDI-FTICR MS中产生这些质量的分子在癌症患者中略微不同,并以低溶剂浓度(20%ACN)洗脱而不是来自No-Cancer患者的类似分子。这就是Glycan分离步骤(GCC SPE分级)对我们的方法至关重要的原因。这种分离步骤可以帮助区分分子之间的非常小的差异。重要的是要注意,每个聚糖质量可以对应于许多异构体,有时超过十几种质量,每个异构体具有其自身的物理性质。这些物理差异可能转化为不同的结合亲和力和与石墨柱的相互作用。我们对GLC的HPLC分离GCC混合物的经验表明,异构体倾向于具有广泛变化的保留时间。结构同源物,例如仅由单个残基不同但是否则相同的结构,往往在保留时间内更近,而立体异构体即使只有一种连杆不同,也可以具有显着不同的保留时间。事实上,这些小差异在甘草结构中可能在肿瘤细胞中具有深刻的功能性后果。最近我们报告说出许多相同的群众列出 表二 血清中卵巢癌的标志物(
      • 一个H.J.
      • 米亚塔托斯。
      • 兰卡斯特K.S.
      • Kirmiz C.
      • 李b.
      • 林K.S.
      • LieSerowitz G.S.
      • lebrilla c.b.
      血清中聚糖的谱分析卵巢癌潜在生物标志物..
      )。在该研究中,发现这些群众在卵巢癌患者中更普遍,并且通常在禁止癌症患者中缺席所有三种GCC级分检查(10,20和40%ACN)。可能在具有不同结构性质的异构体之间的轻微结构差异,导致这些相同的群体在癌症患者样品的20%GCC部分中检测到与No-Cancer患者的40%GCC部分中进行检测。进一步的实验表明,如果改变电离条件,则可以在无癌患者血清样品中检测到这些相同的质量,例如激光功率增加(数据未显示)。在当前报告中提出的结果是在癌症和无癌症患者血清样品中产生这些峰(质量)的电离条件下获得的结果。然而,这些结果仍然与特定的聚糖异构体是用于乳腺癌或卵巢癌的标志物的可能性,但很明显,有必要更广泛的结构和分析实验来解决这些问题。在可以确定该方法是否能够区分这两种癌症,还需要分析来自乳腺癌和卵巢癌患者的大量血清样本。
      T有能力的 II主要的低聚糖列表及其从患者血清样品获得的组合物
      观察到的质量,m / z
      a 道尔顿,每个基本的费用单位(m/z)。
      寡糖组合物
      347.102Hex
      388.141HEXNAC:1HEX.
      509.173Hex
      550.211HEXNAC:2HEX.
      712.283HEX:1HEXNAC.
      772.311HEX *:2HEX:1HEXNAC
      874.364HEX:1HEXNAC.
      915.383HEX:2HEXNAC.
      975.431HEX *:2HEX:2HEXNAC
      1077.474HEX:2HEXNAC.
      1137.511HEX *:3HEX:2HEXNAC
      1239.575HEX:2HEXNAC.
      1280.624HEX:3HEXNAC.
      1442.725HEX:3HEXNAC.
      1502.741HEX *:4HEX:3HEXNAC
      1562.782HEX *:3HEX:HEXNAC
      所有观察到的离子对应于[m - h2o + na]+。 Hex *是指乙酰己糖(用乙酰基改性己糖的一种羟基)。粗体数字对应于来自肿瘤细胞系和癌症患者的血清中的条件培养基中似乎更普遍的聚糖。
      a 道尔顿,每个基本的费用单位(m/z)。

       人血清聚糖的统计分析 -

      对于每个提取的级分,组合从患者样品光谱衍生的峰表以提供表明每个光谱中的共同特征的强度的表。 PCA(
      • 热身h.
      分析统计变量的复合物到主要成分..
      )此表然后方便地总结了光谱之间最显着的差异。癌症和无癌症患者的最大差异在GCC 10%部分中发现。如PCA分数图所示(Fig. 7),主要成分3似乎将四个癌症患者(全部有阳性分数)与No-Cancer患者(负分数)区分开来。进一步发现患者癌症状态的正确分配在PCR分析中获得了最佳的相关系数(参见“实验程序”)预测癌症状态也表明癌症和无癌症患者的光谱是可区分的(Fig. 8)。 图8A 显示PCR分析的结果,如果样品被正确分配为癌症和无癌症,而且 图8B. 如果分配不正确,则显示结果。用于统计分析的特征是质谱中的峰值不仅仅是盒装部分 m/z。数据被解释为 12C去卷积后的C质量,结果是离子而不是零电荷质量。虽然在我们的样本集中,频谱中存在比研究中的样本更多的功能,但存在过度装箱的危险。我们使用现有方法(例如 交叉验证)试图确保任何预测的生物标志物都是真实的。此外,在未来,我们希望开发不接受数据的概率分类方法。我们用于识别两个或多个峰值表共用的特征的主要标准是,在估计的质量错误中,该特征必须在每个峰值表中具有相同的质量。然而,光谱之间的任何小的校准差异都可以产生大于我们估计的质量误差的系统误差,可能导致某些特征被错误识别。因此,需要在表格组合之前纠正峰值表中的任何校准误差。这是通过使用所有表中共用的最强信号作为内部标准来完成的。我们为每个表中的每个表找到线性校正,从所有表中的标准的平均值中除去其标准群众的任何系统偏差。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7使用PCA分析四种癌症患者的PCA图和四种无癌症患者血清。上面的正方形PC1线 是癌症患者,还有四个 圈子下面PC1线 是无癌症患者。
      图缩略图GR8.
      Fig. 8PCR分析结果。a,当所有分配样本都是正确的,结果产生的结果; b,当癌症和无癌症患者被错误分配时产生的结果。
      由于研究中少量的患者,这一发现是非常初步的。但是,如果结果在更大的研究中证实了结果,则在这种早期的主要成分中发现歧视将表明癌症和无癌症患者之间的差异占光谱中的变化的大部分变化,因此可以用来区分与乳腺癌的患者之间没有。

      讨论

      我们寻求寻求与人类乳腺癌存在相关的相关生物标志物涉及使用能够检测乳腺癌患者糖基化变化的新方法。已经利用了三种独立的方法来评估这种技术的使用:1)使用乳腺癌肿瘤细胞系来建立概念的证据,2)使用乳腺癌的小鼠模型,以及3)从转移乳腺癌患者中测试血清样本和将这些与患者没有癌症的血清。
      通过在培养中生长的乳腺癌肿瘤细胞系中获得的CM分析CM来完成第一个“概念证明”。乳腺癌细胞系MDA-MB-468和MDA-MB-453来自胸膜或心包效果,而MDA-MB-361是从脑转移建立的。来自这三种细胞系的糖基化谱非常相似,而第四癌细胞系(BT 474)可能具有不同的轮廓,可能是由于其与乳房的侵入性导管癌的实体瘤中分离。尽管显示了从纤维囊疾病建立的MCF-10A上皮细胞系的数据,但因此不能进行与来自乳腺癌肿瘤细胞系的结果的直接比较,因为它在没有FBS的定义培养基中生长,而其他细胞系在包含10%FBS的完全培养基中生长。 MCF-10A细胞不能在10%FBS中生长,并且其他细胞系不能在定义的介质中生长,防止直接比较。
      由于几个原因,在分析中使用MALDI是有利的。与ESI相比,马尔迪更耐盐,易受抑制作用的易感性。然而,马尔迪确实具有使其少于理想的特征。例如,通常观察样本点中的不同位置之间的变化。因此,在若干位置中采样光斑,直到获得最佳信噪比。这些光谱用于分析。当以这种方式测量时,样品之间的可变性可忽略不计,并且光谱的整体特征使它们几乎无法区分。以相同的方式,当进行预防措施以使实验条件相似时,SPE也在相同的级分中产生相同的聚糖组。这涉及使用相同的流速,施加相同量的材料,通过相同体积的洗涤等。我们已经用其他细胞系检查了这种方法的再现性。例如,分析了三种单独的癌细胞系ES-2(卵巢癌)的培养物,显示了每个级分的高度可再现的MALDI光谱(40%馏分的分析包括在补充材料中)。马尔迪中所有峰的丰度与一个光谱高度相似,下一个光谱具有少于10%的可变性。在分析前列腺癌细胞系LNCAP,PC3和SAOS2(未示出)以三倍一次生长的分析中获得了类似水平的再现性,并通过纳米普通FT-ICR MS单独分析。
      本作品中概述的方法用于检测乳腺癌小鼠模型中是否可以检测到乳腺癌的血清糖基化变化。虽然这些数据过于初步,但是为了得出关于这些结果的结论及其与乳腺肿瘤的关系,但他们表明可以监测小鼠血清中存在的蛋白质糖基化的变化。此外,还不清楚这些聚糖是否是由于乳腺肿瘤的生长或对这些肿瘤的存在的反应;但是,他们保证进一步调查。
      使用乳腺癌的小鼠模型,其中在疾病的进展期间可以对血液进行取样,可能有助于将聚糖的变化与肿瘤的生长和潜在转移相关。使用这种小鼠模型的乳腺癌测试这种方法的优点是1)小鼠是遗传相同的; 2)性别,饮食和年龄可以控制; 3)可以在疾病过程中测试大量的小鼠,因此可以测试再现性。
      癌症使用小鼠模型的一个主要缺点是它们不是人类,可能无法充分代表人类乳腺癌疾病。然而,鼠标模型仍可用于测试该方法的再现性,灵敏度和可靠性,以检测乳腺癌的存在,导管癌 原位或转移性乳腺癌。
      少量患者样品不足以使任何关于该方法用于测试血清中乳腺癌的血清的性能的任何合法要求。尽管有这些限制,但这种方法展示了承诺,并且可以确定在可靠,准确的乳腺癌检测方法之前需要精心设计的前瞻性研究。在获得有关患者的非常有限的信息之前获得了这些样品。乳腺癌患者血清样品是预先存在的样品,已经测试了CA27.29。 “无癌症”血清样品也是从UC戴维斯医疗中心临床实验室获得的预先存在的样品。该发现是,这些患者群体在使用PCA后被隔离到不同的象糊中。

       使用糖基化分析在血清中找到癌症的生物标志物 -

      蛋白质的糖基化在癌细胞中以大而戏剧性的方式变化。聚糖变得越来越短,更负荷,核心结构变化(
      • Hakomori S.
      肿瘤相关的碳水化合物抗原定义肿瘤恶性肿瘤:抗癌疫苗的发展基础..
      ,
      • hollingsworth m.a.
      • Swanson B.J.
      癌症中的粘蛋白:保护和控制细胞表面..
      )。我们的方法旨在瞄准较短的分析 O - 链接和更多的唾液酸化聚糖。这些类型的聚糖通常不会在健康的个体中产生。在血清中寻找可用于早期检测疾病的血清中癌症的相关生物标志物的挑战是相当大的。由于一些现有的蛋白质组学方法产生的困难和问题,用于寻找癌症的生物标志物,尤其是那些高度依赖于数据分析和使用更多的“生物信息化”数据采矿方法的方法,因此必须首先证明任何一个在分析重要的临床样品之前,寻找癌症生物标志物的方法是可靠的,可重复的,并且准确的。这就是为什么我们的组选择在试图分析患者血清样品之前首先选择分析肿瘤细胞条件介质。
      我们还推理的是,由于它已经可以测量患有卵巢癌和患有乳腺癌的妇女的妇女血清中肿瘤生物标志物Ca125的存在(这些都是肿瘤细胞产生的高糖基化粘蛋白),具有更敏感的方法测量糖基化,可以直接测量这些蛋白质的糖基化和其他蛋白质的糖基化或从这些细胞中分泌的其他蛋白质,而不需要纯化蛋白质。粘蛋白来自上皮细胞,通常在循环中通常存在高量。在正常女性中产生的MUC1和CA125(MUC16)不含乳腺癌和卵巢癌肿瘤细胞产生的异常糖基化。
      蛋白质,尤其是粘蛋白的糖基化,占它们极大的分子量。一些粘蛋白有50个串联重复,每个次数可能有五个潜在的网站 O - 可含有250个低聚糖侧链的糖化化。所以它完全有可能一个1 nm 该蛋白质的浓度可具有250 nm 有效浓度的特定低聚糖结构(
      • hollingsworth m.a.
      • Swanson B.J.
      癌症中的粘蛋白:保护和控制细胞表面..
      )。因为一些粘蛋白串联重复可含有5-100个潜在的糖基化位点,并且粘蛋白核心蛋白含有5-500重复,因此粘蛋白蛋白在很大程度上在很大程度上在糖基化的存在而大大变为数百万道尔顿。该量的糖基化可以对应于用于单个蛋白质分子的相关寡糖侧链的潜在化学计量扩增大于7500倍。
      血浆和血清蛋白质组学分析的另一个问题是具有这些样品中蛋白质降解的额外问题的蛋白质的大大动态范围(10级数量级)。虽然糖苷酶可能存在于血清中,但是有趣的发现是,一些糖苷酶的水平实际上实际降低,许多蛋白蛋白酶似乎没有变化(
      • Calvo P.
      • Barba J.L.
      • Cabezas J.A.
      血清β-N-乙酰葡糖胺酶,β-d-Glucosidase,α-d-Glucosidase,β-d - - 羟化酶,α-l - - 羟化酶和β-d - 急性病毒性肝炎,胰腺炎,心肌梗死和乳腺癌中的高溶酶水平..
      )。我们计划在我们在这种方法的持续测试和验证阶段进行血清中聚糖的降解的深入分析。还有相当大的努力来削弱寡糖的鉴定和结构分析。
      终于检测癌的甘油生物标志物应该是寻找癌症相关蛋白质生物标志物的可行性。糖基化可能被认为是蛋白质的“微调”,并且其功能是必不可少的。我们觉得我们的方法将补充蛋白质组学方法,并提供有关患者癌症存在的不同和重要信息。我们的方法的优点是我们使用高分辨率和敏感的FT仪器,使得可以在血清样品中准确地检测非常低(Femtomole或更低)的聚糖。使用IRMPD的串联MS / MS可以获得有关聚糖的额外结构信息。还有可能在癌症患者的血清中检测到癌甘油生物标志物的独特结构和组成。

       结论 -

      这个概念证明研究说明了几个重要观点。 1)通过质谱法收集和分析从血清释放的聚糖。 2)可以观察到糖基化的变化是小鼠血清中疾病状态的进展。 3)聚糖可能是乳腺癌发作的有用标志物。
      判断糖粉是否可以用作乳腺癌早期诊断的生物标志物为时尚早。需要更多有关聚糖性质的信息。虽然本研究中使用的方法通常是释放 O - 链接的低聚糖,总有可能释放 N - 链接的聚糖。该组合物可以通过质量和串联MS实验确定;然而,除了最基本的结构分析中,所有的材料都有太少的材料。尽管如此,我们确信我们正在观察聚糖。因此,糖基化的变化可能是疾病诊断的可行方法。糖类可能与其他方法组合使用,因为它可能证明与其他同样有前途的技术(蛋白质组学和微阵列)互补,以提供早期检测乳腺癌和储蓄的更好方法。

      致谢

      我们承认杰夫格雷格,科林布隆,凯瑟琳奥兰和特里克(加州大学病理学,加州大学医学院)寻求患者样品。

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