Helminth病原体组织蛋白酶L蛋白酶族的蛋白质组学和系统学分析 Fasciola.. hepatica.

扩大毒力相关因素的曲目
  • 马克W. Robinson.
    一致
    由英国生物技术和生物科学研究委员会的威息国际旅行奖学金支持和研究支持助理研究委员会/国家卫生和医学研究委员会研究网络的寄生学和单独的动物健康有限公司研究网络。电话:61-2-95144127;传真:61-2-9514201
    隶属关系
    传染病生物技术研究所,工业大学悉尼大学,6级,建筑4,托马斯和哈里斯街,Ultimo,悉尼,新南威尔士州2007,澳大利亚

    阿伯丁大学医学科学院医学科学学院,英国苏格兰苏格兰阿伯丁AB25 2ZD
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  • 何塞F.侵权
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    传染病生物技术研究所,工业大学悉尼大学,6级,建筑4,托马斯和哈里斯街,Ultimo,悉尼,新南威尔士州2007,澳大利亚

    Dealtameo de Genetica,Facultad de Medicina,Universidad de LaRepuáblica,General Flores 2125,CP 11800 Montevideo,乌拉圭
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  • 乔纳森较低者
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    传染病生物技术研究所,工业大学悉尼大学,6级,建筑4,托马斯和哈里斯街,Ultimo,悉尼,新南威尔士州2007,澳大利亚
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  • Sheila M. Donnelly
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    传染病生物技术研究所,工业大学悉尼大学,6级,建筑4,托马斯和哈里斯街,Ultimo,悉尼,新南威尔士州2007,澳大利亚
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  • 艾米莉黄
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    传染病生物技术研究所,工业大学悉尼大学,6级,建筑4,托马斯和哈里斯街,Ultimo,悉尼,新南威尔士州2007,澳大利亚
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  • 微博徐
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    传染病生物技术研究所,工业大学悉尼大学,6级,建筑4,托马斯和哈里斯街,Ultimo,悉尼,新南威尔士州2007,澳大利亚
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  • 作者脚注
    **现在地址:悉尼西部大学,坎贝尔州,新南威尔士州,1797,澳大利亚。
    Colin M. Stack.
    脚注
    **现在地址:悉尼西部大学,坎贝尔州,新南威尔士州,1797,澳大利亚。
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    传染病生物技术研究所,工业大学悉尼大学,6级,建筑4,托马斯和哈里斯街,Ultimo,悉尼,新南威尔士州2007,澳大利亚
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  • Matthew Padula.
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    蛋白质组学技术技术中心,悉尼理工大学,6级,3号楼,托马斯和哈里斯街,Ultimo,悉尼,新南威尔士州,2007年,澳大利亚
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  • 本赫伯特
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    蛋白质组学技术技术中心,悉尼理工大学,6级,3号楼,托马斯和哈里斯街,Ultimo,悉尼,新南威尔士州,2007年,澳大利亚
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  • 作者脚注
    §新南威尔士州政府生物技术生物铁河奖的接受者。
    约翰·达尔顿
    脚注
    §新南威尔士州政府生物技术生物铁河奖的接受者。
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    传染病生物技术研究所,工业大学悉尼大学,6级,建筑4,托马斯和哈里斯街,Ultimo,悉尼,新南威尔士州2007,澳大利亚
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  • 作者脚注
    **现在地址:悉尼西部大学,坎贝尔州,新南威尔士州,1797,澳大利亚。
    §新南威尔士州政府生物技术生物铁河奖的接受者。
      由Helminth病原体分泌的组织蛋白酶L蛋白酶Fasciola.. hepatica.在寄生虫毒力中具有功能,包括组织侵袭和抑制宿主免疫应答。使用蛋白质组学方法以及系统发育研究,我们表征了成人分泌的组织蛋白酶L蛋白酶的谱F.Hepatica.因此,确定了那些参与宿主病原体相互作用的人。系统发育分析表明Fasciola..组织蛋白酶L基因家族由一系列基因重复扩张,然后发散,从而产生与成熟成人蠕虫(疏皮1,2和5)相关的三分支,以及特异于感染性少年阶段的两种分类物(夹夹3和4)。与这些观察结果一致,我们的蛋白质组学研究确定了来自成年人中的蛹1,2和5的代表,但不是来自成人的夹层3和4F.Hepatica.分泌品。分别为67.39和27.39%和27.63%的分泌物分泌的组织蛋白酶LS的占,表明它们的膨胀是正驱动的,并且这些蛋白酶对于寄生物存活和适应最关键。序列比较研究表明,基因重复的组织蛋白酶LS的膨胀之后是活性位点的S2袋中的残留物。我们的生化研究表明,这些变化导致底物结合的改变,并表明组织蛋白酶L家族的分歧产生了具有重叠和互补的底物特异性的酶的曲目,其可以更有效地切割宿主大分子。尽管组织蛋白酶Ls作为含有散域和成熟结构域的酶产生的,但是将由MS鉴定的所有分泌酶被加工成成熟活性酶。除了在散痕和成熟酶的边界外,散痕区域高度保守。尽管本节缺乏守恒,但保留了由芦氨酸内肽酶和Leu-Ser↓的外源性切割的遗址。
      蠕虫病原体 Fasciola.. hepatica.Fasciola.. gigantica 是羊和牛肝氟氏症(扇形病)的致病因子。虽然感染了 F.Hepatica. 主要发生在温带气候的地区,寄生虫已在欧洲定居者引入导致所有大陆(除南极洲除外)上报道。相比之下, F. Gigantica 感染在很大程度上仅限于热带地区(
      • 安德鲁斯S.J.
      Fasciola. hepatica.的生命周期。
      )。裂缝病也是一个重要的食物传播的人类,估计,估计是全世界的2.4-17万人;进一步的9110万人目前患有感染风险(
      • Keizer J.
      • Utzinger J.
      食品传播的Trematodiais:新兴的公共卫生问题。
      ,
      • Mas-Coma S.
      • 禁止M.D.
      • valero m.a.
      Fascioliaisis和其他植物 - Bourne Trematode Zoonoss。
      ,
      • Macmanus D.P.
      • 道尔顿J.D.
      对抗动物疫苗的疫苗 日本血吸虫瘤, Fasciola.. hepatica.Fasciola.. gigantica.
      )。人类疾病在南美洲,埃及,伊朗和越南的Andean国家特别普遍,养殖实践允许感染动物在用于消费的植物中漫游(
      • Mas-Coma S.
      • 禁止M.D.
      • valero m.a.
      Fascioliaisis和其他植物 - Bourne Trematode Zoonoss。
      ,
      • Macmanus D.P.
      • 道尔顿J.D.
      对抗动物疫苗的疫苗 日本血吸虫瘤, Fasciola.. hepatica.Fasciola.. gigantica.
      )。摄入受污染的植被感染寄生虫幼虫在肠道中迁移到肝脏中,在那里它们造成显着的组织损伤并在进入胆管前诱导免疫相关损伤。寄生虫可以在牛的胆管中保持高达1-2岁,只要羊20年(
      • 安德鲁斯S.J.
      Fasciola. hepatica.的生命周期。
      )。
      我们实验室的研究表明,最主要分子 F.Hepatica. 寄生物 体外 是组织蛋白酶l半胱氨酸蛋白酶(
      • 史密斯上午
      • Dowd A.J.
      • Heffernan M.
      • 罗伯逊C.D.
      • 道尔顿J.P.
      Fasciola.. hepatica.: a secreted cathepsin L-like proteinase cleaves host immunoglobulin.
      ,
      • 道尔顿J.P.
      • neill s.o.
      • 堆叠C.
      • 柯林斯P.
      • 沃尔河A.
      • Sekiya M.
      • Doyle S.
      • Mulcahy G.
      • 霍伊尔D.
      • Khaznadji E.
      • 莫雷·
      • 布伦南G.
      • 穆斯利A.
      • Kreshchenko N.
      • maule a.g.
      • 唐纳利下午
      Fasciola.. hepatica. cathepsin L-like proteases: biology, function, and potential in the development of first generation liver fluke vaccines.
      ),最近患有成人寄生虫的动物的胆汁分析证实这些酶也代表了产生的大多数蛋白质 原位 (
      • 格栅下午
      • 赖特H.A.
      • 加湿e.j.
      • 伍兹D.J.
      • 冰球下午
      肝氟克释放的排泄蛋白质的比较蛋白质组学 Fasciola.. hepatica. 在绵羊主机胆汁和期间 体外 culture ex host.
      )。蛋白酶的分泌有助于寄生虫通过宿主组织迁移和宿主大分子的降解,为寄生虫提供必要的游离氨基酸(
      • 道尔顿J.P.
      • neill s.o.
      • 堆叠C.
      • 柯林斯P.
      • 沃尔河A.
      • Sekiya M.
      • Doyle S.
      • Mulcahy G.
      • 霍伊尔D.
      • Khaznadji E.
      • 莫雷·
      • 布伦南G.
      • 穆斯利A.
      • Kreshchenko N.
      • maule a.g.
      • 唐纳利下午
      Fasciola.. hepatica. cathepsin L-like proteases: biology, function, and potential in the development of first generation liver fluke vaccines.
      )。此外,虽然已知几十年来,但饲命寄生虫分泌多种抑制其宿主免疫应答的分子(
      • Mulcahy G.
      • O'Connor F.
      • 奇特D.
      • Hogan S.F.
      • Dowd A.J.
      • 安德鲁斯S.J.
      • 道尔顿J.P.
      牛对实验抗的免疫反应Fasciola.. hepatica. vaccines.
      ,
      • 布拉迪M.T.
      • o'neill s.m.
      • 道尔顿J.P.
      • 磨坊K.H.
      Fasciola.. hepatica. 抑制保护性Th1反对 Bordetella pertussis..
      ,
      • Donnelly S.
      • o'neill s.m.
      • Sekiya M.
      • Mulcahy G.
      • 道尔顿J.P.
      硫昔林过氧化物酶分泌 Fasciola.. hepatica. 诱导巨噬细胞的替代活化。
      ),组织蛋白酶L蛋白酶被认为是参与者的原则;寄生虫酶切割特异性在铰链区域中的宿主抗体,以防止抗体介导的细胞损伤(
      • 史密斯上午
      • Dowd A.J.
      • Heffernan M.
      • 罗伯逊C.D.
      • 道尔顿J.P.
      Fasciola.. hepatica.: a secreted cathepsin L-like proteinase cleaves host immunoglobulin.
      )改变先天和自适应细胞免疫系统的细胞的功能,以抑制保护性Th1驱动反应的发育(
      • o'neill s.m.
      • 磨坊K.H.
      • 道尔顿J.P.
      Fasciola.. hepatica. 组织蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶抑制 Bordetella pertussis. - 特异性干扰素 - 伽马制作 体内.
      )。
      F.Hepatica. 组织蛋白酶L蛋白酶由大型基因家族代表,该系列在属内扩张 Fasciola.. 通过一系列基因重复,导致单次谨慎的片状组成的单次组成(
      • 欧文J.A.
      • Spithill T.W.
      • 派克r.n.
      • 威士忌J.C.
      • Smooker下午
      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      )。基因家族的各种成员的功能多样性及其与病原体毒力和宿主适应的关系特别感兴趣(
      • 道尔顿J.P.
      • neill s.o.
      • 堆叠C.
      • 柯林斯P.
      • 沃尔河A.
      • Sekiya M.
      • Doyle S.
      • Mulcahy G.
      • 霍伊尔D.
      • Khaznadji E.
      • 莫雷·
      • 布伦南G.
      • 穆斯利A.
      • Kreshchenko N.
      • maule a.g.
      • 唐纳利下午
      Fasciola.. hepatica. cathepsin L-like proteases: biology, function, and potential in the development of first generation liver fluke vaccines.
      ,
      • 欧文J.A.
      • Spithill T.W.
      • 派克r.n.
      • 威士忌J.C.
      • Smooker下午
      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      )。使用分子时钟分析,欧文 。 (
      • 欧文J.A.
      • Spithill T.W.
      • 派克r.n.
      • 威士忌J.C.
      • Smooker下午
      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      )估计,家庭的重复和分歧发生在过去的1.5亿年里,重复的时间与啮齿动物,反刍动物和更高哺乳动物的演变相关。但是,大多数重复都占据了~25万年前的时期气候条件有利于草原的发展和扩张普通宿主 F.Hepatica.,表明,组织蛋白酶L蛋白酶家族的分歧在寄生虫进化和适应寄生体积(
      • 欧文J.A.
      • Spithill T.W.
      • 派克r.n.
      • 威士忌J.C.
      • Smooker下午
      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      )。在分子水平下,这种分歧涉及酶的活性位点内的残留物的变化,特别是在已知占据S2底座的位置,并且对于确定蛋白酶的基质特异性至关重要(
      • 道尔顿J.P.
      • neill s.o.
      • 堆叠C.
      • 柯林斯P.
      • 沃尔河A.
      • Sekiya M.
      • Doyle S.
      • Mulcahy G.
      • 霍伊尔D.
      • Khaznadji E.
      • 莫雷·
      • 布伦南G.
      • 穆斯利A.
      • Kreshchenko N.
      • maule a.g.
      • 唐纳利下午
      Fasciola.. hepatica. cathepsin L-like proteases: biology, function, and potential in the development of first generation liver fluke vaccines.
      ,
      • 欧文J.A.
      • Spithill T.W.
      • 派克r.n.
      • 威士忌J.C.
      • Smooker下午
      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      ,
      • 侵权J.
      • Brindley P.J.
      • 诺克斯D.
      • wolfe K.H.
      • 道尔顿J.P.
      Helminth蛋白酶及其相关基因。
      )。有人建议这些变化产生了具有重叠和互补特异性的蛋白酶,使寄生虫可降解更广泛的大分子(
      • 道尔顿J.P.
      • neill s.o.
      • 堆叠C.
      • 柯林斯P.
      • 沃尔河A.
      • Sekiya M.
      • Doyle S.
      • Mulcahy G.
      • 霍伊尔D.
      • Khaznadji E.
      • 莫雷·
      • 布伦南G.
      • 穆斯利A.
      • Kreshchenko N.
      • maule a.g.
      • 唐纳利下午
      Fasciola.. hepatica. cathepsin L-like proteases: biology, function, and potential in the development of first generation liver fluke vaccines.
      ,
      • 欧文J.A.
      • Spithill T.W.
      • 派克r.n.
      • 威士忌J.C.
      • Smooker下午
      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      )。
      在本研究中,我们分析并表征了成人分泌的组织蛋白酶L蛋白酶的概况 F.Hepatica. 通过二维凝胶电泳(2-DE)
      使用的缩写是:2-de,二维凝胶电泳; ES,排泄和分泌; C7B.zO,3-(4-庚基)苯基-3-羟丙基)二甲基烷基丙二磺酸盐; 2-D,二维;割草,分子量搜索; Z,苄氧基羰基; NHMEC,7-(4-甲基)香豆酰胺。
      1使用的缩写是:2-de,二维凝胶电泳; ES,排泄和分泌; C7B.zO,3-(4-庚基)苯基-3-羟丙基)二甲基烷基丙二磺酸盐; 2-D,二维;割草,分子量搜索; Z,苄氧基羰基; NHMEC,7-(4-甲基)香豆酰胺。
      和MS确定各种组织蛋白酶L组对寄生虫毒力和适应的相对重要性。我们发现这些寄生虫分泌的组织蛋白酶L蛋白酶,其代表由系统发育鉴定的所有三种成年分层;然而,Clade 1(FHCL1)和CLADE 2(FHCL2)的蛋白酶是迄今为止最主要的,其符合其在家庭中提高差异和扩张。在成人阶段分泌产物中没有检测到仅来自传染性幼年阶段的蛋白酶,这表明这些蛋白酶通过肠壁启动宿主感染的特定作用。基因已知的疏水链1(FHCL1C)的亚片 F. Gigantica 但不是在 F.Hepatica. 也没有在分泌产物中代表 F.Hepatica. 寄生虫,支持欧文的建议 。 (
      • 欧文J.A.
      • Spithill T.W.
      • 派克r.n.
      • 威士忌J.C.
      • Smooker下午
      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      )在分离两种物种之后,该亚亚亚亚的亚数膨胀。比较生物化学和序列对准表明 F.Hepatica. 通过基因复制的方法建立了毒力相关的组织蛋白酶Ls的曲目,然后通过改进影响底物特异性的活性位点残留物。在突出和成熟酶之间的边界中也发生了思想的特异性变化,但保留了激活组织蛋白酶L Zymogens所需的特异性切割位点。

      实验步骤

       对准和系统发育分析 -

      使用32种选择来产生系统发育树 F.Hepatica.F. Gigantica 组织蛋白酶L DNA序列。 卡里卡番木瓜 木瓜纸(GenBank™登录号 M15203)用于根序列序列。用于树施工的所有核苷酸序列编码了包括突出区域的全长组织蛋白酶L前体蛋白,但不包括信号肽。 DNA序列最初使用CLUSTALW(
      • 汤普森J.D.
      • 希金斯D.G.
      • 吉布森T.J.
      群集W:通过序列加权,位置特定的间隙惩罚和重量矩阵选择提高逐行多序列对准的灵敏度。
      ),并且树木使用emga版本4.0的obotstraped(1000试验)邻接方法创建(
      • Kumar S.
      • Tamura K.
      • 诺米
      MEGA:微型计算机的分子进化遗传分析软件。
      )使用Kimura 2参数模型,所有站点的均匀速率。用于取向和系统发育分析的组织蛋白酶L序列的Genbank登录号如下:FHCL1A_IE1(U62288),fhcl1a_pe(AF490984),fhcl1a_au3(L33771),fhcl1a_pl(AY277628.),fhcl1a_pt1(AY519971.),fhcl1a_tr(AY573569.),fhcl1b_nl1(AY279092.),fhcl1b_ar(AY029229.),fgcl1c_id(AF510856.),fhcl1c_jpa(AB010923),fhcl1c_jpb(AB009306.),fgcl1c_cn(ef36899.),fgcl1c_tha(AF112566.),fgcl1c_thb(AF239264),fhcl2_jn3(AB010924.),fhcl2_ie2(U62289),fhcl2_chc(Z22765),fgcl2_thd(AF239266.),fhcl3_nl64(AJ279093.),fgcl3_thg(AF419329),fhcl3_nl22(AJ279091.),fhcl3_uy5(EU287914.),fhcl3_uy9(EU287915.),fhcl3_pl1(EU191984),fhcl3_pl2(EU195859.),fhcl4_uy7(EU287916),fhcl4_uy18(EU287917.),fgcl4_thh(AY428949.),fgcl5_thc(AF239265.),fhcl5_au4(L33772)和fhcl5_au5(AF271385)。命名方案反映了所识别的不同的曲线和互联网国家域所代表的序列的起源。
      散文地区 F.Hepatica.F. Gigantica 组织蛋白酶L蛋白酶使用CLUSTALW对齐(
      • 汤普森J.D.
      • 希金斯D.G.
      • 吉布森T.J.
      群集W:通过序列加权,位置特定的间隙惩罚和重量矩阵选择提高逐行多序列对准的灵敏度。
      )。通过去除预测的N-末端信号肽和成熟酶序列,通过去除预测的N-末端信号肽和成熟酶序列来截断26-氨基酸序列(残留物P1至P91,Fluke Copepsin L编号)。氨基酸共有序列由多环产生(
      • CORETET F.
      具有分层群集的多个序列对齐。
      )手动插入对齐。使用初级序列比对的组合鉴定出各种氟基蛋白LS的活性部位的S2袋的残留物(
      • 汤普森J.D.
      • 希金斯D.G.
      • 吉布森T.J.
      群集W:通过序列加权,位置特定的间隙惩罚和重量矩阵选择提高逐行多序列对准的灵敏度。
      )和分析最近确定的原子结构 F.Hepatica. 组织林L1(参考文献。
      • 堆栈c.m.
      • Caffrey C.R.
      • 唐纳利下午
      • Seshaadri A.
      • Lowther J.
      • 侵权行为J.F.
      • 柯林斯P.R.
      • 罗宾逊M.W.
      • 徐W.
      • McKErrow J.H.
      • Craik C.S.
      • 格雷德斯。
      • Marion R.
      • Brinen L.S.
      • 道尔顿J.P.
      在寄生肝氟克的毒力相关的组织蛋白酶L蛋白酶中的结构和功能关系, Fasciola.. hepatica..
      ;蛋白质数据库代码2o6x)并显示在 表二.
      表二形成人和F.Hepatica组织蛋白酶L蛋白酶S2活性位点的残基
      残余物
      6768133157160205
      人类组织素L.遇见遇见g
      成人
      FhCL1A遇见
      FhCL1B遇见
      FhCL1C遇见val / leu.
      FhCL2TYR.遇见
      FhCL5遇见g
      少年
      FhCL3TRP.遇见
      FhCL4ph遇见ph

       F.Hepatica排泄 - 分泌蛋白的制备 -

      成人 F.Hepatica.3周发作,从Merino羊的肝脏组织和胆管中回收(实验感染200元),并在普拉沃尔(37°C)0.1中洗涤 m PBS,pH 7.3。然后转移到含有2米的预制(37°C)RPMI 1640培养基(Invitrogen)中的氟克斯m l-glutamine,30米m HEPES,0.1%(w / v)葡萄糖和2.5μg/ ml庆大霉素,并在37℃下孵育8小时。含有的培养基 F.Hepatica. 合并排泄和分泌蛋白并使用中心柱(Millipore)浓缩,用3-KDA分子量截止至1mg / ml的终浓度,并在-20℃下储存等分试样。

       二维电泳和凝胶成像 -

      F.Hepatica. 用5体积的室温丙酮沉淀ES蛋白(100μg)并通过5000×离心回收 g 10分钟。蛋白质颗粒在proteopp(Sigma)提取溶液4中重新悬浮(7 m 尿素,2 m thiourea, 1% C7Bzo,40米m 三)。用5米降低样品m Tributylphosphine并用20米烷基化m 丙烯酰胺单体在单一的90分钟步骤中。随后通过添加10米淬火过量的丙烯酰胺m dtt。为了在第一尺寸中分离,通过再水化11-cm pH 4-7准备好IPG条(Bio-rad),主动装载样品(150μl),用100μl7 m 尿素,2 m thiourea, and 1% C7Bzo 30分钟。使用从100V至3kV的3-H凸斜面进行IEF,其中5-H线性斜坡进入10kV,其中电压保持直至使用异电仪达到100kV-H.2 IEF设备(蛋白质组系统)。聚焦后,IPG条在7中平均平衡 m urea, 250 mm Tris-HCl(pH8.8)和1%SDS(W / V)25分钟。为了在第二尺寸中分离,IPG条铺设在4-12%标准XT凝胶(Bio-rad)上,并在200V下运行45分钟或直至完成。分离后,通过用火烈鸟荧光蛋白染色(Bio-rad)染色来观察蛋白质。用Pharosfx激光成像系统(BIO-RAD)对染色的2-D凝胶成像,并且使用PDQuest版本8.01软件(BIO-RAD)确定归一化点数。光斑量表示图像中的斑点的总强度,并且对应于凝胶中斑点内的蛋白质的总量。在本研究中,使用下面的公式来使用高斯分析来确定点数:点高度×π×σ x × σy 位置高度是现场高斯表示的峰值,σx 是高斯分布的标准偏差 x axis, and σy 是高斯分布的标准偏差 y axis.

       质谱-

      为了切除肽斑点,在用10%甲醇(v / v)和7%乙酸(v / v)脱水之前,凝胶用胶体Coomassie蓝色G-250(Sigma)吹过过夜。使用具有PDQUEST软件(BIO-RAD)的Exquest机器人点切割器来切除选定的蛋白质点。切除的斑点是用胰蛋白酶(promega)消化的凝胶,并且使用CTEMPO纳米LC系统(Applied Biosystems)用C型纳米LC-ESI-MS / MS分析肽18 列(VYDAC)耦合到QSTAR ELITE混合Quadrupole-Quadrupole飞行时间(QQ-TOF)在信息相关的采集模式(应用生物系统)中运行的质谱仪。使用默认参数的蛋白导频版本1.0软件(应用生物系统)生成的峰值列表文件将导出到本地吉祥物版本2.1.0(Matrix Science)搜索引擎,用于蛋白质数据库搜索。

       数据库搜索 -

      MS / MS数据用于使用吉祥物版本2.1.0(MATRIX Science)的质谱蛋白序列数据库(MSDB)(MSDB)(MSDB)(MATRIX科学)进行3,239,079个条目,其酶特异性设为胰蛋白酶。将半胱氨酸的丙酰胺(丙烯酰胺)改性用作固定参数,并将甲硫醇的氧化设定为可变蛋白质修饰。将质量耐受性设定为前体离子的1.0Da,对于片段离子为0.3Da。只允许一个错过的乳沟。匹配达到分子量搜索(MOWSE)得分>70被认为是重要的(
      • 罗宾逊M.W.
      • Connolly B.
      蛋白质组学分析的排泄分泌蛋白质 Trichinella spiralis. L1幼虫,骨骼肌的线虫寄生虫。
      ,
      • 罗宾逊M.W.
      • Greig R.
      • Beattie K.
      • Lamont D.
      • Connolly B.
      对肌肉幼虫的排泄分泌蛋白质组的比较分析 Trichinella pseudospiralis.Trichinella spiralis..
      )。然而,在分配阳性识别时考虑了其他标准,包括蛋白质的理论分子量和Pi值与肽的观察到2-de之间的观察位置之间的一致性。要考虑到多个成员的匹配 Fasciola.. 组织林家族,我们寻找特异于单个酶或植物的肽(参见“结果”)。

       酶测定和含氟肽基材的动力学 -

      重组的活性 F.Hepatica. 组织蛋白酶L1(FHCL1A_IE1)和组织蛋白酶L2(FHCL2_IE2)酶(
      • 堆栈c.m.
      • Donnelly S.
      • Lowther J.
      • 徐W.
      • 柯林斯P.R.
      • Brinen L.S.
      • 道尔顿J.P.
      肝氟克的主要分泌的组织蛋白酶L1蛋白酶, Fasciola.. hepatica.:Leu-12在突出段的非可介质C末端区域中的Pro-12更换可防止完整的酶自动激活,并允许定义散射术中的分子事件。
      通过使用合成亚Z-Phe-Arg-NHMEC,Z-Leu-Arg-NHMEC和Z-Pro-Arg-NHMEC通过荧光测定法测定。通过使用生物TEKKC4微荧光计监测在370nm的激发波长和460nm的发射波长的释放中,通过监测荧光离去基团(NHMEC)的释放和460nm的发射波长的释放来测量荧光二肽基材的初始水解率。动力学常数 kKm 由非线性回归分析确定。在37℃下在一系列底物浓度下获得初始速率 Km (0.2–200 μm)和固定酶浓度(0.5-5℃m)。测定在0.1中进行 m PBS,pH 7.3,100米m 醋酸钠缓冲液,pH5.5,每个pH5.5含有2.5米m DTT and 2.5 mm EDTA.

      结果

       Fasciola. Codepsin L序列的系统发育分析 -

      之间的进化关系 F.Hepatica.F. Gigantica 通过构建自发邻接树,在分子水平上研究了在公共数据库和惠康信托桑格尔研究所寄存在公共数据库和惠康数据库中的组织蛋白酶L基因序列(46)。十四岁 Fasciola.. 组织蛋白酶L序列不是全长CDNA和/或仅不同少量核苷酸,因此可能代表不同的等位基因而不是单个基因(
      • 欧文J.A.
      • Spithill T.W.
      • 派克r.n.
      • 威士忌J.C.
      • Smooker下午
      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      ,
      • vichasri-grams s。
      • Sobhon P.
      • upathame.s.
      • Viyanant V.
      组织蛋白酶L编码基因的分子克隆与表征 Fasciola.. gigantica.
      )。这是可能的,也许可能在温带和热带地区(以额外的等位基因)发生三倍体粘性体积(具有额外的等位基因)(
      • 弗莱彻H.L.
      • hoey e.m.
      • ORR N.
      • Trudgett A.
      • FairWeather I.
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      三倍体在肝氟化中的发生和意义, Fasciola.. hepatica..
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      • itaGaki T.
      • Tsutsumi K.
      三倍体形式 Fasciola.. 在日本:遗传关系 Fasciola.. hepatica.Fasciola.. gigantica 由其2核rDNA确定。
      ,
      • Terasaki K.
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      • Shibahara T.
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      单性生理学中多倍体源性的形态学比较和假设 Fasciola.. sp.
      )。但是,克 。 (
      • vichasri-grams s。
      • Sobhon P.
      • upathame.s.
      • Viyanant V.
      组织蛋白酶L编码基因的分子克隆与表征 Fasciola.. gigantica.
      从Southern印迹分析中估计,至少10个由重复事件形成的组织蛋白酶L基因存在 F. Gigantica但是,由于所使用的严格杂交条件,不会检测到其他更差异的序列。直到主要的基因组序列信息可用于属的成员,因此等位基因变化对当前的曲目的贡献 Fasciola.. Codepsin LS仍然是完全确定的。
      24的系统发育分析 F.Hepatica. 和八 F. Gigantica 全长序列表明,这些分为由一系列基因重复产生的五种良好支持的枝条(Fig. 1)。两个初始基因重复从成年蠕虫阶段(Clades FHCL1,-2和-5)中表达的三个曲线分离出从感染性新源性的幼儿寄生虫(Clade 3,FHCL3和CLADE 4,FHCL4)分离的组织蛋白酶。在此之后,另一个基因重复导致成人的分离FHCL1和FHCL5从CLADE FHCL2中的分离。系统发育树也表明了 Fasciola.. CLADE FHCL1经历了最大的扩展,并由三个不同的亚基:FHCL1A,FHCL1B和FHCL1C表示。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1系统发育关系 Fasciola.. Compeopsin L基因家族。 呈现是一种引导(1000个试验)邻近的系统发育树,显示了进化关系 F.Hepatica.F. Gigantica 组织蛋白酶l cDNA序列。 数字 表示特定节点的引导值(给定为百分比),显示大于70%的值。 分支长度 与距离成比例。用于树施工的所有核苷酸序列编码组织蛋白酶L散射。树植根了 C. Papaya. 木瓜蛋白纸(Genbank登录号 M15203)。 括号数字 代表每个亚基点的相对表达水平(显示为由2-de可视化的总组织蛋白酶L级别的百分比)。每个序列的各种起源是在Genbank报道的所在位置的互联网国家代码的名称中表示。
      值得注意的是,所有的曲线都包含来自两者的序列 F.Hepatica.F. Gigantica。但是,Subclades FHCL1A和FHCL1B专门组成 F.Hepatica. 序列,而Clade FHCL1C仅包含一个 F.Hepatica. 组织蛋白酶L.后一种序列是从最有可能A的日本隔离物中鉴定出来的 F.Hepatica./F. Gigantica hybrid (
      • 欧文J.A.
      • Spithill T.W.
      • 派克r.n.
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      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
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      • Tsutsumi K.
      三倍体形式 Fasciola.. 在日本:遗传关系 Fasciola.. hepatica.Fasciola.. gigantica 由其2核rDNA确定。
      ),这表明Clade FHCL1C可能是独占的 F. Gigantica。因此,这种系统发育分析表明,组织蛋白酶L基因家族中的早期重复事件发生在 F.Hepatica.F. Gigantica 粉碎机和亚克拉氏亚克拉氏素的膨胀和FHCL1A和FHCL1C的膨胀发生在这两种物种的偏析之后发生。欧文 。 (
      • 欧文J.A.
      • Spithill T.W.
      • 派克r.n.
      • 威士忌J.C.
      • Smooker下午
      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      )制作了类似的观察,并表明FHCL1思工的分歧反映了“温带”的适应 F.Hepatica. 和“热带” F. Gigantica 到不同的宿主物种(参见“讨论”)。

       鉴定成人F.Hepatica-分泌的组织蛋白酶L蛋白酶

      被孤立的成年分泌的蛋白质 F.Hepatica.体外 培养从培养上清液中沉淀并分析2-de。使用电流样品制备方法和pH范围,在2-D凝胶上可见30个主要肽斑点和50个不同的分子量和Pi值的强烈肽 F.Hepatica. ES proteins (图2A)。为了鉴定分泌的组织蛋白酶L酶,将这些80个肽斑点从2-D凝胶中切除,并且使用纳米LC-ESI-MS / MS进行蛋白质组学分析。得到的离子质量数据用于搜索数据碱基。符合先前的蠕虫分泌蛋白质的蛋白质组学研究,分数>70被认为是重要的(
      • 罗宾逊M.W.
      • Connolly B.
      蛋白质组学分析的排泄分泌蛋白质 Trichinella spiralis. L1幼虫,骨骼肌的线虫寄生虫。
      ,
      • 罗宾逊M.W.
      • Greig R.
      • Beattie K.
      • Lamont D.
      • Connolly B.
      对肌肉幼虫的排泄分泌蛋白质组的比较分析 Trichinella pseudospiralis.Trichinella spiralis..
      )。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2成人代表2-de F.Hepatica. ES proteins.A,典型的成人二维谱 F.Hepatica. ES蛋白在pH范围4-7的第一尺寸中分离,然后在标准XT 4-12%梯度凝胶(Bio-rad)上的第二尺寸中。用火烈鸟荧光蛋白染色凝胶凝胶并用Pharosfx激光成像系统(Bio-rad)成像。 盒装地区 显示疏水板1a,1b,2和5的位置 Fasciola.. 在本研究中鉴定的组织蛋白酶Ls。 B,从另一个2-d凝胶的细节 盒装地区 显示在 A。选择用于通过质谱分析的肽斑点是 编号 并对应于识别 .
      虽然预测的所有分子量 F.Hepatica. 用于产生Phyl表的组织蛋白酶LS(成熟形式)是〜24kDa,预测的PI值大幅不同,范围为FHCL2_CHC至8.13的4.54,用于FHCL3_NL64(基于CDNA的概念翻译)。绝对地确定主要肽斑点的十五个主要肽斑点 F.Hepatica. 组织蛋白酶L蛋白酶(表I.图。2B)。这些显示出类似的24kDA的观察分子量,而PI值范围为4.36(点20)至6.42(点7)。另外的八个肽(斑点8,9,13,14,15,16,18和19)也与Fluke Codepsin LS相匹配;尽管这些是基于单一肽匹配分配的,目前他们的身份可以被视为暂定(数据未显示)。在2-D凝胶上的斑点18和19的位置表明它们尚未正确地解决,而斑点8,13,14,15,16和17可能是蛋白水解降解的结果,因为它们以低分子大迁移。 15明确识别的组织蛋白酶LS代表亚克斯FHCL1A(七个斑点),亚级FHCL1B(四个斑点),CLADE FHCL2(三个斑点),以及CLADE FHCL5(一个斑点)(图2A)。
      表I.纳米LC-ESI-MS / MS的成人F.Hepatica ES蛋白的鉴定
      Fasciola.. proteinGenBank名称Genbank登录号理论分子量(KDA)/ PI
      a 使用成熟酶的伯氨基酸序列计算理论分子量和PI值。
      观察到的分子量(KDA)/ PI迈克斯分数匹配的离子/肽离子分数相对表达
      %
      1fhcl1a_pe.Fh1_6
      b W. Barrantes,M. Marroquim,M. Lopez,P.Ho和C. Romero-Ramos,未发表的数据。
      AF49098424.1 / 5.2724.4 / 5.25117590.28 / vtgyytvhsgsevelk.495.03
      621.24 / nswgsywger69
      2fhcl1a_pt1.CatIP1
      c A. Castro,E. Magalhaes,J.Correia de Costa,F. Parra和P.Ferreira,未发表的数据。
      AY519971.24.0 / 4.9824.4 / 5.46167506.23 / esgyvtegk.444.43
      590.28 / vtgyytvhsgsevelk.54
      596.26 / nswglswger70
      3fhcl1a_pt2.CatIP2
      c A. Castro,E. Magalhaes,J.Correia de Costa,F. Parra和P.Ferreira,未发表的数据。
      AY519972.24.0 / 5.4524.4 / 5.69159590.29 / vtgyytvhsgsevelk.3810.53
      835.04 / nlvgsegpaaiavdvesdfmmmy.78(2个奥克西德)
      596.25 / nswlswger42
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      590.28 / vtgyytvhsgsevelk.55
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      f 该肽在FHCL1B_N11和FHCL5序列中发现。
      9510.02
      511.25 / YNEQLGVAK.68
      590.28 / vtgyytvhsgsevelk.40
      596.26 / nswglswger37
      11fhcl1b_n11.CatL1
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      AJ27909224.1 / 5.1422.7 / 5.06175724.81 / FGLETESSYPYR.
      f 该肽在FHCL1B_N11和FHCL5序列中发现。
      815.92
      590.28 / vtgyytvhsgsevelk.38
      596.26 / nswglswger53
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      f 该肽在FHCL1B_N11和FHCL5序列中发现。
      908.92
      511.25 / YNEQLGVAK.74
      590.28 / vtgyytvhsgsevelk.60
      596.27 / nswglswger59
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      604.28 / vtgyytvhsgdeielk.33
      21fhcl2_chc.FHPRC.
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      856.86 / asasfseqqlvdctr.103
      604.28 / vtgyytvhsgdeielk.49
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      h 该肽在胰蛋白质2和CLADE 5序列中发现。
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      604.28 / vtgyytvhsgdeielk.43
      863.85 / nswgtwwgedgyir.
      h 该肽在胰蛋白质2和CLADE 5序列中发现。
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      h 该肽在胰蛋白质2和CLADE 5序列中发现。
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      h 该肽在胰蛋白质2和CLADE 5序列中发现。
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      单个氨基酸取代会影响半胱氨酸蛋白酶的底物特异性 Fasciola.. hepatica..
      .
      AF27138524.4 / 4.7522.8 / 4.73151724.81 / FGLETESSYPYR.
      f 该肽在FHCL1B_N11和FHCL5序列中发现。
      754.98
      863.85 / nswgtwwgedgyir.
      h 该肽在胰蛋白质2和CLADE 5序列中发现。
      77
      a 使用成熟酶的伯氨基酸序列计算理论分子量和PI值。
      b W. Barrantes,M. Marroquim,M. Lopez,P.Ho和C. Romero-Ramos,未发表的数据。
      c A. Castro,E. Magalhaes,J.Correia de Costa,F. Parra和P.Ferreira,未发表的数据。
      d 参考。
      • kuk s.
      • Kaplan M.
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      • Felek S.
      • Kalkan A.
      Fasciola.. hepatica. cathepsin L1 from a Turkish isolate is related to Asian isolates.
      .
      e 参考。
      • Cornelissen J.B.
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      • 荷兰W.G.
      • 哈姆森
      • Boersma W.J.
      使用重组使用重组的反刍动物的早期免疫血管层 Fasciola.. hepatica. 组织蛋白酶L样蛋白酶。
      .
      f 该肽在FHCL1B_N11和FHCL5序列中发现。
      g 参考。
      • Heussler V.T.
      • dobbelaere d.a.
      克隆蛋白酶基因家族 Fasciola.. hepatica. 通过聚合酶链反应。
      .
      h 该肽在胰蛋白质2和CLADE 5序列中发现。
      i 参考。
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      • 派克r.n.
      单个氨基酸取代会影响半胱氨酸蛋白酶的底物特异性 Fasciola.. hepatica..
      .
      在成人ES蛋白中未检测到Clades FHCL3和FHCL4的代表。然而,这证明了我们的系统发育数据,因为衍生自属于这些曲囊的基因的序列仅从感染幼年物中分离,因此可能不会被成人寄生虫表达和分泌(
      • 哈姆森
      • Cornelissen J.B.
      • Buijs H.E.
      • Boersma W.J.
      • jeurissen s.h.
      • 范米格根F.J.
      鉴定一个小说 Fasciola.. hepatica. 组织蛋白酶L含有肽在肽内的保护性表位。
      )。 F.Hepatica. 也没有鉴定代表思工FHCL1C的酶;这种系统发育疏水性植物仅被检测到 F. Gigantica 或者 F.Hepatica./F. Gigantica 混合动力车(见上文)。
      Fasciola.. 组织蛋白酶LS在氨基酸水平上高度保守;因此,胰蛋白酶肽可能与酶家族的多个成员匹配。要考虑到这种潜在的冗余,我们寻找与序列特异性或特定思路特异性肽的匹配。鉴定为疏水片1酶的所有肽斑点(具有斑点5的异常)与CLADE 1特异性序列(离子)匹配(离子)匹配(离子)vtgyytvhsgsevelk(离子) m/z 590)。斑点5的胰蛋白酶摘要显示了MS / MS之后的离子(m/z 590.37)可能是相同的肽,尽管它与用于在当前研究中搜索的数据库搜索的高度严格标准不匹配。另一个思工1个特异性肽,nswglswger(离子 m/z 596),在几乎所有这些斑点中匹配(斑点1和17除外)。斑点1被鉴定为FHCL1A_PE,这是通过离子的存在来支持(m/z 621)对应于仅在该酶中发现的Nswgsywger的氨基酸序列。此外,在该肽点的理论和观察到的分子量和Pi值之间存在几乎完全匹配。斑点2和3被确定为 Fasciola.. Capeopsin LS FHCL1A_PT1和FHCL1A_PT2分别。成熟酶在氨基酸水平上显示出96%的序列同一性,但通过FHCL1A_PT2特异性离子的存在来区分(m/z 835具有两个氧化甲硫氨酸)在从斑点3获得的质谱中。在不存在任何FHCL1A_PT1特异性离子的情况下,其作用作为该酶必须保持暂定,尽管590和596离子的存在支持其鉴定一种思考1酶。将4-7分配给FHCL1A_TR。与470斑点4和5匹配的氨基酸序列ESGEVTGVK也存在于FHCL1A_PT2和FHCL1B_NL1的主要序列中。然而,在从支持其作为FHCL1A_TR酶的这些斑点获得的质谱中检测到没有FHCL1A_PT2-或FHCL1B_NL1特异性离子。对于斑点6和7未观察到470个离子,但是590和596离子的存在再次支持其鉴定作为思考1酶。将四个斑点识别为FHCL1B_NL1(斑点10-12和17)。一个离子(m/z 724)与所有四个斑点的质谱中存在匹配Fgleteressypyr的氨基酸序列。虽然该序列也存在于Clade 5组织蛋白酶LS中,但是疏水液1特异性离子的存在(m/z 590和596)支持其作为FHCL1B_NL1酶的作用。将另外三个斑点鉴定为疏水液2酶FHCL2_CHC(斑点20-22)。来自这些斑点的质谱含有几个离子2特异性氨基酸序列,包括DyyyVtegk(m/z 590),vtgyytvhsgdeielk(m/z 604),和Lthavlavgygsqdgtdywivk(m/z 798)以及离子(m/z 856)与FHCL2_CHC特异性氨基酸序列asasfseqqlvdctr匹配。理论和观察到的分子量和PI值也密切关联这些斑点。因此,作为FHCL2_CHC的斑点20-22的分配被认为是非常稳健的。分配单点(点23),分配给汉族5酶FHCL5_AU5。来自斑点23的质谱含有两种离子(m/z 724和863)与疏水素5组织蛋白酶Ls匹配的肽,也可以分别匹配FHCl1b_nl1和疏水素2序列。在理论和观察分子质量/ pi值之间的缺失与理论和观察分子质量/ pi值之间的出色匹配一起强烈支持鉴定表23作为思考5组织蛋白酶L.

       分泌F.Hepatica组织蛋白LS的相对表达水平 -

      对来自几个成像2-D凝胶的肽斑点进行密度测定法 F.Hepatica. ES蛋白质量化相对于彼此的每种酶的表达水平。每个斑点的原始数据被转换为凝胶中的组织蛋白酶L总量的百分比(Fig. 1表I.)。 CLADE FHCL1的组织蛋白酶占含有Subclades FHC1A和FHCL1B的总组织蛋白蛋白的67.39%,分别表示该值的35.30和32.09%。 CLADE FHCL2占总分泌的组织蛋白酶蛋白水平的27.63%,而代表疏水液的单点FHCL5酶占4.98%。

       活性部位S2底座的变异及其对酶动力学的影响 -

      组织蛋白酶L半胱氨酸蛋白酶的底物特异性由氨基酸的组成和排列确定,该组合物和排列产生活性位点的S2底座的生物化学特性(
      • 土耳其人D.
      • Guncar G.
      • Podobnik M.
      • 土耳其人B.
      修复了木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶的底物结合位点的定义。
      )。使用主要序列对准和原子结构分析 F.Hepatica. 组织蛋白酶L1,该袋中的关键残留物与基板的P2氨基酸相互作用,已被鉴定为位于位置67,68,133,157,160和205(
      • 堆栈c.m.
      • Caffrey C.R.
      • 唐纳利下午
      • Seshaadri A.
      • Lowther J.
      • 侵权行为J.F.
      • 柯林斯P.R.
      • 罗宾逊M.W.
      • 徐W.
      • McKErrow J.H.
      • Craik C.S.
      • 格雷德斯。
      • Marion R.
      • Brinen L.S.
      • 道尔顿J.P.
      在寄生肝氟克的毒力相关的组织蛋白酶L蛋白酶中的结构和功能关系, Fasciola.. hepatica..
      )。占据各种系统发育腕表中占据这些位置的氨基酸的比较 F.Hepatica. Compeopsin L家族被介绍 表二 并且揭示了许多可能对其基材偏好产生关键影响的替换。特别地,蛹之间的最差异发生在位置67(Leu,Tyr,TRP或PHE)和205(Leu,Val或PhE)的残留物中,所认为残留物对于基材识别最重要。在第157位,也观察到变化,其位于S2口袋的开口并充当影响可以进入口袋的残留物的残留物的残余物(
      • 堆栈c.m.
      • Caffrey C.R.
      • 唐纳利下午
      • Seshaadri A.
      • Lowther J.
      • 侵权行为J.F.
      • 柯林斯P.R.
      • 罗宾逊M.W.
      • 徐W.
      • McKErrow J.H.
      • Craik C.S.
      • 格雷德斯。
      • Marion R.
      • Brinen L.S.
      • 道尔顿J.P.
      在寄生肝氟克的毒力相关的组织蛋白酶L蛋白酶中的结构和功能关系, Fasciola.. hepatica..
      )。有趣的是,在157的位置,CLADE FHCL1的FHCL1A和FHCL1B之间的唯一区别在于157的位置;然而,这里的氨基酸始终是疏水性虱或缬氨酸。
      为了证明活性位点的S2袋中发现的变化的影响,使用衍生自表示主要分泌成员的序列的纯化的重组蛋白酶进行衬底动力学研究 F.Hepatica. 片状,FHCL1(FHCL1A_IE1)和FHCL2(FHCL2_IE2)。获得动力常数,用于在其P2位点处具有不同残基的三种荧光肽基材:Z-Phe-Arg-NHMEC,Z-Leu-Arg-NHMEC和Z-Pro-Arg-NHMEC(表III)。全面的 F.Hepatica. Codepsin L1显示了亲和力(k/Km)对于命令Z-Leu-Arg-NHMEC中的基板>z-phe-arg-nhmec»z-pro-arg-nhmec,而对于 F.Hepatica. 组织蛋白酶L2亲和力的顺序是Z-Leu-Arg-NHMEC»Z-PHE-ARG-NHMEC≈Z-Pro-Arg-NHMEC。两种酶都显示出较低的pH下Z-PHE-ARG-NHMEC和Z-Leu-Arg-NHMEC的较高亲和力(与pH7.3相比,平均在pH5.5的亲和力下的2倍。对于这两种基质催化率(k/KmCapeopsin L1显着大于组织蛋白酶L2(对于Z-Phe-Arg-NHMEC的〜25倍,并且在两个pH值下Z-Leu-Arg-NHMEC的平均较高8倍)。然而,尽管表达素L1和L2对P2位置的脯氨酸的基材显示出较低的亲和力,但是组织蛋白酶L2对Z-Pro-Arg-NHMEC显示出更好的偏好,其在pH 5.5下对该基材具有〜6倍的亲和力在pH 7.3的3倍比表达素L1更高的亲和力。
      表III重组F.Hepatica组织蛋白酶L蛋白酶的酶动力学
      pH 7.3pH 5.5
      kKmk/KmkKmk/Km
      s−1μmm−1 s−1s−1μmm−1 s−1
      Z-FR-NMEC
      Compeopsin L1 2.04±0.433.03±1.08673,26724.69±1.30.24.18±3.921,021,092
      组织林L20.40±0.0316.02±2.9024,9691.70±0.0739.94±5.1242,564
      Z-LR-NMEC
      Compeopsin L1 11.02±0.233.55±0.323,104,22536.52±0.634.35±0.218,395,402
      组织林L23.16±0.224.85±0.99651,5461.62±0.081.39±0.201,165,467
      Z-PR-NMEC
      Compeopsin L1 1.74±0.22181.86±13.449,5681.03±0.04191.21±16.905,387
      组织林L21.90±0.1775.21±12.5625,2632.64±0.1384.03±11.2831,417

       FASCIOLA CADEPSIN L PROSEGMENT的生物信息学分析 -

      组织蛋白酶Ls储存在寄生虫的肠道上皮细胞内的专用分泌囊泡中,作为由突出和成熟酶结构域组成的无活性酶(
      • Roche L.
      • Dowd A.J.
      • 侵权J.
      • 麦格尼格尔S.
      • Macsweeney A.
      • CURLEY G.P.
      • Ryan T.
      • 道尔顿J.P.
      功能表达 Fasciola.. hepatica. Compeopsin L1 In. 酿酒酵母酿酒酵母.
      )。在分泌到寄生虫肠后,通过催化切割除去散分,以显示活性成熟蛋白酶(
      • 道尔顿J.P.
      • Caffrey C.R.
      • Sajid M.
      • 堆叠C.
      • Donnelly S.
      • Loukas A.
      • 别。
      • McKErrow J.
      • 哈尔顿D.W.
      • Brindley P.J.
      虫草中的蛋白酶。
      )。我们的研究表明,成人分泌的所有组织蛋白酶L蛋白酶 F.Hepatica. 缺乏散装,因此完全加工成熟酶。
      仅使用散射域的系统发育分析 Fasciola.. 本研究中使用的组织蛋白酶LS产生了类似于介绍的树 Fig. 1 表示突出和成熟域的并行适应(数据未显示)。 PROSEGENTS(残基P1至P91)的对准表明,这些酶的N-末端和中间区域(残留物P1至P70)在所有组织蛋白酶L曲线上显着保守(Fig. 3)。但是,特别值得注意的是,C终端部分 F.Hepatica. 组织蛋白酶L PROSEGMENTS(21个残基,P70至P91)显示了系统发育型切口之间的显着变异,但在每个落后植物中被保守。这在最终五个残留物中特别明显,形成突出和成熟酶之间的边界,并使每个曲折均为签名序列,如图所示 Fig. 3。尽管该签名部分缺乏守恒,但每个仍然仍然保​​留ASN残留物,从而保留高度特异性的裂解部位 trans - 加工酶浅酰胺烯醇纤维素酶,其引起或“启动”酶活化过程(
      • 道尔顿J.P.
      • Caffrey C.R.
      • Sajid M.
      • 堆叠C.
      • Donnelly S.
      • Loukas A.
      • 别。
      • McKErrow J.
      • 哈尔顿D.W.
      • Brindley P.J.
      虫草中的蛋白酶。
      )。在散核的非保守C末端区域内的另一个高度保守的特征是Leu-Ser〗他所示的基序对于一旦通过浅冬烷基内肽酶开始激活(
      • 堆栈c.m.
      • Donnelly S.
      • Lowther J.
      • 徐W.
      • 柯林斯P.R.
      • Brinen L.S.
      • 道尔顿J.P.
      肝氟克的主要分泌的组织蛋白酶L1蛋白酶, Fasciola.. hepatica.:Leu-12在突出段的非可介质C末端区域中的Pro-12更换可防止完整的酶自动激活,并允许定义散射术中的分子事件。
      )。可以看出 Fig. 3 这种切割遗址在成人的所有酶肉类中都是保守的 F.Hepatica. 在成人FHCL2思工中对Leu-Ser↓arg的显着变化以及感染少年FHCL3思工中的Leu-Ser↓Asp。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3初级序列对齐姿势来自 Fasciola.. 组织蛋白酶L蛋白酶。 Clustalw对齐 F.Hepatica.F. Gigantica 显示表明L散射术氨基酸序列。用于对准的残基从去除N-末端信号肽的位点延伸到成熟酶切割位点。所有的全面共识序列 Fasciola.. cathepsin Ls (FHCL共识)显示在 最佳 对准以及单个植物的共识序列(cl1a共识, CL1B共识, 等等)。对齐中的间隙由a表示 短跑 ( - )和在所有序列中保存的氨基酸由a表示 (。)。散痕残留物 大写字母;成熟酶的第一个氨基酸在 小写字母。 GXNXFXD主题(
      • 梨窝T.
      • berti p.j.
      • de montigny c.
      • 摩尼尔r.
      • Tessier D.C.
      • 梅纳德
      • Magny M.C.
      • Storer A.C.
      • Thomas d.y.
      蛋白质前体的加工。 Pro区内的保守氨基酸基序的电离状态参与分子内加工的调节。
      )和Leu-Ser-His Motif(
      • 堆栈c.m.
      • Donnelly S.
      • Lowther J.
      • 徐W.
      • 柯林斯P.R.
      • Brinen L.S.
      • 道尔顿J.P.
      肝氟克的主要分泌的组织蛋白酶L1蛋白酶, Fasciola.. hepatica.:Leu-12在突出段的非可介质C末端区域中的Pro-12更换可防止完整的酶自动激活,并允许定义散射术中的分子事件。
      [中显示了Compactopsins所需的) 粗体字。突出和成熟结构域交界处的保守ASN残基 灰色着色.

      讨论

      寄生虫物种在自然中的寿命依赖于其入侵新主持人的能力(
      • Littlewood D.T.J.
      扁虫寄生症的演变。
      )。 F.Hepatica.,牛和羊的蠕虫寄生虫,是欧洲起源,但由于欧洲人的全球殖民地和牲畜的相关持续出口,它的地理分布已经扩大到过去5世纪。然而,寄生虫的扩张非常促进了适应新主持人的显着能力;因此,即使在最近遇到的种类和南美洲,非洲的骆驼和澳大利亚的喀卡罗斯等骆驼和羊驼等物种,寄生虫也可以发展,成熟,并产生可行的后代。
      • Mas-Coma S.
      • 禁止M.D.
      • valero m.a.
      Fascioliaisis和其他植物 - Bourne Trematode Zoonoss。
      )。 F.Hepatica. 还感染了各种各样的野生动物,包括鹿,兔,野兔,公猪,海狸和水獭,这些动物统称是主要的水库主持人群体,这些人占患有疾病的全球传播和当地传输模式的大大贡献。 F. Gigantica 分歧 F.Hepatica. 1700万年前(
      • 欧文J.A.
      • Spithill T.W.
      • 派克r.n.
      • 威士忌J.C.
      • Smooker下午
      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      )在亚洲和远东地区渗透了更多的热带地区,是牛和水牛的主要寄生虫病(
      • Macmanus D.P.
      • 道尔顿J.D.
      对抗动物疫苗的疫苗 日本血吸虫瘤, Fasciola.. hepatica.Fasciola.. gigantica.
      )。在过去的15年里,人体裂变病是在南美洲,埃及,泰国和伊朗的Andean国家的重要动物学疾病中,动物疾病高度普遍性和农业管理实践的所有地区允许通过感染污染食用水生植物少年幼虫(
      • Mas-Coma S.
      • 禁止M.D.
      • valero m.a.
      Fascioliaisis和其他植物 - Bourne Trematode Zoonoss。
      ,
      • Parkinson M.
      • o'neill s.m.
      • 道尔顿J.P.
      玻利维亚Altiplano的流行人体裂变症。
      )。
      组织蛋白酶L蛋白酶最有可能发挥,并继续发挥作用,在将这些蠕虫寄生虫调整到新的宿主物种中的关键作用(
      • 道尔顿J.P.
      • neill s.o.
      • 堆叠C.
      • 柯林斯P.
      • 沃尔河A.
      • Sekiya M.
      • Doyle S.
      • Mulcahy G.
      • 霍伊尔D.
      • Khaznadji E.
      • 莫雷·
      • 布伦南G.
      • 穆斯利A.
      • Kreshchenko N.
      • maule a.g.
      • 唐纳利下午
      Fasciola.. hepatica. cathepsin L-like proteases: biology, function, and potential in the development of first generation liver fluke vaccines.
      ,
      • 欧文J.A.
      • Spithill T.W.
      • 派克r.n.
      • 威士忌J.C.
      • Smooker下午
      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      ,
      • 侵权J.
      • Brindley P.J.
      • 诺克斯D.
      • wolfe K.H.
      • 道尔顿J.P.
      Helminth蛋白酶及其相关基因。
      )。 Fasciola.. 组织蛋白酶Ls具有几种明确的功能,对寄生虫 - 宿主生物学至关重要,包括宿主大分子的降解和免疫应答的抑制(如需审查,请参阅参考文献。
      • 道尔顿J.P.
      • neill s.o.
      • 堆叠C.
      • 柯林斯P.
      • 沃尔河A.
      • Sekiya M.
      • Doyle S.
      • Mulcahy G.
      • 霍伊尔D.
      • Khaznadji E.
      • 莫雷·
      • 布伦南G.
      • 穆斯利A.
      • Kreshchenko N.
      • maule a.g.
      • 唐纳利下午
      Fasciola.. hepatica. cathepsin L-like proteases: biology, function, and potential in the development of first generation liver fluke vaccines.
      )。在本研究中,我们展示了成年人 F.Hepatica. 分泌具有不同底物特异性的各种蛋白酶。以前的蛋白质组学研究表明,唯一被住在胆管内的成人蠕虫分泌的蛋白质是组织蛋白酶L蛋白酶(
      • 格栅下午
      • 赖特H.A.
      • 加湿e.j.
      • 伍兹D.J.
      • 冰球下午
      肝氟克释放的排泄蛋白质的比较蛋白质组学 Fasciola.. hepatica. 在绵羊主机胆汁和期间 体外 culture ex host.
      ),我们 体外 实验表明,这些在估计0.5-1.0μg/ parasite / h(培养物)中以丰度(具有可能是培养方法的伪影的其他次要蛋白质)分泌
      • 道尔顿J.P.
      • Caffrey C.R.
      • Sajid M.
      • 堆叠C.
      • Donnelly S.
      • Loukas A.
      • 别。
      • McKErrow J.
      • 哈尔顿D.W.
      • Brindley P.J.
      虫草中的蛋白酶。
      )。当认为胆管内部的胆管内部需要消化大量宿主红细胞(350×10时,这种高水平的酶生产并不令人惊讶。6/ h)支持巨大的后代生产(30-50,000个鸡蛋/天/蠕虫;参考。
      • 道尔顿J.P.
      • Caffrey C.R.
      • Sajid M.
      • 堆叠C.
      • Donnelly S.
      • Loukas A.
      • 别。
      • McKErrow J.
      • 哈尔顿D.W.
      • Brindley P.J.
      虫草中的蛋白酶。
      )。对组织蛋白酶LS的沉重依赖性也在高基因转录速率中反映,因此,发现从成年氟菌细胞制备的〜5000种表达序列标签库中的〜10%CDNA编码组织蛋白酶L蛋白酶(参考文献。
      • 道尔顿J.P.
      • Caffrey C.R.
      • Sajid M.
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      • Donnelly S.
      • Loukas A.
      • 别。
      • McKErrow J.
      • 哈尔顿D.W.
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      虫草中的蛋白酶。
      并惠康信任桑格学院蠕虫数据库)。
      系统发育分析 Fasciola.. 组织蛋白酶L基因序列表明,这家蛋白酶通过基因重复和分解为五个主要的植物(参考文献。
      • 道尔顿J.P.
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      • 沃尔河A.
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      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      这项研究)。然而,目前尚不清楚来自寄生虫的所有这些曲巾的蛋白酶是否分泌,因此在寄生术相互作用中发挥作用。因此,我们对成人寄生虫的分泌产物进行了蛋白质组学表征,特别关注鉴定蛋白酶。我们发现代表成人组织蛋白酶L的肽斑点是FHCL1,FHCL2和FHCL5,但没有鉴定FHCL3和FHCL4蛹的成员。这表明表达了 Fasciola.. 组织蛋白酶Ls是发育调节的,与少年氟尿布的FHCL3和FHCL4基因的特异性表达一致。或者,FHCL3和FHCL4基因可以编码未通过成人分泌的蛋白酶 F.Hepatica. 而是表现出蛋白质周转,膜生物发生或鸡蛋生产等内部功能。
      三个成人组织蛋白酶L曲折在分泌物中蛋白质表达水平的平等比例没有表示,并且这种情况稍微相当于系统发育研究中发现的基因的多样性(图。 12表I.)。 Clades FHCL1和FHCL2含有八个和四个成员在当前基因家族中,分别占67.39%(11个斑点)和27.63%(三个斑点)分别由2-de观察到的总分泌的组织蛋白酶Ls。相比之下,CLADE FHCL5含有三个成员,但由单一肽点表示,仅贡献4.98%至分泌蛋白酶的总量。基因分歧和蛋白质产生的水平可能会反映每个酶的相对需要,以在寄生虫感染期间进行它们发挥的功能。
      对组织蛋白酶L家族的关键S1和S2活性位点残留的分析表明,所有氟膜组织蛋白LS都是功能性的(IE。没有堕落的活跃点),这意味着一个正方形的进化驱动器,以产生功能活性蛋白酶的曲目。然而,检查负责确定底物特异性的S2底物残留物在三个最有影响力的位置明确表现出阳性选择, IE。在残留物67,157和205中,我们使用的生物化学数据使用的疏水链1(FHCL1A)和CLADE 2(FHCL2)蛋白酶提供 表III 展示这些职位的变化有多有效;例如,FHCL1A(Leu-67,Val-157和Leu-205)用催化速率与疏水残留物(PHE和LeU)的液体裂解底物(k/Km(分别比FHCL2(Tyr-67,Leu-157和Leu-205)分别为25-和8倍。相反,FHCL1A对P2位置的具有PRO的基板具有低偏好。这表明思工1酶的活性位点已经打开以适应更大的残留物,并且可以以更高的效率切割这些残留物。另一方面,FHCL2容易容纳P2 Pro残留物,表明进化轨迹,然后是疏水性疏水性残留件的活性位点变化,允许更好的疏水性残留物的变化。最近堆栈 。 (
      • 堆栈c.m.
      • Caffrey C.R.
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      在寄生肝氟克的毒力相关的组织蛋白酶L蛋白酶中的结构和功能关系, Fasciola.. hepatica..
      )与FHCL2中的S2底座容纳Pro的能力相关,其能够切割天然胶原蛋白,其含有Gly-Pro的重复基序X。因为胶原蛋白是间隙矩阵的主要成分,包括胆管壁,这种性质将提供寄生虫与用于降解和渗透宿主组织的工具,从而使其能够从下面的血管上喂食血液。有趣的是FHCL5,它在FHCL1发散之前从FHCL2分歧(见 Fig. 1),表现出中间S2底座(Leu-67,Leu-157和Leu-205),并且不容易容纳具有P2脯氨酸残基的基材(
      • Smooker下午
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      单个氨基酸取代会影响半胱氨酸蛋白酶的底物特异性 Fasciola.. hepatica..
      )。因此,可以设想 Fasciola.. 演化了一系列具有重叠底物特异性的酶,以产生更有效的组织降解蛋白酶分泌系统。
      FHCL1A和FHCL1的FHCL1B亚克拉片 F.Hepatica. 序列。相反,FHCL1C亚克片由四个cDNA序列表示 F. Gigantica 只有一个来自 F.Hepatica./F. Gigantica 从日本孤立中鉴定的杂交(
      • 欧文J.A.
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      三倍体形式 Fasciola.. 在日本:遗传关系 Fasciola.. hepatica.Fasciola.. gigantica 由其2核rDNA确定。
      )。这种清晰的分离表明,在分歧后发生了亚克/ FHCL1A / FHCL1B和FHCL1C的缩减 F.Hepatica.F. Gigantica 物种。欧文 。 (
      • 欧文J.A.
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      酶特异性的演变 Fasciola.. spp.
      )建议在两者中单独扩展这些亚洲 Fasciola.. 物种反映了这些寄生虫对不同宿主品种和物种的适应: F.Hepatica. 通常在温带地区感染牛和绵羊,而 F. Gigantica 在亚洲和远东的热带地区已经穿透了热带地区,是牛和水牛的主要寄生疾病(
      • Macmanus D.P.
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      对抗动物疫苗的疫苗 日本血吸虫瘤, Fasciola.. hepatica.Fasciola.. gigantica.
      )。
      通过在成人群体的分泌蛋白质组中完全没有其他内蛋白酶,进一步强调了对组织蛋白酶L蛋白酶的重要性进一步强调。以前的研究发现了显着的组织蛋白酶B半胱氨酸蛋白酶的转录物 F.Hepatica.F. Gigantica 感染幼年和未成熟的肝脏阶段,但这些在成人寄生虫中的表达低(
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      组织素B编码基因的阶段和组织特异性表达的分子克隆与分析 Fasciola.. gigantica.
      )。另外使用抗血清饲养对重组的免疫印迹实验 F.Hepatica. 组织蛋白酶B检测到未成熟寄生虫分泌的蛋白质中的这种蛋白酶,但不是成人寄生虫(
      • 法律r.h.
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      少年克隆和表达主要分泌的组织蛋白酶B样蛋白 Fasciola.. hepatica. 肝氟化感染后免疫原性分析。
      )。这些数据意味着留在胆管中的成熟寄生虫的内含药物,主要涉及饲喂宿主血液,因为寄生虫存在于免疫安全位置,仅由组织蛋白酶LS(
      • 道尔顿J.P.
      • neill s.o.
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      • 柯林斯P.
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      Fasciola.. hepatica. cathepsin L-like proteases: biology, function, and potential in the development of first generation liver fluke vaccines.
      )。相比之下,感染性寄生虫幼虫不仅必须穿透宿主的肠壁,还必须在肝脏的大型组织质量上进行途径,同时防止免疫发作。因此,可能需要更大范围的酶类型来完成这些多个任务。最近使用RNA干扰方法的报告证明了感染性幼稚中的组织蛋白酶B或组织蛋白酶L转录物的敲低降低了它们穿透宿主的肠壁的能力,并暗示了宿主入侵中的两种酶类型的作用(
      • 麦格尼格勒L.
      • 穆斯利A.
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      • maule a.g.
      沉默半胱氨酸蛋白酶 Fasciola.. hepatica. 使用RNA干扰的新源性青少年减少了肠道渗透。
      )。然而,组织蛋白酶L表达的干扰可能对侵袭的影响越大,因为感染性少年特异性组织蛋白酶Ls特别适合于该功能。半胱氨酸蛋白酶也涉及皮肤穿透寄生虫的侵袭过程 Schistosoma Mansoni (
      • 道尔顿J.P.
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      • 琼斯米克。
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      半胱氨酸蛋白酶 Schistosoma Mansoni cercariae.
      ) 和 Trichobilharzia Regenti. (
      • KasšnyáM.
      • 道尔顿J.P.
      • MikesšL.
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      半胱氨酸和丝氨酸肽酶活性的比较 Trichobilharzia Regenti.Schistosoma Mansoni cercariae.
      )指向这些震颤中的宿主入侵的共同机制。
      基因复制被认为是所有生物体产生具有新功能的分子的主要意味着;然而,由于基因组序列信息的可用性增加,这一切发生的机制已成为大量争论的主题(
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      )。在大量引用的早期理论上由OHNO提出(
      • ohno s.
      基因复制的演变。
      )在复制事件之后,新函数出现,并且一对重复基因之一的最常见命运是失去功能。然而,更新的理论表明,祖先基因在重复之前具有多种功能,然后通过随后的阳性选择来保存和精制在重复的基因中,以便以不同的功能进化常规功能(
      • Piatigorsky J.
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      基因重复后功能新型蛋白的演变 Proc。 R. SoC。伦德.
      )。很可能扩大了 Fasciola.. 组织蛋白酶L基因家族因赋予家庭成员的底物特异性重叠而通过重复和改进机制来源。在这种情况下,感染幼年物(FHCL3)表达的基因是具有它产生的FHCL4,FHCL2,FHCL5和FHCL1谱系的组合性质的祖先基因。然而,在细化过程中,特别是在成人阶段,可以仅仅是几种基因表示的FHCL5疏水性并且表达不当,变得非常重要,并且其作用逐渐被扩张所超越并且高表达FHCL1和FHCL2酶。预计存在现有的FHCL1和FHCL2酶之间的伙伴关系将被维持,因为各自具有完全不同的特异性,其提供成人寄生虫的优点,能够粘合更广泛的靶蛋白/组织基材并具有更高的效率。
      F.Hepatica. 组织蛋白酶在胃胚胎上皮细胞内合成并储存在分泌囊泡中作为无活性酶(
      • 柯林斯P.R.
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      • o'neill s.m.
      • Doyle S.
      • Ryan T.
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      • maule a.g.
      • 道尔顿J.P.
      • Donnelly S.
      组织蛋白酶L1,患有肝氟基的主要蛋白酶(Fasciola.. hepatica.)毒力:从胃胚胎细胞分泌的Zymogens的敏感性和自动激活。
      )。 Zymogens含有N-末端延伸或散痕,通过与衬底裂缝来调节组织蛋白酶活性(
      • 库仑R.
      • Grochulski P.
      • Sivaraman J.
      • 梅纳德
      • Mort J.s.
      • Cygler M.
      人类procathepsin L的结构揭示了突出抑制的分子基础。
      )用作分子伴侣,以确保正确折叠酶(
      • Cappetta M.
      • 罗斯I.
      • 迪亚兹A.
      • 侵权J.
      • Roche L.
      散步的作用 Fasciola.. hepatica. 组织蛋白酶L1在催化结构域的折叠中。
      )。通过去除散射的活化必须在分泌到培养基之前在寄生虫肠道中进行,因为我们的研究表明所有由成人产生的组织蛋白酶L蛋白酶 F.Hepatica. 缺乏散文。我们建议,导致散步的切割事件分为两个步骤:(a)一个少量组织蛋白酶L分子的双分子过程 trans - 通过另一种酶,浅酰胺蛋白内肽酶活化,其也局部地在肠上皮细胞内局部化 Fasciola.. (
      • Adisakwattana P.
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      两种浅酰胺蛋白内肽酶的比较分子分子分析和编码基因 Fasciola.. gigantica.
      ),通过在ASN残基的C末端侧的裂解,靠近突出和成熟结构域的结接近(b)通过激活的组织蛋白酶L分子通过在Leu-Ser↓他的主题(
      • 堆栈c.m.
      • Donnelly S.
      • Lowther J.
      • 徐W.
      • 柯林斯P.R.
      • Brinen L.S.
      • 道尔顿J.P.
      肝氟克的主要分泌的组织蛋白酶L1蛋白酶, Fasciola.. hepatica.:Leu-12在突出段的非可介质C末端区域中的Pro-12更换可防止完整的酶自动激活,并允许定义散射术中的分子事件。
      )。尽管在与成熟结构域形成边界的突变的C末端区域中,但是在所有曲折的本节中保存了ASN残基和Leu-Ser↓他的主题,因此支持我们的想法这些切割位点对酶原加工和激活至关重要。
      我们的蛋白质组学和系统源分析表明成人 F.Hepatica. 演化了一个机械阶级,半胱氨酸蛋白酶的大量蛋白酶,以执行允许寄生虫在宿主内存活的各种关键功能。组织蛋白酶L家族的扩张很可能是在其感染和适应新主持人的能力方面对该寄生虫成功的核心。由于它们在粘性生物学中的枢轴作用,因此,蛋白酶是蛋白酶被认为是对扇形裂变病症的第一代疫苗的发育的主要候选者(
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