使用可溶性聚合物基同位素标记的蛇毒液的定量分析*

  • 雅各布A. Galan.
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    生物化学,化学,药用化学和分子药理学,普渡大学,西拉斐特,印第安纳州47907
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  • Minjie Guo.
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    生物化学,化学,药用化学和分子药理学,普渡大学,西拉斐特,印第安纳州47907
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  • Elda E. Sanchez.
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    德克萨斯州德克萨斯州艺术学院的天然毒素研究中心&米大学 - 金斯维尔,金斯维尔,德克萨斯州78363
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  • Esteban Cantu.
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    德克萨斯州德克萨斯州艺术学院的天然毒素研究中心&米大学 - 金斯维尔,金斯维尔,德克萨斯州78363
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  • Alexis Rodriguez-Acosta
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    免疫化学段,热带医学研究所,委内瑞拉大学,委内瑞拉,加拉加斯州1041,委内瑞拉
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  • John C. Perez.
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    德克萨斯州德克萨斯州艺术学院的天然毒素研究中心&米大学 - 金斯维尔,金斯维尔,德克萨斯州78363
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  • W. Andy Tao.
    一致
    应该解决对应的通信。电话:765-494-9605.
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    生物化学,化学,药用化学和分子药理学,普渡大学,西拉斐特,印第安纳州47907
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  • 作者脚注
    *这项工作是由普渡大学,美国质谱协会的支持,以及国家科学基金会职业发展奖(W. A.T.)。在德克萨斯州的天然毒素研究中心的补助金也支持这项工作&米大学 - 金斯维尔(国家卫生大学(NIH)/国家研究资源中心授予1 P40 RR018300-01,NIH /研究基础设施少数民族机构授予5 PMD000216-02,NIH /支持持续研究卓越奖项5 S06 GM008107 -29)和Fondo Nacional de Ciencia,Tecnologia E Innovacion Grant G-2005000400。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
    本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)含有补充材料。
      我们介绍了一种新的定量策略称为可溶性聚合物基同位素标记(SOPIL)的设计和合成及其作为一种新颖的,包括复合蛇毒液中单个蛋白质的新的和包容性方法。 Sopil试剂选择性地捕获并分离含半胱氨酸的肽,并且随后的标记肽被释放并使用纳米氟液相色谱 - 串联质谱法进行分析。 Sopil策略用于量化来自两对毒蛇的毒液蛋白:克罗塔卢 sculatus scululatus.键入a,C. Scutulatus scululatus.B型,克罗塔卢 oreganus helleri, 和两者都是 Colombiensis.。测量粗静脉的出血,溶血,凝血能力和纤维素溶解活性,并与SOPIL分析确定的蛋白质丰度的差异相关。 SOPIL方法可以为定量蛋白质组学提供有效和广泛适用的工具。
      高通量分析中蛋白质的鉴定和准确定量是生物标志物发现和研究蜂窝功能和过程的蛋白质组学策略的基本组分(
      • Aeberberold R.
      定量蛋白质组分析:方法和应用。
      ,
      • ong s.e.
      • 福斯特L.J.
      基于质量的定量蛋白质组学的谱系方法。
      )。虽然测量mRNA表达的技术更为成立,但差异蛋白表达的测量提供了一种更直接,准确和多功能的方式,以检测健康和疾病中细胞动态的全球变化(
      • Duggan D.J.
      • Bittner M.
      • 陈Y.
      • Meltzer P.
      • 特伦特星期三。
      使用cDNA微阵列表达分析。
      )。在过去几年中,已经引入并彻底地研究了许多定量技术和策略。传统和经常使用的方法来研究来自不同来源的样品之间大规模的差异蛋白质丰度是由二维(2D)分开的蛋白质的染色
      使用的缩写是:2D,二维; SOPIL,可溶性聚合物基同位素标记; Pamam,聚酰胺胺; pl2,磷脂酶A.2; MHD,最小的出血剂(最小蛋白质量会导致10毫米出血点); DMF, N,N - 二甲基甲酰胺; TCEP,TRIS(羧乙基)膦; Acth,肾上腺皮质激素; SCX,强阳离子交换; TPP,Trans-Proteomic管道; MT,Mojave Toxin; HT,出血性毒素;凸轮毒素,肌毒素被隔离 克罗塔卢 adamanteus venom.
      1使用的缩写是:2D,二维; SOPIL,可溶性聚合物基同位素标记; Pamam,聚酰胺胺; pl2,磷脂酶A.2; MHD,最小的出血剂(最小蛋白质量会导致10毫米出血点); DMF, N,N - 二甲基甲酰胺; TCEP,TRIS(羧乙基)膦; Acth,肾上腺皮质激素; SCX,强阳离子交换; TPP,Trans-Proteomic管道; MT,Mojave Toxin; HT,出血性毒素;凸轮毒素,肌毒素被隔离 克罗塔卢 adamanteus venom.
      页。该方法的再现性差异,无法检测低丰度和疏水性蛋白质(
      • Gygi S.P.
      • Corthals G.L.
      • 张Y.
      • Rochon Y.
      • Aeberberold R.
      二维凝胶电泳的蛋白质组分析技术评价。
      )。最近,已经研究了最近的无标签方法,主要基于LC和高精度质谱仪(
      • 老为
      • Meyer-Arendt K.
      • Aveline-Wolf L.
      • 皮尔斯K.G.
      • 门多萨A.
      • 七夹J.R.
      • resing K.A.
      • ahn n.g.
      霰弹枪蛋白质组学定量人体蛋白质的无标记方法的比较。
      ,
      • 李X.J.
      • yi e.c.
      • Kemp C.J.
      • 张H.
      • Aeberberold R.
      一种软件套件,用于生成和比较来自液相色谱 - 质谱法收集的数据组的肽阵列。
      )。然而,这些方法严重依赖于数据处理的计算软件。
      稳定的同位素标记仍然是定量蛋白质组学的最流行的方法。稳定同位素的引入通常由(i)蛋白质或肽的化学衍生化进行, 例如 via the ICAT (
      • Gygi S.P.
      • rist b.
      • 格柏S.A.
      • Turecek F.
      • 凝胶M.H.
      • Aeberberold R.
      使用同位素编码亲和标记的复合蛋白混合物的定量分析。
      ),具有相对和绝对定量(ITRAQ)的阻碍标记(
      • 罗斯P.L.
      • 黄玉。
      • Marchese J.N.
      • 威廉姆斯B.
      • 帕克克。
      • 哈桑斯。
      • Khainovski N.
      • Pillai S.
      • 丹尼尔斯S.
      • Purkayastha S.
      • Juhasz P.
      • 马丁斯。
      • Bartlet-Jones M.
      • 雅各布森A.
      • Pappin D.J.
      使用胺 - 反应性的异常标记试剂在酿酒酵母中的多重蛋白质定量。
      )和同位素编码的蛋白质标记(
      • 施密特A.
      • Kellermann J.
      • Lottspeich F.
      同位素编码蛋白标记的定量蛋白质组学的一种新策略。
      ) 方法; (ii)酶催化标记, 例如 重水中的蛋白水解包含 18o进入新生成的羧基末端羧基(
      • Stewart i.i.
      • 汤姆森T.
      • FIGEYS D.
      18o标签:蛋白质组学的工具。
      ); (iii)代谢标记方法将同位素标记的氨基酸残基掺入蛋白质中(使用细胞培养物(Silac)中的氨基酸稳定同位素标记)(
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • ong s.e.
      • 尼尔森M.
      • 福斯特L.J.
      阐明应用于EGF信号传导的功能蛋白质 - 蛋白质相互作用的蛋白质组学策略。
      )。 ICAT可能是最好的描述化学方法。多年来,ICAT的两种优缺点都得到了认可。已经尝试使用ICAT的几种变化和修改,使其更加实用和更简单,例如酸性可切割的ICAT试剂(
      • 李杰。
      • 斯丁H.
      • Gygi S.P.
      用可切割同位素编码的亲和标签(CICAT)试剂的蛋白质分析:酵母盐度应力反应。
      )和基于固相的版本(
      • 周H.
      • ranish j.a.
      • 瓦特J.D.
      • Aeberberold R.
      通过固相同位素标记和质谱法进行定量蛋白质组分析。
      )。固相捕获和释放过程的适应性是显着的改进,该方法消除了额外的净化步骤,具有自动化和高通量实验的可能性。与ICAT方法的并排比较表明,用于稳定同位素标记的肽的固相方法比较更简单,更有效,更敏感。然而,固相萃取的最值得注意的缺点是可以表现出非线性动力学行为,不等的分布和/或获得化学反应的异质反应条件,以及溶剂化问题。蛋白质组学研究的固相反应的异质性质对样品回收和鉴定具有严重问题,这通常会在极其复杂的混合物中处理少量蛋白质和肽。
      我们试图通过引入新的定量策略和试剂,称为可溶性聚合物基同位素标记(SOPIL)来解决这个问题。新试剂基于可溶性纳米聚合物如树枝状聚合物。树枝状大分子是一类超支化合成聚合物。它们由内核周围的一系列分支构建,它们提供不同的代和提供有趣的应用程序(
      • van heerbeek r.
      • 卡姆斯P.C.
      • van leeuwen p.w.
      • Reek J.N.
      树枝状大分子作为可回收催化剂和试剂的支持。
      )。树枝状大分子是正宗的纳米粒子,尺寸在2-10nm的范围内。树枝状大分子具有极其明显的级联图案,具有许多特性,使它们在组合化学和生物系统中有用。许多树枝状聚合物类型已被用作受体 - 配体相互作用的药物载体,用于赋予生物腐蚀性的药物载体,以及膜渗透性和靶向的药物载体,并且已被广泛使用作为疫苗抗原的载体(
      • van heerbeek r.
      • 卡姆斯P.C.
      • van leeuwen p.w.
      • Reek J.N.
      树枝状大分子作为可回收催化剂和试剂的支持。
      )。我们首次介绍了蛋白质组学研究的树枝状体,蛋白质磷酸化分析(
      • 陶w.a.
      • Wollscheid B.
      • 奥布里恩R.
      • ENG J.
      • 李X.
      • Bodenmiller B.
      • 瓦特J.
      • 引擎盖L.
      • Aeberberold R.
      使用树突缀合化学和质谱法进行定量磷脂体分析。
      ),但在定量蛋白质组学中的施用树枝状像蛋白和潜在的 体内 蛋白质组学,仍处于早期发展(
      • 郭米
      • 加兰J.
      • 陶w.a.
      一种基于可溶性纳米聚合物的新型定量蛋白质组学试剂。
      )。 Dendrimers的新应用程序为蛋白质组学研究开辟了令人兴奋的地区,将为目前可用的定量技术提供简单有效的替代品。
      蛇毒液含有复杂的分泌蛋白质的混合物,属于许多不同类别,如神经毒素,κ毒素,心脏毒素,肌毒素,血管和解毒剂(
      • Farsky S.H.
      • Antunes E.
      • Mello S.B.
      来自动物毒液的毒素的亲和力和抗炎特性。
      )。这些相同的蛋白质导致组织损伤和创伤时的动物或人类均呈现,也具有医学和药理学的重要性。许多药物来自蛇毒液。例如,来自马来山坑Viper的毒液的Ancrod是一种纤维蛋白原酶,用于治疗心肌梗塞后患者(
      • 沼泽N.
      • 威廉姆斯五。
      蛇毒液毒素在血肿中的实际应用。
      ); Aggrastat(Tirofiban),首先从锯鳞片Viper的毒液中分离出来,具有抗血小板和抗癌性质(
      • 沼泽N.
      • 威廉姆斯五。
      蛇毒液毒素在血肿中的实际应用。
      )。许多北美和南美响尾蛇毒液具有丰富的这些医学相关蛋白质来源,新的蛋白质及其活动正在稳步上表征。
      蛇毒中最丰富的蛋白质之一是出血性毒素。蛇毒液出血性毒素是金属蛋白酶,其特征在于结构域,例如亚类PI,P-II,p-III和P-IV,其单独与金属蛋白酶均具有与金属蛋白酶相似的结构相似或类似于脱蜡或C-的结构域类型凝集素(
      • Bjarnason J.B.
      • 狐狸J.W.
      来自蛇毒液的出血金属蛋白酶。
      ,
      • 巴雷特A.J.
      • 麦当劳J.K.
      命名法:蛋白酶,蛋白酶和肽酶。
      ,
      • wolfsberg t.g.
      • 白金。
      施肥和发展中的亚当斯。
      )。这些是含锌金属蛋白酶,其特征在于,其中一些蛋白酶结构域具有另外的解毒域或其中一些中的C型凝集素结构域。它们通过降解毛细血管内皮细胞下面的基底膜的组分蛋白来起作用。毒素也作用于这些细胞引起裂解,导致出血。已经发现一些这些毒素施加额外的效果,例如促进出血的纤维糖(基因)裂解和血小板聚集(
      • Bjarnason J.B.
      • 狐狸J.W.
      来自蛇毒液的出血金属蛋白酶。
      )。
      蛇毒液中的另一类高度丰富的蛋白质是磷脂酶a2 (PLA2S),这是viperidae / crotalalae毒液中的主要组成部分。 pl2 酶是120个残基或两至五种互补多肽的混合物的单链多肽(
      • 哈里斯J.B.
      蛇毒液中的磷脂酶及其对神经和肌肉的影响。
      )。这些同工酶催化磷脂的水解成游离脂肪酸和溶溶脂。 pl2S显示各种神经毒性,心脏毒性,肌毒性,溶血,痉挛,抗凝剂,抗血小板,水肿诱导和组织破坏效果(
      • kini r.m.
      丝氨酸蛋白酶影响蛇毒液的血液凝固和纤维蛋白溶解。
      )。
      解吲哚是另一类具有活性和保守的分子类别(RGD或“RGD样”)序列结构同源,其位于发夹环周围(
      • 麦克朗M.A.
      • Sanchez E.E.
      • 黄A.
      • paquette-straub c。
      • Perez J.C.
      解胶。
      )。含RGD的解压缩显示朝向称为整联蛋白的细胞表面受体的差异结合。 Disintegrins可以有其他活跃的三合会图案(例如 KGD,MLD和WGD)将整联蛋白结合和抑制不同程度,并且可以在细胞对基质或细胞对细胞抑制中发挥作用(
      • Ruoslahti E.
      RGD和Integrins的其他识别序列。
      )。整联蛋白的抑制可以导致影响细胞迁移或脂肪发生,血管生成和其他生物事件的改变的信号转导途径(
      • ritter m.r.
      • 周问
      • Markland Jr.,F.S.
      Contortrostatin,蛇毒Disinteglin,诱导CAS和FAK在肿瘤细胞中的αvβ3介导的酪氨酸磷酸化。
      ,
      • 林Y.T.
      • 唐C.H.
      • 庄W.J.
      • 王三。
      • 黄T.F.
      • 福明。
      RGD依赖性脱丁蛋白抑制脂肪生成。
      ,
      • 周问
      • Nakada M.T.
      • 阿诺德C.
      • shieh k.y.
      • Markland Jr.,F.S.
      Contortrostatin,Agkistrodon Contortrix Contortrix的二聚体解体素,抑制血管生成。
      )。
      在许多种类的毒蛇中发现了解毒毒素和其他蛇毒液蛋白;然而,它们在毒液中的丰度因蛇而异。蛇毒毒液中的内部和三分之一的变化使许多不同的有趣毒素的独特生物来源,但这些变化也是无效抗静电的原因。在Mohave Rattlesnake中发生rattlesnake毒液中的内部内部变异的最引人注目的例子之一。 克罗塔卢 sculatus scululatus. (
      • 格伦J.L.
      • 直接R.C.
      • Wolfe M.C.
      • HARDY D.L.
      Geographical variation in Crotalus sculatus scululatus. (Mojave rattlesnake) venom properties.
      ,
      • 格伦J.L.
      • 直接R.C.
      Intergradation of two different venom populations of the Mojave rattlesnake (Crotalus sculatus scululatus.) in Arizona.
      ,
      • Sanchez E.E.
      • 加兰J.A.
      • 鲍威尔r.l.
      • 雷耶斯S.R.
      • SOTO J.G.
      • 罗素W.K.
      • 罗素D.H.
      • Perez J.C.
      Disintegrin, hemorrhagic, and proteolytic activities of Mohave rattlesnake, Crotalus sculatus scululatus. venoms lacking Mojave toxin.
      )。
      蛋白质组学方法的毒液分析,如HPLC或2D凝胶电泳与质谱相结合,增加了蛇毒液蛋白质组中蛋白质的鉴定(
      • 施密特A.
      • Kellermann J.
      • Lottspeich F.
      同位素编码蛋白标记的定量蛋白质组学的一种新策略。
      ,
      • 狐狸J.W.
      • 纳尔逊K.
      • 谢尔曼N.E.
      • Serrano S.M.
      离子阱和傅里叶变换离子回旋谐振质谱法的间接和直接方法进行探索Viperid Venom蛋白质蛋白质的比较。
      ,
      • Sanz L.
      • 吉布斯H.L.
      • Mackessy S.P.
      • Calvete J.J.
      毒液蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质与发散的饮食密切相关的Sistrurus响尾蛇。
      ,
      • Birrell G.W.
      • 伯爵S.T.
      • 瓦斯塔普。
      • Masci P.P.
      • De Jersey J.
      • Gorman J.J.
      • Lavin M.F.
      澳大利亚蛇毒液中生物活性蛋白的多样性。
      ,
      • Bandeira N.
      • 克劳瑟K.R.
      • PEVZNER P.A.
      霰弹枪蛋白测序:从改性蛋白质的混合物中组装肽串联质谱。
      )。 Calvete和Co-Workers(
      • Sanz L.
      • 吉布斯H.L.
      • Mackessy S.P.
      • Calvete J.J.
      毒液蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质与发散的饮食密切相关的Sistrurus响尾蛇。
      )分析了三个亚种的毒液 Sistrurus catenatus. (S. catenatus catenatus, S. catenatus tergeminus., 和S. Catenatus Edwardsii.) 和 Sistrurus Miliarius Barbouri. 通过离线反相HPLC,氨基末端测序,MALDI-TOF和CID-MS / MS。他们观察到患有不同饮食的密切相关物种的毒液组成的差异。彪沙 等等。 (
      • Birrell G.W.
      • 伯爵S.T.
      • 瓦斯塔普。
      • Masci P.P.
      • De Jersey J.
      • Gorman J.J.
      • Lavin M.F.
      澳大利亚蛇毒液中生物活性蛋白的多样性。
      )研究了来自这些蛇种类的18种的毒液蛋白的多样性,并且通过2D页分离毒液蛋白质组分并使用质谱法鉴定 德诺维 肽测序。这两种方法证明了对比较毒液分析的可能性。迄今为止,关于不同物种存在的蛇毒液蛋白的相对丰富或具有不同地质起源的相同物种知之甚少。利用稳定的同位素标记将为蛇毒液变异提供更详细和可理解的分析。
      本研究的目的是描述和表征新的定量蛋白质组学策略Sopil及其应用,以检查来自同一种类的毒液 C. Scutulatus scululatus. (类型A和B)并检查来自两个地理上无关的蛇的毒液 克罗塔卢 oreganus helleri两者都是 Colombiensis. (分别来自北美和南美洲)。含半胱氨酸的肽被有效地分离,同位素标记,并通过二维微毛细管LC串联质谱法分析,用于鉴定和相对定量。

      实验步骤

       Sopil试剂的合成

      除非另有说明,否则化学品购自Sigma-Aldrich。

       (3,5-二甲氧基-4-苯基氨基甲基苯氧基)丁酸的合成(2) -

      4-(4-甲酰基-3,5-二甲氧基苯氧基)丁酸(1)(Novabiochem)(268mg,1.0mmol)溶解在10ml DMF和MeOH(1:4,V / V)中,并与苯胺(250mg,2.5mmol)和HOAC(75μl,1.25mmol)混合,然后进行添加纳米3CN(120mg,2mmol)。反应在室温下进行2小时,2毫升H.2加入o,然后通过真空蒸发,然后用EtOAc萃取产物,并通过快速色谱法纯化,得到NMR纯产物4-(3,5-二甲氧基-4-苯基氨基甲基苯氧基)丁酸(2)(260 mg,75%)。 1H NMR(CDCL3,300 MHz):δ7.17(t, J = 7.5Hz,2小时),6.75(D, J = 7.5 Hz,2小时),6.80(T, J = 7.5Hz,1小时,6.10(S,2 H),4.27(S,2 H),4.00(T, J = 6.0 Hz,2小时),3.80(S,6 H),2.58(T, J = 7.2Hz,2小时),2.14-2.04(m,2 h)。

       合成4-(4 - {[(2-溴乙酰基)苯基氨基]甲基} -3,5-二甲氧基苯氧基)丁酸(3) -

      溴乙酰氯(ALFA AESAR)(50μL,0.6mmol)在0.5ml无水四氢呋喃和0.6ml 1的0.6ml n 将NaOH滴加到化合物的四氢呋喃溶液中 2 (174mg,0.5mmol)在0°C。在该温度下继续反应30分钟。然后用1中和反应混合物 n HCl在0°C。用EtOAc萃取产物,并通过快速色谱法纯化,得到NMR纯产物4-(4 - {[(2-溴乙酰基)苯基氨基]甲基} -3,5-二甲氧基苯氧基)丁酸(3)(175毫克,75%)。 1H NMR(CDCL3300 MHz):δ7.26-7.21(m,3 h),6.98-6.97(m,2 h),5.92(s,2 h),4.97(s,2 h),3.96(t, J = 6Hz,2小时),3.61(S,2 H),3.59(S,6 H),2.58(T, J = 7.5Hz,2小时,2.11-2.05(m,2 h)。通过使用[的相同方式沉重的同位素形式。13C6]苯胺。

       Sopil试剂的合成 -

      Pamam Dendrimer生成4.0(28mg,2μmol)溶解在200毫升200米中m MES(pH = 5.8),然后在200μLDMF中添加4-型尿酸(1.6mg,16μmol,6摄氏,6摄氏度), N - 羟基琥珀酸酐(20mg,15米m)和1- [3-(二甲基氨基)丙基] -3-乙基氨基酰亚胺HCl(200mg,200米m)。将溶液在室温下搅拌12小时。在水中密集透析后,将溶液通过超滤至1mL浓缩,并分成一半以进一步与化合物反应 3 和沉重的形式, 13C6 - 标记的化合物 3, 分别。上面制备的亚烷烃官能化G4-PAMAM(1μmol)溶于2mL 200米中m MES(pH = 5.8)。然后化合物 3, 任何一个 12C6- 或者 13C6 - 标记的(9.2mg,20μmol),将2ml DMF加入上述溶液中,然后加入 N - 羟基琥珀酸酐(10mg,15米m)和1- [3-(二甲基氨基)丙基] -3-乙基氨基酰亚胺HCl(100mg,100米m)。在室温下在黑暗中继续反应12小时。在水中密集透析后,将溶液通过超滤至600μL浓缩,直接用于标记实验。

       合成叠氮珠

      1-氨基-11-Azido-3,6,9-三官氧合(4)在文献中报告(
      • Schwabacher A.W.
      • Lane J.W.
      • Schiaseher M.W.
      • Leigh K.M.
      • 约翰逊C.W.
      去对称反应:有效制备不对称取代的连接分子。
      )。氨基丙基控孔玻璃珠(200毫克,NH2:将〜400μmol/ g)与琥珀酸酐(80mg,0.8mmol)混合在400μldmf和200μl吡啶中。使反应在室温下进行过夜,并广泛洗涤珠子。 1-氨基-11-Azido-3,6,9-三官氧合(4)(109mg,500μmol)在500μldMF中加入珠子中,然后加入1-羟基苯并三唑(63mg,500μmol)和二异丙基碳二亚胺(80μl,500μmol)。使反应在室温下进行过夜,并在真空中广泛洗涤珠子并干燥。

       合成Cys特异性固相珠粒

      氨基丙基控孔玻璃珠(100mg,NH2:用无水DMF预制400μmol/ g。 1-羟基苯并三唑(25mg,200μmol)在100μldmf,化合物 3 (92mg,200μmol)在600μldmf中,依次向珠子中加入二异丙基碳二亚胺(64μl,400μmol)以进行过夜反应。然后用DMF和二氯甲烷顺序洗涤珠子,然后在减压下干燥,并在黑暗中储存在室温下。

       使用Sopil试剂和直接固相方法产生捕获含半胱氨酸肽和酸切割反应的捕获的测定

      使用由100pmol的含半胱氨酸层蛋白B(序列,Cdpgyigsr)和20pmol含有血管紧张素(序列,DRVyiHPF)组成的肽混合物。用5米降低肽m Tris(羧乙基)膦(TCEP)在100μl0.1中 m 三(ph 8.0)和5米m EDTA在室温下10分钟。接下来的10个nmol 12C6 Sopil试剂或7毫克Cys特异性固相 13C6 在恒定搅拌下平行使用珠粒以捕获总体积为100μl的肽。从反应混合物中从反应混合物中和反应期间的不同时间点,从反应混合物中抽出1μL上清液的等分试样。孵育1小时后,通过加入2μl200μl淬灭反应m DTT 5分钟。对于与SOPIL试剂的反应,加入10mg含有2.5米的400μl溶液的总体积的叠氮珠m TCEP, 2.5 mm CuSO4,0.25米m 三(三唑基)胺30分钟。将两个珠子合并并连续洗涤1 m NaCl, H2O,80%乙腈两次。将100微升水90%TFA加入到珠子中并孵育1小时。通过过滤收集释放的肽,并用80%乙腈洗涤珠子两次。将洗脱液合并并在真空下干燥MS分析。使用MALDI-TOF / TOF质谱仪(ABI 4700,Applied Biosystems,Foster City,CA)在MS模式下在MS模式下获得质谱。使用200-kV加速电压的正反射器模式下的200 Hz固态激光进行测量。对于每个MS频谱,一个1000激光镜头 m/z 800-3000的窗口是使用Data Explorer 4.2版(应用生物系统)软件累计的。使用包括参考肽血管紧张素I,ACTH,BRADYKININ和纤维蛋白肽的SIGMA校准试剂盒实现了质量校准。对于样品制备,将0.3μl等分试样在靶标中发现并混合1:1,其中包含80%乙腈,0.1%TFA和7mg / mlα-氰基-4-羟基氨基酸酸。

       毒液系列

      个人Mohave响尾蛇(C. Scutulatus scululatus.)分别在Culberson县,德克萨斯州,亚利桑那州的Culberson县(Avid 011-032-076和011-064-358)类型。南太平洋响尾蛇(Avid 011-032-076)是从圣贝纳迪诺县南加州收集的。这些蛇目前在德克萨斯州的天然毒素研究中心安置 &M University-Kingsville,德克萨斯州金斯维尔。这 B. Colombiensis. 目前在委内瑞拉加拉加斯州洛尼德·威尼斯大学,委内瑞拉举办了苏里科大学,举行了委内瑞拉。通过允许蛇咬进入在一次性塑料杯上伸展的parafilm中,在它们相应的位置中提取来自每个蛇的毒液。将每个毒液样品离心(500× g 10分钟),在正压下通过0.45μm过滤器过滤,并在-90℃下冷冻直至冻干。

       毒液制备

      制备50mg / mL蛇毒液溶液的50微升,使用8变性 m 尿素,减少5米m TCEP在37°C时30分钟。然后用200米稀释样品中的尿素4次m 三,pH 8.5。加入20微克序列级胰蛋白酶(Promega)并在37℃下孵育16小时。然后将样品干燥至100μL。

       同位素标记和含半胱氨酸肽的分离

      将每种样品的40微升消化的肽混合物用30nmol的Sopil试剂标记。来自Mohave A型和南太平洋响尾蛇的毒液肽被标记使用 12C6 Sopil和来自Mohave型B和Mapanare的毒液肽被标记为 13C6 Sopil 2小时。然后20μl200米m 将DTT加入每个混合物中以终止在树枝状聚合物表面上的过量溴乙酰基。然后将两个混合物(Mohave类型A和B; Southern Pacific和Mapanare)混合在一起,然后加入130μLH2o,50μl20米m Tris(三唑基)胺,20μl50米m CuSO4 在最终体积为400μl和tcep,cuso4, 和tris(triazolyl)amine concentration of 2.5, 2.5, and 0.25 mm, 分别。然后将混合物在室温下用5mg叠氮化物珠孵育1小时。用50米洗涤珠子 m TRIS,1 m NaCl, H2o和80%乙腈分别三次。将珠子与100μl90%TFA一起温育1小时。使用过滤收集释放的肽,并用80%乙腈洗涤珠子两次。合并洗脱并用离心速度蒸发液干燥。

       Nanoflow LC-MS / MS分析

      该分析是对连接到LTQ线性离子阱质谱仪(Thermofisher,San Jose,CA)的Agilent 1100纳米洛(Agilent Technologies,Wilmington,DE)进行分析。将干燥的肽以16μl01%的甲酸重构,并用二维液相色谱法(SCX和C)在纳米射线系统上引入18 反向阶段)。使用Agilent SCX(Zormax®,3.5μm,35×0.3mm,Agilent Technologies)柱进行强阳离子交换色谱(一维)。使用的缓冲剂是0.1%甲酸,含有10个不同摩尔浓度的20,40,60,80,100,150,200,300,500和1000米的洗脱缓冲液m 醋酸铵。 C.18 使用填充5μmc的掺入掺入薄膜(50-cm×75mm)的毛细管柱(新目的)进行反相LC(2D)18 Magic®珠子(Michrom Bioresources,Inc .; 75-μm内径和12厘米的床长)。用激光拉拔器(型号P-2000,Sutter仪器有限公司)产生电喷雾电离发射器尖端。质谱仪以数据依赖模式操作,其中全扫描MS随后是10个最丰富离子的MS / MS扫描,其中10个+ 2至+3充电状态。大规模排除时间为180秒。

       数据分析

      使用开源转换蛋白质组学管道(TPP)软件(2.9.4版)将MS / MS数据转换为MZXML格式,并使用MEDSTING的MZXML文件对瑞士蛋白质数据库(带146,720条目的43.0版)进行搜索SORCERER™集成数据设备(IDA)服务器上的续集™算法(软件版本2.5.6; Sagen,Inc.,San Jose,CA)。肽质量耐受设定为3.0 AMU,软件内部设定MS / MS耐受性,值从0到1 AMU变化。搜索标准包括133Da(半胱氨酸大量的半胱氨酸类Plus Light Sopil试剂标签)的半胱氨酸残基的静态改性和用于半胱氨酸的6Da的可变改性(用于重型SOPIL试剂标签)和甲硫氨酸氧化(16DA)。用半晶体消化进行搜索,并允许从序列数据库分析的肽上最多两种错过的切割。用TPP软件进行蛋白质鉴定和定量的验证。 TPP软件包括肽概率得分程序,Peptipeprocet(
      • 凯勒阿。
      • nesvizhskii a.i.
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      经验统计模型来估计MS / MS和数据库搜索的肽识别的准确性。
      ),如果肽在几种同种型中共用,则肽在分配肽MS谱和蛋白质反应程序中分配肽或蛋白质家族的蛋白质反应程序(
      • nesvizhskii a.i.
      • 凯勒阿。
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      用串联质谱法鉴定蛋白质的统计模型。
      )。因为蛇基因组尚未测序并且蛇毒在含半胱氨酸区域中具有高序列同源性,所以许多肽属于多种蛋白质。蛋白质分子(
      • nesvizhskii a.i.
      • 凯勒阿。
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      用串联质谱法鉴定蛋白质的统计模型。
      通过对所有鉴定的肽进行分组并调整相应的概率得分,部分解决了问题。然而,基于当前对蛇毒的知识仍然存在相当长的含糊不清的病例,因此肽被分配给多种蛋白质鉴定(补充表S1-S4)。 Peptipeproclecet程序使用各种续集分数(例如 Xcorr)和许多其他参数来计算每个鉴定的肽的概率得分。 PeptipeprocleT允许过滤大规模数据集,评估可预测敏感性和假阳性率。对于所有接受的Sopil试剂标记的肽鉴定和蛋白质分配(估计的假率为0.9的概率分数为0.9的蛋白质分配,肽前药物和蛋白质不义阈值使用AsaPratio软件进行分析肽量化(
      • 李X.
      • 张H.
      • ranish j.a.
      • Aeberberold R.
      通过稳定同位素稀释和串联质谱法产生的蛋白质丰度差异的自动统计分析。
      ),其从Sopil试剂标记的峰重建离子色谱图,并进行肽丰度比的自动统计分析。 ASAPratio程序通过求解所有离子强度来重建原始单离子色谱图 m/z 覆盖肽的前三个理论同位素峰的范围和肽的色谱洗脱期。然后,它适用Savitzky-Golay平滑过滤方法以获得平滑的色谱图。肽洗脱峰与来自平滑的色谱图的相应峰值中心和峰宽度鉴定(
      • 李X.
      • 张H.
      • ranish j.a.
      • Aeberberold R.
      通过稳定同位素稀释和串联质谱法产生的蛋白质丰度差异的自动统计分析。
      )。在不同SCX纺织中鉴定的肽的定量通过手动检查进行平均。手动检查所有量化的肽并验证真实性。有关肽前容,蛋白质化学,asapratio计划和反式蛋白质组学管道中的其他程序的信息可在线提供。

       出血活动

      Omori-Satoh的方法 等等。 (
      • Omori-Satoh T.
      • Sadahiro S.
      • Ohsaka A.
      • 村田雷
      曲妥霉菌血清血清血清析化与表征,曲折。
      )用于确定粗静脉的最小出血剂量(MHD)。为每个蛇毒液制备每毫升溶液。为蛇毒脉制备八一半串联稀释液(1至 1/256),其中将0.1ml每种稀释液注射到兔脱毛背面。 24小时后,处死兔子,除去皮肤。使用卡钳用于测量皮肤上的出血点直径,测定MHD。 MHD定义为导致10毫米出血点的毒液蛋白的量。

       Sonoclot分析仪配置文件

      根据Sanchez的情况,使用玻璃珠子活化试验(从Sienco,Inc.获得的Gbact +套件)用于监测毒液对Sonoclot®凝血和血小板功能分析仪(Sienco,Inc。)的人血液凝固的影响 等等。 (
      • Sanchez E.E.
      • 加兰J.A.
      • 鲍威尔r.l.
      • 雷耶斯S.R.
      • SOTO J.G.
      • 罗素W.K.
      • 罗素D.H.
      • Perez J.C.
      Disintegrin, hemorrhagic, and proteolytic activities of Mohave rattlesnake, Crotalus sculatus scululatus. venoms lacking Mojave toxin.
      )。使用签名查看器软件(Sienco,Inc。)进行数据采集和分析。

       从粗静脉中除去丝氨酸蛋白酶

      使用HITAP苯胺酰胺FF(快速流动)柱去除来自粗静脉的丝氨酸蛋白酶。 0.05的一毫升(5mg / ml)毒液样品 m Tris-HCl,0.5 m 使用1-mL鲁尔锁定注射器将NaCl,pH 7.5加入到1ml HITAP柱中。使用0.05洗掉丝氨酸蛋白酶的毒液 m Tris-HCl,0.5 m NaCl,pH 7.5。用0.01洗脱丝氨酸蛋白酶 m HCL,0.5 m NaCl,在含有70μl1的Eppendorf管中的1ml等分试样中的pH 2.0。 m Tris-HCl, pH 9.0.

       纤维蛋白催化活性

      在PowerPac Basic TM(Bio-rad)上使用12%Tris-Glycine凝胶测定粗和无丝氨酸无胰岛蛇毒液(0.03mg / ml)的纤维蛋白溶解活性。 20微升纤维蛋白原溶液在0.05时为2.5mg / ml m Tris-HCl,pH 7.5,含0.5 m 将10μl毒液样品的NaCl在37℃下温育2和24小时。用6μl的三甘氨酸SDS样品缓冲液(2×)和2μL的纽扣样品还原剂(10×)减少了总共12μl的纤维蛋白原/毒液混合物,并煮沸3分钟。凝胶用SimplyBlue™Safestain(Invitrogen)染色。蛋白水解活性通过纤维蛋白原的α,β和γ链的消失来确定。

       溶血活性

      粗毒液的最小溶血活性如哈德伯南和Hardt(
      • 哈德伯兰E.
      • Hardt K.L.
      磷脂酶定量的敏感和特异性板试验。
      )修改。将0.3ml包装的人红细胞用盐水溶液洗涤五次,0.3ml大,新鲜蛋黄稀释1:4,用盐水溶液和0.25ml为0.01 m CaCl2 将溶液加入到溶解于PBS溶液(pH8.1)中的25ml 0.8%琼脂糖。将混合物倒入塑料培养皿(135×80mm)中并使其固化。凝固混合物后,制备12个3mm--100-直径的孔并以各种浓度填充10μl粗毒液溶液。将板在37℃温育5小时,测量溶血卤素的直径。使用盐溶液和PBS作为对照。最小溶血剂量定义为导致10mm光晕斑点的毒液蛋白的量。

      结果和讨论

       用于使用可溶性纳米聚合物的试剂进行定量蛋白质组学的理由 -

      我们试图解决与SOPIL试剂的现有蛋白质组学研究中的两个问题。第一个是蛋白质组学研究中样品制剂的效率和一致性。蛋白质组学中的样品制备包括分离和标记来自复杂混合物的一类蛋白质/肽。目前的方法包括额外的纯化步骤,可以导致严重的样品损失或固相萃取,其通常由非均相反应和非线性动力学限制。我们通过构建反应,同位素标记和可溶性纳米聚合物的分离的功能组来解决这个问题。用反应性基团 - 溴乙酰基官能化聚合物PAMAM树枝状聚合物G4,用于含半胱氨酸肽的基位特异性,稳定同位素标记,[12C6]苯胺或[13C6]苯胺作为同位素标签,并通过高效点击化学分离聚合物结合肽的“手柄”作为“手柄”(方案1)。该设计基于特异性捕获靶蛋白/肽,速率限制步骤的概念,当在溶液相中进行的速率限制步骤比固相进行更有效,并且在第二步中,分离标记用纳米聚合物的样品通过在可溶性聚合物上的一对生物正交系中选择高效的生物谐波反应并在固相(方案2.)。在均匀反应中的反应基团与手柄基团的高比使我们能够在不额外纯化步骤的情况下标记样品以除去通常需要的小化学试剂如ICAT试剂所需的过量试剂。
      图缩略图Sch1.
      方案1Sopil试剂的合成。NHS., N - 羟基琥珀酸酐; EDC,1- [3-(二甲基氨基)丙基] -3-乙基氨基酰亚胺HCl; aq。,水性。
      可溶性纳米聚合物如树枝状体也为蛋白质组学研究提供另一种独特的特征。树枝状大分子可以有效地渗透到活细胞中,并已成为药物和基因递送的一个重要分子。虽然本研究未探讨此功能,但Sopil可能会解决第二个问题 体外 蛋白质组学制剂,最佳,通过在活细胞中实现蛋白质组学,近似近似活性细胞或生物中的蛋白质的功能状态 体内.

       SOPIL方法对标准肽和蛋白质混合物的表征及应用 -

      我们已经研究了几种类型的生物惰性偶联伴侣,在PAMAM树枝状聚合物上并分别在固相上,其在高产率高的亚壳浓度下以实际速率反应。我们选择使用点击化学,Cu(i)-catalyzed alyide-alkyne环加装饰,因为它的生物相容性和高反应效率。 Sopil试剂和叠氮化物固相珠粒的合成及其含有含Cys肽的化学方法 方案1, 3, 和4, 分别。在同位素标记中,然后回收用于定量质谱分析的标记肽,在树枝状聚合物和同位素标签之间引入了酸可切割的接头,5-(2-甲酰-3,5-二甲氧基)戊酸(骨架酰胺接头) 。
      图缩略图SCH3.
      方案3.叠氮珠的合成。DMAP.,4-(二甲基氨基)吡啶; 霍布特,1-羟基苯并二唑; Dipci.,二异丙基碳二亚胺。
      为了证明SOPIL策略并在SOPIL和一步固相方法之间进行平行的比较,我们使用由含半胱氨酸的层蛋白B组成的标准肽混合物(m/z 967)和含有非半胱氨酸的血管紧张素II(m/z 1046) (图。1A)。为了准确进行比较,我们设计了一种基于稳定同位素稀释的方法。将标准肽混合物与光肌肉试剂反应(Sopil 12C6)和重固相试剂(固相 13C6) 在平行下。以类似的方式合成固相试剂,以直接掺入酰胺标签苯胺和溴乙酰基作为氨基丙基控孔玻璃珠粒上的硫醇特异性组(方案3.)(参见“实验程序”以供详细合成)。在将Sopil试剂加入肽混合物中后,在小于1分钟的聚合物中连接到聚合物上。相反,在同一时间框架期间仅在固相上捕获50%的层蛋白B,固相试剂需要30分钟以完全捕获溶液中的肽(Fig. 1, BC)。允许两种反应完成并用10米淬火m DTT。然后通过点击化学在叠氮化物官能化珠子上捕获Sopil试剂。得到的珠子与固相结合 13C6 珠子,洗涤,并用酸处理。在相同的MS频谱上分析回收标记产品。使用SOPIL方法的产率超过85%,而固相法的产率小于40%(图。1D)。因此,数据表明,使用SOPil试剂的捕获和释放使用SOPIL试剂比单步固相同位素标记试剂比且更有效。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1固相和SOPIL方法之间的比较。 MALDI-TOF MS用于分析由含半胱氨酸肽,层粘连蛋白B组成的肽混合物(m/z 967.5)和含非半胱氨酸的肽,血管紧张素II(m/z 1046.6)。 A,在反应之前。 B,加入固相后 13C6 珠子(1分钟)。 C,加入后 12C6 Sopil试剂(1分钟)。 D,来自一步固相的酸切割产物 13C6 并从SOPIL中切割产物 12C6 方法。离子 m/z 1100.6是带有光同位素标签的产品和离子 m/z 1106.5是具有重型同位素标签的产品。这 m/z 加入1046离子进行比较。
      为了说明Sopil方法的定量性质,使用标准蛋白质混合物(表I.)。制备含有相同四种蛋白质(牛血清白蛋白,α-乳白,溶菌酶C和β-乳酰脲C和β-乳糖蛋白)的两种混合物,并如图所示分析 方案5.。使用μLC-MS / MS分析定量含有分离的含有半胱氨酸的肽并测序。使用1-400 fmol,所有四种蛋白质被明确地鉴定出多种半胱氨酸肽,其在观察和预期数量之间精确地定量,平均差异低于20%。此外,SOPIL试剂有效地标记含有多于一种半胱氨酸残基的肽,该特征是由于空间障碍(
      • 周H.
      • ranish j.a.
      • 瓦特J.D.
      • Aeberberold R.
      通过固相同位素标记和质谱法进行定量蛋白质组分析。
      )。
      表I.使用SOPil试剂的标准蛋白质混合物的定量分析
      蛋白质名称肽序列
      a ↓表明胰蛋白酶切割网站;跳线表示羧基末端残留物。 *表明SOPil试剂的CYS残留物改性。
      观察比率
      b 比率(12C6/13C6)使用开源ASAPRATIO程序计算错误。
      平均值±S.D.预期比率为错误
      %
      牛血清白蛋白K↓tc * vadeshagc * ek↓s1.33±0.221.19±0.221.019
      f↓hadic * tlpdtek q q1.03±0.14
      k↓yic * dnqdtissk↓l1.17±0.2
      r↓nec * flshkddspdlpk↓l1.44±0.51
      k↓ddphac * ystvfdk↓l1.29±0.24
      K↓eac * favegpk↓l1.18±0.16.
      K↓lkec * c * dkpllek↓s1.61±0.07
      r↓etygdmadc* c * ek↓q1.32±0.21
      K↓slhtlfgdelc * k↓v0.88±0.15
      k↓yeatleec * c *ak¼d1.12±0.17
      K↓slhtlfgdelc * k↓v0.88±0.15
      K↓yngvfqec * c * qaedk↓g1.48±0.22
      K↓lftfhadic * tlpdtek↓q1.15±0.14
      K↓ec * c * hgdllec * addradlak↓y1.02±0.54.
      β-乳酰脱蛋白l↓sfnptqleeqc * hi↓ - 0.62±0.080.52±0.11.0.54
      r↓lsfnptqleeqc* hi↓ - 0.46±0.08
      F↓c * mensaepeqslac * qc * lvr↓t0.47±0.06
      α-乳酸乳白蛋白K↓fldddltddimc * vk↓k1.9±0.782.15±0.432.08
      K↓ddqnphsnic * nisc * dk↓f2.74±0.56
      H↓SSNIC* NISC * DK↓F1.82±0.19
      溶菌酶C.l↓lssditasvnc * ak↓k0.99±0.151.07±0.121.07
      C↓sallssditasvnc * ak↓k1.16±0.3
      r↓nlc* nipc * sallssditasvnc * ak↓k0.94±0.15
      r↓c * elaaamk↓r1.22±0.05
      a ↓表明胰蛋白酶切割网站;跳线表示羧基末端残留物。 *表明SOPil试剂的CYS残留物改性。
      b 比率(12C6/13C6)使用开源ASAPRATIO程序计算错误。
      图缩略图SCH5
      方案5.使用SOPil试剂的定量蛋白质组学的策略。
      对其他氨基酸残基的潜在修饰(例如 在数据库搜索(补充数据)期间使用这些残留物对这些残留物的差异修改来检查赖氨酸,组氨酸,蛋氨酸和色氨酸。除了半胱氨酸残基外,没有鉴定其他修饰,表明使用SOPil试剂的衍生化是特异性的。

       SOPIL法在蛇毒液定量分析中的应用 -

      SOPIL策略用于研究蛇毒液中蛋白质丰度的差异。我们选择定量分析两对蛇毒液:第一对,Mohave响尾蛇毒液类型A和B来自同一物种,以及第二对, B. Colombiensis.C. Orecanus Helleri,两个地区独特的蛇。许多蛇毒液蛋白质富含半胱氨酸(
      • 沼泽N.
      • 威廉姆斯五。
      蛇毒液毒素在血肿中的实际应用。
      ),使它们成为我们使用半胱氨酸特异性Sopil试剂进行研究的优秀范式。
      来自美国西南部和墨西哥的Mohave响尾蛇的大多数毒液, C. Scutulatus scululatus. 毒液,其特征在于Mojave Toxins,并且不会引起动物的严重出血。相比之下, C. Scutulatus scululatus.B型,found in a narrow range of Arizona, lacks Mojave toxins and has hemorrhagic activity. The same amounts of these two characteristically different snake venoms, C. Scutulatus scululatus. 类型A和B分别由轻质和重型肌肉试剂标记。它们被组合并如上所述加工 计划4.。通过在瑞士蛋白质数据库中的30多种毒液(见 表二 对于部分列表;完整列表在补充表S1和S2中。)。相对较少的鉴定的蛋白质是由于未曲线蛇基因组和毒液蛋白的宽动态范围。蛇毒液以许多高丰富的蛋白质为主。我们的分析还揭示了肽冗余,这可能是由于含半胱氨酸的区域保守的高序列同源性。鉴定了蛋白质的分布 图2A。将大约18%的鉴定的蛋白质被归类为同源物。与先前关于Mohave Rattlesnake的报道一致,定量测量表明,几种富含富集的半胱氨酸富含蛋白质在毒液A中存在,但不在毒液B,例如Mojave毒素中。 Mohave Rattlesnake是毒液表征的极端内部变化的一个例子(
      • 格伦J.L.
      • 直r.
      Mojave rattlesnake Crotalus sculatus scululatus. venom: variation in toxicity with geographical origin.
      )。 Mohave Rattlesnake Venom是美国发现的最有毒的蛇毒液之一。致死剂量杀死50%的小鼠群体(LD50)体重0.13和0.54 mg / kg体重(
      • 格伦J.L.
      • 直接R.C.
      响尾蛇及其毒液产量和致命的毒性。
      )。这种有效的致命性主要是由于Mojave Toxin,这是一种强大的突触前作用神经毒素,其阻断神经递质乙酰胆碱导致瘫痪。定量蛋白质组学分析确定了Mojave毒素α亚基的相对强度 C. Scutulatus scululatus. 毒液比B型毒液中的5倍(Fig. 3, AB)。
      表二Partial list of proteins identified and relative abundance in the venom of C. Scutulatus scululatus. A and B
      入口号码蛋白质ID描述鉴定的肽数量平均值±S.D.
      a 大标准偏差主要是由于内源性蛋白水解活性和简并肽的影响。
      1GI | 13959630 | SP | Q91053 | VSP1_AGKCACalobin前身81.84±0.76.
      2gi | 461932 | sp | p30403 | ord_agkrh出血蛋白 - rhodostomin前体(Rho)(含有Disintegrin rhodostomin(Disintegrin Kistrin))20.23±0.08
      3GI | 26397690 | SP | Q8UVZ7 | PA2H_CROAT磷脂酶A.2 Homolog Cax-K49前体20.51±0.45
      4GI | 13959639 | SP | Q9DF67 | VSP2_TRIJE毒液丝氨酸蛋白酶2前体(SP2)62.89±0.76.
      5GI | 6093636 | SP | O93364 | Oxla_Croadl - 氨基酸氧化酶前体(LAO)(Laao)(apoxin i)180.58±0.42
      6GI | 27151648 | SP | O42188 | PA29_AGKHP磷脂酶A.2 homolog2<0.05
      7GI | 462320 | SP | P34182 | HRTE_CROAT出血金属蛋白酶HT-E前体(Atrolysin E)(出血性毒素E)60.15±0.46
      8gi | 231997 | sp | p30431 | Disj_botja推定的毒液金属蛋白酶术术jararhagin前体(HF2-蛋白酶)(含有Disintegin)190.25±0.36
      9GI | 13959659 | SP | Q9YGI6 | VSP2_AGKHPPallabin 2前体52.49±0.97
      10GI | 122973 | SP | P07973 | Hema_incen血凝素 - 酯酶前体(含有血凝素链1(HE1))15.19±0.84
      11GI | 13959638 | SP | Q9DF66 | VSP3_TRIJE毒液丝氨酸蛋白酶3前体(SP3)120.27±0.52
      12GI | 129470 | SP | P24027 | PA2C_CRODU磷脂酶A.2 CB2前体(CrOTOXIN碱性链2)(磷脂酰胆碱2-酰肼酶)62.66±3.42
      13GI | 26007015 | SP | P18998 | PA2A_CROSS莫哈韦毒素酸性链前体(MTX-A)111.35±1.26
      14gi | 118651 | sp | p21858 | Disi_agkhaDisinteglin哈利辛(血小板聚集活化抑制剂)10.15±0.02
      15GI | 462301 | SP | P20164 | HR1B_TRIFL出血金属蛋白酶HR1B(Trimerelysin I)20.11±0.13
      16GI | 27151653 | SP | Q9PVE9 | PA2C_AGKRH磷脂酶A.2 S1E6-C前体(磷脂酰胆碱2-酰肼酶)50.07±0.09
      17GI | 118652 | SP | P16338 | Disi_AgkpiDisintegin Appag蛋白(血小板聚集活化抑制剂)1<0.05
      18GI | 13959631 | SP | Q91507 | VSP1_Trimumucrofibrase1前体,Mucrofib酶3前体31.20±0.22
      19GI | 118661 | SP | P21859 | DISI_TRIFLDisinteglin三氟蛋白(血小板聚集活化抑制剂)70.46±0.24
      20GI | 129398 | SP | P04417 | PA21_AGKHA磷脂酶A.2,碱(PA2-I)(磷脂酰胆碱2-酰肼酶)2<0.05
      21GI | 127777 | SP | P12028 | Myx1_crovc肌毒素I,肌毒素(毒性肽C),肌毒素2和3,肌毒素(凸状毒素)11.39±0.23
      22gi | 125179 | sp | p15946 | klkb_mouse腺Kallikrein K11前体(组织Kallikrein)(MGK-11)12.08±2.24
      23GI | 27734437 | SP | P59171 | PA25_ECHOC磷脂酶A.2 5前体(磷脂酰胆碱2-酰肼酶)10.55±0.03
      24GI | 13959617 | SP | O13059 | VSP1_Triga毒液丝氨酸蛋白酶1前体31.41±0.20
      25GI | 13959616 | SP | O13058 | VSP3_TRIFL毒液丝氨酸蛋白酶3前体31.79±0.65
      26GI | 3122187 | SP | P81176 | VSP1_AGKHA卤代苯磺酸盐40.04±0.00.
      a 大标准偏差主要是由于内源性蛋白水解活性和简并肽的影响。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2蛇毒鉴定使用SOPIL。AB,比较毒液的蛋白质组成 C. Scutulatus Scuculatus. A和B和来自 C. Orecanus HelleriB. Colombiensis., 分别。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3Sopil试剂标记肽的定量分析。A,肽LTGC * dpttdvytyr的MS / MS光谱(MH+ 1738.6)来自Mojave Toxin(酸性亚基)(*表明Sopil试剂的Cys残留物改性)。其特征肽键片离子离子,B型和Y离子标记。 B,重建前体离子的离子色谱图(m/z 868.9)及其重型版本(m/z 871.9)。使用Asparatio进行相对定量,其自动整合父母/单离子跟踪色谱图的相关区域。该程序基于离子信号绘制平滑的色谱图,然后计算峰面积的比率。绘制了原始色谱图 红色的,绘制了平滑的色谱图 蓝色的, 和areas used for calculating the abundance ratio of the charge state are in 绿色.
      相反,在毒液B中仅观察到解毒,在桑切斯最近的一项研究中核实 等等。 (
      • Sanchez E.E.
      • 加兰J.A.
      • 鲍威尔r.l.
      • 雷耶斯S.R.
      • SOTO J.G.
      • 罗素W.K.
      • 罗素D.H.
      • Perez J.C.
      Disintegrin, hemorrhagic, and proteolytic activities of Mohave rattlesnake, Crotalus sculatus scululatus. venoms lacking Mojave toxin.
      )。 Mohave型毒液中的Disintegin蛋白表征并与来自这些蛇的粗毒液表现出强烈的相关性。 Mohave型的出血活动高于A型(
      • Sanchez E.E.
      • 加兰J.A.
      • 鲍威尔r.l.
      • 雷耶斯S.R.
      • SOTO J.G.
      • 罗素W.K.
      • 罗素D.H.
      • Perez J.C.
      Disintegrin, hemorrhagic, and proteolytic activities of Mohave rattlesnake, Crotalus sculatus scululatus. venoms lacking Mojave toxin.
      )。相比之下,Mohave A型不是出血性,并且没有脱蜡酶的基因,用引物设计探测了高度保守的 克罗塔卢 atrox. 解毒素基因并使用PCR分析。本研究还证明了解体蛋白也包括莫布拉韦型毒液,而不是型A.蛋白质组学数据显示B型具有更多的血管蛋白(毒液金属蛋白酶),凝血酶样酶(丝氨酸蛋白酶)和血小板聚集蛋白酶,促进和促进细胞结构膜的降解,溶血,血小板抑制导致组织损伤导致过度出血。这些结果也得到了纤维蛋白原溶胶的证实,其中金属和丝氨酸蛋白酶分别负责分别切割α和β链(Fig. 4, AB)。在Mohave型毒液中也发现了许多凝血酶样酶,例如丝氨酸蛋白酶,毒液蛋白A和Calbin。我们的研究结果还表明,在Mohave型毒液中,存在具有解胶蛋白域的蛇毒液金属蛋白酶(在Acostatin-B,piscivostatin-β和contortrostrostatin中保守)。然而,丝氨酸蛋白酶是负责纤维蛋白原β链的切割的蛋白酶(Fig. 4, AB)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4静脉溶解的静脉溶解活性在2和24小时。 整体十微升(AC)和无丝氨酸蛋白酶(BD(0.05,将毒液(0.03mg / ml)加入到20μl纤维蛋白原溶液(2.5mg / ml)中 m Tris-HCl在pH8.5,并在37℃下孵育2和24小时。将24微升纤维蛋白原/毒液级分混合物加入到来自Invitrogen的12μlSDS缓冲液+4μL还原剂中,并煮沸3分钟。将20微升混合物加入到12%Tris-甘氨酸凝胶的孔中。 Lane 1,纤维蛋白原控制; lane 2, C. Scutulatus scululatus. 类型a; lane 3, C. Scutulatus scululatus. B型; lane 4, C. Orecanus Helleri;和 lane 5, B. Colombiensis.。使用Bio-rad PowerPAC基础,凝胶在125 V,40 mA为1.5小时。凝胶用SimplyBlue Safestain染色。
      南太平洋响尾蛇(C. Orecanus Helleri)和Mapanare(B. Colombiensis.)分别对北部和南美洲的土着展示不同的毒液特征。最多 两者都是 南美的物种导致坏死,出血和促进动物和人类心肌梗死的诱导卒中和心肌梗死(
      • Mosquera A.
      • Idrovo L.A.
      • Tafur A.
      • del brutto o.h.
      两者都是 SPP后卒中。蛇咬。
      ),而许多人 克罗塔卢 物种具有金属蛋白酶,导致envenomation的遗址严重出血和组织损伤(
      • Salazar上午
      • Rodriguez-Acosta A.
      • girónm.e.
      • Aguilar I.
      • Guerrero B.
      蛇毒血液凝血和纤维蛋白溶解活性的比较分析(两者都是 atrox.)(Serpentes:Viperidae)来自委内瑞拉的不同地理区域。
      ,
      • Rodríguez-Acosta A.
      • uzcategui w.
      • Azuaje R.
      • Aguilar I.
      • girónm.e.
      蛇蛇的临床与流行病学分析 两者都是 in Venezuela.
      )。相同数量的蛇毒液 B. Colombiensis.C. Orecanus Helleri 还分别由轻质和重型肌肉试剂标记;合并;并如上所述加工 计划4.。对于SOPIL分析的第二种设置鉴定并定量了瑞士蛋白数据库中类似数量的肽和蛋白质(表III 和补充表S3和S4)。鉴定了蛋白质的分布 Fig 2B。类似于第一个Mohave Rattles分析,将22%的鉴定的蛋白质被归类为同源物。
      表III蛋白质的部分列表鉴定的蛋白质和C. oreganus Helleri和B. Colombiensis的毒液相对丰度
      入口号码蛋白质ID描述鉴定的肽数量平均值±S.D.
      a 大标准偏差主要是由于内源性蛋白水解活性和简并肽的影响。
      1GI | 34922459 | SP | P83519 | LECG_BOTJR特定的半乳糖凝集素(Bjcul)20.14±0.04
      2GI | 6093636 | SP | O93364 | Oxla_Croadl - 氨基酸氧化酶前体(LAO)(Laao)(apoxin i)173.61±2.42
      3GI | 1171971 | SP | P45881 | PA21_BOTJR磷脂酶A.2 前体(磷脂酰胆碱2-酰肼酶)(BJUPLA2)70.13±0.21
      4GI | 27151652 | SP | O42192 | PA28_AGKHP磷脂酶A.2 A`(磷脂酰胆碱2-酰肼酶)40.40±0.58
      5GI | 13959633 | SP | Q91509 | VSP3_Trimumucrofibrase 3前体21.45±0.75
      6GI | 584725 | SP | P34179 | adam_croadadamalysin II(蛋白酶II)82.18±2.00
      7gi | 231997 | sp | p30431 | Disj_botja推定的毒液金属蛋白酶术术jararhagin前体(Hf2蛋白酶)(含有Disinteglin)212.53±4.56.
      8GI | 13959659 | SP | Q9YGI6 | VSP2_AGKHPPallabin 2前体40.24±0.87
      9GI | 27734229 | SP | P81509 | CHBB_CROHOCHH-Bβ亚基68.39±12.2.
      10gi | 118651 | sp | p21858 | Disi_agkhaDisinteglin哈利辛(血小板聚集活化抑制剂)11.37±0.15
      11GI | 13959630 | SP | Q91053 | VSP1_AGKCACalobin前身60.75±0.45
      12GI | 6093643 | SP | P81824 | VSP1_BOTJA血小板聚集蛋白酶PA-BJ30.05±0.02
      13GI | 13959639 | SP | Q9DF67 | VSP2_TRIJE毒液丝氨酸蛋白酶2前体(SP2)410.9±9.52.
      14GI | 118655 | SP | P18618 | Disi_botatDisinteglin Batroxostatin(血小板聚集活化抑制剂)33.06±2.00
      15GI | 1171973 | SP | P24605 | PA22_BOTAS磷脂酶A.2 同源物2(肌毒素II)200.07±0.12
      16GI | 129400 | SP | P20474 | PA21_BOTAS磷脂酶A.2 (肌毒素I)(磷脂酰胆碱2-酰肼酶)90.12±0.17
      17GI | 127786 | SP | P24330 | Myx_cread肌毒素(凸轮毒素)40.44±1.09
      18GI | 1708301 | SP | P15167 | HRTD_CROAT出血金属蛋白酶HT-D和HT-C前体(Atrolysins D和C)(出血性毒素C和D)11>20
      19GI | 462320 | SP | P34182 | HRTE_CROAT出血金属蛋白酶HT-E前体(Atrolysin E)(出血性毒素E)510.9±7.28
      20GI | 462318 | SP | P20897 | HRT2_CRORU出血金属蛋白酶HT-2(Ruberlysin)(出血性毒素II)1615.0±31.1.
      21GI | 461512 | SP | P09872 | VSP1_AGKCOAncrod(Venombin A)(蛋白C活化剂)(ACC-C)31.47±0.50.
      22GI | 129507 | SP | P00623 | PA2_CROAD磷脂酶A.2 α(磷脂酰胆碱2-酰肼酶)51.51±0.45
      23GI | 118660 | SP | P17349 | Disi_trielDisinteglin典雅素(血小板聚集活化抑制剂)73.40±1.98
      24GI | 3914258 | SP | P81243 | PA21_BOTJA磷脂酶A.2 (磷脂酰胆碱2-酰肼酶)(BJ-PLA2)7<0.05
      25GI | 17433168 | SP | Q9PVE3 | PA23_BOTAS磷脂酶A.2 同源物3前体(肌毒素III)(M1-3-3)9<0.05
      a 大标准偏差主要是由于内源性蛋白水解活性和简并肽的影响。
      肌毒素通常是蛇毒液中的小蛋白质和肽,在envenomation时可以诱导对骨骼肌纤维的不可逆损伤(骨折)(
      • Gutierrez J.M.
      • Lomonte B.
      磷脂酶A2来自Bothrops蛇毒液的肌毒素。
      )。他们在南美毒蛇中丰富而普遍普遍,但也可以在其他物种的毒液中发现,包括木材响尾蛇(克罗塔卢恐怖症)在北美找到(
      • 宝贝。
      • 格伦J.L.
      • 直接R.C.
      • 拥有C.L.
      在各种蛇毒液中检测肌毒素α样蛋白。
      )。在分析中,肌毒素I,II和III更丰富 B. Colombiensis. 毒液比在 C. Orecanus Helleri 毒液。相比之下,发现凸轮毒素,肌毒素,在 C. Orecanus Helleri 毒液。另外,磷脂酶a2 α(磷脂酰胆碱2-酰肼酶)也存在于毒液中 C. Orecanus Helleri。这些结果与前面的研究中的哪些结果一致 两者都是 与许多北美相比,物种表现出增加的促凝血剂和肌毒性活动 克罗塔卢 species (
      • Gopalakrishnakone P.
      • Dempster D.W.
      • Havgood B.J.
      • 岁order h.y.
      Crotoxin的细胞和线粒体变化在鼠骨骼肌的结构中,神经毒性磷脂酶A2复合物。
      )。神经毒性PLA.2 肌毒素也可以存在于许多viperid / crotalid物种中,例如曲屈,在毒液中发现的神经毒素 克罗塔卢 durissus Tricitus. from South America (
      • 格拉伦N.
      • Svedberg T.
      crotoxin的分子量。
      )。
      南太平洋响尾蛇队, C. Orecanus Helleri,毒液中有肌毒性,神经毒性和出血性成分(
      • Metsch R.B.
      • DRAY A.
      • 罗素F.E.
      南太平洋鹿茸,克罗特病毒海甲的毒液的影响及其分界与平滑肌。
      ,
      • 布什S.P.
      • Siedenburg E.
      与疑似南部太平洋响尾蛇(Crotalus Viridis Helleri)envenomation相关的神经毒性。
      )。法语 等等。 (
      • 法国W.J.
      • Hayes W.K.
      • 布什S.P.
      • Cardwell M.D.
      • 糟糕的J.O.
      • rael e.d.
      莫哈韦毒素在克罗塔尔斯海里(南太平洋响尾蛇)的毒液中:分子和地理表征。
      )报道,Mojave Toxin(MT)在25中的五分之一被检测到 C. Orecanus Helleri 使用抗MT抗体并使用核苷酸序列分析证实。从Mt中收集MT的所有正毒液样品。圣雅内托在滨江县,加利福尼亚。在我们的研究中,在南太平洋毒液的毒液中没有发现任何山。除了Adamalysin II(蛋白酶II)之外,出血金属化酶酶HT-E前体(Atrolysins E,D和C)是相对于Mapanare毒液中最丰富的蛋白质。据报道,南太平洋毒液将导致10毫米出血点的最小蛋白质量(最小蛋白质量)为2.25μg(
      • Sanchez E.E.
      • 加兰J.A.
      • Perez J.C.
      • Rodriguez-Acosta A.
      • 追逐P.B.
      • Perez J.C.
      两只抗静物对北美蛇毒液的功效。
      )。

       原油蛇毒液生物学测定 -

      在四个粗蛇毒液上进行生物测定,出血,溶血,雌激素和纤维蛋白溶解,并将这些测定结果与用SOPIL方法获得的那些进行比较。在毒液中 C. Scutulatus scululatus.键入a,the MHD was 162.5 μg, and conversely type B venom had an MHD of 16 μg. This assay confirms the higher abundance of metalloproteases existing in type B venom relative to type A analyzed using the SoPIL method (表二)。此外,B型毒液的溶血活性高于A型,可能是由于B型毒液中发现的大多数磷脂酶的丰度,如SOPIL方法的确认。此外,Sonoclot分析仪显示Mohave型B毒液的延迟活化凝块时间为354秒,具有6.2块信号/分钟的低凝块率,而Mohave型毒液显示出的正常活化凝块时间为144秒,具有低凝块率10个凝块信号/分钟(Fig 5A表IV.)。这些结果符合SOPIL方法,其中在B型毒液中发现更多的金属蛋白酶比A型。此外,纤维蛋白原的α链被B型毒液中发现的金属蛋白酶裂解,但不含毒液(Fig. 4, AB)。金属蛋白酶抑制血液凝固(
      • kini r.m.
      丝氨酸蛋白酶影响蛇毒液的血液凝固和纤维蛋白溶解。
      ),它们可以是α-和或β-纤维蛋白原酶,取决于它们的特异性,以切割纤维蛋白原的α或β链(
      • 欧阳C.
      • 腾坪。
      Trimeresurus mucrosquamatus毒液的纤维蛋白溶解酶。
      )。丝氨酸蛋白酶是蛇毒中发现的其他类型的蛋白质,影响血小板聚集,血液凝固,纤维蛋白溶解,补体系统,血压和神经系统(
      • kini r.m.
      丝氨酸蛋白酶影响蛇毒液的血液凝固和纤维蛋白溶解。
      ,
      • 梅尔J.
      • 储料器K.
      蛇静脉对止血的影响。
      ,
      • BRAUD S.
      • bon
      • WISNER A.
      蛇毒蛋白作用在止血上。
      ,
      • kini r.m.
      动物来源的血小板聚集与外源因素。
      ,
      • Markland F.S.
      蛇毒和止血系统。
      ,
      • Kornalik F.
      ,
      • kini r.m.
      • Rao V.S.
      • Joseph J.s.
      来自蛇毒液的促凝血蛋白。
      ,
      • Joseph J.s.
      • kini r.m.
      蛇毒液凝血酶凝血酶激活剂类似于血液凝固因子xa。
      )。根据SOPIL方法,在Mohave型毒液中发现丝氨酸蛋白酶略高(表二)。根据纤维蛋白原溶解测定的结果,A型和B毒液均含有丝氨酸蛋白酶切割β链(Fig. 4, AB);当从这些毒液中除去丝氨酸蛋白酶并未观察到β链切割时,这是明显的(图4B.)。然而,还有进一步的证据表明A型和B型毒液中的金属和丝氨酸蛋白酶互补地作用于β链。例如,2小时内的全毒液能够切割β链,但是当除去丝氨酸蛋白酶时,β链仍然存在,表明丝氨酸蛋白酶仅对β链切割负责。然而,在24小时中,用粗蛋白和丝氨酸蛋白酶的毒液完全切割β链,显然金属蛋白酶或其他酶也称为无丝氨酸蛋白酶毒液中的β链切割,但需要更长的时间用于切割发生。毒液含有丝氨酸蛋白酶,其切割α链,但也需要更多时间来进行(图4, CD)。这些丝氨酸蛋白酶是血浆样酶,其使血液不可透露,并且可以安全地调节毒液含有影响α或β链的不同丝氨酸蛋白酶,因为相同的丝氨酸蛋白酶不太可能影响两条链(
      • aronson d.l.
      凝血酶和凝血酶样毒液酶Ancrod和Batroxobin的作用的比较。
      ,
      • 贝尔Jr.,W.R.
      降解诱导酶。
      )。金属和丝氨酸和丝氨酸蛋白酶的组合在B型毒液中的较高丰度中而不是毒液(表二[因此,这些蛋白酶的组合,特别是金属蛋白酶α链切割的α链切割的作用非常好,这是用B毒液(图5A)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5Sonoclot图表分析了整个人类血液上的毒液。 使用玻璃珠子活化试验(从Sienco,Inc。获得的GBact +套件)用于监测Sonoclot凝血和血小板功能分析仪(Sienco,Inc。)的活化凝块时间,凝块率和血小板功能。 A, 实线,正常人体血液控制(没有毒液); 短虚线, C. Scutulatus scululatus. B; 长虚线, C. Scutulatus scululatus. 一种。 B, 实线,正常人体血液控制; 短虚线, C. Orecanus Helleri; 长划线, B. Colombiensis..
      表IV.Proteolytic and Sonoclot activities of venoms C. Scutulatus scululatus. A and B, C. oreganus helleri, and B. colombiensis
      毒液MHD.
      a 导致10毫米出血点的蛋白质的量。
      MHEMD.
      b 最小的磷脂酶剂量:将导致10mm卤素的蛋白质的量。
      Sonoclot Act,Cr,PF
      c 行为,激活凝块时间:凝块开始形成的时间; CR,凝块率(凝块信号/分钟); PF,血小板功能。正常控制范围值为:ACT:128-213; CR:15-26; PF:3-5。
      纤维蛋白溶解
      d α,β,α和β链切割; α,α链的切割; - ,没有乳沟。
      2 h/24 h
      粗毒剂无丝氨酸蛋白酶毒液
      μg.μg.
      C. Scutulatus scululatus. A
      e C. Scutulatus scululatus. A:神经毒性毒液; C. Scutulatus scululatus. B:出血毒液。
      162.59.7144,10,2.2β/α,β - /β.
      C. Scutulatus scululatus. B
      e C. Scutulatus scululatus. A:神经毒性毒液; C. Scutulatus scululatus. B:出血毒液。
      164.8354,6.2,2.5α,β/α,βα/α,β
      C. Orecanus Helleri64.8<26, >51, 1α,β/α,βα/α,β
      B. Colombiensis.252.4<26, >51, 1α,β/α,βα,β/α,β
      a 导致10毫米出血点的蛋白质的量。
      b 最小的磷脂酶剂量:将导致10mm卤素的蛋白质的量。
      c 行为,激活凝块时间:凝块开始形成的时间; CR,凝块率(凝块信号/分钟); PF,血小板功能。正常控制范围值为:ACT:128-213; CR:15-26; PF:3-5。
      d α,β,α和β链切割; α,α链的切割; - ,没有乳沟。
      e C. Scutulatus scululatus. A:神经毒性毒液; C. Scutulatus scululatus. B:出血毒液。
      毒液 B. Colombiensis.C. Orecanus Helleri 显示出非常明显的凝结活性活动 C. Scutulatus scululatus. venoms (Fig. 5)。毒液均增加了促血管活性(Fig. 5)但凝血机制可能是由于影响止血途径的不同因素的不同毒液蛋白水解酶(
      • kini r.m.
      • Joseph J.s.
      • Rao V.S.
      )。 B. Colombiensis. 毒液切割纤维蛋白原的α和β链; C. Orecanus Helleri 也切割α链并部分地切割β链。 α和β链的切割 B. Colombiensis. 毒液是由于金属蛋白酶,因为当丝氨酸蛋白酶从两种α和β链中除去毒液裂解时,仍然发生在2-和24小时孵育期(Fig. 4, A, B, C, 和D)。再次切割β链 C. Orecanus Helleri 毒液可能是由金属和丝氨酸和丝氨酸蛋白酶的协同作用。溶血活性较高 B. Colombiensis.C. Orecanus Helleri 毒液;然而, C. Orecanus Helleri 毒液更加出血。溶血活性是由于磷脂酶,而出血是由于金属和丝氨酸蛋白酶;通过SOPIL分析磷脂酶和金属蛋白酶在较高的丰度中发现 B. Colombiensis.C. Orecanus Helleri 毒液分别(表III)。

       蛇毒液中的蛋白酶活性 -

      本研究还观察到所有四条蛇毒液中的血液蛋白的第一次大规模裂解。 表V.VI. 说明了来自金属蛋白酶jararhagin和金属蛋白酶HT-D的随机蛋白酶裂解 C. Scutulatus scululatus.B. Colombiensis./C. Orecanus Helleri 分析分析。大多数肽只有一个胰蛋白酶(第22个共分28和17条 表V.VI.分别),并且在一些肽中的每种氨基酸残基上发现切割。这种广泛的裂解最有可能在蛇毒液中通过多种蛋白酶进行活性组合的结果。蛇毒中的蛋白酶和其他酶具有多种目的,例如增加猎物的毒素的吸收和毛皮的消化。在所有四个静脉中的这种内源性蛋白酶活性可以改变平均蛋白质丰度,导致任何现有的测量方法中的误差相对较大,包括蛋白质组学方法。
      表V.Partial list of protease cleavage in the venom of C. Scutulatus scululatus. A and B for putative venom metalloproteinase jararhagin precursor (HF2 proteinase) (contains disintegrin)
      肽序列
      a ↓表明胰蛋白酶切割网站;跳线表示羧基末端残留物。
      p↓vedhcyyhgr↓我
      g↓tpencqneccdaatck↓l
      n↓cqneccdaatck↓
      k↓lksgsqcghgdcceqck↓f
      K↓sgsqcghgdcceqck↓f
      g↓sqcghgdcceqck↓f
      C↓ghgdcceqck↓f
      g↓hgdcceqck↓f
      C↓rasmsecdpaehctgqssecpadvfhk↓n
      r↓asmsecdpaehctgqssecpadvfhk↓n
      r↓ssmsecdpaehctgqssecpadvfh↓k
      a↓smsecdpaehctgqssecpadvfhk↓n
      m↓secdpaehctgqssecpadvfhk↓n
      C↓dpaehctgqssecpadvfhk↓n
      D↓paehctgqssecpadvfhk↓n
      p↓aehctgqssecpadvfhk↓n
      a↓ehctgqssecpadvfhk↓n
      e↓hctgqssecpadvhk↓n
      t↓gqssecpadvfhk↓n
      k↓ngqpcldnygy↓c
      K↓ngqpcldnygycyngn↓c
      K↓ngqpcldnygycy↓n
      Q↓kgnyyycr↓k
      K↓gnyygycr↓k
      k↓ipcapedvk↓c
      k↓dnspgqnnpck↓m
      K↓vcsnghcvdvata↓y
      K↓vcsnghcvdvatay↓ -
      a ↓表明胰蛋白酶切割网站;跳线表示羧基末端残留物。
      表VI.B.哥伦比亚斯斯毒液中的毒性裂解部分蛋白酶裂解列表HELEGANS HELLERI用于出血金属蛋白酶HT-D和HT-C前体(阿替纳蛋白D和C)(出血性毒素C和D)
      肽序列
      a ↓表明胰蛋白酶切割网站。
      g↓kittnpsvedhcyyr↓g
      k↓ittnpsvedhcyyr↓g
      我♥ttnpsvedhcyyr↓g
      r↓griendadstasisacnglk↓g
      r↓yielvvvadhr↓v
      k↓shdnaqlltaieldee↓t
      p↓inllmgvtmahelghnlgmehdgkdclr↓g
      l↓mgvtmahelghnlgmehdgkdclr↓g
      m↓gvtmahelghnlgmehdgkdclr↓g
      g↓vtmahelghnlgmehdgkdclr↓g
      t↓mahelghnlgmehdgkdclr↓g
      a↓helghnlgmehdgkdclr↓g
      l↓ghnlgmehdgkdclr↓g
      n↓lgmehdgkdclr↓g
      g↓mehdgkdclr↓g
      R↓gaslcimr↓g
      y¼kpqcilnkplr↓我
      a ↓表明胰蛋白酶切割网站。
      当毒液蛋白酶被激活时,尚不清楚。在收集毒液的过程中可能发生激活。在冻干和变性后,蛋白酶丧失了他们的活性。然而,蛋白酶可能在胰蛋白酶消化期间重新激活,导致毒液蛋白的广泛裂解。此外,众所周知,即使使用序列等级胰蛋白酶用于更好的特异性,胰蛋白酶也可能导致非特异性切割(
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      灭鼠蛋白质组学蛋白质水解背景的影响。
      )。

       结论-

      本研究介绍了基于稳定同位素标记的几种物种蛇毒的第一种定量蛋白质组学分析。选择性标记和分离含半胱氨酸肽的新SOPIL试剂提供了一种强大的分析工具,以筛分蛇毒性,这些工具是富含半胱氨酸的富含型蛋白质。这种新方法具有溶液反应的均匀性的优点,距离咔哒化学效率高,以及固相捕获/释放过程的便利性。定量蛋白质组学研究有助于我们了解蛇毒液的地理和环境变化;这对于开发用于治疗蛇咬伤的更好的治疗剂至关重要。此外,定量蛋白质组学也可用于发现蛇毒液中存在的新治疗分子。本研究的结论支持了同一物种内毒液的特征差异,以及不同地理位置(
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      Disintegrin, hemorrhagic, and proteolytic activities of Mohave rattlesnake, Crotalus sculatus scululatus. venoms lacking Mojave toxin.
      )。很明显,Sopil方法可以是蛇毒研究的有效工具,并且用于更广泛地应用定量蛋白质组学。

      致谢

      我们感谢M. G. Finn教授在Scripts研究所的点击化学和有用的建议供应配体。我们承认在合同N01-HV-28179下使用来自NHLBI国家卫生研究院的联邦基金开发的系统生物研究所的软件。我们感谢Luis Fernando Navarrete在Instituto de Medicina Tometerd委内瑞拉境内的毒液提取毒液提取。

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