定量蛋白质组学蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶1B函数的研究

  • Philipp Mertins.
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    Max Planck生物化学​​研究所分子生物学系,克罗普芬茨18,82152 Martinsrid,德国
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  • H. Christian Eberl.
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    Max Planck生物化学​​研究所分子生物学系,克罗普芬茨18,82152 Martinsrid,德国
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  • Jörg·雷卡威兹
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    Max Planck生物化学​​研究所分子生物学系,克罗普芬茨18,82152 Martinsrid,德国
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  • Jesper V. Olsen.
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    德国Klopferspitz 18,82152 Martinsridz,德国MAX Planck Biochemistry,Max Planck Biochemistry研究所的蛋白质组学和信号转导。
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  • Michel L. Tremblay.
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    麦吉尔大学麦吉尔癌症中心,3655威廉·奥斯勒长廊,蒙特利尔,魁北克,加拿大魁北克H3G 1Y6
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  • Matthias Mann.
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    德国Klopferspitz 18,82152 Martinsridz,德国MAX Planck Biochemistry,Max Planck Biochemistry研究所的蛋白质组学和信号转导。
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  • Axel Ullrich.
    一致
    可以解决对应的通信。电话:49-89-8578-2512;传真:49-89-8578-2454
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    Max Planck生物化学​​研究所分子生物学系,克罗普芬茨18,82152 Martinsrid,德国
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  • Henrik Daub.
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    Max Planck生物化学​​研究所分子生物学系,克罗普芬茨18,82152 Martinsrid,德国
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      由于它们的拮抗催化功能,蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶(PTP)和蛋白质 - 酪氨酸激酶作用在一起,以控​​制哺乳动物细胞中的磷酸酪氨酸介导的信号传导过程。然而,与蛋白质 - 酪氨酸激酶不同,由于缺乏对细胞PTP函数的系统和详细分析缺乏适当的方法,对许多PTP的细胞底物特异性毫无吻。即使对于最强烈地研究,也可以通过其已知的基材解释原型家庭成员PTP1B许多生理功能。为了提高细胞PTP1B功能,我们使用定量MS以监测PTP1B缺陷小鼠胚胎成纤维细胞的全局酪氨酸磷酸化的改变,与其野生型对应物相比。总共量,我们在基底,表皮生长因子或血小板衍生的生长因子刺激条件下量化了124个含有301个磷酸酪氨酸位点的蛋白质。发现18个蛋白质的子集在敲除细胞中含有高磷酸化的磷酸吡氧胺位点,并与PTP1B有效连接。在这些蛋白质中,细胞活性和粘附性的调节剂是过度级的,例如皮质素,脂肪瘤 - 优选合作伙伴,ZO-1或P120CTN。此外,P62DOK或P120RASGAP的增殖率也显示出增加的细胞酪氨酸磷酸化。通过使用基于MS基分析的平行MS基础分析,进一步证明了这些蛋白质与PTP1b的物理相互作用。我们的结果与所描述的PTP1B缺陷成纤维细胞表型相关的相关性,其特征在于运动性和细胞增殖的增加。本研究提供了关于小鼠成纤维细胞中的磷酸酪氨酸信号传导过程的广泛概括,并且通过鉴定各种新的潜在底物蛋白,表示PTP1B在蜂窝信令网络中的中心作用。重要的是,这里描述的基于MS的策略完全是通用的,可用于解决蜂窝PTP函数的不良方面。
      蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶(PTP)的成员
      使用的缩写是:PTP,蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶; PTK,蛋白质 - 酪氨酸激酶; RPTP,受体样PTP; RTK,受体酪氨酸激酶;硅酸盐,细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记; DHB,2,5-二羟基苯甲酸;阶段,停止和提取; BIS-TRIS,2- [双(2-羟乙基)氨基] -2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇; ABC,碳酸氢铵; RP,反向阶段;纳米,纳米透视毛细血管; IPI,国际蛋白质指数; PTM,翻译后修改; MEF,小鼠胚胎成纤维细胞; ko,敲门; EGF,表皮生长因子; PDGF,血小板衍生的生长因子; PLCγ1,磷脂酶Cγ1; PKCδ,蛋白激酶Cδ; ZO-1,Zonula occludens 1蛋白; LPP,脂肪瘤优选的合作伙伴同源物; EGFR,表皮生长因子受体; PDGFR,血小板衍生的生长因子受体; SH3,SRC同源3; ER,内质网;间隙,GTP酶活性蛋白质; DAG,二酰基甘油; IP.3,肌醇1,4,5-三磷酸盐; ERK,细胞外信号调节激酶。
      1使用的缩写是:PTP,蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶; PTK,蛋白质 - 酪氨酸激酶; RPTP,受体样PTP; RTK,受体酪氨酸激酶;硅酸盐,细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记; DHB,2,5-二羟基苯甲酸;阶段,停止和提取; BIS-TRIS,2- [双(2-羟乙基)氨基] -2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇; ABC,碳酸氢铵; RP,反向阶段;纳米,纳米透视毛细血管; IPI,国际蛋白质指数; PTM,翻译后修改; MEF,小鼠胚胎成纤维细胞; ko,敲门; EGF,表皮生长因子; PDGF,血小板衍生的生长因子; PLCγ1,磷脂酶Cγ1; PKCδ,蛋白激酶Cδ; ZO-1,Zonula occludens 1蛋白; LPP,脂肪瘤优选的合作伙伴同源物; EGFR,表皮生长因子受体; PDGFR,血小板衍生的生长因子受体; SH3,SRC同源3; ER,内质网;间隙,GTP酶活性蛋白质; DAG,二酰基甘油; IP.3,肌醇1,4,5-三磷酸盐; ERK,细胞外信号调节激酶。
      酶系列以协调的方式与蛋白质 - 酪氨酸激酶(PTKS)的协调方式,以控制调节许多基本生理过程的酪氨酸磷酸化信号传导途径。细胞酪氨酸磷酸化平衡的变化是多种人类疾病的原因,例如癌症,糖尿病,免疫缺陷等。我们对PTKS的生理和分子功能的了解大大超过了PTP,并且对于大多数PTP,其细胞基材的身份仍然难以捉摸(
      • Tiganis T.
      • 贝内特上午
      蛋白质酪氨酸磷酸酶功能:基板透视。
      )。在以前的研究中,我们的小组对解决这一问题进行了各种努力,并确定了许多PTP的细胞底物。我们发现受体样PTP(RPTP),如RPTPα,去磷酸化胰岛素受体的成熟形式(
      • Lammers R.
      • Moller N.P.
      • Ullrich A.
      跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶α去磷酸化胰岛素受体在完整细胞中。
      )RPTPκ调节β-catenin信号(
      • Fuchs M.
      • Muller T.
      • 小床。
      • Ullrich A.
      人蛋白 - 酪氨酸磷酸酶κ与Armadillo家族成员的关联。
      ,
      • Anders L.
      • Mertins P.
      • Lammich S.
      • murgia m.
      • 哈特曼D.
      • Saftig P.
      • 哈斯C.
      • Ullrich A.
      Furin-,Adam 10-和γ分泌酶介导的受体酪氨酸磷酸酶的切割和β-连环蛋白的转录活性调节。
      )。此外,我们发现了用于非受体PTP的底物,如受体酪氨酸激酶(RTK)负调节剂SiRPα用于SHP2(
      • Kharitonenkov A.
      • 陈祖
      • 祝我有
      • 王H.
      • 席克林J.
      • Ullrich A.
      一系列蛋白质,其抑制通过酪氨酸激酶受体的信号传导。
      ),HER2对于BDP1(
      • Gensler M.
      • Buschbeck M.
      • Ullrich A.
      PETE型蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶BDP1对HER2信号传导的负调节。
      )和PTP-SL的胞质形式(
      • 普里达R.
      • Zuniga A.
      • Ullrich A.
      PTP-SL和步骤蛋白酪氨酸磷酸酶通过激酶相互作用基序通过关联调节细胞外信号调节激酶ERK1和ERK2的活化。
      ,
      • Buschbeck M.
      • Eickhoff J.
      • Sommer M.N.
      • Ullrich A.
      磷酸吡罗氨酸特异性磷酸酶PTP-SL调节ERK5信号通路。
      )。此外,在原型PTP家族成员PTP1b上的早期研究中,由于在内质网中这些分子的共定位,所以在若干RTK的前体形式的前体形式的去磷酸化活性(
      • Lammers R.
      • Bossenmaier B.
      • 很酷的d.e.
      • Tonks N.K.
      • 雪斯林格J.
      • 菲舍尔e.h.
      • Ullrich A.
      蛋白质酪氨酸磷酸酶在完整细胞中的差异活性。
      )。
      虽然PTP1B是最好了解的磷酸酶之一,但不能用已经已知的基材解释其许多生理功能。 PTP1B获得了很多关注,因为其在2型糖尿病,肥胖,免疫力和癌症中的作用(
      • 杜布恩
      • Tremblay M.L.
      小蛋白酪氨酸磷酸酶TC-PTP和PTP1B在信号转导和疾病中的涉及:从糖尿病,肥胖到细胞周期和癌症。
      ,
      • Tonks N.K.
      ptp1b:从边线到前线!
      )。通过函数损失鼠标遗传模型实现了对其生理功能的根本洞察。 PTP1B缺陷小鼠表现出对糖尿病和肥胖症的抗性(
      • elcheby m.
      • Payette P.
      • Michaliszyn E.
      • 克里姆莱斯W.
      • 柯林斯S.
      • loy a.l.
      • 诺曼底D.
      • 郑艾。
      • Himms-Hagen J.
      • Chan C.C.
      • Ramachandran C.
      • 格雷德M.J.
      • Tremblay M.L.
      • 肯尼迪B.P.
      缺乏蛋白质酪氨酸磷酸酶-1b基因的小鼠胰岛素敏感性和肥胖性增加。
      ,
      • 克拉兰L.D.
      • 老板O.
      • Peroni O.D.
      • kim j.k.
      • 马蒂诺J.L.
      • Zabolotny J.M.
      • Moghal N.
      • Lubkin M.
      • kim y.b.
      • Sharpe A.H.
      • 斯特里克 - 克朗·答:
      • Shulman G.I.
      • Neel B.G.
      • KAHN B.B.
      在蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶1B缺陷小鼠中增加能量消耗,降低肥胖和组织特异性胰岛素敏感性。
      )由于其直接衬底的活性增加,肝脏和骨骼肌中的胰岛素受体和脑肌肌肉诱导的下丘脑中的jak2(
      • 脚k.k.
      • Delibegovic M.
      • 薛b。
      • Gorgun C.Z.
      • Hotamisligil G.S.
      • Neel B.G.
      • KAHN B.B.
      神经元PTP1B调节体重,肥胖和瘦素作用。
      ), 分别。在肿瘤发生中,将不同的功能分配给PTP1B并取决于其行动现场。例如,在P53 / PTP1b双核小鼠中,在B细胞淋巴瘤中鉴定了肿瘤抑制功能(
      • 杜布恩
      • Bourdeau A.
      • 海宁琴日
      • 郑艾。
      • loy a.l.
      • Tremblay M.L.
      蛋白质酪氨酸磷酸酶的遗传烧蚀通过B细胞发育的调节加速P53-核小鼠的淋巴瘤。
      ),而两位实验室用乳腺肿瘤瘤中描述了表达活化形式的ERBB2的转基因小鼠的哺乳动物肿瘤瘤肿瘤瘤功能(
      • 朱利安S.G.
      • 杜布恩
      • 读米
      • 佩尼J.
      • PAQUET M.
      • 韩义。
      • 肯尼迪B.P.
      • Muller W.J.
      • Tremblay M.L.
      蛋白质酪氨酸磷酸酶1B缺乏或抑制延迟ERBB2诱导的乳腺肿瘤瘤,并保护肺转移。
      ,
      • Bentire-Alj M.
      • Neel B.G.
      HER2 / Neu诱导的乳腺癌需要蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶1B。
      )。
      已经使用基板捕获方法表征了大多数已知的PTP1B基板(
      • Flint A.J.
      • Tiganis T.
      • 巴福德D.
      • Tonks N.K.
      “基质捕获”突变体的发展,以鉴定蛋白质酪氨酸磷酸酶的生理基质。
      ,
      • Blanchetot C.
      • Chagnon M.
      • 杜布恩
      • 哈勒姆。
      • Tremblay M.L.
      谱系捕获技术在鉴定细胞PTP靶标中。
      )。该技术利用催化活性PTP1B突变体,其可以形成与其基材的稳定相互作用,然后允许随后纯化这些蛋白质。然而,这种方法通常依赖于免疫印迹与抗磷酸酪氨酸(Tyr(P))抗体的蛋白质检测抗体,因此朝向鉴定已知的酪氨酸磷酸化蛋白作为PTP底物的抗体。鉴定与底物捕获突变体相互作用的蛋白质的更系统的方法涉及使用基于MS的蛋白质鉴定(
      • Aeberberold R.
      基于质谱的蛋白质组学。
      )。公布的研究使用MS分析与底物捕获突变体组合,以鉴定像RPTPΣ(
      • Siu R.
      • Fladd C.
      • 旋转D.
      n-cadherin是蛋白酪氨酸磷酸酶Sigma(PTPσ)的体内底物,并参与PTPσ介导的轴突生长的抑制。
      )或ptpn21(
      • 吴j.
      • katrekar a。
      • Honigberg L.A.
      • 史密斯上午
      • Conn M.T.
      • 唐杰。
      • 杰弗里D.
      • Mortara K.
      • Sampang J.
      • 威廉姆斯S.R.
      • 越野车J.
      • 克拉克准噶。
      人蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN22基材的鉴定。
      )。用SDS-PAGE分解相互作用蛋白质,并且在蛋白质染色之后,切除各个带和MS分析。
      最近的现代质谱仪已成为可用的是极其敏感的,并且允许具有高质量精度的测量,例如混合线性离子阱/傅里叶变换质谱仪(LTQ-FT)(
      • Syka J.E.
      • 玛托J.A.
      • 白D.L.
      • 角horn
      • Senko M.W.
      • Schwartz J.C.
      • Ueberheide B.
      • 加西亚B.
      • 母猪S.
      • 默特雷特T.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      新型线性四极离子阱/ FT质谱仪:性能表征和在组蛋白H3后翻译后修饰的比较分析。
      )或线性离子捕集/壁图质谱仪(LTQ-绕组)(
      • Makarov A.
      • Denisov E.
      • KHOLOMEEV A.
      • Balschun W.
      • Lange O.
      • strupat K.
      • 角horn
      混合线性离子阱/绕组质谱仪的性能评价。
      )。使用纳米尺度毛细管(Nano)ESI LC-MS / MS,这些仪器允许广泛地分析含有广泛的不同大量蛋白质的高度复杂的细胞蛋白质组。此外,这些仪器非常适合分析翻译后修饰,例如丝氨酸,苏氨酸或酪氨酸残留物的蛋白质磷酸化(
      • Mumby M.
      • BREKKEN D.
      磷蛋白质:蜂窝信号传导的新见解。
      )。磷酸肽MS分析与定量蛋白质组学方法的组合,如细胞培养(Silac)中氨基酸的稳定同位素标记,提供了一种强大而强大的方法,同时监测不同生物状态的磷酸化依赖信中的信号传导(
      • ong s.e.
      通过氨基酸在细胞培养中稳定同位素标记,用于定量蛋白质组学。
      ,
      硅胶功能和定量蛋白质组学。
      )。通过该方法,可以在全球蛋白质型范围内测定特异性磷酸锶上的相对蛋白质表达水平和磷酸化的变化(
      • 奥尔森J.V.
      • Blagoev B.
      • GNAD F.
      • MACEK B.
      • Kumar C.
      • Mortensen P.
      全球性,体内和现场特异性磷酸化动力学中的信令网络。
      )。
      在这里,我们报告了一种新的蛋白质组学策略,其使用定量质谱法来鉴定蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶系列成员的潜在细胞底物。为此,我们使用Silac标记来分析PTP1B缺陷小鼠成纤维细胞的TYR(P)信号传导的改变,与基底,EGF-或PDGF刺激条件下的野生型细胞相比。通过在平行MS分析中使用基质捕获突变体,获得有关敲除(KO)细胞中的蛋白质的蛋白质物理相互作用的附加信息,得到PTP1b的活性位点。该组合分析允许我们提出PTP1B的新底物,其提供分子基质以了解其KO小鼠胚胎成纤维细胞的所述表型。这里描述的基于MS的方法和策略也可用于研究古典PTP系列的其他成员,并且可能具有相当大的潜力来提高其蜂窝功能的知识。

      实验步骤

       抗体 -

      使用HITAP蛋白A柱(GE Healthcare)(GE Healthcare)在杂交瘤上清液中纯化抗TYR(P)特异性4G10单克隆抗体。针对PLCγ1的抗体来自转导实验室,在匙孔颗粒血瓣偶联肽KGRYGLFPANYVELRQ上升高了多克隆抗Cortactidin抗体,并在其他地方描述抗FER抗体(
      • Senis Y.A.
      • 克雷格A.W.
      • 格里尔P.A.
      FPS / FES和FER蛋白 - 酪氨酸激酶在调节造血中起着多余的作用。
      )。

       细胞培养和配体刺激 -

      PTP1B野生型(PTP-1B+ / +)和ko(ptp-1b - / - 通过用Simian病毒40(SV40)大的T抗原未经感染永生化的细胞(
      • 郑艾。
      • BAL G.S.
      • 肯尼迪B.P.
      • Tremblay M.L.
      转化成纤维细胞中粘附依赖性信号传导和细胞的衰减缺乏蛋白酪氨酸磷酸酶-1b。
      )。两种细胞系都维持在Dulbecco的改性鹰的培养基(Invitrogen),其补充有10%胎牛血清(Invitrogen)和抗生素(5mg / ml青霉素/链霉素; Invitrogen)。对于氧化硅酸盐实验,细胞在含有正常的培养基中生长7天 l-arginine(arg0)和 l-Lysine(Lys0)(Sigma), l - [u-13C6,14N4]精氨酸(Arg6)和 l - [2H4]赖氨酸(Lys4),或 l - [u-13C6,15N4]精氨酸(Arg10)和 l - [u-13C6,15N2]赖氨酸(Lys8)(Eurisotop)。标记效率确定为大于97%(数据未显示)。在用EGF(50ng / ml,5min; Peprotech)或PDGF(20ng / ml,5分钟; Peprotech)之前,将细胞饥饿3小时。

       细胞裂解和抗TYR(P)免疫沉淀 -

      将细胞在12×15cm的每硅胶标签中生长2天(2×106 接种细胞/盘),在冰冷裂解缓冲液中裂解20分钟(50米m Tris-HCl,pH 7.5,150米m NaCl,1%Nonidet P-40,0.1%脱氧胆酸钠,1米m EDTA, 1 mm 酸钠,1米m PMSF,0.1μg/ ml抑肽酶,10米m naf)。通过以16,500×离心裂解裂解物 g 15分钟。使用BCA测定(Pierce)进行蛋白质量测定。在氧化素实验中,在测定蛋白质的情况下,细胞裂解物混合1:1(双标记)或1:1:1(三重标记)。对于免疫沉淀,将200μg抗TYR(P)4G10抗体与40μl蛋白A-Sepharose(GE Healthcare)一起加入到含有高达20mg每种标记的20mg总蛋白质的混合细胞裂解物中,并孵育4小时4°C。用裂解缓冲液洗涤沉淀物四次,用尿素缓冲液洗脱沉淀的蛋白质(7 m 尿素,2 m thiourea, 50 mm HEPES,pH 7.5,1% n - 葡萄糖苷)在37℃下持续10分钟。对于蛋白质印迹分析,每次免疫沉淀,使用高达500μg的总蛋白质,用SDS样品缓冲液洗脱沉淀的蛋白质。

       体外衬底捕获 -

      PTP1b(残基1-321)的催化结构域与GST融合蛋白连接,并且如前所述产生PTP1B突变体D181A和D181A / Q262A(
      • Flint A.J.
      • Tiganis T.
      • 巴福德D.
      • Tonks N.K.
      “基质捕获”突变体的发展,以鉴定蛋白质酪氨酸磷酸酶的生理基质。
      ,
      • 谢L.
      • 张Y.L.
      • 张Z.Y.
      改进蛋白酪氨酸磷酸酶基质捕获突变体的设计与表征。
      )。表达重组野生型和PTP1B突变融合蛋白 大肠杆菌 并用GST-Sepharose(GE Healthcare)纯化。 体外 如前所述进行底物捕获测定(
      • Blanchetot C.
      • Chagnon M.
      • 杜布恩
      • 哈勒姆。
      • Tremblay M.L.
      谱系捕获技术在鉴定细胞PTP靶标中。
      )。在八个15厘米的菜肴中生长短暂的细胞2天(2×106 细胞/板)100μm刺激30分钟m 在冰冷的裂解缓冲液中均为20分钟的溶质(20米m Tris-HCl,pH 7.5,150米m NaCl,1%Triton X-100,10%甘油,1米m EDTA, 1 mm PMSF,0.1μg/ ml抑肽酶,5米m 碘乙酸)。将DTT加入到10米的最终浓度m然后将样品温育10分钟。通过以16,500×离心裂解裂解物 g 15分钟。 10μg重组PTP1b野生型酶或底物捕获突变体与GSH珠粒(GE Healthcare)偶联,并在4℃下孵育4小时,含有10mg总蛋白质的裂解物。用HNTG缓冲液洗涤捕获的蛋白质三次(20米m HEPES, pH 7.5, 150 mm NaCl,10%甘油,0.1%Triton X-100)。对于随后的MS分析,用尿素缓冲液洗脱蛋白质(7 m 尿素,2 m thiourea, 50 mm HEPES,pH 7.5,1% n - 葡萄糖苷)在37℃下持续10分钟。

       溶液内蛋白质消化 -

      在抗TYR(P)免疫沉淀或底物捕获后,在上述尿素缓冲液中使沉淀的蛋白质变性,使用Bradford测定(Bio-rad)测量蛋白质量。通过加2米减少蛋白质m 在25℃下DTT(最终浓度)45分钟,硫醇羧甲基化用5.5米m 在室温下碘乙酰胺30分钟。以1:100(通常为1-3μgLys-C)的酶/基材比加入内蛋白酶酶Lys-C(Wako),并在室温下消化蛋白质4小时。将得到的肽混合物用水稀释,达到2以下低于2的最终尿素浓度 m。对于双消化,以1:100的酶/基材比(通常为1-3μg胰蛋白酶)加入修饰的胰蛋白酶(测序级,promega),并且将摘要在室温下温育过夜。通过将TFA添加至最终浓度为1%,淬灭胰蛋白酶活性。

       磷酸肽的脂肪富集 -

      胰蛋白酶消化磷酸肽使用钛磷光蛋白富集(TiO2如前所述的列(
      • 奥尔森J.V.
      • Blagoev B.
      • GNAD F.
      • MACEK B.
      • Kumar C.
      • Mortensen P.
      全球性,体内和现场特异性磷酸化动力学中的信令网络。
      ,
      • Larsen M.R.
      • Thingholm T.e.
      • Jensen O.N.
      • Roepstorff P.
      • jorgensen t.j.
      使用二氧化钛微柱的肽混合物的高度选择性富集磷酸化肽。
      )。将肽样品用30g /升2,5-二羟基苯甲酸(DHB)在80%ACN,0.1%TFA中稀释1:6。 5μgTiO2 用洗脱缓冲液洗涤珠子(GL Sciences Inc.)(NH3 在20%ACN,pH10.5)中的水和用洗涤缓冲液(50%ACN,0.1%TFA)平衡。 TIO.2 通过用负载缓冲液洗涤(15%ACN中的6g /升DHB),用DHB加载珠子。将肽样品加载到TiO上2 在旋转轮上的室温下珠子30分钟。随后用洗涤缓冲液洗涤珠子三次,在室温下洗脱与50μl洗脱缓冲液的室温下将结合的磷酸肽洗脱了10分钟。通过自制c过滤eluate8 200-μL移液器尖端的舞台提示。将30μl80%ACN,0.5%乙酸应用于舞台提示(
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      蛋白质组学中的蛋白质组学中的基质辅助激光解吸/电离,纳米电子涂布剂和LC / MS样品预处理的停止和去提取提示。
      )过滤后,并将流动与过滤的样品组合。用TFA将样品的pH值调节至约pH7的值,并将洗脱液浓缩在真空浓缩器中。在MS分析之前,将5%ACN和0.1%TFA(最终浓度)加入样品中。

       凝胶蛋白质消化 -

      通过根据制造商的说明,通过SDS-PAGE分离来自PTP1B野生型和KO细胞(300μg)或沉淀蛋白的混合蛋白质裂解物或沉淀蛋白质,根据制造商的说明,通过SDS-PAGE分离。使用胶体蓝染色试剂盒(Invitrogen)用Coomassie蓝色染色凝胶。将所得通道切成15个切片(蛋白表达分析)或10片(抗Tyr(P)免疫沉淀或底物捕获),然后按照前面描述的基本进行的凝胶消化物(
      • 舍甫琴科A.
      • 威尔m。
      • vorm o.
      • Jensen O.N.
      • podtelejnikov a.v.
      • Neubauer G.
      • Mortensen P.
      单独通过MS识别序列数据库中凝胶分离蛋白的策略。
      )。将凝胶切片切成小块并用50米洗涤 m 碳酸氢铵(ABC),50%乙醇直至立方体完全抵抗。凝胶立方体用乙醇脱水并用50米再水化m ABC containing 10 mm dtt。在56℃下将蛋白质降低1小时。然后通过加入55米来烷基化得到的游离硫醇基团m 碘乙酰胺在50米中m ABC在黑暗中在25°C下为1小时。用50米洗涤凝胶片两次m ABC,50%乙醇溶液;用100%乙醇脱水;并在真空浓缩器中干燥。每个凝胶级分再水合在50米m 含有0.4μg胰蛋白酶的ABC溶液和样品在37℃下孵育过夜。将上清液转移到新的管中,并通过在3%TFA中的30%ACN中与30%ACN一起孵育并用100%ACN进行双重孵育,从凝胶块中萃取残留肽。合并所有提取物,在真空浓缩器中蒸发ACN。随后使用自制反相(RP)C脱盐样品18 STAGE Tip columns (
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      蛋白质组学中的蛋白质组学中的基质辅助激光解吸/电离,纳米电子涂布剂和LC / MS样品预处理的停止和去提取提示。
      ),洗脱的肽用于MS分析。

       Nano-LC-MS / MS分析 -

      通过在线RP纳米LC分离所有肽样品,并通过电喷雾MS / MS分析。使用Agilent 1100纳米流系统(Agilent Technologies),将样品注入15cm RP,熔融石英毛细管(内径,75μm;填充在房屋内,3μmReprosil-pur C.18-AQ,Maisch博士GmbH)。 LC设置连接到具有纳米电子涂布离子源(Proxeon Biosystems)的LTQ-orbitrap质谱仪(Thermo Fisher Scientific)。用140分钟的梯度在0.5%乙酸中用140分钟的梯度洗脱装载肽。使用Xcalibur 2.0软件在正离子模式下对LTQ-orbitrap执行数据相关的采集。通过将内标从环境空气注入到C-Trap(“锁定质量选项”)中实时重新校准仪器(
      • 奥尔森J.V.
      • De Godoy L.M.
      • 李G.
      • MACEK B.
      • Mortensen P.
      • PESCH R.
      • Makarov A.
      • Lange O.
      • 角horn
      通过锁定谱位注入C-Trap零件在横向质谱仪上的百万百万质量准确度。
      )。调查光谱是在Orbitrap中的分辨率60,000的分辨率获得的。平行,可分离每周期最多五个最强烈的多元带电离子,分段,并在仪器的LTQ部分中分析。为了改善磷酸肽分析,软件中的多级激活选项已启用,中性损失物种在97.97,48.99或32.66 m/z 在碎片期间在前体离子下被活化30ms(假态3)(
      • Schroeder M.J.
      • Shabanowitz J.
      • Schwartz J.C.
      • 狩猎d.f.
      • Coon J.J.
      一种中性损失激活方法,用于改进四极离子阱质谱法的磷酸肽序列分析。
      )。

       使用吉祥物搜索引擎的肽识别 -

      使用内部软件RAW2MSM处理原始MS数据(
      • 奥尔森J.V.
      • De Godoy L.M.
      • 李G.
      • MACEK B.
      • Mortensen P.
      • PESCH R.
      • Makarov A.
      • Lange O.
      • 角horn
      通过锁定谱位注入C-Trap零件在横向质谱仪上的百万百万质量准确度。
      )和峰值列表用吉祥物搜索引擎(2.1.0版,矩阵科学)分析。所有串联质谱都被搜查了含有前进和逆转序列的国际蛋白质指数(诱饵IPI版本3.18)的内部策划诱饵IPI小鼠蛋白质数据库。此外,在该数据库中包括人角蛋白,猪胰蛋白酶和内蛋白酶Lys-C等污染物。使用连接的目标/诱饵数据库允许定义截止得分阈值,允许肽鉴定的假阳性率小于1%(p < 0.01) (
      • eliasj.e.
      • 哈斯W.
      • Faherty B.K.
      • Gygi S.P.
      大规模蛋白质组学研究中使用的质谱平台的比较评价。
      )。绝对平均质量准确性及其S.D.对于用LTQ-壁毯测量的所有肽为0.80 / 1.15ppm。因此,在MS峰上的肽鉴定的最大允许的质量偏差为5ppm和ms2 峰值为0.5 da。氨基甲酰亚甲基琥珀酸甲基胞嘧啶被设定为固定改性,氧化甲硫氨酸,SER / THR / TYR的磷酸化,蛋白质 N - 乙酰化, N-Pyroglutamate,以及Silac标签(Lys4,Lys8,Arg6和Arg10)被搜索为可变修改。需要完全胰蛋白特异性,允许最多三个“错过的裂缝”。吉祥物搜索的仪器设置被指定为“esi-trap”。

       使用MSQUANT的翻译后修改(PTM)评分和肽定量 -

      将从吉祥物获得的所有光谱和序列分配导入Msquant软件。实现到该程序中的PTM评分算法是肽序列中的磷酸化位点分配的基于概率的评分系统,并在之前描述(
      • 奥尔森J.V.
      • Blagoev B.
      • GNAD F.
      • MACEK B.
      • Kumar C.
      • Mortensen P.
      全球性,体内和现场特异性磷酸化动力学中的信令网络。
      )。大多数分析的磷酸化肽对于它们的磷酸群体的定位概率为1.只有几个案例 p 值为0.5,磷酸组被分配给具有相同概率的两个残基。在将磷酸化位点分配给肽序列并确定PTM评分后,使用MSQUANT进行磷肽定量。对于每个氧化硅胶双峰或三联,Msquant计算了相应的提取离子色谱图值,并显示和手动验证所做的所有作业(
      • 奥尔森J.V.
      • Blagoev B.
      • GNAD F.
      • MACEK B.
      • Kumar C.
      • Mortensen P.
      全球性,体内和现场特异性磷酸化动力学中的信令网络。
      ,
      • Schulze W.X.
      一种用于肽蛋白质相互作用的新型蛋白质组学筛选。
      )。为了确保定量数据的再现性,重复于正常生长培养基中的PTP1B野生型与KO细胞的比较三次,并且其他氧化硅酸盐实验进行两次。通过计算单测量比率的平均值来确定最终肽定量比。
      为了分析PTP1B野生型和KO细胞之间的酪氨酸磷酸化变化的分布,Tyr(P)肽在直方图中绘制而不是它们的折叠变化,并且使用GraphPad Prism 5软件进行高斯回归分析。所获得的平均值和S.D.高斯曲线用于计算 p 值并通过使用Microsoft Excel的概率质量函数(正常密度函数)来确定整个数据集中的最小变化的重要性。

      结果

       PTP1B缺乏导致小鼠胚胎成纤维细胞的磷酸酪氨酸蛋白质组的改变 -

      PTP1B缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞是一种良好的细胞培养系统,以研究该原型磷酸酶的底物特异性。在没有酶的情况下,与野生型细胞相比,应增加潜在的直接衬底的酪氨酸磷酸化。为了研究PTP1B缺陷细胞的磷酸酪氨酸信号传导的改变,我们使用了基于高分辨率LC-MS的定量蛋白质组学方法,并在硅酸培养基的野生型和KO成纤维细胞的差异标记时(
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
      )(Fig. 1)。在细胞裂解后,用抗Tyr(P)抗体免疫沉淀细胞酪氨酸磷酸化蛋白,并在溶液中消化,并使用TiO进一步富集所得的磷酸肽2 beads (
      • Larsen M.R.
      • Thingholm T.e.
      • Jensen O.N.
      • Roepstorff P.
      • jorgensen t.j.
      使用二氧化钛微柱的肽混合物的高度选择性富集磷酸化肽。
      )。该两步程序导致高磷酸富集的样品,从中可以在单一LC-MS实验中鉴定100多于100个不同的酪氨酸磷酸化位点在线性离子捕集物/横射质谱仪(LTQ-orbitrap)(
      • Makarov A.
      • Denisov E.
      • KHOLOMEEV A.
      • Balschun W.
      • Lange O.
      • strupat K.
      • 角horn
      混合线性离子阱/绕组质谱仪的性能评价。
      )。与抗TYR(P)蛋白质免疫沉淀后的直接蛋白质分析相比,额外的磷酸富集具有潜在的优点。首先,由于样本复杂性的强烈降低,需要约10倍的仪器时间来鉴定具有可比灵敏度的Tyr(P)蛋白质。其次,鉴定策略侧重于TYR(P) - 致癌蛋白及其磷酸化位点。相比之下,抗TYR(P)免疫沉淀物的分析没有额外的富集在酪氨酸磷酸化蛋白和它们的相互作用伴侣之间没有有效地区分,因为通常只有几个Tyr(P) - 悬浮的肽被检测到,因为存在巨大过量的非磷酸化肽种类。为了研究在两步富集后对Tyr(P)肽获得的定量信息如何与从抗TYR(P)免疫沉淀物直接测定的蛋白质丰度的变化相关,两种方法都应用于基于氧化硅酸的定量比较野生型和PTP1B缺乏成纤维细胞。尤其是改变的酪氨酸磷酸化蛋白的丰度与至少相似或通常更明显的一个或多个Tyr(P) - 肽( Fig. 2 和补充表1)。此外,在某些情况下,Tyr(P)肽的水平在没有蛋白质变化的情况下不同,表明在通过一个或多个组成型酪氨酸磷酸化位点免疫沉淀的蛋白质中鉴定了调节位点。这些数据支持观念,即连续富集对磷酸肽定量表示鉴定调节,Tyr(P)蛋白质的有用策略。然而,值得注意的是,在某些情况下,最终磷酸富集富集后的个体位点变化的量化可能是复杂的,例如当不同的酪氨酸磷酸化位点进行差异调节并且表现出抗TYR(P)抗体的不同亲和力。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1PTP1B缺陷成纤维细胞酪氨酸磷酸化改变的质谱分析的工作方案。PY ,磷酸酪氨酸; WT., 野生型。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2不同策略与Tyr(P)特异性抗体免疫沉淀的定量分析蛋白质的比较。 log2 - 将免疫沉淀的Tyr(P)蛋白质的转化PTP1B KO /野生型比率与其TYR(P)肽的各自的TIO相应进行比较2 丰富。 Ptyr.,磷酸酪氨酸; WT., 野生型。
      两步富集方案在基底细胞培养条件下PTP1B野生型和KO MEF中的81种不同酪氨酸磷酸化蛋白的应用,综合磷酸肽分析的应用揭示了来自81种不同酪氨酸磷酸化蛋白的磷酸酪氨酸位点(补充表2)。为了确保酪氨酸磷酸化的差异不是由于不同的蛋白质表达水平,将野生型和KO细胞的总蛋白质提取物以相等的量混合,然后在LC-MS分析之前进行凝胶消化。在该研究中发现发现酪氨酸的所有蛋白质在该研究中被搜查在该研究中,通过定量非磷酸化的肽测定56磷酸酪氨酸蛋白的KO /野生型表达比。有趣的是大多数分析的蛋白质表达比率接近1(补充表3)。
      为了评估我们全球磷酸酪氨酸分析的生物再现性,在散点图中可视化来自两个独立实验的磷肽量化的相对比,并进一步分析它们的正态分布。这种生物重复的这种比较分析表明,在野生型中,TYR(P) - 悬垂的肽变化的肽可被认为是显着的不同 相对 KO细胞随着它们的比率与三个标准偏差的平均值不同(补充图1)。
      可以预期直接细胞PTP1b基材在KO细胞中表现出增加的酪氨酸磷酸化。然而,由于调节位点可能是积极或负面调节PTP1B底物的功能,所以磷酸酶调节还可以增强或下调直细胞底物蛋白下游的磷酸赖环介导的信号传导。可选地,在PTP1B敲除的补偿机制,例如其他PTP家族成员的上调,可能导致磷酸赖环状的信号传导不直接与细胞PTP1B功能的一些改变。这些考虑因素提供了Tyr(P)含有肽的存在的可能原因,该肽在PTP1B缺乏时显示出降低的丰度(Fig. 3)。所有量化的Tyr(P) - 甲型肽的比率产生正常分布,其异常值群体在KO细胞中更强烈地磷酸化。根据这个正态分布, p 针对所有比率计算值,并且将显着调节的磷酸肽的阈值水平设定为a p 值小于0.1。值得注意的是,根据本标准,在PTP1B缺陷细胞中显着上调的所有Tyr(P)肽的比例显着,根据上述生物学重复的分析也是非常显着的。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3在正常条件下PTP1B野生型和KO细胞蛋白质组细胞TYR(P)蛋白质组变化的分布分析。 根据日志填充Tyr(P)肽2 它们的PTP1B KO /野生型比率的值。平均值和S.D.通过高斯回归分析获得。注意Tyr(P)肽的全部分布和在PTP1B缺陷细胞中上调的含量上调的异常值。 Ptyr.,磷酸酪氨酸; WT., 野生型。
      对于一些磷酸肽,对最小的最小变化的估计是因为在这些情况下,检测到来自KO细胞的强烈诱导的磷肽,并在背景中进行定量。根据这些统计标准,在正常细胞培养条件下,在PTP1B KO细胞中发现13个蛋白质,在PTP1B KO细胞中具有显着的高磷酸化Tyr(P)肽(表I.)。为所有这些肽的串联MS光谱作为补充数据提供(补充MS / MS光谱1)。如果可用的,来自总细胞裂解物的并行分析的蛋白质表达数据用于Tyr(P)肽变化的标准化。关于各种蛋白质的主蜂窝功能的附加信息在左栏中给出 表I..
      表I.基底细胞培养条件下PTP1B缺陷成纤维细胞中13例蛋白的高磷酸化
      功能蛋白质磷酸肽序列Tyr(P)肽全蛋白质KO / WT比率
      TYR(P)网站p valueKO / WT比率标准化
      细胞形状和运动LPP.Saqpsphymagpssgqipygpgpr.2450.054.092.621.56
      PY(0.5)PY(0.5)EPYPYAAGPSYGGR297/3020.054.022.581.56
      segdtapygqvqvqpntwk.3180.053.442.211.56
      EAAYAPPASGNQNHPGMYPVSGPKK.3330.044.262.731.56
      mlpydmenppaddyfgr.4030.016.964.471.56
      细胞摩托斯Vav-3TPIALATGIRPFPTEESINDIPYK.1410.00>10.00
      TKS5 /鱼蛋白vkyeepydvpafgfdpsepemneepsgdr.5570.083.42
      VGESSEDVALEEETIPYENEGFRPYTEDTLSAR.6190.025.21
      vqendgkeppppvvnpyeedar.4020.034.703.451.36
      qedggvpyssglk.7150.044.473.291.36
      rhogap12.APT(0.5)PT(0.5)PPNQGRPDPSPVPYANLQELK2410.083.32
      细胞运动/紫砂式运输cortactinnastfeevvqvpsapyqk.3340.025.585.441.03
      KQPTPPAPSPPSPQPIDRPPPS(0.5)PS(0.5)PI PIEDAAPFK4210.034.864.741.03
      细胞粘附Cateninδ-2dpyetyqpfpnstr.11760.007.73
      p120ctn.qdvpygpqpqvr.2570.063.844.130.93
      fhpeppygleddqr.2800.103.073.300.93
      紧密交汇处组件ZO-1tstlrheeqpapapapapyevhnr.11640.063.723.711.00
      YRPEAQPPYSSTGPK.11770.00>10.00>10.001.00
      IP.3 和 DAG signalingPLCγ1igtaepdpygalyegr.7710.162.502.540.98
      吞噬作用Megf10蛋白dsppyaeinnstpanr.10610.00>10.00
      增殖p62DOKfsalemlenslpysptwegsqfwvtsqk.1460.162.452.031.21
      glpydlpqepr.3760.251.871.541.21
      扩散/迁移Eph受体A3 / 4/5VLEDDPEAAPPTTR.7790.063.85
      细胞生长/新陈代谢胰岛素样生长因子1受体/胰岛素受体dipyetdpyyrk.1193/11970.008.75
      未知与oligopherrenin 1类似lwleamdgkepiphytlpaiisk.3710.063.70
      这些蛋白质中只有三种,皮质蛋白,P62DOK(对接蛋白1,DOK-1)和胰岛素受体/ IGF1R在细胞PTP1B灭活时更强烈地描述,并进一步表征为PTP1B的直接底物(
      • elcheby m.
      • Payette P.
      • Michaliszyn E.
      • 克里姆莱斯W.
      • 柯林斯S.
      • loy a.l.
      • 诺曼底D.
      • 郑艾。
      • Himms-Hagen J.
      • Chan C.C.
      • Ramachandran C.
      • 格雷德M.J.
      • Tremblay M.L.
      • 肯尼迪B.P.
      缺乏蛋白质酪氨酸磷酸酶-1b基因的小鼠胰岛素敏感性和肥胖性增加。
      ,
      • 杜布恩
      • 郑艾。
      • Tremblay M.L.
      蛋白酪氨酸磷酸酶1B在RAS信号传导中的作用。
      ,
      • seely b.l.
      • staubs p.a.
      • reichart d.r.
      • Berhanu P.
      • milarski K.L.
      • Saltiel A.R.
      • Kusari J.
      • olefsky准
      蛋白质酪氨酸磷酸酶1B与活性胰岛素受体相互作用。
      ,
      • 腾腾的M.
      • 杜布恩
      • Tremblay M.L.
      PTP1B通过靶向TYR446来调节皮质蛋白酪氨酸磷酸化。
      )。虽然p62dok phosphotyryosine peptides没有 p 根据我们的分析,少于0.1的值,P62Dok的酪氨酸磷酸化增加已直接与该电池系统中的PTP1B缺乏有关,进一步分析表征为细胞PTP1B底物蛋白(
      • 杜布恩
      • 郑艾。
      • Tremblay M.L.
      蛋白酪氨酸磷酸酶1B在RAS信号传导中的作用。
      )。有趣的是P62Dok的高磷酸化与PTP1B KO细胞的增殖速率降低,因为杜布的RAS活性降低 等等。 (
      • 杜布恩
      • 郑艾。
      • Tremblay M.L.
      蛋白酪氨酸磷酸酶1B在RAS信号传导中的作用。
      )。细胞增殖中的这种深度改变也可以在3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化铵测定中综合,并对应于我们的MS数据(补充图2A)。在胰岛素受体/ IGF1R肽的情况下,8.75倍较高的酪氨酸磷酸化不能与其中一种蛋白质直接连接,因为没有这些激酶的独特肽。
      在上调的蛋白质中,控制细胞运动和细胞粘附的那些是过度级的。主要是涉及在细胞基质和细胞 - 细胞粘附位点的肌动蛋白细胞骨架调节的适配蛋白,如脂肪瘤优选的合作伙伴同源物(LPP),P120CTN(CTNND1;Cateninδ1),ZO-1和皮质素,在KO细胞中更强烈地磷酸化。酪氨酸的一定酪氨酸磷酸化与增加的细胞活性有关,例如用于转化的内皮细胞中的皮质素(
      • 黄C.
      • 刘杰。
      • Haudenschild C.C.
      • 詹X.
      酪氨酸磷酸化酪氨酸在内皮细胞运动运动中的作用。
      )。降低的细胞粘附已连接到P120CTN的酪氨酸磷酸化(
      • ozawa M.
      • Ohkubo T.
      V-SRC转染的L细胞中P120(CTN)的酪氨酸磷酸化取决于其与E-钙粘蛋白的关系并降低粘附活性。
      )和zo-1(
      • Takeda H.
      • Nagafuchi A.
      • Yonemura S.
      • Tsukita S.
      • Behrens J.
      • Birchmeier W.
      V-SRC激酶将来自肌肉蛋白的细胞粘附从强状态移到弱状态,而换档不需要βcatenin。
      )。这些结果与PTP1B KO细胞的增加的迁移率相比,与其野生型对应物相比(
      • 巴克利D.A.
      • 郑艾。
      • 基利p.a.
      • Tremblay M.L.
      • O'Connor R.
      通过蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)调节胰岛素样生长因子I型(IGF-1)受体激酶活性和增强的IGF-I介导的PTP-1B缺陷成纤维细胞凋亡和运动性的抑制。
      )。我们通过伤口测定和Boyden室测定证实了PTP1B缺陷细胞中的动力增强了这种强劲增加(补充图2B)。还发现其他细胞运动调节剂在KO细胞中更强烈地磷酸化,其中来自激酶酶,其定位于基于N-Cadherin的粘附结(
      • 格里尔P.
      关闭FPS / FES和FER的生物功能。
      ); Podosome调节器TKS5 / FISH(
      • 密封D.F.
      • Azucena Jr.,例如,
      • 通过I.
      • Tesfay L.
      • 戈登R.
      • 伍德罗姆
      • 驳回J.H.
      • Courtneidge S.A.
      适配器蛋白质TKS5 /鱼是摩托车组形成和功能,以及蛋白酶驱动的癌细胞侵袭。
      );和rho调节器VAV-3和rhogap12。
      此外,发现参与迁移和增殖的RTK激酶系列在PTP1B KO细胞中激活:占据Ephrin受体家庭成员A3,A4和A5之间共用的Tyr(P) - 悬浮肽。然而,由于没有针对任何受体鉴定独特的肽,因此受调节蛋白的确切身份仍然难以捉摸。
      注意,PTP1B野生型和KO细胞之间的所有确定的蛋白质表达差异 表I. 通过扩展小于2倍,表明磷酸酪氨酸信号传导中的大多数观察到的改变不会由改变的蛋白质表达水平产生。 图4A 显示PLCγ1,皮质蛋白和酪氨酸激酶FER的MS光谱作为用MSQUANT软件定量氧化肽(P)肽的氧化肽的实例。较低质量同位素簇代表衍生自正版精氨酸和赖氨酸编码的PTP1B野生型细胞的肽,而较高的质量同位素簇衍生自重的同位素标记(Arg10和Lys8)KO细胞。为了在第二个测定中测试我们的MS分析的结果,通过免疫印迹分析PLCγ1,Cortactin和FER,发现在用抗TYR(P)抗体免疫沉淀时这些蛋白质的增加程度,而它们在总裂解物中的表达不变(图4B.)。因此,来自免疫印迹分析的这些结果与我们的定量MS数据符合很好。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4使用定量MS和Western印迹PTP1B野生型和KO细胞选定蛋白的磷酸化分析。A,所示的Tyr(P)肽的选择MS光谱 这里显示。使用MSQuant软件评估所有MS光谱。由野生型和KO细胞衍生自野生型和KO细胞的Tyr(P)簇的同位素簇 姿。对于定量,仅使用单异点峰;它们标有相应的标记 m/z 价值观。 B,用抗Tyr(P)4G10抗体免疫沉淀未刺激细胞的酪氨酸磷酸化蛋白,并使用SDS-PAGE分离。用指示的抗体探测免疫沉淀的蛋白质。此外,通过加载全细胞裂解物(以下)分析细胞蛋白表达水平(右侧小组)。 IP.,免疫沉淀; Ptyr.,磷酸酪氨酸; WT., 野生型; PY ,磷酸酪氨酸; PS.,磷源; Pt.,磷酸辛; IB.,免疫印迹。

       egf.和PDGF信令中PTP1B功能分析 -

      PTP1B已涉及EGFR和PDGFRβ信令(
      • Lammers R.
      • Bossenmaier B.
      • 很酷的d.e.
      • Tonks N.K.
      • 雪斯林格J.
      • 菲舍尔e.h.
      • Ullrich A.
      蛋白质酪氨酸磷酸酶在完整细胞中的差异活性。
      ,
      • Haj f.g.
      • 马尔多瓦B.
      • 克拉兰L.D.
      • Bohmer F.D.
      • Neel B.G.
      蛋白酪氨酸磷酸酶-1b受体酪氨酸激酶信号传导的调节。
      ),并且两种RTK下游的信号传输对于小鼠胚胎成纤维细胞的生长和运动是重要的。为了分析EGF或PDGF刺激后野生型和KO细胞之间的整体细胞酪氨酸磷酸化的不同,我们进行了TYR(P)的西方印迹分析(图5A)。用抗磷酸酪氨酸抗体检测4G10揭示了每种条件下的野生型和KO细胞之间的差异。然后,我们使用定量MS分析来研究哪些蛋白质在细胞EGFR和PDGFRβ信号中受到PTP1B可能调节的。 图5B. 展示我们在基于基础,EGF-和PDGF刺激条件下三个平行实验中的野生型和KO细胞之间检测磷酸化差异的策略。在第四个实验中,我们应用Silac三重标记以检测由生长因子刺激引起的PTP1B KO细胞中的磷酸化变化(图5B.)。使用该策略,我们不仅鉴定了与PTP1B有效相关的蛋白质,而且还在EGFR或PDGFRβ介导的信号传导中(补充表4-7)中调节各个蛋白质的信息。总共有显着的配体诱导的Tyr(P) - 悬浮肽的上调,在EGF处理时检测32个蛋白,并在PDGF处理时进行31例蛋白(补充表7)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5通过PTP1B缺陷细胞的差分氧化硅酸盐标记检查EGF和PDGF信号中PTP1B功能。A,在血清饥饿3小时后,基部,EGF-(50ng / ml,5分钟)或PDGF(20ng / ml,5分钟)刺激条件下的野生型和KO细胞中酪氨酸磷酸化蛋白的蛋白质印迹分析。 B,描绘策略以分析在EGF(50ng / ml,5分钟)和PDGF(20ng / ml,5分钟)溶解的eGF(50ng / ml,5分钟)和PDGF(20ng / ml,5分钟)刺激的磷酸化差异3小时。每个 椭圆形 代表一个独立的氧化硅酸盐实验。因此,不仅可以检查野生型和KO细胞之间的磷酸化的改变,但也确定配体诱导的磷酸化事件。 Ptyr.,磷酸酪氨酸; WT., 野生型。
      由于PTP1B基质预期在这些治疗条件下在PTP1B KO细胞中进行多磷酸化,我们将所有蛋白质均为显着上调的阳性击中(p <与野生型细胞相比,ko中的至少一个Tyr(p)肽。将这些标准应用于EGF数据集,我们确定了三种不仅通过EGF刺激诱导的三种蛋白质,而且还显示出KO细胞中较高的酪氨酸磷酸化 相对 wild-type cells (表二)。
      表二在PTP1B缺陷细胞中的EGF信号传导中的改变
      功能名称磷酸肽序列Tyr(P)肽全蛋白质KO / WT比率刺激率EGF /基础
      TYR(P)网站p valueKO / WT比率标准化
      细胞摩托斯Vav-3TPIALATGIRPFPTEESINDIPYK.1410.0010.5823.60
      IP.3 和 DAG signalingPLCγ1igtaepdpygalyegr.7710.045.946.050.9812.87
      磷酸膦酸性信号传导SHIP2tlsevdpyapgpgr.11360.104.066.220.6548.61
      增殖p62DOKgfssdtalpysqvqk.4500.183.042.511.212.38
      扩散/迁移表皮生长因子受体pyssdptgavtednidddaflpvpepyvnqsvpk.1069/10920.391.311.680.7845.04
      mhlpsptdsnfpyr.10000.391.201.550.78>50.00
      gshqmsldnpdpyqqdffpk.11720.381.051.350.7837.97
      GPTAENAPYLR.11970.371.021.320.7853.28
      正如预期的那样,EGF刺激后EGFR的酪氨酸磷酸化增加了30-50倍。令人惊讶的是,虽然EGFR已被描述为潜在的PTP1B底物,但所有量化和配体诱导的EGFR(P)肽显示出几乎等于1的KO /野生型比例,但是,在EGFR下游,三种蛋白质显着地发现了三种蛋白质在KO细胞中调节酪氨酸磷酸化。其中,磷酸阳性调节剂PLCγ1和Ship2分别从6-和4倍的下方增加,其中Tyr(P)达到来自这些信号换能器的肽。此外,EGF诱导的RHO调节剂VAV-3在KO细胞中被高磷酸化。类似于基础数据集,增殖P62Dok的负调节器(
      • 赵米
      • Schmitz A.A.
      • 秦义。
      • di cristofano A.
      • Pandolfi P.P.
      • 范艾斯特L.
      P62(DOK)的磷酸阳性3-激酶依赖性膜募集对其对丝裂原激活蛋白(MAP)激酶活化的负面影响至关重要。
      )在PTP1B缺乏时更强烈的酪氨酸磷酸化,虽然是 p 该已知的PTP1B基板的值不在施加的显着阈值范围内。
      在PDGF诱导的信号传导中,五种蛋白质显示出显着增加的KO /野生型磷酸化比(表III)。在KO细胞中,PDGFRβ本身的磷酸化程度约为2.5倍,尽管这种效果主要是由于蛋白质表达增加。然而,PDGFRβ的下游,两个负信号调节器,如P62DOK和P120RASGAP(
      • 杜布恩
      • 郑艾。
      • Tremblay M.L.
      蛋白酪氨酸磷酸酶1B在RAS信号传导中的作用。
      )和阳性调节器SHP2相对于其酪氨酸磷酸化上调(
      • 唐诺万
      • 香农下午茶
      • Bollag G.
      GTP酶激活蛋白:细胞内信号传导的临界调节因子。
      ,
      • Neel B.G.
      • 顾人
      • pao l.
      'Shp'ing News:含Sh2含有细胞信号传导中的酪氨酸磷酸酶。
      ,
      • Agazie Y.M.
      • 海曼M.J.
      SHP2在表皮生长因子受体信号传导中的作用的分子机制。
      )。此外,PLCγ1和二酰基甘油结合激酶PKCδ从我们的PDGF数据中出现为PTP1B调节的元素。集体这些数据表示PTP1B在调制EGF或PDGF处理时调节受体近端信令事件的各种作用。列出的TYR(P)磷酸肽的所有MS / MS光谱 表IIIII 也可作为补充数据(补充MS / MS Spectra 2)。
      表IIIPDGF.信号传导在PTP1B缺陷细胞中的改变
      功能名称磷酸肽序列Tyr(P)肽全蛋白质KO / WT比率刺激比PDGF /基础
      TYR(P)网站p valueKO / WT比率标准化
      吞噬作用Megf10蛋白dsppyaeinnstpanr.10610.01>10.002.14
      IP.3 和 DAG signalingPLCγ1IGTAEPDPYGALPYEGNPGFPYVEANPMPTFK.771/775/7830.056.116.220.9828.47
      igtaepdpygalyegr.7710.143.964.040.9823.29
      扩散/迁移PKCΔ.KLDTTESVGGIPYQGFEK.3110.037.237.960.91
      RAS积极调节SHP2IQNTGDPY(0.5)PY(0.5)Dlyggek62或63.0.094.773.851.24>20.00
      ras负调节p120rasgap.Eipyntir.4510.046.664.421.51
      增殖p62DOKIP.PGPSQDSVPYSDPLGSTPAGAGEGVHSK.3140.242.922.411.21
      tvpppvpqdplgsppalpyaepldslr.2950.272.682.221.21
      扩散/迁移血小板衍生的生长因子受体βyadiespsymapydnpyvpsaper.7780.272.631.531.7218.21
      desidpyvpmldmk.7510.312.381.391.72>50.00
      dimrdsnpyisk.8570.332.181.271.7221.75
      pyqqvdeeflr.9700.362.001.161.7273.45

       PTP1B基板捕获方法识别与潜在基板的物理相互作用 -

      PTP1B缺陷细胞中酪氨酸磷酸化的增加表示功能性连杆,但不一定是由于PTP1B直接衬底结合和去磷酸化。因此,我们使用并行方法来鉴定通过与PTP1B直接相互作用可能调节的蛋白质。鉴定蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶的直接底物的良好策略是 体外 基材捕获方法。由此通过在PTP1B的情况下引入其基本催化残基中的取代而产生重组的磷酸酶 - 死突变体,其是D182a和Q262a(
      • Flint A.J.
      • Tiganis T.
      • 巴福德D.
      • Tonks N.K.
      “基质捕获”突变体的发展,以鉴定蛋白质酪氨酸磷酸酶的生理基质。
      ,
      • 谢L.
      • 张Y.L.
      • 张Z.Y.
      改进蛋白酪氨酸磷酸酶基质捕获突变体的设计与表征。
      )。这些突变体已经失去了去磷酸化素蛋白的能力,而是可以用它们的基材形成稳定的络合物(补充图3A)。相反,没有野生型酶拉下酪氨酸磷酸化蛋白,因为所有相互作用的蛋白质都是可去磷酸化的。为了使酪氨酸磷酸化蛋白的量的印模印象与重组PTP1B基底捕获突变体相互作用,用来自PTP1b KO细胞的细胞提取物进行Western印迹分析。如预期的那样,没有野生型酶拉下酪氨酸磷酸化蛋白质,而大量与PTP1B D182A和D182A / Q262A基底捕获突变体类似地相互作用(补充图3B)。
      在我们的实验方法中,用尿素和随后的TiO洗脱结合蛋白质的底物捕获2 Tyr(P)肽的纯化。此后,通过LC-MS / MS在LTQ-甲座质谱仪中分析磷酸肽。这种分析富含磷酸富集的级分以定性方式进行,因为几乎没有酪氨酸磷酸化蛋白质富含重组野生型酶。我们选择刺激PTP1b KO细胞与普通酸盐,以提供足够量的酪氨酸磷酸化蛋白,用于底物捕获,MS分析作为与EGF或PDGF处理的裂解物的类似实验没有导致可检测的,TYR(P) - 悬浮肽(数据未显示)。这些技术限制很可能是由于基材 - 磷酸酶相互作用的相当低。可以鉴定53个蛋白质的完全Tyr(P)肽肽 体外 与PTP1B D182A / Q262A基板捕获突变体(补充表8)的关系。此外,这些蛋白质中的八种在PTP1B KO细胞中也鉴定为PTP1B KO细胞中的显着上调,根据我们的TYR(P)蛋白质组,提供了这些蛋白质是PTP1B的潜在直接底物(表IV.)。重要的是,对于这些八种蛋白中的五种,在细胞分析中也发现了在基材捕获实验中鉴定的所有Tyr(P) - 鉴定的肽,表明Pervanadate诱导的酪氨酸磷酸化非常类似于这些PTP1b基材的生理状态。此外,对于LPP和P120CTN,存在相当大的磷酸肽重叠。仅针对rhoGAP12,在生理生长或治疗条件下,在细胞中发现来自基质捕获实验的Tyr(P)肽。
      表IV.体外衬底捕获鉴定八个蛋白质,其既与PTP1B的活性位点合并,并在PTP1B缺陷细胞中的TYR(P)位点处于TYR(P)位点的超磷酸化
      名称定性Tyr(P)肽分析
      a 显示Tyr(P)肽,其属于与PTP1B捕获突变体结合的蛋白质。
      ns
      b 数字 ns 表示在基材捕获实验中鉴定了多少Tyr(P)肽,和 nc 表明在生理细胞条件下也鉴定了这些Tyr(P)肽中有多少。
      (nc)
      上调
      c 发现蛋白质明显上调Tyr(P)肽(p 价值 <0.1)由X. Tyr(P)肽从所述PTP1B底物中表明P62DOK由(X)表示,因为它们未找到它们 p 值小于0.1。
      定量衬底陷阱
      d 列出了PTP1B基质捕获突变体/野生型酶比率。
      蛋白质比特陷阱/重量
      已经描述(参考)
      TYR(P)网站磷酸肽序列基础egf.PDGF.
      p120ctn.280fhpeppygleddqr.9 (5)X7.29
      257qdvpygpqpqvr.X
      LPP.245Saqpsphymagpssgqipygpgpr.5 (3)X
      301/302Yyeppypyaagpsyggr.X
      318segdtapygqvqvqpntwk.X
      cortactin421KQPTPPAPSPSPQPIEDRPPPS(0.5)PS(0.5)PIPYEDAAPFK2 (2)X2.62(
      • 腾腾的M.
      • 杜布恩
      • Tremblay M.L.
      PTP1B通过靶向TYR446来调节皮质蛋白酪氨酸磷酸化。
      )
      334nastfeevvqvpsapyqk.X
      ZO-11164tstlrheeqpapapapapyevhnr.1 (1)X2.80
      rho gtpase-activating蛋白123 (0)X21.08
      PLCγ1771igtaepdpygalyegr.4 (4)XX43.96
      SHIP21136tlsevdpyapgpgr.1 (1)X
      p120rasgap.451Eipyntir.1 (1)X47.62
      p62DOK295tvpppvpqdplgpsppalpyaepldslr.6 (4)(X)12.66(
      • 杜布恩
      • 郑艾。
      • Tremblay M.L.
      蛋白酪氨酸磷酸酶1B在RAS信号传导中的作用。
      )
      376glpydlpqepr.(X)
      450gfssdtalpysqvqk.(X)
      表皮生长因子受体1197GPTAENAPYLR.5 (5)7.69(
      • Haj f.g.
      • 马尔多瓦B.
      • 克拉兰L.D.
      • Bohmer F.D.
      • Neel B.G.
      蛋白酪氨酸磷酸酶-1b受体酪氨酸激酶信号传导的调节。
      )
      1172gshqmsldnpdpyqqdffpk.
      1000mhlpsptdsnfpyr.
      1069/1092pyssdptgavtednidddaflpvpepyvnqsvpk.
      血小板衍生的生长因子受体β751desidpyvpmldmk.4 (3)17.89(
      • Haj f.g.
      • 马尔多瓦B.
      • 克拉兰L.D.
      • Bohmer F.D.
      • Neel B.G.
      蛋白酪氨酸磷酸酶-1b受体酪氨酸激酶信号传导的调节。
      )
      763/778.pyadiespsymapydnpyvpsaper.
      a 显示Tyr(P)肽,其属于与PTP1B捕获突变体结合的蛋白质。
      b 数字 ns 表示在基材捕获实验中鉴定了多少Tyr(P)肽,和 nc 表明在生理细胞条件下也鉴定了这些Tyr(P)肽中有多少。
      c 发现蛋白质明显上调Tyr(P)肽(p 价值 <0.1)由X. Tyr(P)肽从所述PTP1B底物中表明P62DOK由(X)表示,因为它们未找到它们 p 值小于0.1。
      d 列出了PTP1B基质捕获突变体/野生型酶比率。
      如图所示 表IV.,已经描述了EGFR,PDGFR,P62DOK和皮质蛋白与PTP1B底物捕获突变体结合,从而确认该方法的可靠性(
      • Blanchetot C.
      • Chagnon M.
      • 杜布恩
      • 哈勒姆。
      • Tremblay M.L.
      谱系捕获技术在鉴定细胞PTP靶标中。
      ,
      • 腾腾的M.
      • 杜布恩
      • Tremblay M.L.
      PTP1B通过靶向TYR446来调节皮质蛋白酪氨酸磷酸化。
      )。对于各种其他酪氨酸磷酸化的蛋白质,除了在细胞PTP1B缺乏时,我们还获得了其能够直接与PTP1B催化部位与PTP1B的催化部位相互作用的证据。在这些蛋白质中,主要是细胞粘附的调节剂,如P120CTN或ZO-1和ZO-1和LPP或皮质素的稳压剂。因此,PTP1B调节的酪氨酸磷酸化与观察到的磷酸酶缺陷MEFS的细胞运动增加良好。此外,对于P120RASGAP,我们通过两种方法检测了RA信号的关键调节器,并且通过作用于脂质水解酶PLCγ1和脂质磷酸酶船2,我们的组合数据进一步揭示了PTP1B对磷酸阳性信号传导的先前未知的连接。
      为了进一步确认鉴定的Tyr(P) - 甲型蛋白的选择性结合,我们使用定量氧化硅酸方法与重组PTP1B野生型酶(补充表9)相比分析与基材捕获突变体的蛋白质结合。所有蛋白质显示在 表IV. 在除脂肪瘤优选的合作伙伴同源物和Ship2之外的定量底物捕获实验中被鉴定。蛋白质结合率证实PTP1B捕获突变体具有比潜在的底物蛋白更高的结合亲和力,而不是野生型酶(表IV.)。

      讨论

      PTP1B是酪氨酸信号传导的公知的调节剂,控制各种代谢,致癌和免疫功能。生物化学研究已描述以前12种PTP1B底物(
      • 杜布恩
      • Tremblay M.L.
      小蛋白酪氨酸磷酸酶TC-PTP和PTP1B在信号转导和疾病中的涉及:从糖尿病,肥胖到细胞周期和癌症。
      ,
      • 腾腾的M.
      • 杜布恩
      • Tremblay M.L.
      PTP1B通过靶向TYR446来调节皮质蛋白酪氨酸磷酸化。
      )。这些研究中的许多研究涉及PTP1B缺陷的细胞,其中,如预期的那样,观察到鉴定的基质的磷酸酪氨酸含量的上调。通过分析在相应的细胞因子和生长因子处理上,通过分析PTP1B缺陷的成纤维细胞来鉴定诸如EGFR,PDGFR,胰岛素受体,IGF1R,JAK2,TYK2和P62DOK的几个底物。然而,对于大多数这些基质信息,关于Tyr(P)特异性调节缺失,关于PTP1b对作用在各种PTK的下游的效应蛋白的活性也几乎熟知。在我们的研究中,其中六个已经描述的底物中被发现在PTP1b KO细胞中被发现和/或在底物捕获分析中鉴定(胰岛素受体/ IGF1R,P62DOK,Cortactin,IRS1,EGFR和PDGFR)。总的来说,我们的定量MS分析使我们能够比较酪氨酸磷酸化的相对差异124个蛋白质在PTP1b KO细胞和基础和EGGF或PDGF刺激条件下的野生型对应物之间的301磷酸酪氨酸位点。因此,这种细胞磷酸酪氨酸分析详细概述了该广泛使用的细胞系统中的全局酪氨酸信号传导过程,进一步提供了对酪氨酸磷酸化在增加的迁移增加和减少的增殖时对PTP1B缺乏观察到的新洞察力。在细胞水平上,PTP1b的调节显示为18个分析的蛋白质,其中没有PTP1b导致酪氨酸磷酸化的显着增加,从一个或多个Tyr(p)肽中是明显的。 PTP1B KO细胞中蛋白质的超磷酸化不一定涉及直接酶底物相互作用;然而,它表明鉴定的蛋白质在功能上与细胞PTP1B功能相关。 PTP1B与其功能相关蛋白的直接相互作用的分析提供了有关潜在酶衬底关系的进一步信息。确定酪氨酸磷酸化蛋白与PTP1b的结合的良好的方法使用催化失活的磷酸酶捕获突变体。上面提到的所有先前报告的底物蛋白已被显示为直接与PTP1B的活性中心结合(
      • Blanchetot C.
      • Chagnon M.
      • 杜布恩
      • 哈勒姆。
      • Tremblay M.L.
      谱系捕获技术在鉴定细胞PTP靶标中。
      )。使用这种基材捕获方法,我们将各种其他酪氨酸磷酸化蛋白的酶蛋白与酶活性突变体的特异性结合。有趣的是,在我们研究中发现的18个显着上调的蛋白质中有八个被发现与PTP1B基质捕获突变体结合:皮质素,LPP,PLCγ1,SHAP2,P120CTN,ZO-1,RhoGAP12和P120RASGAP。 Fig. 6 概述所有新型推定底物并将这些蛋白质放入其描述的功能上下文中。另外,根据我们的全球磷酸酪氨酸分析数据与PTP1B相关联的蛋白质,酪氨酸磷酸化和功能可以连接到PTP1B KO细胞中观察到的增加的运动性和增殖降低。然而,应该注意,虽然这些蛋白质没有表现出来 体外 与底物捕获突变体的结合不能排除PTP1B在相当瞬时的蜂窝相互作用中直接去磷酸化它们。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6概述功能背景下的新型电位PTP1B酶基质相互作用的示意图。 ER局部的PTP1b含有富含脯氨酸的结构域,允许与含有SH3结构域的底物蛋白相互作用。 红色箭头 表明推定基材的直接相互作用和去磷酸化,而 虚线红色箭头 从PTP1B缺乏增加的酪氨酸磷酸化增加中,指定直接或间接功能协会。所有所描绘的Tyr(P)位点在PTP1B缺陷细胞中是高磷酸化的。此外,潜在衬底的Tyr(P)位点被鉴定为底物捕获测定中的推定相互作用位点。该方案是在以下参考的基础上设计的:局灶性粘附位点(
      • 坎德伍德D.A.
      • Shattil S.J.
      • Ginsberg M.H.
      整联蛋白和肌动蛋白细丝:细胞粘附和信号传导的互核调节。
      ),PDGFRβ-介导的N-CADHERIN细胞 - 细胞粘附调节(
      • 格里尔P.
      关闭FPS / FES和FER的生物功能。
      )和P62DOK和P120RASGAP RAS信令的调节(
      • 杜布恩
      • 郑艾。
      • Tremblay M.L.
      蛋白酪氨酸磷酸酶1B在RAS信号传导中的作用。
      )。 漩涡,血管扩张剂刺激的磷蛋白; PY ,磷酸酪氨酸; pi(4,5)p2,磷脂酰肌醇4,5-双磷酸盐; pi(3,4,5)p2,磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸盐; pi(3,4)p2,磷脂酰肌醇3,4-双磷酸盐。
      这里鉴定的大多数蛋白质作为潜在的新PTP1B基板(表IV.)可以细分为两个功能等级:包含细胞迁移和粘附性的调节剂,另一类由细胞​​增殖中的调节作用定义。我们验证了PTP1B缺陷的细胞表明,如巴克利所描述的那样,细胞运动的强劲增加 等等。 (
      • 巴克利D.A.
      • 郑艾。
      • 基利p.a.
      • Tremblay M.L.
      • O'Connor R.
      通过蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)调节胰岛素样生长因子I型(IGF-1)受体激酶活性和增强的IGF-I介导的PTP-1B缺陷成纤维细胞凋亡和运动性的抑制。
      )。根据该观察,已显示PTP1B在HeLa细胞中的异位表达,以减少血清诱导的细胞迁移(
      • yigzaw Y.
      • Poppleton h.m.
      • Sreejayan N.
      • 哈西德A.
      • Patel T.B.
      蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶-1B(PTP1B)介导Sprouty的抗迁移作用。
      )。有趣的是,我们将多达七种潜在的PTP1B基质鉴定为细胞迁移和粘附的调节剂:Cortactin,LPP,PLCγ1,Ship2,P120CTN,ZO-1和rhoGAP12。酪氨酸皮质素的磷酸化导致肌动蛋白交联活性降低,并促进内皮细胞中的细胞活性(
      • 黄C.
      • 刘杰。
      • Haudenschild C.C.
      • 詹X.
      酪氨酸磷酸化酪氨酸在内皮细胞运动运动中的作用。
      )。使用Tyr(P)-421位点特异性抗体,头部 等等。 (
      • 头J.A.
      • 江泽民
      • 李米
      • Zorn L.J.
      • Schaefer e.m.
      • 帕森斯J.T.
      • 杂草s.a.
      皮质蛋白酪氨酸磷酸化需要Rac1活性和与皮质肌动蛋白细胞骨架的关联。
      )显示皮质蛋白在局部化为Lamlipodia和Podosomes的Tyr-421上磷酸化,而其磷酸化位点Tyr-334的功能尚不清楚。最近,最悠久 等等。 (
      • 腾腾的M.
      • 杜布恩
      • Tremblay M.L.
      PTP1B通过靶向TYR446来调节皮质蛋白酪氨酸磷酸化。
      )还将皮质素鉴定为PTP1B的底物,并将PTP1B基质捕获突变体的结合映射到皮里氏菌素的TYR(P)-446。此外,他们表明TYR-446和TYR-421的磷酸化是相互依赖的,并且PTP1B功能与特异性抑制剂的干扰或通过显性阴性突变体的表达导致HELA细胞中的两个残基的磷酸化增加。在我们的研究中,我们检测到Cortactin Tyr(P)-421但不是Tyr(P)-446。这可能是由于技术困难在通过我们的MS策略分析Tyr(P)-446的相应肽,或者,或者,在小鼠胚胎成纤维细胞中也可能不会发生这种磷酸化事件。目前尚未研究LPP的酪氨酸磷酸化,但LPP被显示为定位局灶性粘附结,并结合血管扩张剂刺激的磷蛋白和α-肌醇蛋白(
      • Petit m.m.
      • Meulemans S.M.
      • van dev.j.
      含铅脂肪瘤优选合作伙伴(LPP)蛋白的焦粘附和核靶向能力。
      )。
      有趣的是我们还确定了在我们的分析中作为PTP1B:PLCγ1的潜在基材的磷酸阳性改性酶,其将磷脂酰肌醇4,5-双磷酸盐转化为IP3/ DAG和SHOP2,将磷酸三磷脂3,4,5-三磷酸盐去磷酸盐3,4-双磷酸盐。 PTP1B与PLCγ1的绑定已经映射到PLCγ1的SH3结构域(
      • Choi J.H.
      • 金H.S.
      • 金S.H.
      • 杨y.r.
      • BAE Y.S.
      • 常J.s.
      • 夸甘
      • ryu s.h.
      • Suh P.G.
      磷脂酶Cγ1通过与JAK2和蛋白酪氨酸磷酸酶-1b形成三元复合物来负调节生长激素信号传导。
      ),但目前没有直接去磷酸化的证据。 PTP1B KO细胞中PLCγ1的升高导致PDGF刺激后Tyr(P)-311上的PKCδ磷酸化增加。 PKCδ酪氨酸磷酸化通过DAG呈正常调节,导致激酶活性增加,又导致小鼠成纤维细胞的动力增强(
      • Iwabu A.
      • 史密斯K.
      • Allen F.D.
      • Lauffenburger D.A.
      • 嗯A.
      表皮生长因子通过蛋白激酶Cδ依赖性途径诱导成纤维细胞收缩性和运动性。
      )。符合这些细胞数据,也发现PTP1B可去磷酸盐酸盐PKCδ 体外 (
      • Benes C.
      • SOLTOFF S.P.
      通过SRC激酶调制PKCδ酪氨酸磷酸化和唾液酸和PC-12细胞活性的调节。
      )。在Ship2的情况下,Tyr-986或Tyr-987上的酪氨酸磷酸化可能控制蛋白质的酶活性,并且显示对肌动蛋白细胞骨架的形成和调节是重要的(
      • Prasad N.
      • 打开r.s.
      • Decker S.J.
      SRC系列酪氨酸激酶调节粘附依赖性酪氨酸磷酸化5'-肌醇磷酸酶Ship2期间的细胞附着和胶原I.
      )。如何在残留物tyrue tyr-987和tyr-1136上增加磷酸化的磷酸化可能会影响PTP1b KO细胞中的EGF信号传导,以及是否存在Ship2到磷脂酰肌醇3,4-双磷酸盐粘合剂TKS5 / Fish的连接(
      • 密封D.F.
      • Azucena Jr.,例如,
      • 通过I.
      • Tesfay L.
      • 戈登R.
      • 伍德罗姆
      • 驳回J.H.
      • Courtneidge S.A.
      适配器蛋白质TKS5 /鱼是摩托车组形成和功能,以及蛋白酶驱动的癌细胞侵袭。
      ),其在KO细胞中也是高磷酸化的,仍有待研究。
      PTP1B野生型成纤维细胞表现出比KO细胞(数据未示出)更强的细胞 - 细胞粘附接触。 P120CTN的酪氨酸磷酸化可以解释这种表型,因为它证明了SRC激酶的P120CTN磷酸化导致E-Cadherin功能的损失(
      • ozawa M.
      • Ohkubo T.
      V-SRC转染的L细胞中P120(CTN)的酪氨酸磷酸化取决于其与E-钙粘蛋白的关系并降低粘附活性。
      )。相比之下,其他研究表明,P120CTN的酪氨酸磷酸化可分配用于调节Cadherin基细胞粘连(
      • Cozzolino M.
      • Giovannone B.
      • Serafino A.
      • Knudsen K.
      • Levi A.
      • Alema S.
      • Salvatore A.
      胚胎癌细胞中TrkA酪氨酸激酶的激活促进细胞压实,独立于酪氨酸酪氨酸磷酸化。
      )。为了阐明这种差异,重要的是通过酪氨酸激酶和磷酸酶获得有关调节P120CTN的现场特异性信息(
      • Alema S.
      • Salvatore上午
      P120 Catenin和磷酸化:未解决问题的机制和特征。
      )。在我们的研究中,我们发现P120CTN可能由TYR(P)-257和TYR(P)-280的PTP1B调节,但不是在TYR(P)-228和TYR(P)-904(补充表S2) 。由于PTP1B缺陷细胞显示出增强的迁移和降低的细胞粘附,所调节的TYR(P)位点可以与这些细胞过程连接。还与ZO-1的酪氨酸磷酸化相连,还原细胞粘附降低(
      • Takeda H.
      • Nagafuchi A.
      • Yonemura S.
      • Tsukita S.
      • Behrens J.
      • Birchmeier W.
      V-SRC激酶将来自肌肉蛋白的细胞粘附从强状态移到弱状态,而换档不需要βcatenin。
      )。由于成纤维细胞中没有紧密的交界处,ZO-1可能定位为并调节细胞粘附结(
      • ITOH M.
      • Nagafuchi A.
      • Yonemura S.
      • kitani-yasuda t.
      • Tsukita S.
      在非上皮细胞中与钙丝蛋白共致纳米甲蛋白质的220kd蛋白质与ZO-1,上皮细胞中的紧密结相关蛋白质相同:cDNA克隆和免疫电解显微镜。
      )。
      还发现PTP1B在完整细胞中调节RHO信号调节器VAV-3和rhoGAP12。 VAV-3 TYR(P)-141是一个新的网站,并且已经描述了rhoGAP12 TYR(P)-241而无需进一步表征其功能。进一步分析这些GTPAse调节剂的磷酸酪氨酸调节可以有助于解释最近的观察,即PTP1B可以在上游(
      • 达克斯。
      • Chernoff J.
      蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶1b介导胰岛素对长化成纤维细胞中肌动蛋白细胞骨架的影响。
      )和下游(
      • Kabuyama Y.
      • Langer S.J.
      • Polvinen K.
      • Homma Y.
      • resing K.A.
      • ahn n.g.
      功能性蛋白质组学将蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶1B鉴定为RHOA信号传导的靶标。
      )小GTPase RhoA。
      与野生型电池相比,PTP1B KO MEFS表现出强烈的增殖降低。杜拜 等等。 (
      • 杜布恩
      • 郑艾。
      • Tremblay M.L.
      蛋白酪氨酸磷酸酶1B在RAS信号传导中的作用。
      )这种降低的增殖率与RAS活性降低相关,这是其负调节剂P62Dok的磷酸化增加的结果。随着我们的定量MS分析,我们在PTP1B KO细胞中复制了P62DOK酪氨酸磷酸化的报告的上调,进一步表明P120RASGAP在PDGF刺激后在KO细胞中进行过磷酸化,而其表达仅略微增加。有趣的是P120RASGAP是一种P62DOK结合蛋白,它通过促进其内在GTP酶活性来负调节RAS(
      • 唐诺万
      • 香农下午茶
      • Bollag G.
      GTP酶激活蛋白:细胞内信号传导的临界调节因子。
      )。
      PTP1B的底物特异性取决于其蛋白质复合物的亚细胞定位和组织。 PTP1B通过其富含脯氨酸的域与SH3结构域的结合相互作用,例如P130CAS的SH3结构域(
      • 刘F.
      • 山D.E.
      • Chernoff J.
      富含蛋白酪氨酸磷酸酶1B的富含脯氨酸区域的直接结合P130(CAS)的SRC同源性3结构域。
      )。这里鉴定的一些潜在的底物蛋白含有SH3结构域,例如皮质素,ZO-1,P120RASGAP,rhoGAP12和PLCγ1(Fig. 6)。此外,我们发现其他酪氨酸磷酸化蛋白质,如TKS5或VAV-3,如TKS5或VAV-3,在PTP1B缺陷细胞中被上调,我们未获得与PTP1B的催化结构域直接结合的实验证据 体外。然而,在细胞背景下,可以通过富含脯氨酸的磷酸酶的富含脯氨酸结构域的PTP1B-SH3结构域相互作用促进这些蛋白质的直接去磷酸化。
      根据将PTP中的非催化域描述为其蜂窝定位至关重要的“邮政编码”模型(
      • Mauro L.J.
      • 迪克森J.E.
      'Zip码'直接细胞内蛋白酪氨酸磷酸酶磷酸酶到正确的细胞'地址'。
      ),ptp1b定位到er(
      • Frangioni J.v.
      • Beahm p.h.
      • Shifrin V.
      • Jost C.a.
      • Neel B.G.
      非映射酪氨酸磷酸酶PTP-1B通过其35氨基酸C-末端序列定位于内质网。
      )。这提出了PTP1B如何在血浆膜和细胞溶溶胶中局部地置于底物蛋白质的问题。 PTP1B的蜂窝功能可以通过其基板的定位来细分。显示出胰岛素受体和其他rtKs的受体蛋白的前体(如胰岛素受体和其他RTK)的去磷酸盐前体,从ER到血浆膜(
      • Lammers R.
      • Bossenmaier B.
      • 很酷的d.e.
      • Tonks N.K.
      • 雪斯林格J.
      • 菲舍尔e.h.
      • Ullrich A.
      蛋白质酪氨酸磷酸酶在完整细胞中的差异活性。
      ,
      • Boute N.
      • 布贝尔S.
      • Lacasa D.
      • issad t.
      活细胞胰岛素受体与蛋白酪氨酸 - 磷酸酶1B相互作用的动态。
      )。
      有趣的是哈吉 等等。 (
      • Haj f.g.
      • verveer p.j.
      • 乡绅A.
      • Neel B.G.
      • Bastiaens P.I.
      PTP1b在内质网的表面上去磷酸化的成像位点。
      )还表明,当受体被内化并且内体接触到ER时,PTP1B在配体刺激后靶向EGFR和PDGFR等RTK。这可能在我们研究中解释EGFR和PDGFR在PTP1B KO细胞中缺少的高磷酸化,因为在这里使用的短刺激时间点之后,两个受体都没有内化。 Anderie证明了血浆膜上的ER-结合的PTP1B对底物的直接进入 等等。 (
      • 安德里I.
      • Schulz I.
      • 施密A.
      ER膜结合PTP1B与其血浆膜锚定靶之间的直接相互作用。
      )但仍然存在争议。此外,在血小板中证明了通过蛋白水解钙蛋白介导的切割释放PTP1B进入胞质溶胶的裂解(
      • Frangioni J.v.
      • Beahm p.h.
      • Shifrin V.
      • Jost C.a.
      • Neel B.G.
      非映射酪氨酸磷酸酶PTP-1B通过其35氨基酸C-末端序列定位于内质网。
      ,
      • kuchay s.m.
      • 金恩。
      • Grunz E.A.
      • Fay W.P.
      • chishti a.h.
      双敲除揭示蛋白酪氨酸磷酸酶1B是血小板中Calpain-1的生理靶标。
      )。在其中蜂窝定位PTP1B地址我们在我们的研究中表征的新型潜在基质将是进一步研究的一个有趣问题。
      我们的研究提供了哺乳动物细胞中PTP1B的潜在新底物蛋白和下游效应分子的宝贵清单。特别是,我们的研究结果有助于解释PTP1B在控制细胞活性和粘合中的涉及,因为许多所识别的潜在底物蛋白定位在细胞 - 细胞粘附位点中。这些观察结果还表明,PTP1B不仅作用于构成其大部分已经描述的底物蛋白的PTK,而且在其下游效应蛋白上以维持可逆细胞蛋白酪氨酸磷酸化的稳态。据我们所知,本研究首次提供了PTP系列酶成员的蜂窝功能的全局图像。现在可以应用于分析细胞PTP1B功能和衬底特异性的策略应用于该重要酶系列的其他成员,并且具有在蜂窝信号传输网络的上下文中定义其他PTP的功能。

      致谢

      我们感谢Max Planck生物化学​​研究所的分子生物学系的其他成员,以获得帮助和富有讨论,特别是Michaela Bairlein,Felix Oppermann和Yixiang Zhang。我们还感谢Verena Maier进行批判性阅读稿件。 FER抗体是Peter A. Greer的善意的礼物。

      补充材料

      参考

        • Tiganis T.
        • 贝内特上午
        蛋白质酪氨酸磷酸酶功能:基板透视。
        生物学习。 j。 2007; 402: 1-15
        • Lammers R.
        • Moller N.P.
        • Ullrich A.
        跨膜蛋白酪氨酸磷酸酶α去磷酸化胰岛素受体在完整细胞中。
        费用。 1997; 404: 37-40
        • Fuchs M.
        • Muller T.
        • 小床。
        • Ullrich A.
        人蛋白 - 酪氨酸磷酸酶κ与Armadillo家族成员的关联。
        J. Biol。化学。 1996; 271: 16712-16719
        • Anders L.
        • Mertins P.
        • Lammich S.
        • murgia m.
        • 哈特曼D.
        • Saftig P.
        • 哈斯C.
        • Ullrich A.
        Furin-,Adam 10-和γ分泌酶介导的受体酪氨酸磷酸酶的切割和β-连环蛋白的转录活性调节。
        摩尔。细胞。 BIOL。 2006; 26: 3917-3934
        • Kharitonenkov A.
        • 陈祖
        • 祝我有
        • 王H.
        • 席克林J.
        • Ullrich A.
        一系列蛋白质,其抑制通过酪氨酸激酶受体的信号传导。
        自然。 1997; 386: 181-186
        • Gensler M.
        • Buschbeck M.
        • Ullrich A.
        PETE型蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶BDP1对HER2信号传导的负调节。
        J. Biol。化学。 2004; 279: 12110-12116
        • 普里达R.
        • Zuniga A.
        • Ullrich A.
        PTP-SL和步骤蛋白酪氨酸磷酸酶通过激酶相互作用基序通过关联调节细胞外信号调节激酶ERK1和ERK2的活化。
        Embo J. 1998; 17: 7337-7350
        • Buschbeck M.
        • Eickhoff J.
        • Sommer M.N.
        • Ullrich A.
        磷酸吡罗氨酸特异性磷酸酶PTP-SL调节ERK5信号通路。
        J. Biol。化学。 2002; 277: 29503-29509
        • Lammers R.
        • Bossenmaier B.
        • 很酷的d.e.
        • Tonks N.K.
        • 雪斯林格J.
        • 菲舍尔e.h.
        • Ullrich A.
        蛋白质酪氨酸磷酸酶在完整细胞中的差异活性。
        J. Biol。化学。 1993; 268: 22456-22462
        • 杜布恩
        • Tremblay M.L.
        小蛋白酪氨酸磷酸酶TC-PTP和PTP1B在信号转导和疾病中的涉及:从糖尿病,肥胖到细胞周期和癌症。
        Biochim。 Biophys。 acta。 2005; 1754: 108-117
        • Tonks N.K.
        ptp1b:从边线到前线!
        费用。 2003; 546: 140-148
        • elcheby m.
        • Payette P.
        • Michaliszyn E.
        • 克里姆莱斯W.
        • 柯林斯S.
        • loy a.l.
        • 诺曼底D.
        • 郑艾。
        • Himms-Hagen J.
        • Chan C.C.
        • Ramachandran C.
        • 格雷德M.J.
        • Tremblay M.L.
        • 肯尼迪B.P.
        缺乏蛋白质酪氨酸磷酸酶-1b基因的小鼠胰岛素敏感性和肥胖性增加。
        科学。 1999; 283: 1544-1548
        • 克拉兰L.D.
        • 老板O.
        • Peroni O.D.
        • kim j.k.
        • 马蒂诺J.L.
        • Zabolotny J.M.
        • Moghal N.
        • Lubkin M.
        • kim y.b.
        • Sharpe A.H.
        • 斯特里克 - 克朗·答:
        • Shulman G.I.
        • Neel B.G.
        • KAHN B.B.
        在蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶1B缺陷小鼠中增加能量消耗,降低肥胖和组织特异性胰岛素敏感性。
        摩尔。细胞。 BIOL。 2000; 20: 5479-5489
        • 脚k.k.
        • Delibegovic M.
        • 薛b。
        • Gorgun C.Z.
        • Hotamisligil G.S.
        • Neel B.G.
        • KAHN B.B.
        神经元PTP1B调节体重,肥胖和瘦素作用。
        NAT。 Med。 2006; 12: 917-924
        • 杜布恩
        • Bourdeau A.
        • 海宁琴日
        • 郑艾。
        • loy a.l.
        • Tremblay M.L.
        蛋白质酪氨酸磷酸酶的遗传烧蚀通过B细胞发育的调节加速P53-核小鼠的淋巴瘤。
        癌症res。 2005; 65: 10088-10095
        • 朱利安S.G.
        • 杜布恩
        • 读米
        • 佩尼J.
        • PAQUET M.
        • 韩义。
        • 肯尼迪B.P.
        • Muller W.J.
        • Tremblay M.L.
        蛋白质酪氨酸磷酸酶1B缺乏或抑制延迟ERBB2诱导的乳腺肿瘤瘤,并保护肺转移。
        NAT。遗传。 2007; 39: 338-346
        • Bentire-Alj M.
        • Neel B.G.
        HER2 / Neu诱导的乳腺癌需要蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶1B。
        癌症res。 2007; 67: 2420-2424
        • Flint A.J.
        • Tiganis T.
        • 巴福德D.
        • Tonks N.K.
        “基质捕获”突变体的发展,以鉴定蛋白质酪氨酸磷酸酶的生理基质。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 1997; 94: 1680-1685
        • Blanchetot C.
        • Chagnon M.
        • 杜布恩
        • 哈勒姆。
        • Tremblay M.L.
        谱系捕获技术在鉴定细胞PTP靶标中。
        方法。 2005; 35: 44-53
        • Aeberberold R.
        基于质谱的蛋白质组学。
        自然。 2003; 422: 198-207
        • Siu R.
        • Fladd C.
        • 旋转D.
        n-cadherin是蛋白酪氨酸磷酸酶Sigma(PTPσ)的体内底物,并参与PTPσ介导的轴突生长的抑制。
        摩尔。细胞。 BIOL。 2007; 27: 208-219
        • 吴j.
        • katrekar a。
        • Honigberg L.A.
        • 史密斯上午
        • Conn M.T.
        • 唐杰。
        • 杰弗里D.
        • Mortara K.
        • Sampang J.
        • 威廉姆斯S.R.
        • 越野车J.
        • 克拉克准噶。
        人蛋白酪氨酸磷酸酶PTPN22基材的鉴定。
        J. Biol。化学。 2006; 281: 11002-11010
        • Syka J.E.
        • 玛托J.A.
        • 白D.L.
        • 角horn
        • Senko M.W.
        • Schwartz J.C.
        • Ueberheide B.
        • 加西亚B.
        • 母猪S.
        • 默特雷特T.
        • Shabanowitz J.
        • 狩猎d.f.
        新型线性四极离子阱/ FT质谱仪:性能表征和在组蛋白H3后翻译后修饰的比较分析。
        J.蛋白质组。 2004; 3: 621-626
        • Makarov A.
        • Denisov E.
        • KHOLOMEEV A.
        • Balschun W.
        • Lange O.
        • strupat K.
        • 角horn
        混合线性离子阱/绕组质谱仪的性能评价。
        肛门。化学。 2006; 78: 2113-2120
        • Mumby M.
        • BREKKEN D.
        磷蛋白质:蜂窝信号传导的新见解。
        基因组Biol。 2005; 6: 230
        • ong s.e.
        通过氨基酸在细胞培养中稳定同位素标记,用于定量蛋白质组学。
        方法mol。 BIOL。 2007; 359: 37-52
        硅胶功能和定量蛋白质组学。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2006; 7: 952-958
        • 奥尔森J.V.
        • Blagoev B.
        • GNAD F.
        • MACEK B.
        • Kumar C.
        • Mortensen P.
        全球性,体内和现场特异性磷酸化动力学中的信令网络。
        细胞。 2006; 127: 635-648
        • Senis Y.A.
        • 克雷格A.W.
        • 格里尔P.A.
        FPS / FES和FER蛋白 - 酪氨酸激酶在调节造血中起着多余的作用。
        Exp。血糖。 2003; 31: 673-681
        • 郑艾。
        • BAL G.S.
        • 肯尼迪B.P.
        • Tremblay M.L.
        转化成纤维细胞中粘附依赖性信号传导和细胞的衰减缺乏蛋白酪氨酸磷酸酶-1b。
        J. Biol。化学。 2001; 276: 25848-25855
        • 谢L.
        • 张Y.L.
        • 张Z.Y.
        改进蛋白酪氨酸磷酸酶基质捕获突变体的设计与表征。
        生物化学。 2002; 41: 4032-4039
        • Larsen M.R.
        • Thingholm T.e.
        • Jensen O.N.
        • Roepstorff P.
        • jorgensen t.j.
        使用二氧化钛微柱的肽混合物的高度选择性富集磷酸化肽。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2005; 4: 873-886
        • Rappsilber J.
        • Ishihama Y.
        蛋白质组学中的蛋白质组学中的基质辅助激光解吸/电离,纳米电子涂布剂和LC / MS样品预处理的停止和去提取提示。
        肛门。化学。 2003; 75: 663-670
        • 舍甫琴科A.
        • 威尔m。
        • vorm o.
        • Jensen O.N.
        • podtelejnikov a.v.
        • Neubauer G.
        • Mortensen P.
        单独通过MS识别序列数据库中凝胶分离蛋白的策略。
        生物学习。 SOC。跨。 1996; 24: 893-896
        • 奥尔森J.V.
        • De Godoy L.M.
        • 李G.
        • MACEK B.
        • Mortensen P.
        • PESCH R.
        • Makarov A.
        • Lange O.
        • 角horn
        通过锁定谱位注入C-Trap零件在横向质谱仪上的百万百万质量准确度。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2005; 4: 2010-2021
        • Schroeder M.J.
        • Shabanowitz J.
        • Schwartz J.C.
        • 狩猎d.f.
        • Coon J.J.
        一种中性损失激活方法,用于改进四极离子阱质谱法的磷酸肽序列分析。
        肛门。化学。 2004; 76: 3590-3598
        • eliasj.e.
        • 哈斯W.
        • Faherty B.K.
        • Gygi S.P.
        大规模蛋白质组学研究中使用的质谱平台的比较评价。
        NAT。方法。 2005; 2: 667-675
        • Schulze W.X.
        一种用于肽蛋白质相互作用的新型蛋白质组学筛选。
        J. Biol。化学。 2004; 279: 10756-10764
        • ong s.e.
        • Blagoev B.
        • Kratchmarova I.
        • 克里斯滕森D.B.
        • 斯丁H.
        • Pandey A.
        细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2002; 1: 376-386
        • 杜布恩
        • 郑艾。
        • Tremblay M.L.
        蛋白酪氨酸磷酸酶1B在RAS信号传导中的作用。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2004; 101: 1834-1839
        • seely b.l.
        • staubs p.a.
        • reichart d.r.
        • Berhanu P.
        • milarski K.L.
        • Saltiel A.R.
        • Kusari J.
        • olefsky准
        蛋白质酪氨酸磷酸酶1B与活性胰岛素受体相互作用。
        糖尿病。 1996; 45: 1379-1385
        • 腾腾的M.
        • 杜布恩
        • Tremblay M.L.
        PTP1B通过靶向TYR446来调节皮质蛋白酪氨酸磷酸化。
        J. Biol。化学。 2008; 283: 15740-15746
        • 黄C.
        • 刘杰。
        • Haudenschild C.C.
        • 詹X.
        酪氨酸磷酸化酪氨酸在内皮细胞运动运动中的作用。
        J. Biol。化学。 1998; 273: 25770-25776
        • ozawa M.
        • Ohkubo T.
        V-SRC转染的L细胞中P120(CTN)的酪氨酸磷酸化取决于其与E-钙粘蛋白的关系并降低粘附活性。
        J. Cell SCI。 2001; 114: 503-512
        • Takeda H.
        • Nagafuchi A.
        • Yonemura S.
        • Tsukita S.
        • Behrens J.
        • Birchmeier W.
        V-SRC激酶将来自肌肉蛋白的细胞粘附从强状态移到弱状态,而换档不需要βcatenin。
        J.细胞Biol。 1995; 131: 1839-1847
        • 巴克利D.A.
        • 郑艾。
        • 基利p.a.
        • Tremblay M.L.
        • O'Connor R.
        通过蛋白质酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)调节胰岛素样生长因子I型(IGF-1)受体激酶活性和增强的IGF-I介导的PTP-1B缺陷成纤维细胞凋亡和运动性的抑制。
        摩尔。细胞。 BIOL。 2002; 22: 1998-2010
        • 格里尔P.
        关闭FPS / FES和FER的生物功能。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2002; 3: 278-289
        • 密封D.F.
        • Azucena Jr.,例如,
        • 通过I.
        • Tesfay L.
        • 戈登R.
        • 伍德罗姆
        • 驳回J.H.
        • Courtneidge S.A.
        适配器蛋白质TKS5 /鱼是摩托车组形成和功能,以及蛋白酶驱动的癌细胞侵袭。
        癌细胞。 2005; 7: 155-165
        • Haj f.g.
        • 马尔多瓦B.
        • 克拉兰L.D.
        • Bohmer F.D.
        • Neel B.G.
        蛋白酪氨酸磷酸酶-1b受体酪氨酸激酶信号传导的调节。
        J. Biol。化学。 2003; 278: 739-744
        • 赵米
        • Schmitz A.A.
        • 秦义。
        • di cristofano A.
        • Pandolfi P.P.
        • 范艾斯特L.
        P62(DOK)的磷酸阳性3-激酶依赖性膜募集对其对丝裂原激活蛋白(MAP)激酶活化的负面影响至关重要。
        J. Exp。 Med。 2001; 194: 265-274
        • 唐诺万
        • 香农下午茶
        • Bollag G.
        GTP酶激活蛋白:细胞内信号传导的临界调节因子。
        Biochim。 Biophys。 acta。 2002; 1602: 23-45
        • Neel B.G.
        • 顾人
        • pao l.
        'Shp'ing News:含Sh2含有细胞信号传导中的酪氨酸磷酸酶。
        趋势生物化学。 SCI。 2003; 28: 284-293
        • Agazie Y.M.
        • 海曼M.J.
        SHP2在表皮生长因子受体信号传导中的作用的分子机制。
        摩尔。细胞。 BIOL。 2003; 23: 7875-7886
        • yigzaw Y.
        • Poppleton h.m.
        • Sreejayan N.
        • 哈西德A.
        • Patel T.B.
        蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶-1B(PTP1B)介导Sprouty的抗迁移作用。
        J. Biol。化学。 2003; 278: 284-288
        • 头J.A.
        • 江泽民
        • 李米
        • Zorn L.J.
        • Schaefer e.m.
        • 帕森斯J.T.
        • 杂草s.a.
        皮质蛋白酪氨酸磷酸化需要Rac1活性和与皮质肌动蛋白细胞骨架的关联。
        摩尔。 BIOL。细胞。 2003; 14: 3216-3229
        • Petit m.m.
        • Meulemans S.M.
        • van dev.j.
        含铅脂肪瘤优选合作伙伴(LPP)蛋白的焦粘附和核靶向能力。
        J. Biol。化学。 2003; 278: 2157-2168
        • Choi J.H.
        • 金H.S.
        • 金S.H.
        • 杨y.r.
        • BAE Y.S.
        • 常J.s.
        • 夸甘
        • ryu s.h.
        • Suh P.G.
        磷脂酶Cγ1通过与JAK2和蛋白酪氨酸磷酸酶-1b形成三元复合物来负调节生长激素信号传导。
        NAT。细胞生物。 2006; 8: 1389-1397
        • Iwabu A.
        • 史密斯K.
        • Allen F.D.
        • Lauffenburger D.A.
        • 嗯A.
        表皮生长因子通过蛋白激酶Cδ依赖性途径诱导成纤维细胞收缩性和运动性。
        J. Biol。化学。 2004; 279: 14551-14560
        • Benes C.
        • SOLTOFF S.P.
        通过SRC激酶调制PKCδ酪氨酸磷酸化和唾液酸和PC-12细胞活性的调节。
        是。 J. physiol。 2001; 280: C1498-C1510.
        • Prasad N.
        • 打开r.s.
        • Decker S.J.
        SRC系列酪氨酸激酶调节粘附依赖性酪氨酸磷酸化5'-肌醇磷酸酶Ship2期间的细胞附着和胶原I.
        J.Cell。 SCI。 2002; 115: 3807-3815
        • Cozzolino M.
        • Giovannone B.
        • Serafino A.
        • Knudsen K.
        • Levi A.
        • Alema S.
        • Salvatore A.
        胚胎癌细胞中TrkA酪氨酸激酶的激活促进细胞压实,独立于酪氨酸酪氨酸磷酸化。
        J. Cell SCI。 2000; 113: 1601-1610
        • Alema S.
        • Salvatore上午
        P120 Catenin和磷酸化:未解决问题的机制和特征。
        Biochim。 Biophys。 acta。 2007; 1773: 47-58
        • ITOH M.
        • Nagafuchi A.
        • Yonemura S.
        • kitani-yasuda t.
        • Tsukita S.
        在非上皮细胞中与钙丝蛋白共致纳米甲蛋白质的220kd蛋白质与ZO-1,上皮细胞中的紧密结相关蛋白质相同:cDNA克隆和免疫电解显微镜。
        J.细胞Biol。 1993; 121: 491-502
        • 达克斯。
        • Chernoff J.
        蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶1b介导胰岛素对长化成纤维细胞中肌动蛋白细胞骨架的影响。
        J. Biol。化学。 2003; 278: 40607-40611
        • Kabuyama Y.
        • Langer S.J.
        • Polvinen K.
        • Homma Y.
        • resing K.A.
        • ahn n.g.
        功能性蛋白质组学将蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶1B鉴定为RHOA信号传导的靶标。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2006; 5: 1359-1367
        • 刘F.
        • 山D.E.
        • Chernoff J.
        富含蛋白酪氨酸磷酸酶1B的富含脯氨酸区域的直接结合P130(CAS)的SRC同源性3结构域。
        J. Biol。化学。 1996; 271: 31290-31295
        • Mauro L.J.
        • 迪克森J.E.
        'Zip码'直接细胞内蛋白酪氨酸磷酸酶磷酸酶到正确的细胞'地址'。
        趋势生物化学。 SCI。 1994; 19: 151-155
        • Frangioni J.v.
        • Beahm p.h.
        • Shifrin V.
        • Jost C.a.
        • Neel B.G.
        非映射酪氨酸磷酸酶PTP-1B通过其35氨基酸C-末端序列定位于内质网。
        细胞。 1992; 68: 545-560
        • Boute N.
        • 布贝尔S.
        • Lacasa D.
        • issad t.
        活细胞胰岛素受体与蛋白酪氨酸 - 磷酸酶1B相互作用的动态。
        Embo Rep。 2003; 4: 313-319
        • Haj f.g.
        • verveer p.j.
        • 乡绅A.
        • Neel B.G.
        • Bastiaens P.I.
        PTP1b在内质网的表面上去磷酸化的成像位点。
        科学。 2002; 295: 1708-1711
        • 安德里I.
        • Schulz I.
        • 施密A.
        ER膜结合PTP1B与其血浆膜锚定靶之间的直接相互作用。
        细胞。信号。 2007; 19: 582-592
        • kuchay s.m.
        • 金恩。
        • Grunz E.A.
        • Fay W.P.
        • chishti a.h.
        双敲除揭示蛋白酪氨酸磷酸酶1B是血小板中Calpain-1的生理靶标。
        摩尔。细胞。 BIOL。 2007; 27: 6038-6052
        • 坎德伍德D.A.
        • Shattil S.J.
        • Ginsberg M.H.
        整联蛋白和肌动蛋白细丝:细胞粘附和信号传导的互核调节。
        J. Biol。化学。 2000; 275: 22607-22610