通过顶部向下电子捕获解离/电子转移解离质谱法解开磷酸化人心肌肌钙蛋白I的分子复杂性

  • vlad zabrouskov
    隶属关系
    Thermo Fisher Scientific,San Jose,加利福尼亚州95134
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  • 莹戈
    一致
    可以解决对应的通信。电话:608-263-9212;传真:608-265-5512.
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    威斯康星州威斯康星大学医学与公共卫生学院的人类蛋白质组学计划和生理学部。53706
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  • jae schwartz.
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    Thermo Fisher Scientific,San Jose,加利福尼亚州95134
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  • Jeffery W. Walker.
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    威斯康星州威斯康星大学医学与公共卫生学院的人类蛋白质组学计划和生理学部。53706
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      心肌循环期间心肌弛豫需要心肌肌钙蛋白I(CTNI),薄灯丝肌钙蛋白 - 番茄素 - roporomyosin调节综合体需要抑制亚基。仅在心肌中表达,CTNI广泛用于临床中作为心脏损伤的血清生物标志物。体内22和Ser的一个小说网站76/ thr.77,每个都有部分占用(SER22:53%;塞76/ thr.77:36%)。排名第一的女士3二磷酸化CTNI分析显示SER的占用23仅在二磷酸化物种中一致,与顺序(或有序)磷酸化/ Ser的去磷酸化22/23一对。 CTNI的顶部下降MS为解开其分子复杂性和定量磷酸化的位置异构体提供独特的机会,从而允许建立这种修饰与生理功能和疾病状态的相关性。
      心肌肌钙蛋白I(CTNI)
      使用的缩写是:CTNI,心肌肌钙蛋白I; ECD,电子捕获解离; ETD,电子转移解离; CAD,牢固激活解离; IRMPD,红外多波旋塞解离; LTQ,线性离子阱; PKA,营养依赖性蛋白激酶; PKC,蛋白激酶C; S / N,信噪比信号; AR,丰富率; PPO%,磷酸化占用; MS,质谱; MS / MS,串联质谱。
      1使用的缩写是:CTNI,心肌肌钙蛋白I; ECD,电子捕获解离; ETD,电子转移解离; CAD,牢固激活解离; IRMPD,红外多波旋塞解离; LTQ,线性离子阱; PKA,营养依赖性蛋白激酶; PKC,蛋白激酶C; S / N,信噪比信号; AR,丰富率; PPO%,磷酸化占用; MS,质谱; MS / MS,串联质谱。
      ,关键薄丝肌钙蛋白 - 番茄素 - 卓越素调节综合体的抑制亚基,在CA中起着关键作用2+ - 介绍了心肌收缩和放松的调节(
      • Solaro R.J.
      • rarick h.m.
      肌钙蛋白和刺激素 - 蛋白质在心脏肌细胞的活动中接通和调谐。
      ,
      • Kobayashi T.
      • Solaro R.J.
      钙,薄细丝,以及心脏收缩性的综合生物学。
      ,
      • 黄X.P.
      • pi y.q.
      • 李克..
      • Henkel A.S.
      • 格雷格r.g.
      • p.a。
      • 沃克J.W.
      心肌肌钙蛋白I基因敲除 - 一种小鼠模型的心肌肌钙蛋白缺乏。
      ,
      • 沃克J.W.
      蛋白激酶C,肌钙蛋白I和心力衰竭:过表达,高磷酸化和低估吗?
      ,
      • pi y.q.
      • Kemnitz K.r.
      • 张D.H.
      • 克拉尼亚斯e.g.
      • 沃克J.W.
      肌钙蛋白的磷酸化I控制心脏抽搐动力学 - 来自小鼠肌钙蛋白I-Null背景上表达的磷酸化位点突变体的证据。
      ,
      • pi y.q.
      • 张D.H.
      • Kemnitz K.r.
      • 王H.
      • 沃克J.W.
      蛋白激酶C和肌钙蛋白的部位I调节肌丝CA2+ 小鼠心肌中的敏感性和ATP酶活性。
      ,
      • 王H.
      • 格兰特J.E.
      • 摘为下午心。
      • 萨塔佩纳斯。
      • 罗宾斯J.
      • 沃克J.W.
      PKC-BβII使心脏肌细胞敏感到CA2+ 通过在苏氨酸-144上磷酸化肌钙蛋白I。
      )。 CTNI是在所有脊椎动物中发现的三种肌钙蛋白I基因之一,但仅在心脏中表达。它已成为检测心肌损伤的生物标志物,因为它没有骨骼肌缺失(
      • 巴布林L.
      • jaffe A.S.
      肌钙蛋白:检测心损伤的选择生物标志物。
      )。改变CTNI和其他关键的丝丝蛋白的磷酸化可以对心脏功能具有显着影响(
      • van der Velden J.
      • PAPP Z.
      • Zaremba R.
      • Boontje n.m.
      • de Jong J.W.
      • 欧文v.j.
      • 伯顿P.B.J.
      • Goldmann P.
      • Jaquet K.
      • Stienen G.M.M.
      增加了CA.2+结束阶段人心力衰竭中的收缩装置的敏感性来自收缩蛋白的改变磷酸化。
      ,
      • 德兰·J。
      • Solaro R.J.
      • 沙阿上午
      肌钙蛋白I磷酸化对心脏收缩功能的调节。
      ,
      • Sakthivel S.
      • 芬利N.L.
      • 玫瑰花属p.r.
      • Lorenz J.N.
      • 古拉克J.
      • 金斯。
      • 瑞士州P.
      • 马丁L.A.
      • 罗宾斯J.
      体内 and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation.
      )。已经提出了CTNI的高磷酸化,以因病变从补偿肥大转变为心脏功能障碍导致对心力衰竭(
      • 德兰·J。
      • Solaro R.J.
      • 沙阿上午
      肌钙蛋白I磷酸化对心脏收缩功能的调节。
      )。 CTNI的磷酸化已被广泛研究(
      • pi y.q.
      • Kemnitz K.r.
      • 张D.H.
      • 克拉尼亚斯e.g.
      • 沃克J.W.
      肌钙蛋白的磷酸化I控制心脏抽搐动力学 - 来自小鼠肌钙蛋白I-Null背景上表达的磷酸化位点突变体的证据。
      ,
      • pi y.q.
      • 张D.H.
      • Kemnitz K.r.
      • 王H.
      • 沃克J.W.
      蛋白激酶C和肌钙蛋白的部位I调节肌丝CA2+ 小鼠心肌中的敏感性和ATP酶活性。
      ,
      • 王H.
      • 格兰特J.E.
      • 摘为下午心。
      • 萨塔佩纳斯。
      • 罗宾斯J.
      • 沃克J.W.
      PKC-BβII使心脏肌细胞敏感到CA2+ 通过在苏氨酸-144上磷酸化肌钙蛋白I。
      ,
      • 德兰·J。
      • Solaro R.J.
      • 沙阿上午
      肌钙蛋白I磷酸化对心脏收缩功能的调节。
      ,
      • Sakthivel S.
      • 芬利N.L.
      • 玫瑰花属p.r.
      • Lorenz J.N.
      • 古拉克J.
      • 金斯。
      • 瑞士州P.
      • 马丁L.A.
      • 罗宾斯J.
      体内 and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation.
      ,
      • Noland Jr.,T.A.
      • guo x.d.
      • Raynor R.L.
      • Jideama n.M.
      • Averyhartfullard V.
      • Solaro R.J.
      • kuo J.F.
      心肌肌钙蛋白I突变体。蛋白激酶C和A的磷酸化和CA调节2+ - 重构的Actomyosin S-1的刺激MgATPase。
      ,
      • Buscemi N.
      • 福斯特D.B.
      • verveva i.
      • 范艾克J.E.
      P21-活化的激酶通过可能涉及肌钙蛋白I的新磷酸化的机制增加了大鼠Triton皮肤心肌纤维束的钙敏感性。
      ,
      • Haworth R.S.
      • Cuello F.
      • 赫朗T.J.
      • Franzen G.
      • 肯特J.C.
      • Gautel M.
      • Avkiran M.
      蛋白质激酶D是心肌肌钙蛋白I磷酸化的新型介体,并调节丝网功能。
      )并且已知通过CAMP依赖性蛋白激酶(PKA),蛋白激酶C(PKC),P21-活化激酶,环状GMP依赖性蛋白激酶和蛋白激酶D.的蛋白激酶D.至少五个丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点(CTNI)的调节。已被确定,包括SER23/24 (Ser22/23 不包括启动蛋氨酸),SER43/45和thr144, 基于 体外 磷酸化研究(
      • 黄X.P.
      • pi y.q.
      • 李克..
      • Henkel A.S.
      • 格雷格r.g.
      • p.a。
      • 沃克J.W.
      心肌肌钙蛋白I基因敲除 - 一种小鼠模型的心肌肌钙蛋白缺乏。
      ,
      • 沃克J.W.
      蛋白激酶C,肌钙蛋白I和心力衰竭:过表达,高磷酸化和低估吗?
      ,
      • pi y.q.
      • Kemnitz K.r.
      • 张D.H.
      • 克拉尼亚斯e.g.
      • 沃克J.W.
      肌钙蛋白的磷酸化I控制心脏抽搐动力学 - 来自小鼠肌钙蛋白I-Null背景上表达的磷酸化位点突变体的证据。
      ,
      • pi y.q.
      • 张D.H.
      • Kemnitz K.r.
      • 王H.
      • 沃克J.W.
      蛋白激酶C和肌钙蛋白的部位I调节肌丝CA2+ 小鼠心肌中的敏感性和ATP酶活性。
      ,
      • 王H.
      • 格兰特J.E.
      • 摘为下午心。
      • 萨塔佩纳斯。
      • 罗宾斯J.
      • 沃克J.W.
      PKC-BβII使心脏肌细胞敏感到CA2+ 通过在苏氨酸-144上磷酸化肌钙蛋白I。
      ,
      • 德兰·J。
      • Solaro R.J.
      • 沙阿上午
      肌钙蛋白I磷酸化对心脏收缩功能的调节。
      ,
      • Sakthivel S.
      • 芬利N.L.
      • 玫瑰花属p.r.
      • Lorenz J.N.
      • 古拉克J.
      • 金斯。
      • 瑞士州P.
      • 马丁L.A.
      • 罗宾斯J.
      体内 and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation.
      ,
      • Noland Jr.,T.A.
      • guo x.d.
      • Raynor R.L.
      • Jideama n.M.
      • Averyhartfullard V.
      • Solaro R.J.
      • kuo J.F.
      心肌肌钙蛋白I突变体。蛋白激酶C和A的磷酸化和CA调节2+ - 重构的Actomyosin S-1的刺激MgATPase。
      ,
      • Buscemi N.
      • 福斯特D.B.
      • verveva i.
      • 范艾克J.E.
      P21-活化的激酶通过可能涉及肌钙蛋白I的新磷酸化的机制增加了大鼠Triton皮肤心肌纤维束的钙敏感性。
      ,
      • Haworth R.S.
      • Cuello F.
      • 赫朗T.J.
      • Franzen G.
      • 肯特J.C.
      • Gautel M.
      • Avkiran M.
      蛋白质激酶D是心肌肌钙蛋白I磷酸化的新型介体,并调节丝网功能。
      )。但是,到我们的知识, 体内 CTNI的基础磷酸化位点直接从心脏组织纯化。 CTNI(24kDa,Pi〜9.5)具有12个丝氨酸,八个苏氨酸和三个酪氨酸残基,这对明确的磷酸化位点的确定以及所得的位置异构体的相对定量呈现主要挑战。
      已显示“顶部”质谱(MS)方法具有独特的适用于蛋白质(10-200kDa)的表征,复杂的翻译后修饰(
      • Kelleher N.L.
      • 林H.Y.
      • 瓦斯卡维奇G.A.
      • Aaserud D.J.
      • Fridriksson E.K.
      • MLEFFERTY F.W.
      通过串联高分辨率质谱,顶下与底层蛋白质表征。
      ,
      • Kelleher N.L.
      自上而下的蛋白质组学。
      ,
      • GE Y.
      • Lawhorn B.G.
      • Elnaggar M.
      • 施特劳斯E.
      • 公园J.H.
      • Begley T.P.
      • MLEFFERTY F.W.
      通过电子捕获解离质谱法如较大蛋白质(45kDa)的顶部表征。
      ,
      • GE Y.
      • Elnaggar M.
      • SZE S.K.
      • 箱子哦
      • Begley T.P.
      • MLEFFERTY F.W.
      • Boshoff H.
      • 巴里C.E.
      电子捕获解离质谱法从结核分枝杆菌分泌分泌蛋白质的顶部表征。
      ,
      • GE Y.
      • Lawhorn B.G.
      • Elnaggar M.
      • SZE S.K.
      • Begley T.P.
      • MLEFFERTY F.W.
      通过自上向下质谱检测病毒脯氨酰-4-羟化酶中的四种氧化位点。
      ,
      • SZE S.K.
      • GE Y.
      • 哦,
      • MLEFFERTY F.W.
      29-KDA蛋白的自上而下的质谱法,用于表征任何后晶体改性到一个残余物内。
      ,
      • 北班志拉贾赫J.A.
      • 皮特曼J.L.
      • 汤姆森B.A.
      • Budnik B.A.
      • kaur p.
      • 强奸M.
      • Kirschner M.
      • Costello C.E.
      • O'Connor P.B.
      新型QQQ-FTICR质谱仪的表征,进行翻译后修饰分析和全蛋白质自上而下的串联质谱。
      ,
      • Zabrouskov V.
      • Whitelegge J.P.
      跨膜结构域的覆盖率增加了活性离子电子捕获离子的整体膜蛋白的下落傅里叶变换质谱法。
      ,
      • Whitelegge J.
      • Halgand F.
      • Souda P.
      • Zabrouskov V.
      整体膜蛋白的自上而下的质谱。
      ,
      • 谢Y.M.
      • 张继夫
      • 尹斯。
      • lo j.a.
      自上而下的ESI-ECD-FT-ICR质谱定位非共价蛋白质 - 配体结合位点。
      ,
      • Pesavento J.J.
      • mizzen c.a.
      • Kelleher N.L.
      用串联质谱法测量分析改性蛋白质及其定位异构体:人组蛋白H4。
      ,
      • 翟H.L.
      • Dorrestein P.C.
      • Chatterjee A.
      • Begley T.P.
      • MLEFFERTY F.W.
      顶下质谱法同时进行多种蛋白质形式的动力学表征。
      ,
      • Zabrouskov V.
      • 韩x
      • 韦尔科尔E.
      • 翟H.L.
      • 林C.
      • van wijk k.j.
      • Scheraga H.A.
      • MLEFFERTY F.W.
      在由顶部肿块质谱法测定的五个位点逐步脱染核糖核酸酶A。
      ,
      • Zabrouskov V.
      • Giacomelli L.
      • van wijk k.j.
      • MLEFFERTY F.W.
      植物蛋白质组学的新方法。拟南芥叶片丙烯蛋白通过自上向下质谱法表征。
      ,
      • 韩x
      • j
      • Breuker K.
      • MLEFFERTY F.W.
      将自上而下的质谱延伸至蛋白质,质量大于200千盎司。
      ,
      • 孟福。
      • Forbes A.J.
      • 米勒l.m.
      • Kelleher N.L.
      高分辨率串联质谱法检测和定位蛋白质修饰。
      )。在传统的“自下而上”方法中,利益蛋白质用酶消化(例如 胰蛋白酶)在MS和MS / MS分析之前的凝胶或溶液中(
      • yates j.r.
      质谱 - 从基因组学到蛋白质组学。
      ,
      • Gygi S.P.
      • Aeberberold R.
      质谱和蛋白质组学。
      ,
      • 史密斯r.d.
      • 唐k.q.
      • 沉Y.F.
      蛋白质素的超敏和定量表征。
      )。这提供了蛋白质的快速,可靠的鉴定以及某些类型的翻译后修饰。然而,底部上升分析具有特征蛋白质修饰的内在限制,因为从消化中回收的肽序列通常仅代表蛋白质序列的部分覆盖,并且大多数胰蛋白肽相对较小,导致不同部分的修改之间的相关性丧失蛋白质(
      • Chait B.T.
      质谱:自下而上或自上而下?
      ,
      • Kjeldsen F.
      • Savitski m.m.
      • Nielsen M.L.
      • Shi L.
      • Zubarev R.A.
      用自下而上的LC-MS / MS研究蛋白质磷酸化图案:人α-酪蛋白的情况。
      )。顶部下降策略测量完整蛋白质的分子量,并将这些完整的分子离子直接分解在气相中,提供高度可靠的检测和表征序列改变和翻译后修饰(
      • Kelleher N.L.
      • 林H.Y.
      • 瓦斯卡维奇G.A.
      • Aaserud D.J.
      • Fridriksson E.K.
      • MLEFFERTY F.W.
      通过串联高分辨率质谱,顶下与底层蛋白质表征。
      ,
      • Kelleher N.L.
      自上而下的蛋白质组学。
      ,
      • GE Y.
      • Lawhorn B.G.
      • Elnaggar M.
      • 施特劳斯E.
      • 公园J.H.
      • Begley T.P.
      • MLEFFERTY F.W.
      通过电子捕获解离质谱法如较大蛋白质(45kDa)的顶部表征。
      ,
      • GE Y.
      • Elnaggar M.
      • SZE S.K.
      • 箱子哦
      • Begley T.P.
      • MLEFFERTY F.W.
      • Boshoff H.
      • 巴里C.E.
      电子捕获解离质谱法从结核分枝杆菌分泌分泌蛋白质的顶部表征。
      ,
      • GE Y.
      • Lawhorn B.G.
      • Elnaggar M.
      • SZE S.K.
      • Begley T.P.
      • MLEFFERTY F.W.
      通过自上向下质谱检测病毒脯氨酰-4-羟化酶中的四种氧化位点。
      ,
      • SZE S.K.
      • GE Y.
      • 哦,
      • MLEFFERTY F.W.
      29-KDA蛋白的自上而下的质谱法,用于表征任何后晶体改性到一个残余物内。
      ,
      • 北班志拉贾赫J.A.
      • 皮特曼J.L.
      • 汤姆森B.A.
      • Budnik B.A.
      • kaur p.
      • 强奸M.
      • Kirschner M.
      • Costello C.E.
      • O'Connor P.B.
      新型QQQ-FTICR质谱仪的表征,进行翻译后修饰分析和全蛋白质自上而下的串联质谱。
      ,
      • Zabrouskov V.
      • Whitelegge J.P.
      跨膜结构域的覆盖率增加了活性离子电子捕获离子的整体膜蛋白的下落傅里叶变换质谱法。
      ,
      • Whitelegge J.
      • Halgand F.
      • Souda P.
      • Zabrouskov V.
      整体膜蛋白的自上而下的质谱。
      ,
      • 谢Y.M.
      • 张继夫
      • 尹斯。
      • lo j.a.
      自上而下的ESI-ECD-FT-ICR质谱定位非共价蛋白质 - 配体结合位点。
      ,
      • Pesavento J.J.
      • mizzen c.a.
      • Kelleher N.L.
      用串联质谱法测量分析改性蛋白质及其定位异构体:人组蛋白H4。
      ,
      • 翟H.L.
      • Dorrestein P.C.
      • Chatterjee A.
      • Begley T.P.
      • MLEFFERTY F.W.
      顶下质谱法同时进行多种蛋白质形式的动力学表征。
      ,
      • Zabrouskov V.
      • 韩x
      • 韦尔科尔E.
      • 翟H.L.
      • 林C.
      • van wijk k.j.
      • Scheraga H.A.
      • MLEFFERTY F.W.
      在由顶部肿块质谱法测定的五个位点逐步脱染核糖核酸酶A。
      ,
      • Zabrouskov V.
      • Giacomelli L.
      • van wijk k.j.
      • MLEFFERTY F.W.
      植物蛋白质组学的新方法。拟南芥叶片丙烯蛋白通过自上向下质谱法表征。
      ,
      • 韩x
      • j
      • Breuker K.
      • MLEFFERTY F.W.
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      生物化学 - 生物分子质谱。
      )。使用新开发的电子捕获解离(ECD)的MS / MS技术(ECD)(
      • Zubarev R.A.
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      电子捕获乘法蛋白阳离子的捕获解离。一个非精通过程。
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      电子捕获解离用于繁殖蛋白质阳离子的结构表征。
      )电子转移解离(ETD)(
      • Syka J.E.P.
      • Coon J.J.
      • Schroeder M.J.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      通过电子转移解离质谱法分析肽和蛋白质序列分析。
      )大大提高了顶部分析中的效率和序列覆盖。 ECD和ETD切割NH-CHR键主要生产 cz. 离子,与来自良好发育的能量解离方法的互补性(如禁区活化的解离(CAD))互补(
      • Senko M.W.
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      傅里叶变换质谱法的大型乘法电离离子的碰撞激活。
      )红外线多相解离(IRMPD)(
      • 小D.P.
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      用于生物分子测序的大型乘法离子的红外多光子解离。
      )切割CO-NH键生产 by 片段离子。 ECD和ETD最重要的特征是它们是非原子体(
      • Zubarev R.A.
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      电子捕获乘法蛋白阳离子的捕获解离。一个非精通过程。
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      • 狩猎d.f.
      通过电子转移解离质谱法分析肽和蛋白质序列分析。
      ),这使得它们在定位肽或完整蛋白质中的不稳定翻译改性方面非常强大(
      • Shi S.D.H.
      • 哼唱M.E.
      • carr s.a.
      • 喇叭d.m.
      • Lindh I.
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      电子捕获解离质谱法测定磷酸肽/磷蛋白映射。
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      通过电子捕获解离方式定位不稳定的后翻透修饰:γ-羧基酸的情况。
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      电子捕获解离和红外多光子解离MS / MS的N-糖基化胰蛋白肽,得到互补序列信息。
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      电子捕获解离在生物分子分析中的作用。
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      磷酸肽的全局蛋白质组学分析使用电子转移解离串联质谱法。
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      • 狩猎d.f.
      电子转移离解(ETD)质谱法分析酿酒酵母酿酒酵母蛋白磷酸化位点。
      )。
      越来越欣赏蛋白质组学中量化的重要性(
      • ong s.e.
      基于质谱的蛋白质组学转变定量。
      )和为定量蛋白质组学开发的各种技术,包括但不限于同位素涂层的亲和标签(ICAT)(
      • Gygi S.P.
      • rist b.
      • 格柏S.A.
      • Turecek F.
      • 凝胶M.H.
      • Aeberberold R.
      使用同位素编码亲和标记的复合蛋白混合物的定量分析。
      ),胺 - 反应性等异物标签(ITRAQ)(
      • 罗斯P.L.
      • 黄Y.L.N.
      • Marchese J.N.
      • 威廉姆斯B.
      • 帕克克。
      • 哈桑斯。
      • Khainovski N.
      • Pillai S.
      • 丹尼尔斯S.
      • Purkayastha S.
      • Juhasz P.
      • 马丁斯。
      • Bartlet-Jones M.
      • 雅各布森A.
      • Pappin D.J.
      使用胺 - 反应性的异常标记试剂在酿酒酵母中的多重蛋白质定量。
      )和细胞培养中的氨基酸(硅酸)稳定同位素标记(
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
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      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
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      硅胶功能和定量蛋白质组学。
      )产生了广泛的兴趣。然而,估计具有特异性修饰的异构蛋白质物种的相对丰度仍然是蛋白质组学中的挑战,但对于阐明生物学功能非常重要。顶部下降MS方法是特别有吸引力,因为与肽相比,完整蛋白质的电离效率低得多,通过改性基团的存在较小(
      • Pesavento J.J.
      • mizzen c.a.
      • Kelleher N.L.
      用串联质谱法测量分析改性蛋白质及其定位异构体:人组蛋白H4。
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      用自下而上的LC-MS / MS研究蛋白质磷酸化图案:人α-酪蛋白的情况。
      )。最近,具有ECD的顶级MS策略已成功用于定量表征具有稳定修改和部分地点占用的位置异构体(
      • Pesavento J.J.
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      用串联质谱法测量分析改性蛋白质及其定位异构体:人组蛋白H4。
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      • 韦尔科尔E.
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      • van wijk k.j.
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      在由顶部肿块质谱法测定的五个位点逐步脱染核糖核酸酶A。
      )。由于替代磷酸化和磷酸的容易损失,蛋白质磷酸化的MS分析仍然是蛋白质组学中的困难任务(
      • 斯丁H.
      • 北班志拉贾赫J.A.
      • 赶紧J.
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      质谱法磷酸化分析。神话,事实,以及定性和定量测量的后果。
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      • Huddleston M.J.
      • 安南R.S.
      质谱法测定披风水平磷酸肽的选择性检测和排序。
      )。因此,磷酸化的位置异构体的定量非常具有挑战性,并且在文献中尚未报告我们的知识。在这项研究中,我们使用了顶部的ECD和ETD质谱法,用于解开临床重要人CTNI的分子复杂性和不稳定的磷酸化位置异构体的定量。

      实验步骤

       顶部质谱 -

      人CTNI被从人心脏组织(Calbiochem,San Diego,Ca)中纯化的免疫亲和性,溶于0.1μg/μl的水/乙腈/甲酸(50:50:0.1),并装入外部涂覆的纳米粥发射器中使用1.0-1.4 kV的喷射电压为1.0-1.4 kV的2-μm内径(新客观Inc.,Woburn,MA) 相对 质谱仪的入口,导致20-50nl / min的流动。使用线性陷阱/ FTICR(LTQ FT Ultra)混合质谱仪(Thermo Scientific Inc.,Bremen,Bervers)分析完整的蛋白质分子离子。将离子传递到线性捕集器中,并将其进一步用于FTICR电池,用于最大离子信号。全MS扫描线性陷阱扫描,FTICR细胞(FT)扫描,MS的目标值(累积离子的近似数量)n 线性陷阱扫描和MSn FTICR扫描为3×104, 106, 104和5×105, 分别。 FTICR质量分析仪的解决能力设定为100,000 m/ c:\工作\ Bhatia \ 2020 \ 08-AUG \ ASMB \ Upload \ J-ELBM0001-0142m50%m/z 400,导致一个扫描/ s采集率。首先分离蛋白质分子离子的单个电荷状态,然后通过ECD使用2%“电子能量”和45-ms持续时间来解离,没有延迟。每光谱平均高达3000个瞬变,以确保来自低丰度前体离子的高质量ECD光谱。或者,在ICR细胞中通过IRMPD解离前体离子。调节激光持续时间和强度,以导致80-90%的前体耗尽。所有FTICR谱都是用XTRACT软件(FT程序2.0.1.0.6.1.4,Xcalibur 2.0.5,Thermo Scientific Inc.,Bremen,Germany)处理了1.2的S / N阈值,适合尺寸为10%并手动验证。通过针对人类数据库(Uniprot,2005年12月6日,含有33,592个基本序列发布的Uniprot,含有33,592个基本序列),进一步搜索所产生的单同步缺陷质量清单,10 ppm单同位素片段耐受性,以及10个最小匹配。在搜索期间考虑静态(单次,二 - 和三甲基化,磷酸化和乙酰化。顶部候选蛋白质序列完整蛋白质序列,P级比10更好 −3 然后使用使用单一蛋白质搜索模式分配先前未分配的片段,其具有10 ppm单同步缺陷前体和片段容差; Ser,Thr和Tyr残留物的可变磷酸化; ermitini上的序列截断;和10个最低匹配。这 Mr 研究中报告的价值是最丰富的质量和最丰富的同位素峰之间的质量差异(以1.00235A的单位为单位),并且单同位素峰值在每次后面以斜体表示 Mr value.
      使用LTQ ETD进行ETD实验,具有100ms反应时间和2×105 由附着在线性捕集器背面的负化学电离源产生的ETD试剂氟的阴离子靶。平均最多100个扫描以在MS上实现所需的S / N3 ETD碎片。由此产生的女士3 手动分配光谱以产生用于确定MS内磷酸化残留物的位置的序列标签2 fragment.

       具有有限的Glu-C消化的底部质谱 -

      将10微克人CTNI溶解在25米中m 碳酸氢铵缓冲液,pH7.8,并在37℃下用0.2μg内蛋白酶胶(Calbiochem,San Diego,Ca)(Calbiochem,San DieAga,Ca)消化1小时,并得到的肽混合物(相当于1μg蛋白质)通过使用C通过LC分离18 150微米 - 内径,100毫米长的柱(MicroTech Scientific,Vista,CA),流量为200 NL / min流速和45分钟的梯度。使用LTQ orbitrap XL质谱仪(Thermo Scientific Inc.,Bremen,Germany)分析肽混合物。在这些LC / MS实验中,与LTQ中的三个数据相关的MS / MS扫描并行地获取orbitrap中的全MS扫描。动态排除™与单一重复计数和7分钟排除持续时间一起使用。高分辨率全扫描光谱(60,000 m/ c:\工作\ Bhatia \ 2020 \ 08-AUG \ ASMB \ Upload \ J-ELBM0001-0142m50%m/z 使用具有700ms最大离子注入时间的单个MicroScan获得400)。对于MS / MS,在默认激活q为0.25的默认激活Q处使用25%常规碰撞能,并在线性离子阱中检测到前体离子。将LC / MS / MS数据与吉祥物搜索引擎(2.2版,矩阵Sciences Ltd.,伦敦,英国)进行搜索,对抗人类数据库(IPI_humanuman_v3_27,含有67,528个序列),具有5ppm前体质量精度,0.8-da片段质量精度,ESI-FTICR仪器型,以及最多三种错过的V8-E酶切割,并允许在蛋白质n末端和Ser,Thr和Tyr残基上的可变磷酸化上固定乙酰化。使用意义阈值过滤结果 p <0.001和离子得分为15,只考虑了“粗体红色”肽比赛。

       多网站磷酸化占用的计算 -

      为了定量确定每个部位的部分磷酸化占用率,在M上进行ECD实验33+,M.32+和m31+ 不磷酸化的分子离子的充电状态(23,554.757-14m/z 714.8,737.1和760.8分别)和单磷酸化的同种型III(23,634.728-14m/z 717.2,739.6和763.4分别为每次充电状态三重复。所得不磷酸化的峰值强度 c fragment ions (S/N >3)用于计算每个不同磷酸化位点的部分磷酸化占用率。首先标准化,每种单独的不磷酸化片段最丰富的最丰富的同位素的绝对丰度 触题与 磷酸化后相对丰度没有改变的片段(类似于“内标”)。然后比较了这种归一化丰富的丰富 Interspectra 在不磷酸化和磷酸化前体之间。根据的丰富率(Ar)和磷酸化占用(PPO%)按照计算计算 方程1 2。单个磷酸化位点的部分占据计算为其全占患者的相对百分比。
      AR.=(Ax/Ai)p(Ax/Ai)u
      (eq。1)


      and
      pro%=[1-AR.]×100%
      (eq。2)


      其中Ax是每种单磷酸化最丰富的同位素最丰富的绝对丰富 c 片段离子,ai是“内标”最丰富的同位素的绝对丰富 c 片段离子,P表示单磷酸化形式,并且U表示不磷酸化的形式。
      这些。计算每个片段AR(n = 18(三个内标复制 c 离子)))。使用三种重复评估分析再现性,与三个最丰富的充电状态。

      结果

       人CTNI的高分辨率质谱分析

      人CTNI是免疫亲和性纯化的来自名义上的健康成年人心脏组织。 SDS-PAGE和COMASSIE蓝染色确认其尺寸和相对纯度(图。1D)。通过PLQ FT Ultra通过顶下质谱法分析蛋白质样品。直接电喷雾电离分析产生高分辨率乘以带电质谱,如图所示 图。1A。显示CTNI的去折叠MS谱 图。1B,揭示CTNI蛋白的36种分子同种型。分子量,初始分配基于精确的分子量,以及主要和次要成分的标准化相对丰富的分配 表I.。 CTNI最丰富成分的身份,具有23,554.757 - 14 (同种型III; 图1C.),23,634.728-14,23,714.695-14 DA由ECD和IRMPD实验在PriveIscpc中使用绝对质量搜索模式确认。它们对应于CTNI的N-末端Ala-乙酰化产物,从N末端的去除和来自C末端的Phe-Glu-Ser残基的损失(计算 Mr = 23,554.683-14)分别和单磷酸化的同种型。这些阳性鉴定得到8.6×10的高p谱−29 和 3.6 × 10−10 对于同种型III及其单磷酸化形式(来自23,554.757的ECD光谱 - 14 - 和23,634.728-14-da父离,32+, m/z 737和739.5分别为4×10的p级−4 对于其二磷酸化形式(来自IMPD频谱为23,714.695-14-da父ION,32+,AT m/z 742)。另外两种形式,分子量为23,701.826-14 (同种型II)和23,426.662-14 (同种型IV)与N-末端ALA-乙酰化截突匹配,分别从C末端除去Glu-Ser或Lys-Phe-Glu-Ser残基。分子量为23,917.911-的蛋白质同种型14 (同种型I)与人类数据库中的N-末端ALA-乙酰化全序列的N-末端ALA-乙酰化全序列的分子量同意。没有进一步进行MS / MS实验以确认这些作业。样品的其他主要组分与单磷酸化异形的同种型I-IV或氧化产品匹配。总结了包括修改和未改性形式的四个截短同种型(I-IV)的相对定量 表二。对CTNI分子观察到的非 - ,单 - 和二磷酸化形式的相对丰度总结在 表III。显示了四种人CTNI同种型(I-IV)的氨基酸序列和分子量 表IV..
      图缩略图GR1.
      Fig. 1人体心脏组织纯化完整CTNI的高分辨率ESI / MS分析。A,全质谱乘以电荷CTNI分子离子。 B,XTRACT去卷积谱的乘法加入的完整CTNI分子离子如图所示 A. 罗马数字 表示四种不同的C末端截短同种型CTNI。每种同种型也是+ 80-和+ 160-DA形式(单和二磷酸化的(+P 和 +2P)))。氧化物种被“O。“ C,同位素分离的同种型III的分子离子(m32+)。 表示对应于分配的质量的同位素峰的理论丰富同位素分布。 D,用Coomassie蓝色染色人CTNI一维SDS-PAGE分析。 Calc。,计算; expt。,实验。
      表I.在人CTNI的ESI / FT MS谱中观察到的主要和次要组分的鉴定和相对定量
      观察到的 Mr-14计算 Mr-14
      a 计算 Mr 基于从Swiss-Prot序列数据库获得的入门名称TNNI3_human的氨基酸序列。
      错误暂定识别
      b 罗马数字表示四个不同的N-末端乙酰化CTNI(I,残基1-209; II,残基1-207; III,残基1-206; IV,残基1-205)的四种不同的C末端截短的同种型。 “P”代表磷酸化,“O”代表氧化。对于观察到同位素峰的病例,未分配暂定的鉴定(“无ID”)。
      绝对丰富相对丰富
      PPM.%
      23,426.66223,426.5883.1IV.2,5404.5
      23,442.655.23,442.584.3.0IV. + O.2270.4
      23,461.627没有id ..2620.5
      23,506.651.23,506.554.4.0IV. + P.1,7903.1
      23,522.613.23,522.550.2.6IV. + P + O.2580.5
      23,538.629.23,538.546.3.5IV. + P + 2o2720.5
      23,554.75723,554.6833.1III8,52014.9
      23,570.74823,570.679.2.9III + O.1,5202.7
      23,586.716.23,586.675.1.7III + 2O和IV + 2P2350.4
      23,589.733没有id ..2,4204.2
      23,634.72823,634.6493.3III + P.7,78013.6
      23,650.71723,650.645.3.0III + P + O.2,8805.1
      23,670.708没有id ..2,1303.7
      23,686.717.没有id ..9331.6
      23,701.82623,701.751.3.1II2,8405.0
      23,714.69523,714.6153.3III+2P3,8806.8
      23,730.68423,730.6113.0III + 2P + O.1,6102.8
      23,749.680没有id ..9951.7
      23,765.677没有id ..3870.7
      23,781.81123,781.717.3.9II + P.1,7103.0
      23,797.75723,797.7131.8II + P + O.5100.9
      23,813.76823,813.679.3.7II + P + 2o2280.4
      23,829.65723,829.6450.5II + P + 3o2620.5
      23,845.796.23,845.6117.7II + P + 4o1400.2
      23,861.768.23,861.6833.5II+2P2680.5
      23,877.8123,877.6795.5II + 2p + o1550.3
      23,917.91123,917.8263.5I4,5408.0
      23,933.88723,933.8222.7I + O.2500.4
      23,952.865.没有id ..1,7303.0
      23,968.859.没有id ..2810.5
      23,984.793没有id ..7381.3
      23,997.890.23,997.7924.1我+ P.1,6702.9
      24,013.859.24,013.788.3.0我+ p + o9881.7
      24,029.84724,029.7842.6我+ P.+2O2,0803.6
      24,077.73324,077.758−1.0I+2P1240.2
      24,093.78224,093.7242.4I+2P+O3410.6
      a 计算 Mr 基于从Swiss-Prot序列数据库获得的入门名称TNNI3_human的氨基酸序列。
      b 罗马数字表示四个不同的N-末端乙酰化CTNI(I,残基1-209; II,残基1-207; III,残基1-206; IV,残基1-205)的四种不同的C末端截短的同种型。 “P”代表磷酸化,“O”代表氧化。对于观察到同位素峰的病例,未分配暂定的鉴定(“无ID”)。
      表二相对定量的人CTNI(I-IV)的四种同种型,包括分配的修改和未改性的形式 表I.
      CTNI同种型组合绝对丰富相对丰富
      %
      我(AC1-209)9,99321.0
      II(AC1-207)6,11312.8
      III(AC1-206)26,42555.5
      IV.(AC1-205)5,08710.7
      47,618100
      表III相对定量总体,单磷和二磷酸化人CTNI,包括所有四种同种型(I-IV)(I-IV)所分配的 表I.
      CTNI磷酸化形式组合绝对丰富相对丰富
      %
      不磷酸化20,67243.4
      单磷酸化20,56843.2
      二磷酸化6,37813.4
      47,618100
      表IV.四种人CTNI同种型的氨基酸序列和分子量
      CTNI同种型氨基酸序列对TNNI3_human的序列修改a计算 Mr-14a
      我(AC1-209)AdgssdaarerpapapirrrssnyrayatephakkkskisasasrklqlktlllqiakqelerealeerrgekgralstrcqpleltglgfaelqdlcrqlharvdkvdeerydieakvtkniteiadltqkifdlrgkfkrptlrrrvrisadammqallageldlrahlkqvkedtekenrevgdwrknidalsgmegrkkkfesN-末端乙酰化23,917.826
      II(AC1-207)adgssdaarerpapapirrrssnyrayatephakkkskisasrklqlktllllqiakqelerealeerrgekgralstrcqpleltglgfaelqdlcrqlharvdkvdeerydieakvtkniteiadltqkifdlrgkfkrptlrrrvrisadammqallageldlrrahlkqvkedtekenrevgdwrknidalsgmegrkkkf.N-末端乙酰化和C末端截短glu-ser23,701.751.
      III(AC1-206)Adgssdaarerpapapirrrssnyrayatephakkkskisasrklqlktlllqiakqelerealeerrgekgralstrcqpleltglgfaelqdlcrqlharvdkvdeerydieakvtkniteiadltqkifdlrgkfkrptlrrrvrisadammqallageldlrrahlkqvkedtekenrevgdwrknidalsgmegrkkk.N-末端乙酰化和PHE-Glu-Ser的C末端截短23,554.683
      IV.(AC1-205)Adgssdaarerpapapirrrssnyrayatephakkkskisassrklqlktlllqiakqelerealeerrgekgralstrcqpleltglgfaelqdlcrqlharvdkvdeerydieakvtkniteiadltqkifdlrgkfkrptlrrrvrisadammqallageldlrahlkqvkedtekenrevgdwrknidalsgmegrkk.N-末端乙酰化和Lys-Phe-glu-Ser的C末端截短23,426.588

       单磷酸化CTNI同种型中的基础磷酸化位点的定位III-

      CTNI同种型(I-IV)中的每一个存在于三种状态,M,M + 80和M + 160中,分别代表非,单磷和二磷酸化的分子物种。地图基础磷酸化站点,单个充电状态(m32+)通过ECD分离和解离单磷酸化的同种型III(Fig. 2)。从得到的ECD光谱衍生的质量被分配给来自预测的CTNI的预测序列与N-末端ALA乙酰化和PHE-glu-SER残基的C-末端截短(根均方= 3.1ppm)。一个ECD实验产生37 c 和 30 z. 代表同种型III中总共205nh-Ch可用骨架键的片段离子,确认N-末端ALA乙酰化和C末端截短(Fig. 3 和补充表1和2)。只有不磷酸化的事实 c 碎片离子被检测到 c9c21 但观察到未经和单磷酸化离子的混合物 c22c113 片段明确地将一个磷酸化位点分配给Ser22。本网站的部分占用是由联合和单磷酸化的共存的 c22c113 离子。不磷酸化和单磷酸化的存在 c66 ECD谱中的离子(Fig. 2, 插入)表明一些蛋白质位置异构体具有前(或ON)残基66之前的磷酸化位点,并且其余在残留物后磷酸化66.观察主要不磷酸化 z.100 在残留物106(残留物206-100)之后,IAOFORM III中没有同种型III的主要磷酸化位点。因此,残留物67和106之间必须有一个主要的磷酸化位点;具有侧链羟基的唯一残留物是衬里76 和 Thr77.
      图缩略图GR2.
      Fig. 2单磷酸化的代表性ECD谱(p)人CTNI同种型III(M32+)分子离子在 m/z 739.
      图缩略图GR3.
      Fig. 3从ECD光谱的产品映射用于DNA预测的CTNI同种型III的DNA预测序列,除去了三种C末端残基,PHE-Glu-Ser。 仅示出了三个重复中的可重复的可再现片段。 Ser(S),thr(T)和tyr(Y)突出的残留物 .
      SER的单磷酸化位点22 也用ms验证3 ETD experiments (Fig. 4)。首先是个人充电状态(m32+m/z 739.6)CTNI的单磷酸化异形素III(图4A)使用CAD在离子阱中解离(图4E.)。在CAD光谱中观察到80Da的主导中性损失(图4C.)由于CAD(或IRMPD)的能量解离条件下磷酸化是不稳定的。也可能是离子的一小部分 m/z 683.545可能是不磷酸化的 b315+ 片段,单磷酸化M的MS / MS产品32+ 前体离子。丰富的单磷酸化 b31 fragment (Fig. 4, CD)(它的身份通过高分辨率准确的质量MS单独证实2 IRMPD实验; 图4B.使用ETD进一步分离和碎片。顺序双重充电 c13c25 片段离子在Ser核实一种磷酸化22 (图4F. 和补充表3)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4SER中的单磷酸化位点确认22 by MS3 ETD experiments.A,在线性离子阱中测量的乘以带电完整CTNI分子离子的低分辨率ESI光谱。 B,来自单磷酸化CTNI同种型III 32+分子离子的部分高分辨率IRMPD谱 m/z 740. C,部分线性捕集来自前体分子离子的CAD光谱 m/z 740. D,线性陷阱Ultrazoom CAD扫描显示同位素分辨的单磷酸化(p) b315+ 片段离子。 E,线性捕获来自单磷酸化CTNI同种型III 32+分子离子的CTN CAD光谱 m/z 740. F,ETD女士3 单磷酸化的光谱 b315+ 片段离子。该地区显示ETD双重充电 c 形成序列标签的片段离子,其与完全磷酸化的Ser一致22 和不磷酸化的Ser23.

       单磷酸化CTNI中磷酸化占用的测定 -

      ECD实验在不磷酸化和单磷酸化的CTNI同种型III上单独进行,以量化每个部位的磷酸化占用。鉴于第一个N-末端磷酸化残余物是衬里22 从定性数据中,我们选择了六个丰富 c N末端和SER之间的片段离子22 作为独立的“内标”(因为它们的相对丰度在不磷酸化和磷酸化同种型之间不改变(补充图1))。剩余的不磷酸化的绝对丰度 c 来自不磷酸化和磷酸化同种型III的离子标准化为这六个片段 触题。存在多重不磷酸化的 c N末端和SER之间的离子22 (我们的案例中的六个)是有利的,因为它允许对AR的多个独立测量(等式1 )对于每个片段离子,大大提高了我们量化方法的精度。此外,所有不磷酸化的丰富 c 离子(独立归一化到前六个n末端 c 在单磷酸化和不磷酸化的同种型III之间比较了离子。这些丰度比揭示了由磷酸化事件引起的片段丰度的差异。为了确保我们测量的统计有效性,在不相磷酸化和单磷酸化的CTNI同种型III的三次最丰富的充电状态下重复实验三次。
      所有不磷酸化的丰富率 c 来自非磷酸化和单磷酸化同种型III的ECD的离子符合CTNI的氨基酸序列(Fig. 5)。还示出了单磷酸化CTNI的磷酸化占用图 Fig. 5。前六片碎片的丰富比(c9, c15, c18, c19, c20, 和 c21来自未经和单磷酸化的同种型III约为1(1.01±0.1),表明它们的相对丰度在ECD光谱中没有变化,这证实N末端和SER之间没有磷酸化位点22。丰富的比率开始下降 c22 (Ser22)平均保持在0.47±0.05之间 c23c69 表明47%的SER22 是不磷酸化的,占23,634.728的53%14 分子在Ser磷酸化22。丰富的比率在之间没有明显变化 c23c69,强烈建议衬里之间没有磷酸化残留物23 和 Glu69 including Ser41/43 (Ser41/43 in human cTnI; Ser43/45 在小鼠CTNI中),然后减少到0.18 c79 表明含量之间存在另一个主要磷酸化位点69 和 Cys79。该地区只有两种可能的磷酸化位点,Ser 76 和 Thr77,表明第二个主导地位异构体在这两种残基中的任一个中磷酸化,并占23,634.728的磷酸化占含量的36% - 14 分子。因为没有 c 在这两个残留物之间观察到片段离子,我们不能自信地将修改分配给任何一种。此外,丰度比平均依次为0.11±0.08 c79c113 建议在Glu之间存在低水平(10-12%)未识别的位置异构体,可能在Glu之间的磷酸化位点113 和C终点。因为没有磷酸化 z. 在C末端和术后发现片段离子 z.28 (S / N = 20),该次要的基础磷酸化位点可能位于残留物之间113 和 Thr180;其中包含五个Thr,两个Ser和No Tyres。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5单磷酸化CTNI同种型III的PPO%图。 非磷酸化的标准化绝对Ars c 来自不磷酸化的ECD光谱的片段离子(m/z 737)和单磷酸化(m/z 740)绘制的分子离子 相对 氨基酸序列(仅显示114个N-末端残基)。根据条例计算AR和PPO% 。 S. E.计算每个片段AR(n = 18(三个内标复制 c ions)).

       通过底部质谱法确认磷酸化位点 -

      验证Ser的磷酸化76/ thr.77用Glu-C蛋白酶消化1小时的人CTNI,并通过反相HPLC分离所得肽,并使用LTQ orbitrap以数据依赖性方式测序。使用吉祥物搜索生成的LC-MS / MS文件。总共八个肽与CTNI(国际蛋白质指数进入00244346)的序列相匹配,得分为45且序列覆盖率为37%(补充表4)。发现肽Lys-Gly-Arg-Ala-Lys-Ser-Thr-Arg-Cys-Gln-Pro-Leu-glu-ala-Gly-Leu-Gly-Phe-Ala-glu被证实是单磷酸化的通过其准确的质量(计算 Mr = 2297.142-1;实验 Mr = 2297.147-1; 2.2 ppm;在 m/z 766.389,3+)以及其线性陷阱MS2 频谱(吉祥物得分,16)具有80 da的主导中性损失(Fig. 6 和补充图2和表5)。结构片段表明SER6 or Thr7 (Ser76/ thr.77 在蛋白质序列中,通过直接通过磷酰基酯化 定性 确认我们对高分辨率和高精度顶部下调ECD数据的解释。考虑到在许多结构相似同种型的混合物上进行Glu-C消化(在全扫描FTICR光谱中观察到超过30个完整的分子离子),并且在消化后磷酸肽的回收不是定量的,并且没有结论该网站的磷酸化占用率可以通过自下而上的实验制成。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6SER磷酸化位点的构型76/ thr.77 通过自下而上的质谱。 来自前体离子的CAD光谱(M3+) 在 m/z 767 (插入),对应于单磷酸化(p示出了来自CTNI的有限消化的Glu-C肽(序列)。 Calc。,计算; expt。,实验。

       在Ser的二磷酸化位点定位23 by Top Down MS3 Mass Spectrometry—

      二磷酸化的同种型III(m32+)首先将分子离子分离并通过ICR细胞中的IRMPD或通过CAD在LTQ中分离。在每种情况下,占主导地位的二磷酸化 b315+ fragment (3572.620-1,1.9 ppm)在 m/z 由于IRMPD和CAD的能量性质,有两个连续的80 dA连续中性损失产生了715.91(Fig. 7, AB)。离子的一部分也可能 m/z 683.545和699.538可以是未经和单磷酸化的 b315+ 二磷酸化M直接导致的碎片32+ 前体离子。对于女士来说3 实验,二磷酸化m32+ 首先将分子离子分离,并通过CAD在单独配备有ETD源的实体中解离。所结果的 b315+ 片段离子at. m/z 进一步分离出715.88,使用ETD分离,其中相应的双重充电 c 离子从额外的80 da开始移动 c23 fragment ion (图7D)与...相比 c ETD MS中的片段离子3 从单磷酸化的同种型获得的光谱(图7C. 和补充表6)。这表明在同种型III的二磷酸化异构体中,均有大部分具有综合组织的位置异构体 22 和 Ser23 在同一分子中磷酸化。重要的是占SER的占用23 在单磷酸化物种中未检测到,但在双磷酸化CTNI离子中观察到。没有其他丰富的女士2 适用于连续ms的碎片3 在CAD或IRMPD光谱中观察分析,进一步实验,以定位二磷酸化异形族III中的其他可能的磷酸化位点。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7MS的二磷酸化CTNI同种型III中磷酸化位点的定位3 ETD.A,前体离子的部分高分辨率IRMPD谱 m/z 742.092对应二磷酸化同种型III(32+)。 B,在同一母体离子的线性阱中记录的部分低分辨率CAD光谱。 C,部分ETD MS3 单磷酸化的光谱 b315+ 片段离子。扩展区域显示双重充电 c 形成包括单磷酸化的序列标记的片段离子(pSER.22 和不磷酸化的Ser23. D,部分ETD MS3 二磷酸化的光谱(2p) b315+ 片段离子。该地区显示ETD双重充电 c 形成序列标签的片段离子,其包括磷酸化的Ser22 和 Ser23.

      讨论

       CTNI的复杂分子异质性

      CTNI的高分辨率MS谱显示出大量的异质性,其中观察到人CTNI的36个不同的组分;尽管SDS-PAGE对CTNI的并行分析仅显示了单个尖锐带。以前的低分辨率LC / MS和MALDI / MS分析人CTNI仅报告了八个异构CTNI组件(
      • 双打下午。
      • 韦尔奇M.J.
      对人心肌肌钙蛋白I的新认证参考材料的表征。
      )。通过高分辨率MS测量的准确分子量揭示了人CTNI的许多特征。与从Swiss-Prot数据库中获得的氨基酸序列一致地确认了MET的去除。此外,这里检测到的所有异形型在N-末端ALA上乙酰化。发现由C末端Glu-Ser,PHE-Glu-Ser和Lys-Phe-glu的截短产生CTNI的三种不同类型的CTNI截短产物。 Ser残留物。 CTNI的这种蛋白水解C-末端截短可能与改变的心功能相关,因为C末端高度保守并且可以在CA期间直接参与变构开关2+ 收缩的激活(
      • jin J.P.
      • 杨福夫。
      • yu z.b.
      • ruse c.i.
      • 陈A.H.
      肌钙蛋白的高度保守的CoOH末端形成CA2+ - 肌钙蛋白复合物中的制定构振域。
      )。在CTNI的所有四种同种型(I-IV)中观察到单磷酸酯和二磷酸酯。也观察到可能发生的氧化 体内 由于氧化应激或 体外 来自样品制备或两者。已知CTNI受到广泛的翻译后改性,包括在生理和病理条件下的磷酸化,蛋白水解和氧化(
      • Labugger R.
      • SIMPSON J.A.
      • quick
      • 棕色H.A.
      • Collier C.E.
      • verveva i.
      • 范艾克J.E.
      具有亲和色谱法和质谱法的生物样品中心肌肌钙蛋白的策略。
      )。在心肌中或释放到一般循环中发生的这些修饰可能会对身体组织和流体中存在的CTNI历史有可能提供洞察力,并且最终与疾病病因,发病机制和预后相关联。

       以ECD为顶部的MS,用于定量磷酸化的位置异构体 -

      单磷酸化CTNI同种型III的顶部落下ECD分析表明,在单磷酸化23,634.728-中存在多个位置异构体的存在14 分子离子。因为已知ECD保留不稳定的翻译后修改(
      • Zubarev R.A.
      • Kelleher N.L.
      • MLEFFERTY F.W.
      电子捕获乘法蛋白阳离子的捕获解离。一个非精通过程。
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      • Zubarev R.A.
      • 喇叭d.m.
      • Fridriksson E.K.
      • Kelleher N.L.
      • 克鲁格N.A.
      • Lewis M.A.
      • 木匠B.K.
      • MLEFFERTY F.W.
      电子捕获解离用于繁殖蛋白质阳离子的结构表征。
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      • Shi S.D.H.
      • 哼唱M.E.
      • carr s.a.
      • 喇叭d.m.
      • Lindh I.
      • MLEFFERTY F.W.
      电子捕获解离质谱法测定磷酸肽/磷蛋白映射。
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      • Kelleher R.L.
      • Zubarev R.A.
      • 布什K.
      • Furie B.
      • Furie B.C.
      • MLEFFERTY F.W.
      • 沃尔斯C.T.
      通过电子捕获解离方式定位不稳定的后翻透修饰:γ-羧基酸的情况。
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      • 哈莎逊K.
      • Cooper H.J.
      • Emmett M.R.
      • Costello C.E.
      • Marshall A.G.
      • Nilsson C.L.
      电子捕获解离和红外多光子解离MS / MS的N-糖基化胰蛋白肽,得到互补序列信息。
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      • Cooper H.J.
      • 哈莎逊K.
      • Marshall A.G.
      电子捕获解离在生物分子分析中的作用。
      ),存在未和单磷酸化的混合物 c22c113 片段离子表明存在至少一个位于Ser之间的另外的磷酸化位点22 和C终点。相反,只有在SER上仅存在所有磷素组22 (单个位置异构体的情况),人们希望只看磷酸化 c22c113 fragments.
      为了量化磷酸化的位置异构体,而不是直接测量单频谱中不磷酸化的磷酸化片段(类似于Kelleher和Co-Worker成功完成的磷酸化片段(
      • Pesavento J.J.
      • mizzen c.a.
      • Kelleher N.L.
      用串联质谱法测量分析改性蛋白质及其定位异构体:人组蛋白H4。
      )对于非不稳定的翻译后修改),我们通过测量不磷酸化相对丰富的差异来开发一种新方法 c 来自不磷酸化和单磷酸化前体离子的ECD的离子。这是因为肽骨架键的ECD裂解效率可能受附近磷酸盐部分的影响,从而改变磷酸化片段的产率(
      • Tsybin Y.O.
      • 他h.
      • Emmett M.R.
      • Hendrickson C.L.
      • Marshall A.G.
      通过组合电子捕获解离和活化离子电子捕获解离和蛋白质表征自动化De Novo肽测序和蛋白质表征。
      )因此,磷酸化的相对丰富 c 来自ECD / ETD的离子是 不是 必然与相应的磷酸化异构前体的尺寸成比例。因此,直接测量磷酸化以不磷酸化的丰度比 c/z. 在一个光谱内的离子会显着地损害磷酸化异构体的定量方面的准确性。
      相比之下,我们的方法仅使用不磷酸化的片段离子 触题 正常化 相对 内部标准片段随后是不磷酸化和磷酸化前体离子的ECD光谱的比较,允许定量测定相应位点的部分磷酸化占用,因为富含磷酸化事件归因于磷酸化事件的差异。因此,由于磷酸化多肽的物理化学性质,可以说是一种更准确的方法来定量磷酸化占用(
      • Pesavento J.J.
      • mizzen c.a.
      • Kelleher N.L.
      用串联质谱法测量分析改性蛋白质及其定位异构体:人组蛋白H4。
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      • Kjeldsen F.
      • Savitski m.m.
      • Nielsen M.L.
      • Shi L.
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      用自下而上的LC-MS / MS研究蛋白质磷酸化图案:人α-酪蛋白的情况。
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      • 斯丁H.
      • 北班志拉贾赫J.A.
      • 赶紧J.
      • 莫里斯N.
      • Kirschner M.W.
      质谱法磷酸化分析。神话,事实,以及定性和定量测量的后果。
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      • Huddleston M.J.
      • 安南R.S.
      质谱法测定披风水平磷酸肽的选择性检测和排序。
      )。

       新的磷酸化位点的潜在生理含义 -

      在残留型Ser中鉴定并定量新的磷酸化位点76/ thr.77 通过顶部的ECD并由Glu-C蛋白水解消化证实。为了我们的知识,这是SER的第一个实验证据76/ thr.77 作为A. 体内 人类CTNI的磷酸化位点,但SER76 预计是基于检测激酶识别基序(磷,细胞信号传导技术)的算法的磷酸盐。此外,Kuo和同事(
      • noland t.a.
      • Raynor R.L.
      • kuo J.F.
      用蛋白激酶C和含有磷酸化位点的合成肽的蛋白激酶C和肌钙蛋白T磷酸化位点的鉴定。
      )报告说78 在牛CTNI通过PKC缓慢而不完全磷酸化 体外。有趣的人类CTNI和牛CTNI份额为100%序列标识>侧翼的20个残留物(Ser76 in human cTnI; Ser78 在牛ctni)。 PKC CTNI的磷酸化主要在Ser上发生43/45 和 Thr144,收缩期间钙敏感性和ATP酶率的改变(
      • 黄X.P.
      • pi y.q.
      • 李克..
      • Henkel A.S.
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      心肌肌钙蛋白I基因敲除 - 一种小鼠模型的心肌肌钙蛋白缺乏。
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      • 沃克J.W.
      蛋白激酶C,肌钙蛋白I和心力衰竭:过表达,高磷酸化和低估吗?
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      肌钙蛋白的磷酸化I控制心脏抽搐动力学 - 来自小鼠肌钙蛋白I-Null背景上表达的磷酸化位点突变体的证据。
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      蛋白激酶C和肌钙蛋白的部位I调节肌丝CA2+ 小鼠心肌中的敏感性和ATP酶活性。
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      • 摘为下午心。
      • 萨塔佩纳斯。
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      PKC-BβII使心脏肌细胞敏感到CA2+ 通过在苏氨酸-144上磷酸化肌钙蛋白I。
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      • Solaro R.J.
      • 沙阿上午
      肌钙蛋白I磷酸化对心脏收缩功能的调节。
      )。在Maeda和Co-Workers获得的人肌钙蛋白络合物的晶体结构中(
      • Takeda S.
      • yamashita A.
      • Maeda K.
      • Maeda Y.
      人体心肌肌钙蛋白核心结构域的结构2+ - 饱和形式。
      ),Ser76/ thr.77 暴露于溶剂,可能可用于激酶。此外,可以磷酸化76/ thr.77 位于α-螺旋的末端,可以通过类似于Ser的磷酸化来延伸螺旋41/43 改变杠杆臂中的杠杆臂中的刚度(
      • 沃克J.W.
      蛋白激酶C,肌钙蛋白I和心力衰竭:过表达,高磷酸化和低估吗?
      )。蛋白激酶的表达水平和丝丝蛋白的磷酸化状态均已显示出在末端心力衰竭中改变(
      • van der Velden J.
      • PAPP Z.
      • Zaremba R.
      • Boontje n.m.
      • de Jong J.W.
      • 欧文v.j.
      • 伯顿P.B.J.
      • Goldmann P.
      • Jaquet K.
      • Stienen G.M.M.
      增加了CA.2+结束阶段人心力衰竭中的收缩装置的敏感性来自收缩蛋白的改变磷酸化。
      ),但SER的状态76/ thr.77 由于缺乏关于该商业上可获得的人CTNI的储存和纯化条件的信息,尚未进一步调查。

       订购或连续的磷酸化 -

      我们的顶级MS / MS和MS3 CTNI分析显示SER22 作为单磷酸化人CTNI中的主要磷酸化位点,而Ser23 仅在二磷酸化物种中磷酸化。已经基于PKA的合成肽的磷酸化,提出了这些丝氨酸残基的顺序(或有序)磷酸化。 体外 (
      • 基恩N.E.
      • QUIRK P.G.
      • 高雅。
      • patchell v.b.
      • 佩里S.V.
      • Levine B.A.
      营养依赖性蛋白激酶 - 结构后果和功能影响,心肌肌钙蛋白I的有序磷酸化。
      ,
      • 佩里S.V.
      • patchell v.b.
      • Levine B.A.
      • QUIRK P.G.
      对应于心肌肌钙蛋白N-末端结构域的肽的丝氨酸残留的有序磷酸化。
      ,
      • QUIRK P.G.
      • patchell v.b.
      • 高雅。
      • Levine B.A.
      • 佩里S.V.
      相邻丝氨酸残基的顺序磷酸化对有序磷酸化心肌肌钙蛋白-i结构 - 活性影响的N-末端区域。
      ,
      • Mittmann K.
      • Jaquet K.
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      在心肌肌钙蛋白-i中存在的营养依赖性蛋白激酶的重复最小识别基序的有序磷酸化。
      )。在这些研究中,SER23 首先是磷酸化,然后是Ser22 以〜10倍较慢的速度。波特和同事报告磷酸化动力学的差异(
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      需要在心肌肌钙蛋白中的丝氨酸残基磷酸化来减少CA.2+ 心肌肌钙蛋白C.
      )将含有PKA的丙氨酸取代的小鼠CTNI治疗 体外 和 found that Ser23 比SER更快地磷酸化几倍22。这些作者认为SER23 可能组成型磷酸化,均22 因此,磷酸化可以在功能上更重要。在这里,我们发现SER的组成型磷酸化的有力证据22 rather than for Ser23 在人类ctni。对我们与文献结果的结果进行这种明显的分歧,可以通过我们对完整的人CTNI磷酸化的基础磷酸化状态分析来解释 体内 与以前的人相比 体外 studies (
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      )。此外,必须考虑磷酸酶的作用 体内 设置也可以去磷酸盐胺23 faster than Ser22 such that Ser22 是热力学优选的网站,即使是SER23 是动力学上的。需要研究发生的磷酸水 体内 最近的研究被强调,因为有些人 体外 网站似乎是文物(
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       结论-

      在此直接施加顶部ECD和ETD质谱,用于解开从人心脏组织纯化的磷酸化CTNI的分子复合性。完整CTNI离子的FTMS光谱在CTNI的标称纯样品中显示出高度的异质性(超过30种不同的分子离子)。许多离子被分配给特定的分子物质,并且占该技术提供的高质量准确度和高分辨率的大部分异质性。 CTNI保留不稳定磷素部分的ECD和ETD解离,并允许在人CTNI中可靠地定位基础磷酸化位点。两个主要的基础磷酸化位点以单磷酸化的CTNI为特征,其中一个是广泛研究的PKA位点,而另一个是几乎完全未知和未取消的位点。同时还开发了一种新的方法,用于定量具有不稳定性翻译后修饰的位置异构体。排名第一的女士3 二磷酸化CTNI分析揭示了另一种PKA磷酸化位点,并在这些PKA位点之间建议顺序(或有序)磷酸化/去磷酸化。对CTNI结构的新见解和顶级MS / MS提供的新功能将有助于更深入地了解这一重要人类磷蛋白的生理学和病理生理学。如图所示,以ECD / ETD的顶部下降MS / MS为1)个新型磷酸化位点的发现提供了独特的机会,2)甚至具有不稳定磷酸化的位置异构体的定量,以及3)通过不同激酶/磷酸酶的磷酸化位点之间的相互依赖性探索系统。

      致谢

      我们感谢Fred Mleceerty博士,Michael Senko博士,Joseph Loo博士,斯瓦文角博士,Raquel Solis,Lisa Xu,Tonya第二,Nate Evans,Matt Lawrence和Ka Young Chung,有助于讨论。

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