细胞苷A作为子宫内膜癌的潜在预后因子和治疗靶标的蛋白质组学鉴定

  • 正宇李
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    四川大学西部医院生物治疗妇科和妇产科和国家重点实验室,成都610041
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  • 夏泽
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  • Canhua Huang.
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      子宫内膜癌是女性生殖道中最常见的恶性肿瘤之一,迫切需要发现对子宫内膜癌的预后评估和治疗靶标的新因素。这里,使用二维凝胶电泳和MALDI-Q-TOF MS / MS基蛋白质组学方法,用于鉴定子宫内膜癌中的差异表达蛋白质。在鉴定的99个蛋白质中,Cellophilin A是最显着改变的蛋白质之一,并且使用RT-PCR和Western印迹分析证实其过表达。免疫组织化学建议细胞苷表达和分化差和生存率下降的联系(p <0.01)。 Cyclophilin的敲低通过RNA干扰的表达导致细胞生长的显着抑制和子宫内膜癌HEC-1-B细胞中凋亡的诱导体外 (p <0.01)和抑制肿瘤生长体内 (p <0.01)。这些数据表明,Cellophilin A可以用作新的预后因子,并且可能是子宫内膜癌的有吸引力的治疗靶标。
      子宫内膜癌是女性生殖道中最常见的恶性肿瘤之一,所有阶段都有约80%的5年生存率。每年有超过142,000个新案件在全球范围内发展,估计有42,000名妇女死于这种疾病。子宫内膜癌的发生率在地区之间变化;与发展中国家相比,北美和欧洲国家的10倍(
      • Parkin D.M.
      • Pisani P.
      • Ferlay J.
      全球癌症统计。
      )。最近的研究表明,子宫内膜癌的特征在于多种致病步骤和各种遗传和表观遗传相互作用(
      • Shiozawa T.
      • Konishi I.
      早期子宫内膜癌:临床病理学,荷尔蒙方面,分子遗传学,诊断和治疗。
      ,
      子宫内膜癌中的免疫组织化学肿瘤标志物。
      )。各种遗传分子表征该疾病的起始,发育和结果,包括DNA甲基化(
      • Shih M.C.
      • yeh k.t.
      • 唐k.p.
      • 陈准备。
      • chang J.G.
      甲基化特异性PCR检测的子宫内膜癌症中的启动子甲基化。
      ,
      • Helmle K.E.
      • 奥托C.J.
      • Constantinescu G.
      • 荣誉L.H.
      • 安德鲁S.E.
      子宫内膜亚型亚型的子宫内膜癌中缺乏DNA错配修复的可变MLH1启动剂甲基化模式。
      )改变的p53表达或突变(
      • ragni n。
      • Ferrero S.
      • Prefumo F.
      • Muschiato B.
      • Gorlero F.
      • 金铜棉
      • 富豪E.
      子宫内膜癌中P53表达,阶段和组织学特征的关联。
      ),k-拉斯 (
      • 涂Z.
      • GUI L.
      • 王J.
      • 李X.
      • 太阳P.
      • 魏L.
      雌激素受体上调的人子宫内膜癌K-RAS突变的肿瘤。
      )和braf(
      • Pappa K.I.
      • Choleza M.
      • Markaki S.
      • Giannikaki E.
      • Kyroudi A.
      • Vlachos G.
      • 弗里加斯Z.
      • Anagnou N.P.
      尽管KRAS突变状态,宫颈和子宫内膜癌中的BRAF突变一致的缺乏。
      ,
      • 冯y.z.
      • Shiozawa T.
      • Miyamoto T.
      • 克什米马·
      • Kurai M.
      • 铃木A.
      • Konishi I.
      子宫内膜癌和增生中的BRAF突变:与KRAS和P53突变的相关性和错配修复蛋白表达。
      )。全局基因表达分析已被用于研究与此过程相关的变化(
      • konstantakopoulos n。
      • 蒙哥马利K.G.
      • 张伯伦
      • Quinn M.A.
      • 面包师M.S.
      • 米饭G.E.
      • 乔治罗H.M.
      • 坎贝尔i.g.
      基因因子对人子宫内膜癌细胞生理浓度引起的基因表达的变化。
      ),包括基于DNA微阵列的方法,用于筛选与致癌作用相关的基因(
      • 冈田H.
      • NA. kajima T.
      • Yoshimura T.
      • Yasuda K.
      • Kanzaki H.
      孕激素在体外孕激素控制基因的微阵列分析。
      ,
      • 阿巴米
      • Planaguma J.
      • Gil-Mireno A.
      • Monge M.
      • Gonzalez M.
      • 巴洛T.
      • 加西亚A.
      • Castellvi J.
      • 拉蒙 - y-cajal s.
      • Xercavins J.
      • Alameda F.
      • revEnos J.
      子宫内膜癌的分子病理:子宫内膜瘤中的转录签名。
      )。许多新型标记,如CD171(
      • Fogel M.
      • 哈萨尔姆
      • Altevogt P.
      • 本A.A.
      L1(CD171)作为卵巢和子宫内膜癌的新型生物标志物。
      ),PTEN(
      • Uegaki K.
      • Kanamori Y.
      • Kigawa J.
      • 川口W.
      • Kaneko R.
      • NA. niwa J.
      • Takahashi M.
      • Shimada M.
      • oishi T.
      • Itomochi H.
      • Terakawa N.
      PTEN阳性和磷酸化-AKT阴性表达是先进子宫内膜癌患者的存活率的预测因素。
      )和尿激酶纤溶酶原激活剂受体(
      • Memarzadeh S.
      • Kozak K.r.
      • 常长
      • NA. tarajan S.
      • Shintaku P.
      • reddy s.t.
      • Farias-Eisner R.
      尿激酶纤溶酶原激活因子:用于子宫内膜癌的预后生物标志物。
      )已被记录,并随后用于诊断,预后预测和亚型分类。然而,虽然病例死亡率低于许多种类的恶性肿瘤,但子宫内膜癌患者的预后仍然是穷人,这表明迫切性和持续的需要进一步阐明基于子宫内膜癌的分子机制的进一步阐明。
      最近已经变得显而易见的是,除了更好的知名遗传和表观遗传改变之外,还存在与肿瘤起始和生长中涉及的翻译,翻译后修饰和细胞内的分子变化有关的因素。通过测量RNA的量或通过研究核苷酸序列变异,不能检测这些因素。据认为,蛋白质改变与恶性肿瘤之间的关联通过分析癌症蛋白质组可以比单独的基因组学或转录组织更丰富地(
      • 百素e.f.
      • ZOON K.C.
      • kohn e.c.
      • 巴雷特J.C.
      • Liotta L.A.
      临床蛋白质组学:将台边承诺转化为床边现实。
      )。蛋白质组学方法已经在研究许多类型的癌症的研究中取得了成功,包括脑,肺,肝,胃和结肠癌,并且被认为是适合克服目前阐明分子机制的一些局限性的局限性子宫内膜癌。迄今为止,已经报道了关于子宫内膜癌的少数蛋白质组学研究;但是,一些发现是值得注意的(
      • 杨可生馆
      • 郭杰。
      • Diehl G.
      • desouza l.
      • Rodrigues M.J.
      • Romaschin A.D.
      • Colgan T.J.
      • SiU K.W.
      子宫内膜恶性肿瘤的蛋白质表达谱揭示了一种新的肿瘤标志物:伴侣素10。
      ,
      • Yoshizaki T.
      • Enomoto T.
      • NA. kashima R.
      • Ueda Y.
      • Kanao H.
      • 吉野K.
      • Fukumoto M.
      • Yoneda Y.
      • Buzard G.S.
      • 村田y.
      子宫内膜发生中的改变蛋白质表达。
      ,
      • desouza l.
      • Diehl G.
      • Rodrigues M.J.
      • 郭杰。
      • Romaschin A.D.
      • Colgan T.J.
      • SiU K.W.
      在使用差分标记的标签ITRAQ和CICAT中搜索子宫内膜组织的癌症标记,具有多维液相色谱和串联质谱法。
      )。这些研究报告了略有不同的发现和结论;差异可能是由于患者的种族差异或诸如质谱鉴定特定蛋白质的不同能力等问题。
      本研究的目的是鉴定用于潜在生物标志物或使用2次的分子治疗靶标的新型肿瘤相关分子
      使用的缩写是:2-de,二维;艾因,子​​宫内膜术中瘤形成; PCNA,增殖细胞核抗原; iod,积分光学密度; siRNA,小干扰RNA; ShRNA,短发夹RNA; MTT,3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴; PI,碘化丙锭; TUNEL,末端脱雄核核苷酰亚胺转移酶DUTP乳糜蛋白末端标记; ANOVA,方差分析;割草,分子量搜索;胶囊,钙盐; E-FABP,表皮脂肪酸结合蛋白; EPCAM,上皮细胞粘附分子。
      1使用的缩写是:2-de,二维;艾因,子​​宫内膜术中瘤形成; PCNA,增殖细胞核抗原; iod,积分光学密度; siRNA,小干扰RNA; ShRNA,短发夹RNA; MTT,3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴; PI,碘化丙锭; TUNEL,末端脱雄核核苷酰亚胺转移酶DUTP乳糜蛋白末端标记; ANOVA,方差分析;割草,分子量搜索;胶囊,钙盐; E-FABP,表皮脂肪酸结合蛋白; EPCAM,上皮细胞粘附分子。
      基于蛋白质组学方法。在癌和正常组织之间揭示了100多种差异表达的蛋白质,随后通过MS分析鉴定了99个蛋白质。其中,基于它已经发现在几种癌症中具有致癌性能的事实,进一步表征了细胞环素A,例如,肺癌(
      • Campa M.J.
      • 王米..
      • 霍华德B.
      • Fitzgerald M.C.
      • Patz e.f.
      蛋白质表达分析鉴定巨噬细胞迁移抑制因子和环诊酶A作为非小细胞肺癌中的潜在分子靶标。
      ,
      • 杨H.
      • 陈杰。
      • 杨杰。
      • 乔S.
      • 赵某。
      • yu l.
      细胞环素A在小细胞肺癌中上调并激活ERK1 / 2信号。
      )和胰腺癌(
      • 沉J.
      • 人M.D.
      • 朱茹
      • Abbruzzese J.L.
      • 李德。
      与由二维凝胶电泳和质谱法检测到的胰腺组织和组织相比,胰腺癌腺癌中的蛋白表达曲线与胰腺炎的癌症腺癌和组织相比。
      ,
      • Mikuriya K.
      • Kuramitsu Y.
      • Ryozawa S.
      • 富士岛M.
      • OKA M.
      • 哈曼K.
      • okita K.
      • Sakaida I.
      • NA. kamura K.
      通过二维电泳和液相色谱 - 质谱/质谱法通过蛋白质组学分析所证明的糖癌组织中糖酵母酶的表达。
      )。本研究中提出的数据表明,细胞素A可以是新的预后因子以及子宫内膜癌的临床治疗的潜在治疗靶标。

      实验步骤

       临床标本 -

      新鲜子宫内膜癌和配对相邻的正常组织是从患有子宫内膜癌的患者获得的,在2005年至2006年,在四川大学西部第二医院妇科部门进行手术切除。石蜡包埋的子宫内膜癌标本是从84名患者获得的从1998年至2002年开始的手术切除。根据世界卫生组织1975年建立的标准分配子宫内膜癌的组织细胞化分级,并根据1988年国际妇科和妇产科联合会的建议分配了外科病理分期。石蜡嵌入的子宫内膜中性肿瘤瘤(EIN)标本是从患有子宫切除术的29例患者中获得。从39例正常月经的患者获得石蜡包埋的正常子宫内膜标本,为子宫肌瘤进行子宫切除术。 21例患者在增殖阶段,分泌阶段18例。所有这些样品都是通过经验丰富的妇科医生和妇科外科医生进行,并通过经验丰富的病理学家检查了组织学确认。这些患者的临床病理信息概述显示在 表I..
      表I.所有患者的临床病理特征
      临床病理特征n (%)
      正常的子宫内膜
      平均年龄(范围)43.6±4.2(36-48)
      a 平均年龄(范围)多年。
      增殖阶段21(53.8)
      分泌阶段18(46.2)
      全部的39(100.0)
      艾因
      平均年龄(范围)45.3±5.5(39-52)
      a 平均年龄(范围)多年。
      艾因 I.9(31.0)
      艾因二9(31.0)
      艾因二I11(37.9)
      全部的29(100.0)
      子宫内膜癌
      病理分类
      EndometroIAID腺癌84(100.0)
      平均年龄(范围)47.8±13.3(34-73)
      a 平均年龄(范围)多年。
      <50 years45(53.6)
      ≥50岁39(46.4)
      差异化分级
      差异化31(36.9)
      适度差异化37(44.0)
      差异很差16(19.0)
      手术病理分期
      I(涉及子宫内膜或肌肉层)55(64.5)
      II(涉及宫颈部分)16(19.0)
      III(盆腔淋巴结转移)13(15.5)
      全部的84(100.0)
      a 平均年龄(范围)多年。
      这项研究由四川大学制度伦理委员会批准。在分析之前从所有患者获得知情同意。

       二维电泳和图像分析 -

      将组织研磨成液氮中的粉末,并在裂解缓冲液中裂解(7 m 尿素,2 m 硫脲,4%的乳酪,2米m Tributylphosphine,2米m PMSF,1mg / ml DNase I,0.2mg / ml rnase a)。离心后,用涡旋和孵育,用冷丙酮/三氯乙酸沉淀上清液。将颗粒重新溶解在补水缓冲液中(7 m 尿素,2 m 硫脲,4%的乳酪,2米m Tributylphosphine,0.2%载体两晶))。在Protean IEF系统(Bio-rad)上使用ReadyStrip™IPG条(17厘米,pH 3-10非线性; Bio-rad)进行IEF,直至在被动补液后达到总共80,000V-H.然后将聚焦的条带平衡两次,以使用蛋白II Xi细胞系统(Bio-rad)转移到12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶上。通过Coomassie亮蓝G-250染色可视化凝胶中的蛋白质点。
      使用PDQuest 7.1软件(BIO-RAD)进行图像分析。通过将图像的归一化在图像的标准化之后通过将一个点的强度与总斑点的比率的比率计算并表示为分数强度来自动地量化点强度。那些带有2.5倍的斑点(t 测试, p <选择0.05)或更多的表达强度和高于25%的频率的变化以识别。

       凝胶消化 -

      根据制造商的说明(Promega,Madison,Wi),切除感兴趣的斑点和凝胶消化,并进行了一些修改。简而言之,凝胶斑点是0.2毫升100米的两次m NH4HCO3,在37℃下为45分钟的50%ACN,并在100%ACN中脱水5分钟。然后将斑点在室温下用10μl10μg/ ml胰蛋白酶金(Promega)温育1小时,然后在37℃下覆盖20μl消化缓冲液(40μmm NH4HCO3,10%ACN)。然后除去液体并保存,通过超声处理15分钟,用50μl50%AcN,5%TFA萃取胰蛋白肽两次。然后将所有提取物合并并在室温下以速度vac干燥。使用c脱盐肽18 Ziptips(Millipore,Bedford,MA)并以5μl的70%ACN,0.1%TFA重构。

       质谱分析 -

      将1.5μL肽洗脱液与不锈马尔达靶标的相同体积的α-氰基-4-羟基氨基酸基质混合并允许风干。 MALDI-Q-TOF MS / MS是在水上Q-TOF Premier Mass Spectom谱仪(Waters,曼彻斯特,英国)的水域中进行的。自动扫描速率为1秒,间隙延迟为0.02秒。积分累积直至获得令人满意的信号/噪声比率,从900-3500的范围内获得 m/z。在MS采集后,自动为MS / MS分析选择10个最大强度。胰蛋白酶自溶剂产品和角蛋白衍生的前体离子被自动排除在外。取决于前体的质量,CID的碰撞电压在34和161eV之间变化。来自MS / MS的数据,作为PKL(峰值列表)由蛋白酶键合(版本2.2.5; Waters)获取的文件,并使用搜索算法吉祥物(2.2版;矩阵科学,伦敦,英国)对国家中心进行处理对于生物技术信息,非冗余(NCBINR)蛋白质序列数据库(2007年3月18日发布)。对MS / MS数据进行检索 HOMO SAPIENS. 与参数设定的序列子集如下:酶,胰蛋白酶;允许缺少一个错过的乳化肽;质量耐受,±0.1 da;和MS / MS耐受性,±0.05 da。固定修饰半胱氨酸氨基甲酰化和可变改性的甲硫氨酸氧化。使用的阈值的理由是 p <0.05,表明这些匹配肽的95%置信区间处的鉴定,并且吉祥物评分(基于组合MS和MS / MS光谱)超过66种被认为是统计学意义。仅那些具有超过阈值的具有统计学上显着的离子分数的单独的MS / MS光谱(基于MS / MS数据)被认为是可接受的。为了消除不同名称或登录号的数据库中出现的蛋白质的冗余,该蛋白质成员属于物种 H. Sapiens. 从多个成员蛋白质家庭进一步选择了最高的吉祥物评分。

       RT-PCR-

      PCR产物的引物序列和预期尺寸如下:Cellophilin A,感测5'-Cat GGT CCC CCC CAC CAC CAC CAC和反义5'-标签ATG GAC TTG CCA CCA GTG CCA T-3'( 236 BP); CD147,感测5'-AGC GGT TGG AGG TTG标签G-3'和反义5'-GGG AG AAG ACG CAG GA-3'(311 BP)。使用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA,用以下条件进行RT-PCR:在48℃下逆转录30分钟,在94℃下变性2分钟;然后在94℃下扩增30次循环0.5分钟,在60℃(环托磷宾A)或57℃(CD147)下退火0.5分钟,并在72℃下延伸0.5分钟;然后在72℃下末端伸长步骤10分钟,并且在4℃下最终保持阶段。

       Western Blotting-

      将组织样品在液氮中研磨,并在RIPA裂解缓冲液中裂解(50米m Tris-HCl(pH7.4),0.25%脱氧核酸钠,150米m NaCl,1%Nonidet P-40,100m EDTA, 1 mm NaF, 1 mm Na3vo.4, 1 mm PMSF)。将裂解物进行12%SDS-PAGE,转移到PVDF膜(Millipore),并用兔抗人类环旋蛋白免疫栓塞(Upstate Biotechnology,Charlottesville,Va)。用辣根过氧化物酶 - 缀合的二抗标记墨水并通过化学发光检测来观察。

       免疫组化 -

      根据KIT制造商的说明,该部分由Envision System Horseradish过氧化物酶方法(Dakocytomation Inc.,Carpinteria,CA)染色。使用的特异性抗体包括兔抗人体环旋蛋白A和山羊抗人PCNA(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)。
      具有细胞质细胞质和/或核免疫反应性的癌细胞被认为是阳性细胞。对于每个部分,在×200放大率下检查至少具有保存良好的癌组织的五个代表性场,每个场都计算200个癌细胞。对这些领域采用免疫染色强度或阳性细胞百分比的平均值。如前所述评价免疫抑制甲醛(
      • 冯y.z.
      • Shiozawa T.
      • Miyamoto T.
      • 克什米马·
      • Kurai M.
      • 铃木A.
      • 莹宋J.
      • Konishi I.
      刺猬信号传导分子的过度表达及其参与子宫内膜癌细胞的增殖。
      )有一些轻微的修改。免疫染色强度(A)被分类为缺乏染色(0),温和染色(1),中等染色(2),强染色(3);染色阳性细胞的比例(B)半定形分为四个等级<5%(0),6-25%(1),26-50%(2),51-75%(3),和>75%(4)。测量每个部分的分数为 A × B并且结果定义为阴性( - ,0),弱阳性(+,1-3),阳性(++,4-7),强阳性(+++,8-12)。使用ImagePro-Plus 5.0软件作为整体光密度(IOD)分数也定量免疫染色。评估每个部分的至少五个字段。
      部分经验丰富的病理学家分别检查了部分,没有任何患者临床信息和结果的先验知识。在达成协议之前,通过重新评估和仔细讨论解决了两名评估员之间的任何差异。

       siRNA合成和短发夹RNA(ShRNA)质粒矢量构建 -

      双链siRNA寡核苷酸靶向Cellophilin A(Sense,5'-AAG AGA ACU UCC UCC UCC UCDTDT-3'; Antisense,5'-AGG Aug AAG UC UCA UCU UCU UDTDT-3')在3'-End的DTDT悬垂根据已发表的人细胞环旋蛋白A(GenBank™登录号 nm_021130.)。对应于核苷酸265-283的该序列已被用于先前的研究(
      • 刘S.
      • asparuhova m.
      • Brondani V.
      • Ziekau I.
      • Klimkait T.
      • 舒姆伯利D.
      反义U7 SnRNA和靶向Cellophilin A的抑制HIV-1乘法。
      )被证明是具体的和有效的。糖浆SiRNA核苷酸用作阴性对照,靶向甘油醛-3-磷酸脱氢酶的siRNA核苷酸被用作转染评估的阳性对照。
      根据ShRNA设计原理,Cyclophilin A-shRNA的寡核苷酸序列(意义,5'-GAT CCA AGA TGA GaA CTT CYCTTC AAG ACG AGG ATG AAG TTC TCA TCT TTT TTT CGA CA-3';反义,3' -GTT CTA CTC TTG AAG标签GAA AGT TCT GCT CCT ACT TCA AGA GTA GAA AAA AAA CTG TTC GA-5')设计成对应于核苷酸265-283。 HK序列与任何人类基因没有同源性,用作阴性对照。含有卡那霉素抗性基因的质粒pgenesil-2用BamHI和HindIII线性化,使用T4 DNA连接酶将退火的寡核苷酸模板连接到质粒载体中。化学竞争力的DH5α. 大肠杆菌 转化,通过卡那霉素选择分离阳性转化体并使用标准方法扩增。通过用Sali消化证实含有含嵌刀质粒的鉴定,并提取来自阳性克隆的质粒DNA并进行额外验证。一旦满足要求,就提取了质粒DNA的大规模制备,并命名为Pgenesil-2-环旋蛋白A-shRNA或Pgenesil-2-HK-shRNA。

       细胞培养和转染 -

      人体子宫内膜癌HEC-1-B细胞系(ATCC,Manassas,VA)维持在ROSWELL PARCE纪念学院(RPMI)1640培养基中。将Lipofectamine 2000(Invitrogen)和siRNA分别在无酸性培养基中稀释,然后以2.5:1的比例组合。根据制造商的建议,将组合转染到指定的浓度中的细胞中。

       细胞增殖和细胞凋亡测定 -

      以三份上播种的细胞在各种浓度下用三份转染三份。在37℃温育后,向所示的持续时间孵育,再加入20μlMTT(2mg / ml;σ)再次孵育。然后将MTT格式沉淀物溶于200μLDMSO中,并在595nm波长下测量吸光度。
      对于克隆形成测定,将用siRNA转染的100个计数细胞在6孔板中三份接种,并连续培养14天。用Giemsa染色克隆并在显微镜下计数。具有超过50个细胞的簇被认为是克隆。
      对于流式细胞术分析,在EPIC ELITE ESP流量仪(Beckman Coulter)上分析了PI染色的细胞。用15毫瓦的风冷氩离子激光器在488-nm激发中测量DNA结合的PI荧光。通过Coulter Elite 4.5多运行软件进行细胞周期分布和细胞凋亡谱的分析。
      根据制造商的方向(Promega)进行Tunel染色。然后在荧光显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)下观察细胞,并记录具有鲜绿色荧光染色的核作为TUNEL阳性事件。

       肿瘤异种移植模型和shRNA治疗 -

      四川大学的机构动物护理和治疗委员会批准了本文的所有研究。用HEC-1-B细胞皮下注射健康的女性裸鼠(BALB / C,6-8周,6-8周,无数,有效,18-20g)(5×106/100μLPBS/小鼠)通过右侧。 7天后,当肿瘤直径为约0.6厘米时,小鼠随机分为四组(每组5个)用于肿瘤内注射。该基团如下:1)PBS,100μLPBS; 2)Lipo,Lipofectamine 2000在62.5μg/100μlPBS中; 3)阴性对照,Pgenesil-2-HK-shRNA,25μg/100μlPBS; 4)ShRNA,Pgenesil-2-环旋蛋白A-shRNA,25μg/100μlPBS。每3天进行肿瘤内注射,并根据下式评估肿瘤体积:肿瘤体积(mm3)= 0.52×长度×宽度2。在处死小鼠后24天记录了治疗和重量,食欲和行为的副作用。将解剖的肿瘤固定在中性缓冲福尔马林中并嵌入石蜡中,并用苏木精和曙红染色部分(5μm)以确认组织学。

       数据分析和统计 -

      所有定量数据都被记录为平均值±S.D.两组之间的比较由学生进行 t 测试;通过单向ANOVA进行多个群体的比较,最小差异 t 测试,或邓恩特的 t 测试;通过秩和测试进行两组之间的序数数据比较;序数数据的相关性分析由交叉标签χ执行2 测试。根据Kaplan-Meier方法产生生存曲线,使用对数秩检验进行统计分析。用Cox比例危险模型评估多变量分析。统计显着性被定义为 p < 0.05.

      结果

       子宫内膜癌和正常子宫内膜组织之间的差异表达蛋白质 -

      使用来自八名患者的个体匹配的子宫内膜癌和正常子宫内膜组织进行二维电泳(平均年龄,45.63±3.42岁;范围,41-50岁)。使用PDQuest 7.1软件进行图像分析,并为人类子宫内膜癌和正常子宫内膜组织显示出良好的分辨和可再现的蛋白质谱(图。1A)。用于子宫内膜癌和正常子宫内膜的Coomassie染色,显示出85.6%的匹配速率,平均为782±28和760±33斑点(图。1B)。基于两个标准定义为差异表达蛋白质的统计学意义:1)强度改变>2.5-fold (t 测试, p <0.05)和2)在八双检查中复发超过两次。根据这些标准,使用MALDI-Q-TOF串联质谱法选择并分析112个斑点。鉴定了来自112个斑点的总共99个蛋白质。因为蛋白质的不同同种型可能具有不同的功能(
      • 库克。
      • Schey K.L.
      • Wilcox M.D.
      • 丁斯J.
      • ertling r.
      • 纳尔逊T.
      • KNAPP D.R.
      • Hildebrandt J.D.
      牛脑G蛋白γ亚基加工异质性的蛋白质组学分析。
      ),每个同种型/斑点被认为是我们研究中的单一蛋白质进行分析。其中,大多数(99个蛋白质中的79个蛋白)位于细胞质中,并且大多数据报道,致癌过程中的大多数涉及细胞功能,包括代谢(20%),细胞转化(14%),蛋白质折叠( 12%),翻译和修饰(12%),细胞增殖和细胞凋亡(8%),信号转导(6%),细胞骨架(6%)等(Fig. 1, CD)。列出了21种显着改变的蛋白质,在八对样品中重复超过四次。 表二,它们的表达配置文件显示在 图1E.。为了消除不同加入数下具有多种同种型的蛋白质的冗余,对于那些具有多种同种型的蛋白质,只属于物种的特定同种型 H. Sapiens. 选择了最高的吉祥物得分(
      • 郑X.
      • 洪L.
      • Shi L.
      • 郭杰。
      • 太阳Z.
      • 周J.
      感染性Bursal病毒感染宿主细胞的蛋白质组学分析。
      )。和登录号,序列覆盖率,吉祥物评分和 - 涉及蛋白质的特定同种型的含量。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1子宫内膜癌和正常子宫内膜组织之间的蛋白质分布差异。A,蛋白质谱通过子宫内膜癌与正常子宫内膜组织之间的二维凝胶电泳的比较。平均分别为子宫内膜癌和正常子宫内膜的平均782±28和760±33斑点,匹配速率为85.6%。具有差异表达的三个代表性斑点是指示为 T1, T2, 和 N1. B,N1和T2斑点的裁剪2-de凝胶图像。 N1点下调14.1倍±9.62(t 测试, p <0.01)在子宫内膜癌组织中,T2点上调6.56倍±1.92(t 测试, p <0.01)在子宫内膜癌组织中由PDQuest 2-DE软件量化。 C,99个蛋白质,鉴定由MS鉴定的差异表达是细胞质,核,膜结合或分泌的。 D,蛋白质发现 C 参与新陈代谢(20%),细胞转化(14%),蛋白质折叠(12%),增殖和凋亡(8%),细胞骨架(6%)等功能(40%)。 E,21的表达谱明显改变蛋白质,复发超过四次。这 上部 显示14个蛋白质在子宫内膜癌中调节,和 下部 显示七种下调的蛋白质。使用PDQuest 2-DE软件从斑点的强度量化每个点体积;将值记录为平均值±S.D. N,正常的子宫内膜; C,子宫内膜癌。
      表二21的数据表征差异表达蛋白质重复≥4次样品中的≥4次
      蛋白质描述
      a 对于几种蛋白质,在同一个体中鉴定了一些同种型。
      加入否。
      b 加入号码来自NCBINR数据库。
      理论分子量(KDA)/ PI序列覆盖范围查询匹配迈克斯分数平均比率(C / N)
      c 子宫内膜癌之间的斑点强度的比例 相对 正常子宫内膜(C / N)或正常子宫内膜 相对 使用PDQuest 2-DE软件量化子宫内膜癌(N / C)。
      p value
      %
      在子宫内膜癌中调节
      过洛昔洛辛-4(PRX-IV)(硫氧化辛过氧化物酶)np_006397.30.75 / 5.86.18417024.950.006
      突变体德芬AAL93205.53.53 / 5.21258408143.330.007
      Cellophilin A.np_066953.18.23 / 7.6836413927.230.014
      Stathmin 1(磷蛋白p19)NP_00555417.29 / 5.761831303.820.005
      谷胱甘肽 S - 转移酶p,链a1AQV_A23.45 / 5.2212418329.380.012
      钙霉素np_004049.21.07 / 4.743773053.660.014
      含缬氨酸的蛋白质(过渡内质网ATPase)np_009057.89.95 / 5.14536418.210.007
      PEBP-1(磷脂酰乙醇胺结合蛋白1,前列腺结合蛋白)np_002558.21.12 / 7.0127515634.410.005
      β-半乳糖糖苷结合凝集素np_002296.15.05 / 5.341962853.480.023
      表皮脂肪酸结合蛋白np_001435.15.50 / 6.602231316.560.003
      三糖 - 磷酸异构酶1np_000356.26.94 / 6.4532728613.470.007
      亮氨酸氨基肽酶(Cytosol氨基肽酶)AAD17527.56.41 / 7.5813714111.580.003
      锰 - 超氧化物歧化酶(MN-SOD)CAA4206624.89 / 8.352451456.380.006
      前梯度蛋白2同源物NP_00639920.02 / 9.031237033.370.05
      在子宫内膜癌中调
      热休克蛋白(27 kda)AAA6217522.31 / 7.833252039.110.005
      拼接因子,精氨酸/丝氨酸7NP_00102685427.58 / 11.83103736.410.046
      果子蛋白样囊蛋白(巨噬细胞封蛋白)NP_00173838.76 / 5.821441357.510.009
      纤维蛋白原β链Aai07767.56.56 / 8.549516220.670.013
      异质核核糖核蛋白H1np_00551149.48 / 5.89.10412920.950.004
      转铁素np_00105479.28 / 6.8164646.80.003
      NADH脱氢酶黄酮蛋白2NP_066552.27.63 / 5.2228514814.10.042
      a 对于几种蛋白质,在同一个体中鉴定了一些同种型。
      b 加入号码来自NCBINR数据库。
      c 子宫内膜癌之间的斑点强度的比例 相对 正常子宫内膜(C / N)或正常子宫内膜 相对 使用PDQuest 2-DE软件量化子宫内膜癌(N / C)。
      Cellophilin A.被发现表明癌和正常组织之间表达中最显着的差异之一(p = 0.014)。与正常子宫内膜组织相比,其在子宫内膜癌中上调超过27倍,MS / MS分析显示出四种匹配的肽,序列覆盖率36%和139分为139 Fig. 2.
      图缩略图GR2.
      Fig. 2Cellophilin A的裁剪2-de凝胶图像。 上调27.23倍±9.52(t 测试, p <在子宫内膜癌组织中看到了0.01)。 MS / MS分析显示了四种匹配的肽,36%的序列覆盖率和139分的剪裁分数。 N,正常的子宫内膜; C,子宫内膜癌; N'C',三维视图表示 N 或者 C. ex,实验; Calc.,计算。数据表示为平均值±S.D.

       细胞膜癌细胞苷A的过度表达 -

      为了确认在子宫内膜癌中的Cellophilin A的改变表达,进行了验证实验,以通过RT-PCR分析比较其转录物。在癌和正常组织(癌组织,90.15±17.04;正常组织,36.2±5.09;学生 t 测试, p <0.01)。使用抗环托素抗体进行进一步的Western印迹分析,在检查的所有癌组织中观察到环诊室A的过表达(癌组织,62.45±2.75;正常组织,24.45±2.05;学生的 t 测试, p < 0.01) (Fig. 3)。我们的数据一起证明了细胞素A在mRNA和蛋白质水平的子宫内膜癌组织中过表达;这与2-DE分析中的观察结果一致。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3细胞素对子宫内膜组织中的过表达的确认。 RT-PCR表示2.49倍(t 测试, p < 0.01) (A)蛋白质印迹表示2.55倍(t 测试, p < 0.01) (B)对子宫内膜癌的环托素A的上调,用量一体的软件量化。 C,子宫内膜癌; N,正常的子宫内膜; M,DNA标记; Cypa.,Cyclophilin A; GAPDH.,甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

       细胞苷A的过度表达与差的分化和预后 -

      为了进一步研究细胞膜癌中环托宾A的致癌性质,并评估其潜在的诊断和治疗价值,通过检查链烷烃嵌入式组织中的表达模式进行免疫组织化学(图4A)。细胞环素A的定位对癌细胞的细胞质和核的核心揭示了癌细胞对细胞素A的过表达负责,并且这不会归因于周围基质中的炎症反应。在39个正常样本中,在23%(39个)中没有检测到染色,在77%(39个中)中检测到弱阳性染色,并且没有检测到阳性或强烈阳性染色。在29例eIn标本中,在10%(29个中)没有检测到染色,在72%(21个中)中检测到弱阳性染色,并在17%(29个中的5个)中检测阳性染色。在52个癌样品中,检测到9.6%(52个中的52个)中检测到弱阳性染色,在44.2%(52个中)中检测到阳性染色,并在46.2%(52个中的24%中)检测强阳性染色。如图所示 表III,在正常子宫内膜,EIN和子宫内​​膜癌样本中观察到染色强度和阳性细胞的显着差异(等级和测试, p <0.01)。为了消除半定量评分的潜在偏见,我们进一步评估了计算机辅助系统染色的IOD。正常子宫内膜,艾因和癌样品的定量IOD分数分别为5.991±1.515,11.955±2.299和34.028±6.91,这也表明普通子宫内膜,艾因和癌组织之间的免疫反应性显着差异(一个 - 方式Anova, p < 0.05).
      图缩略图GR4.
      Fig. 4细胞膜癌组织中细胞苷表达的免疫组织化学分析。A,对Cyclophilin A染色显示正常子宫内膜和癌组织之间的显着差异(等级和测试, p <0.01),并且对细胞素A的过表达可能存在于差的分化(交叉标签χ2 测试, p < 0.01). a,正常子宫内膜,阴性阴性阴性,核中弱阳性; b,分化的子宫内膜癌,适度阳性; c,适度差异化,强烈阳性; d,差异不良,强烈呈阳性。 广告',代表部分的扩大 广告. B,Kaplan-Meier曲线和统计显示Cellophilin A表达与存活率下降之间的相关性(对数级测试, p < 0.05). H&E,苏木精和曙红。
      表III子宫内膜癌的相关性临床特征对Cyclophilin的免疫反应性:Cellophilin在正常子宫内膜,EIN和子宫内​​膜癌中的免疫反应性
      案件++++++
      a 排名和测试, p < 0.01.
      总得分平均分
      b 单向Anova, p < 0.05.
      IOD得分
      b 单向Anova, p < 0.05.
      N3923%(9/39)77%(30/39)00441.13±0.765.991±1.515.
      E2910%(3/29)72%(21/29)17%(5/29)0692.38±1.35.11.955±2.299
      C5209.6%(5/52)44.2%(23/52)46.2%(24/52)3556.83±2.4834.028±6.91.
      a 排名和测试, p < 0.01.
      b 单向Anova, p < 0.05.
      在标准的组织模块化标准之后(由1975年的世界卫生组织建立),52个癌样品(平均年龄,49.4±7.3岁;范围,37-65岁),20次分化,20次均均匀,12个是差异很差; 40在阶段I,八是在II阶段,四是根据外科病理分期标准(由1988年国际妇科和妇产科联合会建立的第三阶段)。显示了通过免疫染色临床特征对细胞素A的过表达的相关性 表III.V。 Cellophilin A的过度表达显示出明显更可能存在于差的分化(交叉标签χ2 测试, p < 0.01) (表IV.),但在本研究中没有观察到外科病理分期的明显关系(交叉标签χ2 测试, p > 0.05) (表V.)。
      表V.子宫内膜癌的相关性临床特征对细胞素的免疫反应性:手术病理分期对胞环磷脂的免疫反应性
      宿舍案件++++++
      a 交叉标签χ2 测试, p > 0.05.
      总得分平均分
      b 方差分析, p > 0.05.
      I40010%(4/40)42.5%(17/40)47.5%(19/40)2746.85±2.56.
      II8012.5%(1/8)50%(4/8)37.5%(3/8)536.63±2.77
      III4002/42/4287.00±1.15
      a 交叉标签χ2 测试, p > 0.05.
      b 方差分析, p > 0.05.
      表IV.子宫内膜癌的相关性临床特征对Cyclophilin的免疫反应性:Cellophilin具有免疫反应性的组成细胞膜
      差异化案件++++++
      a 交叉标签χ2 测试, p < 0.01.
      总得分平均分
      b 最不重要的差异 t 测试, p < 0.01 (well 相对 适度且差别不佳), p > 0.05 (moderately 相对 差异很差)。
      出色地20015%(3/20)75%(15/20)10%(2/20)1045.2±1.61.
      适度的2005%(1/20)30%(6/20)65%(13/20)1487.4±2.41
      不好1208.3%(1/12)16.7%(2/12)75%(9/12)1038.58±2.71.
      a 交叉标签χ2 测试, p < 0.01.
      b 最不重要的差异 t 测试, p < 0.01 (well 相对 适度且差别不佳), p > 0.05 (moderately 相对 差异很差)。
      84个癌病例的存活分析(31,37和16,分别适度,适度,差异不良; 55,16和13分别用于阶段I,II和III;平均年龄,47.8±13.3岁;范围,34-73岁),细胞苷A的免疫反应性在25例患者中弱阳性,33例患者中度阳性,26例患者强烈呈阳性。根据Kaplan-Meier方法产生的存活曲线,使用对数秩检验的生存分析表明,环托胺A的免疫反应性更可能与子宫内膜癌患者的差(LOG-RAND测试, p < 0.05; 图4B.)。对于弱阳性,阳性和强烈染色样品,5年的生存率为92,82和72%。为了确定Cellophilin的预后值是否与与子宫内膜癌的临床结果相关的其他风险因素无关,使用COX比例危害模型进行多变量分析。检查的风险变量包括Cellophilin一种免疫反应性(弱/中度 相对 强烈阳性),患者年龄(<50 相对 ≥50岁),组成细胞化(井/中度) 相对 差异不良))和手术病理分期(阶段I / II 相对 III)。通常已知这些因素可显着影响子宫内膜癌的结果。 Cellophilin免疫反应性在子宫内膜癌患者的存活率中独立统计学意义(p < 0.05).

       抑制细胞素的降低细胞增殖 -

      转染后72小时观察到细胞素A-siRNA转染细胞中的细胞素表达的显着抑制。 RT-PCR测定显示,在mRNA水平下,Cellophilin A表达减少了60.3%,蛋白质印迹测定显示其表达减少84.9%。通过同时转染糖浆的siRNA,观察到对Cyclophilin的表观抑制表达。
      使用MTT和克隆原因测定检查转染细胞的增殖活性。 MTT结果表明,在剂量和持续时间依赖的方式中,通过环孔A-siRNA抑制增殖活性,转染后,增殖比减少到对照值72小时的47.8%(图5A)。在克隆基形成测定中,在14天的连续培养物中,克隆数分别在未处理的对照,Lipofectamine 2000和阴性对照组中分别为76±4.6,67.3±4.5和64±4。同时,Cellophilin A-siRNA组中的克隆数为23.7±3.1,抑制率为68.8%(Dunnett t 测试, p < 0.01; 图5B.)。我们的数据证实了细胞内癌中细胞苷A的致癌性能,并且siRNA的细胞素A的抑制可能导致HEC-1-B细胞的增殖显着降低。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5细胞素A的抑制与细胞增殖抑制和凋亡诱导相关 体外.A,MTT数据显示通过剂量和持续时间依赖的方式通过细胞素A-siRNA抑制细胞生长,并在转染后72小时降低增殖比至47.8%。 B,克隆基形成测定表明,克隆数为76±4.6(a),67.3±4.5(b),64±4(c)和23.7±3.1(d)在未经处理的控制中(a),Lipofectamine 2000(b),阴性对照(c)和细胞环素a-siRNA(d分别的群体。 siRNA组的抑制比为68.8%(Dunnett t 测试, p < 0.01). C,流式细胞术分析表明,子层峰值以时间依赖的方式增加(Dunnett的 t 测试, p < 0.01). DTunel测定表明,与未处理的Lipofectamine(Lipo.)或阴性对照组(所示 A-F.;邓恩特的 t 测试, p < 0.01). NC.,负面控制。数据表示为±S.D.

       抑制细胞素A诱导细胞凋亡和g1 Arrest—

      肿瘤生长通常被认为是增殖和细胞凋亡之间的平衡。流式细胞术分析表明,转染细胞中的子样脂峰以时间依赖性方式增加,分别在转染后24,48和72小时达到25.4,36.9和45.7%的凋亡/ pi阳性百分比,而分别在未处理和阴性对照组中仅达到4%和7.8%(Dunnett的 t 测试, p < 0.01) (图5C.)。对于细胞周期分布,环托酚素A-siRNA的转染导致G中的细胞群增强0/G1 相位伴随着时间依赖的方式降低。 g增加了16.5%0/G1 转染后72小时,在72小时观察到S相的降低15.3%。
      作为子g1 通过流式细胞术测量的值代表来自细胞凋亡和坏死的细胞,应用了更特异性的调节来验证Cyclophilin A-siRNA诱导的细胞凋亡。通过标记游离3'-OH末端并观察到通过荧光显微镜观察,表明细胞凋亡,并被记录为TUNEL阳性核,观察到DNA链中断的细胞核。如图所示 图5D,以剂量依赖的方式在细胞苷素A-siRNA转染细胞中观察到TUNEL阳性核的显着增加(Dunnett t 测试, p <0.01)与对照组相比:35.2±4.3%(100nm),22.6±4.4%(50nm)和17.5±3.0%(12.5nm) 相对 3.2±1.3%(未处理对照),7.2±2.3%(Lipofectamine 2000)和9.6±2.7%(阴性对照)。这些数据表明,siRNA的Cellophilin的抑制可能导致HEC-1-B细胞和G的显着凋亡诱导0/G1 逮捕细胞周期分布 体外.

       抑制细胞素A抑制肿瘤异种移植生长的体内 -

      通过免疫组织化学分析,抗链环蛋白A抗体的免疫组化分析导致抗环化学小鼠中的细胞内小鼠中的细胞素A超过70%抑制了70%抑制。为了控制质粒载体或脂质体的非特异性效应,用脂质切除胺2000或PGENESIL-2-HK-shRNA处理的小鼠在相对于PBS注射液相同的细胞苷表达中没有差异。
      在治疗持续时间期间每3天测量肿瘤体积,直到处死动物,在此期间没有观察到动物死亡或可能毒性的迹象。虽然所有小鼠的肿瘤在初始体积中大致相等,但在治疗过程中观察到肿瘤生长的显着差异,如肿瘤生长曲线所示 图6A。在治疗过程中,所有肿瘤体积增加,但与PGENESIL-2-环旋蛋白A-shRNA治疗的小鼠中的肿瘤分别与PBS,脂质体或PGENESIL-2-HK-SHRNA治疗的分别相比,呈现的生长速率显着更小。此外,在Pgenesil-2-环旋蛋白A-shRNA处理18天后观察到肿瘤体积的降低。在实验终止时,三组肿瘤体积达到603.64±59.68,563.16±61.87和534.17±61.73 mm 3 对于PBS,LIPO或Pgenesil-2-HK-shRNA(方差分析, p >0.05)。相比之下,用Pgenesil-2-环托氨酸A-shRNA小鼠肿瘤体积为159.56±43.33mm3,平均比用PBS处理的对照组小73%(学生 t 测试, p <0.01)。这些数据表明,Cellophilin通过shRNA抑制可以显着降低肿瘤生长 体内 并且在这种剂量上没有明显的毒性。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6抑制细胞素A与肿瘤异种移植生长相关 体内.A,肿瘤体积生长曲线在肿瘤内注射细胞素A-shRNA。 24天,Pgenesil-2-环旋蛋白A-shRNA(d)与对照组PBS相比,治疗导致肿瘤生长显着降低(a),Lipo(b)或pgenesil-2-hk-shrna(c)(Dunnett的 t 测试, p < 0.01). B,所示的量化值是在×200放大率的五个随机场中计算的PCNA或TUNEL阳性核的平均百分比。 C,通过PCNA免疫反应性评估Pgenesil-2-环托氨酸A-shRNA注射的显着抑制细胞增殖,并且认为核染色是阳性的;由TUNEL测定和核来评估显着的促进细胞凋亡 鲜绿色 荧光染色被认为是积极的(Dunnett的 t 测试, p < 0.01). Cypa.,Cyclophilin A; NC.,负面控制。数据表示为平均值±S.D.

       抑制细胞苷的细胞增殖降低,体内凋亡增加

      显而易见的是,Cellophilin抑制细胞增殖和诱导的细胞凋亡 体外。获得额外的洞察力 体内 通过PCNA免疫反应性分析和TUNEL测定评估效果,肿瘤细胞增殖和细胞凋亡。如图所示 图6B.,三组PCNA阳性核的百分比分别达到89.4±6.42,81.6±7.09,81.6±9.73,分别用于PBS,LIPO或Pgenesil-2-HK-shRNA,而Pgenesil-2-环旋蛋白A的相应值-ShRNA集团仅达到39.0±11.13;这平均超过PBS对照的价值超过56%(学生 t 测试, p <0.01)。在标记的对比中,在Tunel测定中以评估细胞凋亡 体内,Pgenesil-2-环托胺A-shRNA处理的肿瘤显示出比用PBS,Lipo或Pgenesil-2-HK-shRNA处理的肿瘤的肿瘤显着更大百分比(29.2±7.62 相对 6.6±2.70,8.2±2.86,或11.6±4.39;邓恩特的 t 测试, p <0.01)。此外,对对照组PBS,Lipo或Pgenesil-2-HK-shRNA(方差分析,术后没有对增殖或细胞凋亡的显着影响 p >0.05)。因此,Cellophilin抑制ShRNA可以显着抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡 体内.

      讨论

      子宫内膜癌仍然是女性中死亡的主要原因之一,因此对其诊断,预后和治疗的新型分子靶点的发现有可能改善这种疾病的临床策略和结果。在本研究中,我们将子宫内膜癌与基于MS / MS / MS的方法与匹配正常子宫内膜之间的全球蛋白质谱进行比较。这种方法没有关于已知或未知分子的假设,允许该过程与任何预先假设的假设无关。鉴定了总共99种差异表达的蛋白质,其中大部分涉及生物过程,包括代谢,细胞转化,蛋白质折叠,细胞增殖和细胞凋亡,以及细胞骨骼,通常在恶性肿瘤的开始和发育中起重要作用。一些鉴定的蛋白质在理论上不同 Mr 由于翻译后修改的结果,并且其中一些在2-de凝胶上迁移为具有反对变化的多个斑点。例如,在鉴定的五个斑点中,三个被上调,两个在癌组织中下调。这表明在致癌过程中不同的同种型可能具有不同的功能,因此每种同种型/斑点被认为是我们研究中的分析的不同蛋白质。仅适用于同种型变化的蛋白质,可以确定其整体水平。
      癌症与正常组织之间的蛋白质谱的这种比较产生了有趣和可解释的结果。然而,已知生物标志物具有显着改变诊断和治疗的选择和策略,因此将我们的蛋白质组学观察转化为临床应用,因此需要进行诊断和治疗的选项和策略,因此需要进行核制性分析的复杂过程。进一步选择99个蛋白质中的99个蛋白质,作为参与癌相关方法的候选物,包括硫昔林过氧化物酶,突变体Desmin,Cellophilin A,Stathmin 1,谷胱甘肽 S - 转移酶P,钙氨酸(盖子),PEBP-1,表皮脂肪酸结合蛋白(E-FABP),三糖 - 磷酸异构酶1,热休克蛋白27,转移素等。E-Fabp被增加6.56-用三个匹配的肽,22%序列覆盖率折叠癌,造成22%的分数为131.涉及影响分化,增长调节和基因表达的细胞信号传导(
      • Das R.
      • Hammamieh R.
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      • 捷径
      人正常和手机前列腺细胞和组织中脂肪酸结合蛋白的表达模式。
      )。它被鉴定为相对于原发性乳腺癌的节点转移中调节的cDNA(
      • mooq-lutz c.
      • 大甲基
      • Regnier C.H.
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      • 马特里M.G.
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      • 巴塞特P.
      牛皮制素(S100A7)和S100C基因在乳腺癌中的比较表达和人染色体1Q21-Q22的共定位。
      )在食管鳞状细胞癌中(
      • 吉杰。
      • 赵L.
      • 王X.
      • 周C.
      • 丁F.
      • 苏L.
      • 张C.
      • 毛X.
      • 吴米
      • 刘Z.
      S100基因家族在人食管鳞状细胞癌中的差异表达。
      )。蛋白质组学分析表明在较差的膀胱癌中降低了E-FABP(
      • Ostergaard M.
      • 拉斯穆森H.H.
      • Nielsen H.V.
      • vorum h.
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      膀胱鳞状细胞癌的蛋白质组分析:鉴定定义其分化程度的标记。
      )。最近E-FABP被证明是C-MYC的主要目标,其被EPCAM诱导(
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      • 着陆器E.S.
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      • golub r.t.
      用寡核苷酸微阵列的表达分析表明,Myc调节参与生长,细胞周期,信号传导和粘附的基因。
      )。 EPCAM表达后C-MYC和E-FABP诱导的动力学表明EPCAM通过转录因子C-MYC诱导E-FARP(
      • Munz M.
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      • Gires O.
      肿瘤相关的抗原EPCAM上调脂肪酸结合蛋白E-FABP。
      )。因此,E-FABP可能被鉴定为EPCAM的靶标,导致致癌和转移期间的细胞变化。
      显示盖子在癌症中增加3.66倍,具有七种匹配的肽,37%的序列覆盖率,并且蜂鸣评分为305.它是刺激后营养依赖性蛋白激酶的主要磷酸化基质的钙结合蛋白质甲状腺细胞通过甲状腺素(
      • Lecocq R.
      • 拉米F.
      • Erneux C.
      • Dumont J.E.
      快速净化和鉴定钙霉素,A CA2+ - 用蛋白激酶A磷酸化粘合蛋白。
      )。由于其以营养依赖性方式磷酸化,因此认为将这些级联之间的交叉信号涉及,以坐标细胞增殖和分化(
      • 克莱特S.
      • Dumont J.E.
      • Schurmans S.
      小鼠和其他啮齿动物中钙氨基基因表达的丧失。
      )。在最近的蛋白质组学分析中,与神经分区肿瘤相比,发现盖子在EnenCymomas中过表达(
      • 德·杰奇
      • Den Boer M.L.
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      蛋白微血分析鉴定儿科原语神经分区肿瘤和外膜瘤瘤的鉴定。
      )。虽然帽的确切功能仍然被阐明,但其在营地信号传导和细胞增殖和分化中的活动表明它可能参与致癌作用的一个重要方面。
      在本研究中,基于几种选择标准,细胞环素A还表征为子宫内膜癌的潜在预后生物标志物和治疗靶标。 (a)据报道,主要是参与子宫内膜发生癌。 (b)它显示正常和癌组织之间最显着的变化之一。 (c)通过质谱法可靠地识别。 (d)它显示出癌组织中普遍存在的过表达(不包括对罕见亚型特异性的效果的可能性,并且表明这可能是常见的改变)。
      2-DE分析显示,子宫内膜癌的细胞素A的表达显着高于正常子宫内膜组织,并通过RT-PCR和Western印迹分析进一步证实其改变。作为免疫蛋白家族的成员,Cyclophilin A是一种具有多种功能的18kDa蛋白。它是一种肽基 - 脯氨酰顺式 - 反式异构酶和蛋白质折叠中的重要组分。最初被认为是细胞内呈现,但已发现响应炎症刺激的细胞分泌(
      • 金紫色。
      • Melaragno M.G.
      • Liao D.F.
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      Cellophilin A.是通过氧化应激引起的分泌的生长因子。
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      体内肿瘤分泌物的质谱蛋白质组学谱:呼后肿瘤毛细血管超滤采样。
      )。许多研究侧重于其在蛋白质折叠,免疫应答和人类免疫缺陷病毒中的作用,1型感染(
      • 赌博T.R.
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      • 商品价D.K.
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      人细胞环旋蛋白的晶体结构与HIV-1衣壳的氨基末端结构域结合。
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      Cellophilin A络合着HIV-1 GAG蛋白的片段:洞察HIV-1传染性活动。
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      人类免疫缺陷病毒1型颗粒成熟不需要掺入掺入,并且不会破坏成熟的衣壳。
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      从早期的HLA-B57介导的细胞毒性T淋巴细胞压力逃离和补偿人免疫缺陷病毒1型GAG改变衣壳相互作用与细胞素A相互作用。
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      细胞素A至Fv1的融合使得人和猫培养的免疫缺陷病毒具有环孢菌素敏感的限制。
      )并证明其是环孢菌素A的细胞内受体。环托素A-环孢菌素A复合物可以抑制T淋巴细胞和其他细胞中活性T细胞的钙素活性和核迁移核因子(
      • 淮琦
      • 金H.Y.
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      • Mondragon A.
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      Calcineurin-Cyclophilin-Cyclosporin的晶体结构显示出对免疫蛋白 - 药物复合物的常见而明显识别。
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      人钙素的晶体结构与细胞环素A和人细胞环素复合。
      )。
      由于在子宫内膜癌中经常观察到细胞环素A的过度表达,进行研究以检查环托蛋白表达,组织细胞化/手术病理分期和存活率之间是否存在任何相关性,这将表示作为预后的生物标志物的潜在有用性或子宫内膜癌的其他侵略性。我们的研究结果表明,细胞素A的过度表达更容易存在低分化,并且存活分析还表明其过表达与减少的存活率相关。研究结果表明,测定细胞苷表达预后预测的潜在价值,以及用于子宫内膜癌的临床治疗的可能生物标志物。与先前在肺癌的研究一致(
      • 霍华德B.A.
      • 郑Z.
      • Campa M.J.
      • 王米..
      • Shama A.
      • 哈拉E.
      • Herndon II,J.E.
      • Fitzgerald M.C.
      • 嵌送器G.
      • Patz e.f.
      将生物标志物转化为临床实践:在非小细胞肺癌中蛋白表达型蛋白表达谱中鉴定的细胞苷A和巨噬细胞移植抑制因子的预后意义。
      ),在Cellophilin A和手术病理分期表达之间没有观察到显着的相关性,并且这可能部分是由于样品不足的统计显着性。醒目的是,这项研究中的几乎所有癌样品都具有广泛的阶段,通常显示对细胞素A的中度或强烈阳性染色,强烈表明细胞素过表达可能参与致癌过程中的过程,但不在晚期入侵或转移中。另外,考虑到细胞膜A中的细胞素A中的表达,它可能在用作潜在的分子治疗靶标中具有一些值。
      最近的研究表明,在几种癌细胞中表达了Cellophilin A表达,并且它可能在凋亡激活和凋亡诱导因子的参与中发挥凋亡中的作用。为了支持这一点,在肺癌中已经观察到细胞素过表达(
      • Campa M.J.
      • 王米..
      • 霍华德B.
      • Fitzgerald M.C.
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      蛋白质表达分析鉴定巨噬细胞迁移抑制因子和环诊酶A作为非小细胞肺癌中的潜在分子靶标。
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      • 杨H.
      • 陈杰。
      • 杨杰。
      • 乔S.
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      细胞环素A在小细胞肺癌中上调并激活ERK1 / 2信号。
      ), 胰腺癌 (
      • 沉J.
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      • 朱茹
      • Abbruzzese J.L.
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      与由二维凝胶电泳和质谱法检测到的胰腺组织和组织相比,胰腺癌腺癌中的蛋白表达曲线与胰腺炎的癌症腺癌和组织相比。
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      • Mikuriya K.
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      • NA. kamura K.
      通过二维电泳和液相色谱 - 质谱/质谱法通过蛋白质组学分析所证明的糖癌组织中糖酵母酶的表达。
      ),肝细胞癌(
      • LIM S.O.
      • 公园S.J.
      • 金W.
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      • j
      肝细胞癌蛋白质组分析。
      )和颊鳞状细胞癌(
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      • 他Q.Y.
      • Yuen A.P.
      • Chiu J.f.
      颊鳞状细胞癌的蛋白质组学:多种途径在肿瘤发生中的参与。
      )通过蛋白质组学方法。还发现一种类似于Cyclophilin A的新细胞素,也发现与膀胱癌,肝癌和乳腺癌过度表达的转移涉及转移(
      • Meza-Zepeda L.A.
      • Forus A.
      • Lygren B.
      • 达尔伯格A.B.
      • Godager L.H.
      • 南A.P.
      • Marenholz I.
      • Lioumi M.
      • Florenes v.a.
      • 玛兰伊娃省
      • 塞拉米
      • 误码D.
      • nizetic D.
      • Ragoussis J.
      • Tarkkanen M.
      • 涅斯兰省。
      • Knuutila s。
      • myklebost O.
      定位克隆在1Q21中识别新的环旋蛋白作为候选扩增的癌基因。
      )。该研究是第一次鉴定细胞膜癌中的过表达,其在致癌物中的确切作用需要进一步调查。
      以前的报道表明,抑制环托肽A. 体内 导致肺癌生长抑制和细胞增殖抑制(
      • 霍华德B.A.
      • Furumai R.
      • Campa M.J.
      • Rabbani Z.N.
      • Vujaskovic Z.
      • 王X.F.
      • Patz e.f.
      稳定的RNA干扰介导的细胞苷A的抑制减少了体内非小细胞肺肿瘤生长。
      )和外源环旋蛋白通过与CD147的相互作用和细胞外信号调节激酶ERK1 / 2和P38丝裂剂活化蛋白激酶(MAPK)的激活来促进癌细胞生长。
      • 杨H.
      • 陈杰。
      • 杨杰。
      • 乔S.
      • 赵某。
      • yu l.
      细胞环素A在小细胞肺癌中上调并激活ERK1 / 2信号。
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      • 李米
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      • Bharadwaj U.
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      • 费舍尔W.E.
      • 陈C.
      • 姚Q.
      Cellophilin A在人胰腺癌细胞中过表达,并通过CD147刺激细胞增殖。
      )。与这些结果一致,我们的数据也表明,Cellophilin的抑制引起了细胞增殖的显着抑制 体外 通过MTT和克隆原形成测定来测量。相比之下,最近的研究报告说,在各种癌细胞中的转染子和敲除样品之间没有观察到细胞增殖的差异(
      • Choi K.J.
      • Piao Y.J.
      • Lim M.J.
      • kim j.h.
      • 哈杰。
      • 选择W.
      • 金斯。
      癌细胞中过表心式的环旋蛋白A呈对缺氧和顺铂诱导的细胞死亡的抗性。
      ),小鼠胚胎干细胞中环托肽A的丧失对细胞生长或活力没有影响(
      • Colgan J.
      • Asmal M.
      • 鲁班J.
      小鼠PPIA的分离,表征和靶向破坏:Cellophilin A对哺乳动物细胞活力不是必需的。
      )。关于Cellophilin A对细胞增殖的涉及的差异可以基于细胞类型特异性差异或实验方法和条件。
      凋亡抑制被认为是肿瘤生长至关重要,因此对凋亡诱导的敏感性增加被认为是临床治疗的有希望的策略。流式细胞术分析和TUNEL测定证明,Cellophilin抑制诱导子宫内膜癌细胞的显着细胞凋亡,伴随着G.1 逮捕细胞周期。与我们的结果一致,另一份报告显示抑制环托胺A. 体内 导致肺癌细胞凋亡诱导,其肺癌细胞可能与Bcl-2途径无关(
      • 霍华德B.A.
      • Furumai R.
      • Campa M.J.
      • Rabbani Z.N.
      • Vujaskovic Z.
      • 王X.F.
      • Patz e.f.
      稳定的RNA干扰介导的细胞苷A的抑制减少了体内非小细胞肺肿瘤生长。
      )。虽然在动脉粥样硬化的背景下,有几项研究表明,Cellophilin A促进血管平滑肌细胞生长和内皮细胞凋亡,与凋亡相关的染色体溶解中的凋亡诱导因子合作(
      • 铃木J.
      • 金紫色。
      • Meoli D.F.
      • Matoba T.
      • Berk B.C.
      细胞环素A由血管平滑肌细胞中的凹凸途径分泌。
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      • lungu a.o.
      • 谢L.
      • 王米
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      • Berk B.C.
      细胞环素A是激活内皮细胞的促炎细胞因子。
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      • CANDE C.
      • Vahsen N.
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      • 施密特E.
      • Daugas E.
      • SPAHR C.
      • 鲁班J.
      • kroemer r.t.
      • Giordanetto F.
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      • Penninger J.M.
      • kroemer g.
      AIF和Cellophilin A合作在凋亡相关的染色体溶解中。
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      • 朱克
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      • Deinum J.
      • 黄Z.
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      • modjtahedi n.
      • Neagu M.R.
      • Nilsson M.
      • eriksson p.s.
      • Hagberg H.
      • 鲁班J.
      • kroemer g.
      • Blomgren K.
      Cellophilin A参与脑缺氧缺血后神经元细胞凋亡诱导因子的核转移。
      )。关于细胞素A对细胞凋亡的影响的癌症和正常细胞之间的差异仍有进一步阐明。
      本数据清楚地表明抑制细胞素A抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡 体外。获得额外的洞察力 体内 效果,我们观察了细胞素A抑制对肿瘤异种移植模型的影响。值得注意的是,与获得的结果一致 体外,抑制细胞苷a 体内 被证明导致肿瘤生长减少,伴随着抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。该发现代表了Cellophilin A的显着活性的第一报告 体外体内 针对人的子宫内膜癌。此外,在此期间观察到没有毛尺度的变化,例如减肥,喂养,行为或其他可能副作用的迹象 体内 治疗期,表明细胞环素通过RNA干扰抑制似乎是安全的,并且在使用的剂量中至少是可检测的毒性。因此,存在对细胞素A是针对子宫内膜癌的有前途的新疗法的明确指示。此外,RNA干扰治疗在临床中可能更有效地与化疗组合,这也为我们提供了一种有吸引力的进一步调查方法。
      血管生成也是血管生成对肿瘤生长至关重要,并且可以通过增加的内皮细胞存活和活化来增强。最近的研究表明,Cellophilin A可以诱导细胞外信号调节激酶,C-Jun NH 2-Terminal激酶和p38激酶活化(
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      细胞环素A是激活内皮细胞的促炎细胞因子。
      )增加人脐静脉内皮细胞增殖,迁移,侵入能力和小管发生(
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      )。相比之下,其他研究报道了血管生成和环诊酶之间的相关性使用RNA干扰的敲低,通过CD31染色和微血管密度测量(
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      稳定的RNA干扰介导的细胞苷A的抑制减少了体内非小细胞肺肿瘤生长。
      )。显然,应进行进一步的研究,以阐明Cellophilin A在血管生成中的确切作用。
      最近的报道还表明,环孔A的上调可以使化学治疗诱导的癌细胞中的凋亡造成抗性(
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