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精确的包涵体筛选

从无偏见发现到针对生物标志物验证的测定开发的桥梁
  • 作者脚注
    ‡这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
    雅各布D. Jaffe
    脚注
    ‡这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
    隶属关系
    Massachusetts Technitute of Massachusetts Technitute of Massachusetts,Massachusetts 02142
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  • 作者脚注
    ‡这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
    Hasmik Keshishian.
    脚注
    ‡这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
    隶属关系
    Massachusetts Technitute of Massachusetts Technitute of Massachusetts,Massachusetts 02142
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  • 贝蒂张
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  • Theresa A. Addona.
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  • 迈克尔A. Gillette.
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    Massachusetts Technitute of Massachusetts Technitute of Massachusetts,Massachusetts 02142
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  • 史蒂文A. Carr.
    一致
    应解决对应的通信:广泛的Inst。 MIT和HARVARD,剑桥市剑桥中心,MA 02142。电话号码:617-324-9762;传真:617-252-1902
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    Massachusetts Technitute of Massachusetts Technitute of Massachusetts,Massachusetts 02142
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  • 作者脚注
    ‡这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
      血液中候选候选生物标志物蛋白的验证通常使用通过在三重四极杆MS系统上使用LC-MS / MS的多重反应监测(MRM)来完成。每种蛋白质的MRM测定发育需要很大的时间和成本,如果候选生物标志物低于原始发现数据中的血液的检测限或假阳性的检测限,那么大部分的价值可能很少。在这里,我们提出了一种新的技术,准确的包含质量筛选(AIMS),旨在提供从基于MS的靶向测定发育的无偏见发现的桥梁。在每次扫描中监视软件包含列表上的肿块,并且仅当使用正确的精确质量和充电状态检测来自列表的肽时,才获取用于序列确认的MS / MS光谱。目的实验证实了等离子体中存在给定的肽(以及因此来自衍生的蛋白质)。该方法的吞吐量足以获得高达一百个蛋白质/周。 AIMS的敏感性类似于使用优化的样品制备方法(等离子体中的低数量的Ng / ml)的三重四极杆MS系统上的MRM,并且来自侧嵌上的AIMS实验的MS / MS数据可以直接用于配置MRM测定。该方法在检测比利用相同仪器的无向的LC-MS / MS实验之外,在检测利息的肽的情况下,该方法更有效,并且可以通过瞄准来获得相对定量信息相对控制实验。目的检测可确保可以为该蛋白质配置基于MRM的测定。该方法在促进建立定量测定的时间和资源密集型步骤之前,该方法具有基于血浆中的检测来限定大量生物标志物候选者。
      生物标志物的临床重要性已成熟(
      • Etzioni R.
      • 城市N.
      • Ramsey S.
      • McIntosh M.
      • Schwartz S.
      • 里德B.
      • Radich J.
      • 安德森G.
      • 哈特韦尔
      早期检测的情况。
      )。它们可用于筛选健康个体,以预测疾病的倾向或检测无症状疾病的存在( 例如 前列腺癌前列腺特异性抗原)。生物标志物还可用于监测疾病的阶段或严重程度,指导分子靶向治疗( 例如 Her2neu的乳腺癌治疗状态),并评估治疗的反应。在生物制药行业中,生物标志物用于分析患者进行初步评估新药物治疗,并作为早期药物试验中的替代终点。但是,尽管行业和学术界都加剧了兴趣和投资,但疾病新蛋白质生物标志物的引入率已急剧下降到自1998年以来的少于一个/年(
      • 安德森N.L.
      • 安德森N.G.
      人血浆蛋白质组:历史,性格和诊断前景。
      )。最近的几项研究中探讨了这种严重差异的原因(
      • 安德森N.L.
      多个蛋白质组学平台在新诊断管道中的角色。
      ,
      • 古曼S.
      • Kessler L.G.
      美国食品和药物管理局癌症生物标志物发育的透视。
      )反映了生物标志物必须从初始候选人“发现”中临床使用的漫长而困难的道路(
      • rifai n。
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      蛋白质生物标志物发现和验证:临床效用的长而不确定的途径。
      )。
      为了提高MS-Sapded BioMarker候选人将进入临床验证的可能性,我们向生物标志物发现提出了一个名义管道,这强调需要“验证”来自发现努力的候选标记(
      • rifai n。
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      蛋白质生物标志物发现和验证:临床效用的长而不确定的途径。
      )。验证阶段对于许多原因至关重要,所有原因都与检测到的候选性差异是真实的和疾病特异性的不确定性,以及蛋白质是否可以在血液中鲁棒地定量。丰富的蛋白质耗尽结合在肽水平的肽水平上,在分析组织,近端流体或其他生物流体样品的情况下,LC-MS / MS现在经常常规提供成千上万的蛋白质,其中数百种似乎在案例之间显着变化对照样品。然而,由于这些LC-MS / MS实验几乎总是对相对于数据分析的样本数量的数据不足,所以许多发现可能是误报。此外,许多这些研究是在组织或近端流体中进行的( 例如 卵巢囊肿液或乳头吸气液)。因此,因此不保证每种候选生物标志物蛋白在血液中可检测水平(或其他易于接近的生物流体)的蛋白质是不保证的,并且必须通过实验确定。最后,蛋白质组学数据不是潜在候选生物标志物的唯一来源。公开文学和公开可用的基因组学数据集是其他可行的候选人来源,值得审议额外审查(
      • Gortzak-uzan L.
      • Ignatchenko A.
      • Evangelou A.I.
      • 代译中
      • 棕色K.A.
      • ST Onge P.
      • Kireeva I.
      • Schmitt-Ulms G.
      • 布朗T.J.
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      • jurisica I.
      • kislinger t.
      卵巢癌腹水的蛋白质组织资源:综合蛋白质组学和生物信息分析,以确定推定的生物标志物。
      ,
      • Paulovich A.G.
      • Whiteaker J.R.
      • Hoofnagle A.N.
      • 王P.
      生物标志物发现与临床验证的界面:蛋白质生物标志物管道的焦油坑。
      )。显然,在投资定量测定发育所需的重要资源之前,必须有一种强大的方法来帮助优先考虑这些冗长的候选列表。
      验证的目标是在足够数量的样品中量化蛋白质生物标志物候选,以确定哪个能够单独或小组合,以区分疾病的存在或不存在。测量必须具有足够的测定灵敏度,特异性和精度来实现这项任务。这些测量的核心方法是稳定的同位素稀释 - 多反应监测(MRM)
      使用的缩写是:MRM,多次反应监测;目的,准确的包涵体筛选; BHMT,甜菜碱 - 同型半胱氨酸甲基转移酶; PP1G,蛋白质磷酸酶1G; AKR1C1,Aldo-Keto还原酶系列1,成员C1; Calr,Caltretitetulin; SCX,强阳离子交换; XIC,提取离子色谱图; SPI,得分峰值强度。
      1使用的缩写是:MRM,多次反应监测;目的,准确的包涵体筛选; BHMT,甜菜碱 - 同型半胱氨酸甲基转移酶; PP1G,蛋白质磷酸酶1G; AKR1C1,Aldo-Keto还原酶系列1,成员C1; Calr,Caltretitetulin; SCX,强阳离子交换; XIC,提取离子色谱图; SPI,得分峰值强度。
      -质谱 (
      • Keshishian H.
      • addona t.
      • Burgess M.
      • Kuhn E.
      • carr s.a.
      靶标质谱法对等离子体低丰度蛋白的定量,多重测定和稳定同位素稀释。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 张H.
      • 赵L.
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      • Kelly-Spratt K.S.
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      • Piening B.D.
      • 冯L.C.
      • Kasarda E.
      • Gurley K.E.
      • ENG J.K.
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      • Kemp C.J.
      • McIntosh M.W.
      • Paulovich A.G.
      乳腺癌小鼠模型中显示了基于质谱的发现和生物标志物的确认的集成管道。
      )。稳定的同位素稀释-MRM-MS是对“签名肽”的测量来唯一代表蛋白质候选者的测量。通常,基于MRM的测定开发以每种蛋白质的三到五个合成肽开始,并以任何给定的蛋白质为一个到两个配置的测定。为蛋白质配置这种基于MRM的测定的成本是关于试剂,仪器和人员成本的几千美元的阶数。我们估计,这些分析可以开发的速度约为专家实验室的100 /年。因此,使用MRM方法作为筛选的成本和容量是缺点,以确定候选蛋白质在较大数量的患者样品中的优异研究。可以使用主要抗体的测量。然而,仅存在足够的敏感性和特异性的所需的ELISA级抗体,仅存在少量潜在的候选生物标志物蛋白质,并且对于较差的资本候选者开发这种测定的成本是令人满意的。显然需要发现和验证之间的中间步骤。
      在这里,我们提出了一种方法,该方法使用靶向高质量精度MS以检测来自候选蛋白生物标志物的序列已验证的肽,并将其转化为MRM测定以进行候选生物标志物的定量验证。我们称之为准确的包含大规模筛查或目标的技术来自我们的实验室在使用目标MS方法中的早期研究,以搜索细胞裂解物中的计算预测的蛋白质(
      • 卡尔沃S.
      • jain m.
      • 谢X.
      • sheth s.a.
      • 昌B.
      • Goldberger O.A.
      • Spinazzola A.
      • Zeviani M.
      • carr s.a.
      • Mootha V.K.
      通过整合基因组学系统鉴定人体线粒体疾病基因。
      )并鉴定观察到水平的蛋白质使用基于模式的发现方法来改变的蛋白质(
      • Jaffe J.D.
      • MANI D.R.
      • Leptos K.C.
      • 教堂。
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      Pepper,实验蛋白质组学模式识别的平台。
      )。我们描述了AIMS技术,并评估其针对血液中蛋白质检测的适用性。目的可以迅速进行候选生物标志物蛋白的冗长列表,聚焦在低Ng / ml范围或更高的血液中可检测到的血液中可检测到的副本。随后使用该技术产生的肽前体和片段离子,以促进低分辨率三重四极杆MS系统的敏感和定量MRM测定的发育。旨在作为无偏见的发现和定量测定开发进行验证研究之间的旨在作为桥梁的潜力。

      实验步骤

       统一 15n标记的蛋白质 -

      统一 15N标记的蛋白质是Argonne National实验室的Lee Makowski博士的善意。根据要求提供有关其克隆,表达和净化的详细信息。在本研究中使用了41个蛋白质(补充1包括身份,摘录和序列)。通过质谱分析这些蛋白质的表明>99.5原子%的氮 15 N。

       测试混合的构建 -

      根据制造商的指示,人类血浆使用IGY-12高容量LC10柱(12.7×79mm; Genway Biotech,Inc.,San Diego,CA)耗尽了丰富的蛋白质。通过添加构建两组混合物 15将N-标记的蛋白质进入耗尽的血浆。
      第一组混合物用于小规模的试验研究(“小混合物”)。这些混合物的组合物显示在 表I. 在“结果”下。使用的四种蛋白质是甜菜碱 - 同型半胱氨酸甲基转移酶(BHMBI; NCBI登录号GI | 4502407),蛋白质磷酸酶1G(PP1G; NCBI登录号GI | 4505999),Aldo-keto还原酶家庭1,成员C1(AKR1C1; NCBI登录号GI | 5453543)和CalreteteLIN(CALR; NCBI登录号GI | 4757900)。
      表I. 目的是检测目标 15n标记的蛋白质
      蛋白质 小混合1浓度肽被发现混合1小混合2浓度肽被发现混合2发现总特殊肽
      NG. / ml. NG. / ml.
      Bhmt. 10110066
      PP1G3316666
      AKR1C16623313
      卡尔 10031003
      在补充1(蛋白磷酸酶1g中所示的41个蛋白中使用的40个混合物(“大混合物”)的第二组混合物(省略了蛋白质磷酸酶1g)。构建了四种大混合物,各自具有以下水平的所有40个蛋白质:10,30,60和100ng / ml。这些是使用Vivaspin 15R集中器(5000-Dalton分子大规模截止; vivascience,德国汉诺威)浓缩的最终浓度的最终浓度。耗尽和浓度后的总蛋白质浓度为3.3mg / ml。
      将100μl每种混合物用6变质 m 尿素,减少20米m 在37℃下DTT 30分钟,然后用50米烷基化m 在室温下在黑暗中碘乙酰胺30分钟。在通过胰蛋白酶(测序级改性的蛋白质,麦迪逊,WI)在37℃下过夜,用胰蛋白酶(测序等级改性的蛋白质,麦迪逊,Wi)在37℃下用温和的蛋白质 - 胰蛋白酶比为50:1(w / w)。使用Oasis HLB 1-CC(30mg)反相盒(水,Milford,MA)和真空浓缩至干,消化饮料。

       混合物的SCX分级 -

      将每种冻干的消化物重悬于25%乙腈,0.05%甲酸(pH3.0)中。在下列条件下,整个消化在强阳离子交换色谱下进行:Thermofisher Biobasic SCX 1×250mm柱;缓冲液A,25%乙腈,0.05%甲酸(pH3.0);缓冲b,25%乙腈,250米m 甲酸铵,4%甲酸(pH3.0);流速,50μl/ min;梯度计划,保持0%B 0-15分钟,0-20%B从15至35分钟,20-40%B从35〜45分钟,40-100%B,45至55分钟,占100%B 55至65分钟,100-0%B从65〜67分钟,并保持0%B从67〜85分钟。收集级分5分钟。将级分真空浓缩至干。进一步分析在15-65分钟内收集的10分级分。混合物依次从最低峰值水平开始处理并进行最高。

       目标蛋白和肽 -

      定向LC-MS AIMS实验进行了检测衍生自衍生的肽 15n标记的蛋白质掺入血浆中。通过质谱仪方法中的“包含列表”完成这些实验。 orbitrap上的包含列表(软件释放LTQ orbitrap 2.4,2007年7月19日)可以至少有2000个条目。包含清单包括 m/z, z,从靶蛋白预测的胰蛋白酶肽的保留时间值(保留时间是可选的,并且在我们的实验中未使用)。列表上的值由一些简单的规则管理。 1)肽是完全胰蛋白酶,不含未遗产的裂解。 2)肽可以承担指控 z = 2到 z = 4给出足够的基本残留物以适应这种充电。 3) m/z 给定电荷的肽在300和1500之间。4)不需要修改全面保存 15N代谢标记和半胱氨酸氨基甲酰化,这是我们实验室中进行的有意改性。 5)没有保留时间预测与给定的肽相关;在LC-MS实验期间,可以在任何点观察。当在仪器期间通过仪器期间检测质谱峰值,以满足包含列表的任何条目的标准,为相关的前体离子自动获得MS / MS光谱。我们包含列表的目标和值在补充3中给出(所有值源自光谱蛋白质组学工作台(Agilent)的MSDIGEST功能)。
      这些实验是在耦合到安装有13.5cm×75μm柱的Agilent 1100纳米LC泵的热炉Scientific轨道质谱仪上进行,其中包含13.5cm×75μm柱,并用Reprosil C中填写在房屋内18-AQ 3-μm包装材料。以下条件用于色谱法:缓冲液A,0.1%甲酸;缓冲剂B,0.1%甲酸在90%乙腈中;梯度和流程,从0至20分钟的梯度和流程,3%B在0.8μl/ min,3-7.5%B,在0.2μl/ min的0.2μl/ min,7.5-50%B,0.2μl/ min的22至60分钟,50-90%B在0.2μL/ min的0.2μl/ min的60至65分钟,从65至75分钟,0.8μl/ min,3%B,75至90分钟,0.8μl/ min。相当于的金额 1/51/50 将SCX级分注入柱上,体积为2μL。
      以下参数用于玻璃岩质谱仪上包含依赖于依赖的采集。单个orbitrap MS扫描来自 m/z 在分辨率60,000时,300至1500之后是最多三个离子捕集MS / MS扫描以正常扫描速率。来自包含列表(如果存在)的前三个最丰富的前体是针对90分钟的实验过程中的MS / MS谱采集。启用预览模式和充电状态筛选,以便选择前体。这 m/z 靶向前体的耐受性为±7.5ppm。通过重复计数2的动态排除还具有10秒的重复计数,排除持续时间为20秒。再次 m/z 动态排除的公差为±7.5 ppm。对检测到的峰值触发的强度阈值设置为100,并且所有列表成员的碰撞能量为28%。
      使用光谱蛋白质组学工作台(安捷伦和内部)分析所有原始数据。使用默认的orbitrap参数和45-s扫描合并公差从原始数据文件中提取MS / MS峰值列表。针对人的Refseq数据库(下载2007年6月)搜索提取的光谱,验证含有41个可能靶向蛋白中的每一个。搜索参数如下:所有群众被认为单向异位缺乏;父质量耐受,±0.035 da;片段质量耐受,±0.7 da;没有错过的乳沟;和固定修饰:氨基甲酰甲基化, 15 不/ 14n混合物。如下进行自氧化,如下所示:蛋白质分组模式,总分为7.8,所有文件组合在一起;肽规则: z = 2 score >5, SPI >50%,C:\工作\ Bhatia \ 2020 \ 08-Aug \ Asmb \ Upload \ J-ELBM0001-0142RAKNG1-2> 2; z = 3 score >6, SPI >50%,C:\工作\ Bhatia \ 2020 \ 08-Aug \ Asmb \ Upload \ J-ELBM0001-0142RAKNG1-2> 2; and z = 4 score >7, SPI >55%,C:\工作\ Bhatia \ 2020 \ 08-Aug \ Asmb \ Upload \ J-ELBM0001-0142RAKN1-2> 2.

       基于MRM的AIMS实验的后续行动 -

      MRM测定被配置为由AIMS实验检测的所有肽。在使用绕道的线性离子阱前端的目的期间获得每种肽的MS / MS光谱。在陷阱中观察到的片段用于定义在三重四极仪器上监测的过渡。对于在较低的电荷状态(通常为2或3)上检测的肽,但含有额外的碱性氨基酸,MRM测定被配置用于电荷态(3或4)。如果没有针对特定电荷状态观察到orbitrapsms / ms光谱,则考虑到另一种充电状态的现有MS / MS以及应用肽片段的常用规则来选择转变。为了最大化特异性,为每种肽选择并监测五到七种过渡。基于斜拉瓣结果构建每个SCX分数的MRM转换列表。
      MRM实验是在4000 Q陷阱混合三重四极杆/线性离子阱质谱仪上进行,耦合到Tempo LC系统(应用生物系统,Framingham,MA)。 SCX级分在MRM分析之前稀释1:3和1:10,并在Picofrit柱上进行全环注射每种稀释液(75μm内径,10μm尖端开口;新目标,Woburn,MA )在房屋内包装在房子里,12-13厘米的Reprosil-pur c18-AQ 3-μm反相树脂(Maisch,GmbH博士)。将样品在300nl / min下洗脱,梯度为3-20%溶剂B,3分钟,20-55%溶剂B,35分钟,55-80%溶剂B 3分钟。通过2200V,20pm的离子喷射电压进行数据采集,为20 p.i.i,雾化器气体为3 p.i.i,以及150℃的界面加热温度。 MRM参数定义如下。 1)前体的降解潜力为50次< m/z = 400, 70 for 400 < m/z < 800, and 100 for m/z >800.2)使用分析师软件MRM Builder中的方程计算每个前体的碰撞能量。 3)碰撞电池出口电位设置为10个过渡。 4)使用10-12 ms的停留时间来最大化每个MRM方法的过渡次数。为了避免超过1 s的循环时间,使用两个或更多MRM方法分析大多数SCX级分。
      数据分析是手动完成的。绘制给定肽的所有转变的所提取的离子色谱图(XIC)用于100ng / ml尖刺样品。确认存在肽的存在基于所有转变的共洗脱,并通过在绕组上获得的MS / MS光谱的那些肽的转变的相对比。在混合物中比较所有转变的XIC,以确认在较低浓度的尖刺蛋白浓度下存在肽的存在。来自AIMS实验的相对保留时间信息与多种混合物中XIC的强度水平的差异相结合,这有助于鉴定肽,尽管甚至被监测的五到七个过渡的转变所观察到的基质干扰。

      结果

      在生物标志物发现和验证的背景下,目标实验的实际目标是1)从蛋白质组学发现实验中获得的生物标志物候选的分类,或者综合基因组学涉及那些在临床相关样本和2中易于检测的那些。提供信息使用MRM在三重四极杆仪器上对检测到的候选生物标志物蛋白的定量测定产生的值。为了实现这些目标,含有含有含有高优先级候选蛋白的签名肽的含量列表(Fig. 1)。包含列表上的肿块在每次扫描上监视orbitrap MS系统上的每个扫描,并且仅在用正确的精确质量和充电状态检测来自列表的肽时获得MS / MS光谱。肽MS / MS数据使用标准软件自动解释。观察到用于签名肽的MS / MS碎片随后用于填充用于配置基于敏感的MRM的量化测定的父片转换列表。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1AIMS-TO-MRM实验的示意图。 在这种方法中,血清或血浆耗尽丰富的蛋白质,并用任选的标准加入标记的蛋白质微量加工。并行地,分析用于筛选的候选蛋白面板以产生目标列表(m/z, z关于AIMS的对。注意,如果预期多次充电状态,则在列表中可以在列表上由多个目标表示一些肽。这 盒装部分 该示意图说明了精确质量筛选的选择性功率以及MS / MS光谱如何集成到MRM测定发育中。这 阴影粉红色区域 指示研究中使用的±7.5-ppm窗口。

       小规模试点研究 -

      为了初步测试我们的方法的效用,我们构建了四种蛋白质的简单混合物,并将它们掺入人雌性血浆中,该血浆被浓度为通常与候选生物标志物相关的浓度(见 表I. 对于浓度)。为了帮助我们的评估,避免可能与这些蛋白质的内源性水平混淆,我们使用均匀的重组蛋白质 15n标记(见“实验程序”)。通过强阳离子交换消化,粗加工混合物,然后使用目标进行LC-MS / MS分析(Fig. 1 )。
      我们能够检测来自所有四种靶向蛋白的多种肽( 表I. )通过AIMS在壁图上。这些蛋白质的所有验证的肽光谱被解释为完全 15n标记,没有肽从这些蛋白质中检测到没有 15n标签。标签为解释这些原则证明实验的解释提供了额外的信心,但不需要常规应用目标。有155个独特(m/z, z)对本研究的成对(代表102个独特的肽序列)(注意 z = 4个肽在初始研究中未靶向。每一个 (m/z, z在分析级分期间至少一次触发一次对。鉴于样品中存在的其他人类蛋白质的背景,这不会出现意外,这可能导致满足在规定的公差内触发的触发要求的肽(有关此内容的更多细节)。事实上,还检测来自除靶向的蛋白质以外的蛋白质的肽(包括来自其他常见的血清蛋白质的肽,如互补,转移素和载脂蛋白)。然而,四个靶向蛋白质在我们通过光谱分析中具有前四种聚集蛋白质评分(所有肽分数的总和),并且没有将其他验证的肽解释为轴承 15n标签。
      还可以注意到,每种蛋白质检测到的肽数似乎与蛋白质丰富量规模。这长期以来在蛋白质组学实验中得到了认可,并且可以用作粗型相对量化的基础。一种更好的方法是利用在壁图上获得的高分辨率MS光谱来产生检测到的每种肽的XIC。这些色谱图用作肽丰度的更真实的定量测量,并且可用于在验证实验中近似壳体和对照样品之间的候选生物标志物水平的差异。例如,在我们的小规模研究中,有两种肽在多个尖峰水平上鉴定。在这两种情况下,基于XIC的量化产生了在实际差异2倍内的两个级别之间的相对差异(数据未示出)。

       生物标志物验证的蛋白质目标的大规模靶向 -

      我们试图将这种方法扩展到分类中,预计将作为候选生物标志物从发现研究中提交的更多蛋白质。要测试这一点,我们制作了40的混合物 15N标记的蛋白质并使用上述完全相同的方法。给出了小型和大规​​模实验的摘要 表二Fig. 2。我们能够通过AIMS检测40个蛋白质中35个蛋白的肽。由于纳入了我们的标识,我们再次非常有信心 15n标签和随后的肽光谱解释为轴承该标签。鉴于扩展的目标列表,我们预期(并发现)除了目标之外的许多额外蛋白质。事实上,我们靶向的645个肽中的551种具有可能相同的肽(m/z, z)考虑到我们选择的公差(超过13,500 在Silico. 匹配的人refseq数据库中的消化肽与一个或多个(m/z, z)对)。然而,当聚集蛋白质评分的级别排序时,我们针对所有蛋白质清单顶部的蛋白质(Fig. 3)在排名列表的上半部分中检测到35个蛋白中的32个。
      表二小型和大规​​模的实验结果摘要旨在侦察实验
      小的
      实验装置
      靶向的蛋白质数量440
      数量(m/z, z在列表上的成对1551,161
      独特肽的数量102645
      具有潜在干扰的肽 N / C. 551
      触发数据
      触发次数 ~19,000 ~86,000
      触发目标1551,047
      肽触发102636
      未触发的目标0114
      肽未被触发09
      成功率
      检测到/企图的总靶蛋白(累积)4/435/40
      在10 ng / ml N / C. 3
      30 ng / ml N / C. 18
      在60 ng / ml N / C. 25
      在100 ng / ml N / C. 35
      检测到的其他蛋白质20340
      图缩略图GR2.
      Fig. 2触发和未触发的目标和肽的含义的插图 . 盒装 触发条目。 xed盒子 are untriggered.
      图缩略图GR3.
      Fig. 3靶蛋白在所有鉴定的蛋白质的顶部附近等级。刻度线 显示目标蛋白质的等级列表位置。
      鉴于所提供的特殊性 15n标签,我们可以探索产生有效蛋白质鉴定的光谱中的肽和蛋白质解释得分的空间。我们惊讶的是,比在常规实践中接受的分数低得分可能会产生完全合理的肽和蛋白质解释。当然,降低得分阈值也介绍了误报率的增加数量。这是通过观察结果证明,所述肽属于实验中靶向的蛋白质以外的蛋白质被解释为轴承 15n标签。总共,306个光谱被解释为145个独特 15N标记的肽在我们选择的得分阈值下。 306的306 Spectra(64%)代表了87个独特的肽,并且是我们在实验中靶向的蛋白质是独一无二的。对于这些光谱,平均光谱解释得分为11.8,其中最大可获得的得分为25,并且得分为13分别被认为是单一肽鉴定的不含糊。肽的均方根(RMS)质量误差为5.2ppm。其余110个光谱表示58个独特的肽,但具有仅为7.4的平均光谱解释得分,并且具有16.5ppm的根均态质量误差。显然,我们可以在采集和解释过程中利用更严重的质量公差,以减少误报的数量(参见“讨论”)。然而,中央信息是,即使在目标实验中靶向的肽的甚至低解释评分可能是正确的。任何数量的因素也可能有助于解释虚假 15n标记的解释,例如纯蛋白尖刺到携带其他一些的实验中 15来自表达系统的N标记的蛋白质。实际上,当在含有细菌蛋白的数据库中重新搜索含有细菌蛋白的数据库时,这些光谱很多,这些光谱比可能存在于细菌表达系统中的蛋白质的肽较高。即使在保持细菌蛋白的情况下 15n标签在他们的解释中。这些“虚假”的另一个重要组成部分 15N标记的光谱对不承受的其他肽序列得分更高 15n标签在某些公差(例如允许的错过剪发数量和数据库大小)时。
      与无向数据相关的采样相比,我们还评估了该方法的有用性。我们选择用100 ng / ml尖峰重新采样一组分数(在 1/50 注射量;请参阅“实验程序”)使用等效的前3个方法,但不使用包含列表。这种情况可能是常规数据依赖的抽样最有利的是,尖峰处于最高水平,但柱子不会过载有肽,因为它是 1/5 注入量的水平(数据未显示)。在包含列表实验中,检测到对应于28个靶向蛋白的67个光谱,而在无向数据依赖性实验中发现了对应于11个靶肽11的15个光谱。这>考虑到下游MRM测定配置的目标,检测到的光谱数量增加400%尤为重要。获得相关肽的更多光谱提供了有关碎片可以期望用于过渡的碎片的更多实证信息。如下所述,在下面的情况下,在筛选实验中观察到的片段与MRM实验中可观察到的那些术语非常合作。

       MRM测定的快速配置和评估 -

      成功的MRM测定构型高度依赖于通过酶消化衍生自目标蛋白的签名肽。签名肽的选择考虑了他们所观察到的和/或预测的LC保留,序列同源性( IE。 唯一性),分子量和预测或观察到的充电状态,偏好用于中等疏水性肽,其可能在质谱仪的可检测质量范围内产生双层或三透射的离子。虽然通常给予在无偏见的发现实验中检测到的肽的优先级,但也可以选择肽 在Silico. 蛋白质序列的分析,如果候选蛋白质从蛋白质组学实验以外的来源获得候选蛋白,则需要进行步骤。我们的肽选择的常用目标是每次靶蛋白合成三到五种肽,因为来自相同蛋白质的不同肽可以在其MS响应中广泛变化并从样品处理中恢复,并且由于等离子体的干扰的可能性很高。每目标蛋白质多种签名肽的必要性增加(但不保证)将开发特定和敏感的MRM测定的可能性。然而,尽管进行了仔细和周到的选择过程,但在构建最终MRM测定之前,每种签名肽需要大量优化MRM参数和LC保持,色谱峰形状和来自血浆基质的干扰。根据为给定验证研究配置的MRM测定数,该过程可以从天到几周的时间范围内。
      对于MRM测定配置在此,我们专门依赖于目的实验中收集的实验数据。从我们的小规模试验研究中,我们能够立即在应用的生物系统4000 Q捕集器三重四极杆菌质谱仪上配置MRM测定,以便在壁球上观察到的18个肽( 表I. )。这是MRM测定制剂的复杂性(102→18个靶标)的显着降低。我们从离子阱MS / MS光谱中选择了最强烈的片段离子作为4000 Q陷阱的过渡的基础,在可能的情况下选择高达七种/肽(表III 和补充数据)。在4000Q疏水膜上注射用于筛选的相同样品级分的等分试样在没有进一步的样品制备(尽管在某些情况下制备浓缩级分的稀释级分))。我们只需要分析肽已经在壁图上检测到肽的分数,从而减少了总仪器时间。我们还定制了每个级分的MRM方法,允许较少过渡的少数肽,该肽在馏分中仅基于侧面的数据。应该注意的是,观察到的几种肽可能不被认为是“规范”MRM测定肽(例如含有半胱氨酸或甲硫氨酸的那些或非常长的肽),但我们认为这是一个优点,使实验数据指导实验过程。
      表III通过基于MRM的方法检测到通过AIMS检测到的肽的肽,观察到的过渡和检测的平均限值
      小规模实验
      蛋白质名称检测到的肽数观察到的总转换 vs. attempted at 100a or 66b ng/ml观察到的总转换 vs. attempted at 10a or 33b ng/mlAVG肽LOD.
      NG. / 毫克
      AKRF1C1 a28/118/1133
      Bhmt. b524/2924/2910
      CalreteteLIN前体a210/1310/1310
      PP1Gb629/3625/3633
      大规模实验
      蛋白质名称检测到的肽数观察到的总转换 vs. 尝试在100 ng / ml观察到的总转换 vs. 尝试在10 ng / mlAVG肽LOD.
      NG. / 毫克
      ADP-核糖基化因子616/66/610
      AKRF1C1 419/2411/2432.5
      akrf1c2. 28/122/1255
      PDZ和LIM结构域1(ELFIN)311/154/1540
      S100钙结合蛋白A129/116/1110
      S100钙结合蛋白,β315/1514/1510
      annexin i.525/3014/3046
      annexin四29/129/1210
      脑肌酸激酶312/158/1540
      CalreteteLIN前体313/202/2040
      Chromogranin a precorsor523/3016/3028
      胱抑素B.16/65/610
      enolase 2.310/172/1770
      成纤维细胞生长因子1(酸性)同种型1前体 15/53/510
      果糖 - 双磷酸醛磷酸酶C.29/121/1255
      葡萄糖 - 磷酸异构酶628/3627/3610
      谷胱甘肽 S-Transferase M1同种型115/51/510
      谷胱甘肽 S-Transferase M215/65/610
      谷胱甘肽 S-Transferase M3313/1610/1640
      生长停滞和DNA损伤诱导,γ211/1111/1110
      热休克27-KDA蛋白1419/238/2355
      DNA结合的抑制剂215/54/510
      白细胞介素18 Proprotein.14/54/510
      非转移细胞1,蛋白质(NM23A)异构型B.312/1612/1610
      过氧化毒素2同种型A210/117/1110
      磷素氨基转移酶同种型1315/1613/1610
      Ser(或Cys)蛋白酶抑制剂,CLADE B,成员314/50/5100
      Femermine / Femermine. N1 - 乙酰转移酶28/115/1155
      超氧化物歧化酶1,可溶210/106/1010
      Transgelin.13/52/510
      TYR 3- / TRP 5-单氧基酶活化蛋白,ɛ421/2116/2110
      泛素缀合酶E2C同种型2210/1010/1010
      泛素缀合酶E2I423/2420/2410
      泛素缀合酶E2N628/3127/3110
      在小型飞行员试验中检测到的18个肽中,在orbitrap上产生了适用于4000 q陷阱的合适MRM测定性能。 “合适的测定性能”由观察来自肽的多重转变的能力来定义,该肽具有3或更多的信噪比毫不含糊地识别目标。在没有每个肽的稳定同位素标记的类似物的不存在的情况下,无法配置真正的定量测定。通过将测定移植到MRM平台,我们能够在许多情况下实现敏感性的增加,如图所示 表III (和补充数据)。在壁图的线性离子阱中获得的MS / MS碎片光谱与我们能够在4000 Q陷阱中观察的过渡时,令人尖锐的一致性。对于我们能够在4000 Q陷阱观察到的15个肽,也观察到作为眶上片段观察到的大部分产物离子作为4000 Q陷阱的过渡(平均为80%/蛋白;中位数为100% /蛋白质)。仅来自三重四极MS系统的一种肽的CID光谱表现出在离子阱数据中观察到的七种产物离子中的少于三个。
      随后我们将这种方法应用于更大的规模目标。使用在侧面质谱仪上获取的MS / MS光谱,我们选择了由AIM观察到的87个肽中的86个七个过渡(一个被错误省略; 645肽最初靶向; 表二Fig. 2)。这些肽代表40个蛋白质中的34个掺入血浆中。收集的16个SCX级分通过MRM分析了八个级分,所述MRM表示通过AIMS方法在嵌合质谱仪上检测到这些肽的分数。我们能够通过MRM测定将来自34个蛋白质中的34个蛋白质中的所有86个蛋白质从100ng / ml和70个肽的蛋白质中捕获到血浆。在30ng / ml下检测未在10ng / ml下未检测到的16个肽中的12。结果再次显示两种不同的仪器平台之间的高度相关性,表明我们可以通过对壁图质谱仪进行目的来加速MRM测定设计,并利用观察到的肽及其碎片行为来配置三重四极杆MS系统上的MRM测定。
      虽然成功使用目标技术并不重要,但使用均匀的使用 15N标记的蛋白质使我们能够确定血浆中CaltreteLin的天然浓度为〜100ng / ml。我们为自然假定创建了XIC 14N标记版本的肽Fyalsasfepfsnk,Gtwihpeidnpeyspdpsiyaydnfgvlgldlwqvk,以及iddptdskpedwdkpehepdpdak。基于对比较估计浓度 14n xic峰面积 15来自衍生自蛋白质的肽的N XIC峰面积以100ng / ml掺入。我们最初制作了 15 n和 14N XIC在小规模研究中靶向的所有肽,看看是否存在蛋白质的任何可检测的内源水平。 CalleteteLin结果也由MRM测定为与这些肽的“轻”版本(与所述肽)平行构建的MRM测定 15n标记的版本。

      讨论

      蛋白质组学生物标志物发现研究和技术的爆炸在各种疾病中产生了较长的候选标志物。然而,许多如果不是所有这些候选人都仍然只是那样,候选人,因为跟进后续的艰巨的任务以系统和有效的方式。候选生物标志物发现和验证的无偏见发现方法之间的显着差距,最近被称为“焦油”(
      • Paulovich A.G.
      • Whiteaker J.R.
      • Hoofnagle A.N.
      • 王P.
      生物标志物发现与临床验证的界面:蛋白质生物标志物管道的焦油坑。
      ),被描述为有效蛋白质组学生物标志物发育的主要障碍(
      • rifai n。
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      蛋白质生物标志物发现和验证:临床效用的长而不确定的途径。
      )。原则上,抗体试剂,尤其是ELISA级抗体,可用于弥合这种间隙,但尚未为绝大多数蛋白质产生高度特异的敏感抗体及其对感兴趣的修改。清楚地,需要更快的测定开发时间,较高容量和更低成本的免疫检测的替代方案。
      我们开发的AIMS技术专门设计用于帮助弥合无偏见的发现实验或综合基因组学之间的差距来候选生物标志物名单的开发和验证血液或其他复杂生物流体的候选者(Fig. 4)。当然,目的方法也可用于在任何示例源中确认或进行有针对性的发现( 例如 细胞,近端流体或组织)。成功地检测与候选生物标志物相关的肽(如等离子体)中的候选生物标志物相关的肽,其可能与用于发现候选者(如初级组织)是一种强大的Winnowing代理。因此,我们建议那些蛋白质 容易 在临床上可访问的样本中可观察到 应该优先考虑 作为生物标志物候选人进行进一步研究。重要的是要注意,缺乏通过AIMS对候选蛋白的观察并不意味着候选蛋白质不存在于血液中并潜在地通过其他方法可检测。这些候选人,特别是如果另外被证纳为该疾病的潜在生物标志物,先前的先例,在正交数据集中观察( 例如 将使MRM测定发育的微阵列等,但可以优先考虑直接转移到蛋白质或肽免疫亲和富集方法(
      • Paulovich A.G.
      • Whiteaker J.R.
      • Hoofnagle A.N.
      • 王P.
      生物标志物发现与临床验证的界面:蛋白质生物标志物管道的焦油坑。
      ,
      • 安德森N.L.
      • 安德森N.G.
      • 海南L.R.
      • Hardie D.B.
      • Olafson R.W.
      • Pearson T.W.
      使用稳定同位素标准品和抗肽抗体捕获(SISISCAPA)的肽和蛋白质的质谱定量。
      ,
      • 伯纳米
      • OTT L.
      • 恩格尔S.
      • 沃森D.
      • 塞尔P.
      • Ackermann B.
      使用免疫沉淀和LC / MS / MS的大鼠血清中NTPROBNP的定量:药物诱导的心脏肥厚的生物标志物。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 赵L.
      • 张H.Y.
      • 冯L.C.
      • Piening B.D.
      • 安德森L.
      • Paulovich A.G.
      抗体基于磁珠的肽富集基于血清生物标志物的质谱型量化。
      )。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4提出的生物标志物管道和目标的位置。 ID , 鉴别; TP. ,吞吐量; rel。 , 相对的。
      我们开始在持续的癌症和心血管疾病的持续生物标志物研究中使用目的方法进行分类大量生物标志物候选者。我们预计优化的目标方法可以评估每月数百种生物标志物候选人。该吞吐量与通常在发现实验中生成的列表的比例兼容。虽然向管道添加了旨在在时间和资源的时间内引发成本,但通过对可检测的候选生物标志物的努力来获得的整体效率可能很大。目的方法也可用于确认原始发现样本中的检测( 例如 近端流体或组织)。
      目的方法也适用于需要覆盖特定蛋白质或肽靶标的任何应用。人们可以想象使用Cell培养(Silac) - 或相对定量(ITRAQ)的细胞培养物(Silac)的氨基酸稳定同位素标记的稳定同位素标记(ITRAQ),基于定量方法,磷酸肽测绘(或其他翻译后修改映射)或交叉-Link检测。我们之前在验证预测的线粒体蛋白质(
      • 卡尔沃S.
      • jain m.
      • 谢X.
      • sheth s.a.
      • 昌B.
      • Goldberger O.A.
      • Spinazzola A.
      • Zeviani M.
      • carr s.a.
      • Mootha V.K.
      通过整合基因组学系统鉴定人体线粒体疾病基因。
      )在细胞裂解物和Picotti 等等。 (
      • Picotti P.
      • Aeberberold R.
      • Domon B.
      灭鼠蛋白质组学蛋白质水解背景的影响。
      )使用方法的变异来鉴定简单蛋白质混合物的消化中的次要蛋白水解片段。
      具有高质量准确度和高分辨率的壁图提供了一种敏感和高度特异的方法来询问针对有针对性的分析物的样本。为了试图通过高特异性量化我们的意思,在本研究中,我们编写了仪器以搜索1161 m/z 目标(具体 z 各国)在7.5 ppm的耐受性范围内。有超过216,000 7.5 ppm的“频道” m/z 范围300-1500可以由AIMS询问,这意味着我们仅询问0.5% m/z 空间。耦合与每个潜在前体的相关电荷状态信息,这表示数据采集期间的巨大选择性。尽管原则上,可以在几乎所有MS / MS的MS仪器类型上实现基于列出的基于MS的方法(已经描述了类似的方法(多重反应监测发起的检测和测序)用于三重四极杆MS系统(
      • 不胜的R.D.
      • Griffiths J.R.
      • Leverentz M.K.
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      • 哈根I.M.
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      多重反应监测,以高灵敏度鉴定蛋白质磷酸化位点。
      )),获得这种高选择性的关键是能够以准确的质量依赖性方式触发MS / MS。
      通过拧紧来进一步增加该方法的选择性 m/z 触发MS / MS频谱所需的公差。我们使用相对宽的7.5 ppm公差的一部分动机是我们通过使用orbitrap的“预览扫描”或第一个FT瞬态来操作仪器来指导仪器触发仪器。预览扫描可能不是最终扫描(平均累计瞬变)的准确性,因此我们提供了一些纬发性触发。我们可以以牺牲总占空比为代价禁用基于预览扫描的触发。作为质量选择性的力量的说明,人的Refseq数据库中有超过13,500个潜在突出的肽,其中1161套(m/z, z我们在7.5 ppm指定的对。 Fig. 5 显示这种值如何随着更严格的方式减少 m/z 宽容。仪器质量准确度和稳定性的进一步改善可能允许进一步拧紧质量公差而不会丢失信息。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5PPM耐受性人员Refseq数据库中干扰肽的数量。 该图显示了人的Refseq数据库中存在的肽数(作为PPM耐受性的函数)(m/z, z)可以基于我们的1161列表来引起触发事件的参数(m/z, z)对。这 比例在上面 每个 观点 显示可以将MS / MS扫描扫描到每个公差水平的特定目标的平均未标准肽数。
      管理该方法的效用的另一个因素是样品处理和吞吐量。在这里,我们最小地分级消化的血浆样品,用于筛选尖刺蛋白标准,模拟生物标志物发现实验并允许检测限制被明确确定。我们能够以重复的四种不同的尖峰水平筛选40种蛋白质(在 1/51/50 每馏分的量)在不到1周的情况下,使用壁图上的目的方法。由于该筛选,MRM分析可以选择性地应用于感兴趣的部分,导致MRM实验在大约一周内的设计和完成。如果需要,可以通过增加分馏和/或收紧的粒度来获得更深的覆盖 m/z基于数据依赖选择的公差。
      高性能实验中的观察以观察到的MS / MS片段的形式产生的信息,其通过MRM测定进一步随访。我们和其他人已经证明了基于MRM的临床样本环境中的MRM的量化的敏感和特异性。其在单个实验中复用对数十或数百个分析物的能力符合快速生物标志物候选验证的要求。到目前为止,在没有实验数据的情况下,通过检查原发性蛋白质序列加上教育猜测和使用计算机预测算法,常常常规做法是选择MRM测定肽靶标,前体和转变。对于定量测定发育,需要肽的重和光线版本来建立校准曲线(
      • Keshishian H.
      • addona t.
      • Burgess M.
      • Kuhn E.
      • carr s.a.
      靶标质谱法对等离子体低丰度蛋白的定量,多重测定和稳定同位素稀释。
      )。然而,在MRM主要用于询问用于存在/不存在的样品(和它们和修饰的版本)而不是导出定量信息,如果纠正有关MRM评估的碎片的校正信息,则不一定需要合成肽可用。我们已经表明,AIMS orbitrap实验可以提供该信息。目的的证据还可以避免合成多种肽以配置单个成功的MRM测定的需要。
      鉴于实验的AIM部分在高分辨率/高质量准确仪器上进行,高度特异性的丰度信息(以XIC峰面积形式)也可以从全扫描MS光谱导出。此信息可能被用作无标签相对定量的基础(
      • Jaffe J.D.
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      • Leptos K.C.
      • 教堂。
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      Pepper,实验蛋白质组学模式识别的平台。
      )通过高性能质谱仪进行了广泛的实践。除了在等离子体中仅仅是检测,可以将附加过滤器放置在生物标记仪表管线中:各个或汇集壳体和控制样品之间的差异的要求。
      总之,我们证明了旨在候选候选生物标记的途径以及涉及在复杂的生物样品中检测预定素蛋白或肽的任何其他应用。该技术提供了一种快速的方式来筛选大量候选蛋白质在复杂样品中存在,并且使用优化的样品制备方法(等离子体中的低数量的Ng / ml),具有与三重四极杆的MRM相似的敏感性。该方法的吞吐量足以获得高达一百个蛋白质/周。最重要的是,目的在于在犯下建立定量测定的时间和资源密集的步骤之前,可以基于它们在血浆中的检测来实现大量生物标志物候选的优先级。我们认为该方法具有加速和提高生物标志物发现和验证研究的整体效率的巨大潜力。我们希望这些方法将是基础科学与整体蛋白质组学领域临床实践的重要联系。

      补充材料

      参考

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