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突触磷酸化和蛋白质表达的定量分析*

  • Jonathan C. Trinidad.
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    大众光谱设施,加利福尼亚州旧金山加州大学药学化学系94143
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  • Agnes Thalhammer.
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    伦敦Gower Street大学伦敦大学学院药理学分子药理实验室,伦敦WC1E 6BT,英国
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  • Christian G. SpecHt.
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    伦敦Gower Street大学伦敦大学学院药理学分子药理实验室,伦敦WC1E 6BT,英国
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  • Aenoch J. Lynn.
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  • Peter R. Baker.
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  • Ralf Schoepfer
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    伦敦Gower Street大学伦敦大学学院药理学分子药理实验室,伦敦WC1E 6BT,英国
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  • Alma L. Burlingame.
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    大众光谱设施,加利福尼亚州旧金山加州大学药学化学系94143
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了Wellcome Trust和Biotechnology和Biological Scorences研究委员会(R. S.)的支持,并由国家卫生研究所研究资源生物医学研究技术计划授予RR01614和RR14606(至A. L. B.)。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
    本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)含有补充材料。
    ¶现代地址:Biologie Cellulaire de La Synapse,U789,Ecole NormaleSupérieure,巴黎75005,法国。
      突触后密度(PSD)信号机机械含有具有不同功能的蛋白质。 PSD组分的脑区特异性变异介导对突触激活的不同生理反应。我们已经开发了基于质谱的方法,以全面地比较突触后密度生化制剂中存在的蛋白质的相对蛋白质表达和磷酸化状态。使用这些方法,我们确定了来自鼠皮质,中脑,小脑和海马的PSD制剂中2159蛋白和1564个磷酸化位点的相对表达。使用独立的生物重复进行这些实验两次,使我们允许我们评估该系统的实验性和生物变异性。关于蛋白质的表达,聚类分析显示,已知的功能相关的蛋白显示协调突触表达。因此,用已知的蛋白质复合物鉴定为共聚蛋白质的蛋白质是用于预先识别的组分的任务的主要候选。关于磷酸化程度,我们观察到更广泛的磷酸化位点N-甲基-d - 巴西酸盐(NMDA)受体比α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸(AMPA)受体,与核心作用一致 N-甲基-d - 加工突触传输模式的海地受体。海马的平均激酶和磷酸酶水平最高,与该脑区中存在的较高总体磷肽丰度相关。这些发现表明,海马在改变突触强度时比其他脑区更大程度地利用可逆蛋白质磷酸化。
      中枢神经系统中神经元之间的突触传递涉及从突触前神经元释放神经递质,并通过突触后神经元的表面膜中的特定配体门通道的检测。这些神经递质受体作为高度有组织的蛋白质复合物的一部分存在,称为突触后密度(PSD)。
      使用的缩写是:PSD,后突触密度; Camkii,钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II; Glur,离子粒细胞谷氨酸受体; NMDA, N-甲基-d - 海滨; SCX,强阳离子交换; SOM,自组织地图; AMPA,α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸; TARP,跨膜AMPA受体调节蛋白; ITRAQ,相对和绝对定量的等离性标记;薄荷,分子相互作用; QQ-TOF,四极选择,四极碰撞单元,飞行时间。
      1使用的缩写是:PSD,后突触密度; Camkii,钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II; Glur,离子粒细胞谷氨酸受体; NMDA, N-甲基-d - 海滨; SCX,强阳离子交换; SOM,自组织地图; AMPA,α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸; TARP,跨膜AMPA受体调节蛋白; ITRAQ,相对和绝对定量的等离性标记;薄荷,分子相互作用; QQ-TOF,四极选择,四极碰撞单元,飞行时间。
      除神经递质受体外,PSD还由不同功能的蛋白质组成(
      • Ziff E.B.
      启发突触后密度。
      ,
      • 肯尼迪M.B.
      信号处理机在突触后密度。
      )。这些官能团包括支架分子,激酶和磷酸酶,G蛋白及其效应器和粘附蛋白。
      不同的PSD组件的协调功能部分地调节前后神经元和后腹膜神经元之间的信号传导的强度。在分子水平,可以通过蛋白质定位的改变来实现该调节(
      • Malenka R.C.
      突触塑性和AMPA受体贩运。
      ,
      • 科尔布兰R.J.
      • 棕色上午。
      钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II和突触塑性。
      ,
      • 史密斯K.E.
      • Gibson E.S.
      • Dell'Acqua M.L.
      通过蛋白激酶易位锚定蛋白质支架蛋白质静脉蒸馏群受体激活调节营养依赖性蛋白激酶突触突出定位。
      ),可逆后翻译后修改( 例如 phosphorylation (
      • Soderling t.r.
      • derkach v.a.
      后腹膜蛋白磷酸化和LTP。
      ,
      • Yamauchi T.
      分子成分和磷酸化依赖性调节后突触后密度。
      ) 和 O-GLCNAC糖基化(
      • Vosseller K.
      • 特立尼达J.C.
      • Chalkley R.J.
      • specht c.g.
      • Thalhammer A.
      • 林恩A.J.
      • Snedecor J.O.
      • 关斯。
      • Medzihradszky K.F.
      • maltby d.a.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      O-连接的N-乙酰葡糖胺蛋白质组蛋白质组器使用凝集素弱亲和色谱法和质谱法使用凝集素密度制剂。
      )),通过局部合成和降解蛋白质水平的变化(
      • ehlers m.d.
      活性水平通过泛素 - 蛋白酶体系控制突触后组合物和信号传导。
      )。这些过程的整合可能是突触疗效思想提出更高认知过程(如学习和记忆)的长期变化的基础(
      • Bliss T.v.
      • collingridge g.l.
      • 莫里斯r.g.
      介绍。长期潜力和问题的结构。
      )。
      旨在鉴定突触蛋白的蛋白质组学方法(
      • 李克..
      • 犀牛M.P.
      • van der schors r.c ..
      • Watson R.
      • 塔特S.
      • Casetta B.
      • JIMENEZ C.R.
      • Gouwenberg Y.
      • 甘德福格·艾迪
      • 小k.h.
      • smit a.b.
      大鼠脑后密度的蛋白质组学分析。不同蛋白质官能团对突触生理学集成的影响。
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      • 彭J.
      • kim m.j.
      • 诚变。
      • Duong D.M.
      • Gygi S.P.
      • 盛M.
      大鼠大鼠突触突破密度级分质谱法的半定位蛋白质组学分析。
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      • Yoshimura Y.
      • Yamauchi Y.
      • Shinkawa T.
      • Taoka M.
      • Donai H.
      • Takahashi N.
      • isobe t.
      • Yamauchi T.
      蛋白质组学分析使用多维液相色谱 - 串联质谱揭示的突触后密度分数的分子量。
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      • 约旦B.A.
      • Fernholz B.D.
      • Boussac M.
      • 徐C.
      • 格里俄罗波尔G.
      • Ziff E.B.
      • neubert t.a.
      新型啮齿动物突触后密度蛋白的鉴定与验证。
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      • 特立尼达J.C.
      • specht c.g.
      • Thalhammer A.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      突触后密度制剂中磷酸化位点的综合鉴定。
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      • 特立尼达J.C.
      • Thalhammer A.
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      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      突触后密度蛋白的磷酸化状态。
      )及其翻译后修改(
      • Vosseller K.
      • 特立尼达J.C.
      • Chalkley R.J.
      • specht c.g.
      • Thalhammer A.
      • 林恩A.J.
      • Snedecor J.O.
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      • Medzihradszky K.F.
      • maltby d.a.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      O-连接的N-乙酰葡糖胺蛋白质组蛋白质组器使用凝集素弱亲和色谱法和质谱法使用凝集素密度制剂。
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      • 柯林斯M.O.
      • yu l.
      • COBA M.P.
      • Husi H.
      • Campuzano I.
      • 黑色的 stock W.P.
      • Choudhary J.s.
      • 格兰特S.G.
      体内磷酸化突触蛋白的蛋白质组学分析。
      ,
      • degiorgis J.A.
      • jaffe h.
      • 更多的 ira J.E.
      • Carlotti Jr.,C.G.
      • Leite J.P.
      • 喘气。
      • Dosemeci A.
      人脑皮层突触体的磷蛋白蛋白质分析。
      )提高了我们对突触复杂性的了解。然而,只有在蛋白质组学研究中的鉴定,难以将生物功能分配给单个蛋白/磷酸化位点。为了了解特定蛋白质和磷酸化位点的角色,重要的是要了解他们的突触水平如何随着生理和药理学条件的变化以及影响中枢神经系统的疾病而变化。最近的一项研究检测了两个脑区中突触蛋白的相对表达,并且在一小部分蛋白质中进行绝对量化(
      • 诚变。
      • hoogenraad C.C.
      • 赶紧J.
      • RAME E.
      • 施拉格M.A.
      • Duong D.M.
      • 徐P.
      • wijayawardana s.r.
      • 汉福J.
      • NA. kagawa T.
      • 盛M.
      • 彭J.
      大鼠前脑和小脑中分离的突触后密度蛋白质组的亲属和绝对量化。
      )。第二种研究在突触体中检测了磷酸化,并专注于有限地点的定量变化(
      • 慕尼黑r.p.
      • tweedie-cullen r.
      • Livingstone-Zatchej M.
      • Weinandy F.
      • Waidelich M.
      • 朗科D.
      • Gehrig P.
      • Potthast F.
      • Rutishauser D.
      • Gerrits B.
      • 泛C.
      • Schlapbach R.
      • Mansuy i.M.
      幼稚刺激小鼠突触体制剂蛋白质磷酸化的定性和定量分析。
      )。使用质谱法定量可以使用同位素标记或无标记的方法进行(
      • rinner o.
      • 穆勒L.N.
      • Hubalek M.
      • Muller M.
      • Gstaiger M.
      • Aeberberold R.
      蛋白质相互作用网络分析的集成质谱与计算框架。
      )。
      在本研究中,我们从皮质,中脑,小脑和海马和海马中孤立PSD复合物,并用串联MS使用ITRAQ多路复用化学标记试剂(
      • 罗斯P.L.
      • 黄玉。
      • Marchese J.N.
      • 威廉姆斯B.
      • 帕克克。
      • 哈桑斯。
      • Khainovski N.
      • Pillai S.
      • 丹尼尔斯S.
      • Purkayastha S.
      • Juhasz P.
      • 马丁斯。
      • Bartlet-Jones M.
      • 雅各布森A.
      • Pappin D.J.
      使用胺 - 反应性的异常标记试剂在酿酒酵母中的多重蛋白质定量。
      )在2159个独特的蛋白质和1564个独特的磷酸化地位获得比较蛋白丰度比。我们表明,注释蛋白质 - 蛋白质相互作用的子集显示出高度相关的表达,表明这些新的高度相关的蛋白质对是用于新的蛋白质 - 蛋白质相互作用的候选者。我们发现在相对于AMPA受体的不同水平的NMDA受体磷酸化地区使用的部位数的大差异。最后,我们证明参与激酶信号传导的蛋白质在海马中具有更高的总体丰度,并且它们的平均磷酸化化学计量显着高于其他脑区域。

      实验步骤

       PSD样品制备和质量控制 -

      使用两组PSD样品进行了两次,如前所述在4℃下独立纯化的两组PSD样品进行两次(
      • 特立尼达J.C.
      • specht c.g.
      • Thalhammer A.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      突触后密度制剂中磷酸化位点的综合鉴定。
      )。从成年小鼠短暂脑(菌株C57BL / 6J;第一次实验:3-12个月的年龄;第二个实验:4-16个月; n ≥14每实验)被解剖;首先将小脑(不包括脑干)缩短,然后被皮质半球(不包括嗅灯泡)。中间脑区被称为“中脑。”将海马形成从皮质中解剖。整个解剖的持续时间低于5分钟。脑区(小脑,皮质,海马和中脑)立即冷冻在液氮中,在生化纯化之前将来自几种动物的材料组合。脑组织在含有磷酸酶抑制剂的混合物的蔗糖缓冲液中均化(1米 m Na3 vo. 4, 1 mm NaF, 1 mm Na2 Moo. 4, 4 mm 酒石酸钠,100 nm fenvalerate, 250 nm 冈田酸)并通过离心清除。对于每个脑区,缓冲体积与开始脑重的比率保持恒定(10mL缓冲液/ g),以确保将每个PSD制备物暴露于相当水平的磷酸酶抑制剂。膜级分在蔗糖密度上层叠并通过离心分馏。在1.0-1.2收集突触膜 m 接口并应用到第二梯度上。在1.4-2.2收集PSD级分 m 接口和造粒。各个区域每种大脑的PSD样品的平均产量大致如下:600μg用于皮质,280μg用于中脑区,190μg用于小脑,用于海马60μg。

       消化PSD样品 -

      平行处理500μg的每个PSD样品。每个PSD样品在25米中重新悬浮m 含有6的碳酸氢铵 m 盐酸胍。将混合物在57℃下温育1小时,2米m TRIS(2-羧乙基)盐酸膦减少半胱氨酸侧链;然后将这些侧链用4.2米烷基化m 在21℃下碘乙酰胺在黑暗中45分钟。将混合物用25米稀释6倍m 加入碳酸氢铵和5%(w / w)改性胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)。将pH调节至8.0,将混合物在37℃下消化12小时。使用c脱盐摘要18 使用SpeedVac集中器(Thermo Electron,San Jose,CA),Sep-Pak盒(水域,Milford,MA)和冻干到干燥。

       ITRAQ标记胰蛋白酶PSD消化 -

      将干燥的肽重悬于80μl的ITRAQ溶解缓冲液中。使用70μL乙醇重构每个ITRAQ试剂小瓶,并且共使用5个试剂小瓶标记每种500μg胰蛋白酶肽的摘要。对于第一个实验,每组ITRAQ试剂与特定的脑区PSD消化相结合如下:具有114的皮质,带115的中脑区域,具有116的小脑和117个。在第二次重复中实验,脑区的标记逆转。使标记反应在21℃下进行1小时。然后使用1-H LC-MS / MS运行检查等分试样,并搜索允许ITRAQ作为可变修饰,以确认鉴定的所有肽的99%显示出完整的ITRAQ标签。通过LC-MS / MS分析含有1:1:1:1的含有1:1:1:1的第二等分试样,以确定是否在四个样品的最终组合期间对蛋白质量进行任何校正。

       强阳离子交换色谱 -

      使用配备在房屋内的Tricorn 5/200柱(GE Healthcare)的Ákta净化器(GE Healthcare)进行SCX色谱法进行色谱法,其中包含5μm300-å多硫磺酰基树脂(西部分析,Elsinore,CA)。将2.0mg组合的PSD样品加载到30%乙腈,5米的柱上m KH24,pH 2.7(缓冲A)。缓冲b由350米的缓冲器a组成m KCL。梯度从1%B到29%B超过19毫升,从29%B到75%B超过14毫升,75%B至100%B超过2.5毫升。使用MAX-RP反向相c收集90至100个级分和脱盐18 弹药筒(现象,托兰,CA),并使用SpeedVac集中器干燥。使用ESI-QQ-TOF串联MS保留5%的每馏分进行分析,剩余的95%受到二氧化钛富集。

       使用二氧化钛富集磷酸化肽 -

      使用Ákta净化器在每个SCX级分的剩余部分上进行二氧化钛富集。使用5-μm二氧化钛珠(GL科学,东京,日本)富集肽(GL科学)(
      • Pinkse M.W.
      • Uitto下午
      • hilhorst m.j.
      • OOM B.
      • Heck A.J.
      使用2D-Nanolc-ESI-MS / MS和氧化钛预训柱的蛋白水解消化的雌性磷酸磷肽的Femtomole水平的选择性分离。
      ,
      • Larsen M.R.
      • Thingholm T.e.
      • Jensen O.N.
      • Roepstorff P.
      • jorgensen t.j.
      使用二氧化钛微柱的肽混合物的高度选择性富集磷酸化肽。
      )用62μL包装体积(俯卧性科学,橡木港,WA)包装成分析卫柱。将来自个体SCX级分的干燥的肽颗粒在250μl洗涤溶液中重悬(35%乙腈,200米 m NaCl,0.3%TFA)并用另外的3.9ml洗涤溶液在二氧化钛柱上运行以除去非磷酸化肽。然后将其洗脱3.5ml漂洗溶液(5%乙腈,0.1%TFA)。将磷酸化肽直接从二氧化钛柱上洗脱到C上18 Macrotrap肽柱(Michrom Bioresources,Auburn,CA)使用15ml洗脱溶液(1 m KH24)。 C.18 然后用17.1ml漂洗溶液洗涤柱。从c中洗脱肽18 柱使用400μL有机洗脱溶液(50%乙腈,0.1%TFA),并使用SpeedVac浓缩器冻干该溶液以干燥。

        NA. no-LC-ESI-QQ-TOF串联质谱分析 -

      使用75μm×15cm反相C分离单独的SCX和SCX-二氧化钛级分18 柱(LC填料,Sunnyvale,CA)以350 nL / min的流速,在装备自动进样器(Agilent Technologies,Palo Alto,Palo Alto,Palo Alto)的Agilent 1100系列HPLC系统上运行3-32%的乙腈梯度。加利福尼亚州)。根据样本复杂性,梯度循环时间长度为1.0至1.5小时。 LC洗脱液耦合到连接到QSTAR脉冲质谱仪(应用生物系统,福斯特城CA)的微离子喷射源。以正离子模式分析肽。获得MS光谱1秒。对于每个MS光谱,选择两个最强烈的多元带电峰用于产生后续碰撞诱导的解离MS。对于前体离子选择,将四极分辨率设定为“低”,其允许在〜2内传输离子 m/z 单同质粒细胞单位。根据肽电荷自动调节碰撞诱导的解离能量 m/z 比率。应用了一个动态排除窗口,以防止相同的窗口 m/z 在其初始收购后被选中3分钟。

       解释MS / MS光谱 -

      使用分析师QS软件(版本1.1)分析数据,使用Mascot.dll脚本(1.6b18版本)生成MS / MS质心峰值列表。搜索MS / MS光谱,针对整个UNIPROT 亩肌肉 数据库(2007年4月19日下载,共有64,717个条目)使用以下参数。 MS和MS / MS模式中的初始肽耐受分别为200ppm和0.2道尔顿。胰蛋白酶被指定为酶,允许最多两个错过的切割。搜索氨基甲酰基甲基化和ITRAQ标记的赖氨酸残留物作为固定修改。将肽氨基末端固定为ITRAQ改性或蛋白质N-末端乙酰化。允许蛋氨酸的氧化作为可变改性。丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸残基的磷酸化仅允许富含二氧化钛的级分。所有高评分肽匹配(期望值<然后,来自单个LC-MS / MS的0.01)然后用于在内部重新校准MS母离子 m/z 运行中的值。然后在50ppm的MS模式下搜索重新校准数据文件。将两个搜索的输出组合成单个输出文件以进行鉴定目的,如果用至少一种肽鉴定用蛋白质培训肽肽评分≥25和肽期望值≤0.01,则认为蛋白质被认为是肯定鉴定的。通过使用包含原始UTIPROT数据库的连接数据库以及序列已被随机化的每个原始条目的版本进行搜索来估计假阳性率。蛋白质加入数映射到相应的Unigene条目上,如果它们与同一Unigene进入匹配,蛋白质被缩合到单个蛋白质以进行定量和识别目的。与来自一个以上的未蛋白质的蛋白质相对应的肽不用于定量。这导致使用19,037个独特的肽序列定量2839个独特的Unigene条目,其总蛋白质假阳性率为0.14%(四个假阳性蛋白),肽假阳性率为0.026%(五种假阳性肽)。两种复制导致总鉴定为1738次磷酸化肽,假阳性率为0.12%(两个假阳性磷酸肽)。

       磷酸肽MS / MS光谱的评价 -

      手动检查所有磷酸肽以验证大多数高丰度峰是Y或B序列离子或Y - H.234 or b − H234 适当时的离子。在内部网站分配脚本的帮助下手动完成站点分配。

       蛋白质表达和磷酸化水平的定量 -

      使用蛋白质勘探器(版本4.24.4)直接阅读原始MS数据。对于每种肽MS / MS光谱,峰的原始区域 m/z 114.1,115.1,116.1和117.1(±0.1 m/z)确定。使用供应商提供的这些批次的试剂来调整ITRAQ区域测量。如果在相同的电荷状态下为相同的肽收集多个MS / MS光谱,则仅使用最佳评分光谱来定量。为了计算四个样本中的每一个中给定肽的相对百分比,将该相应峰的面积除以该MS / MS光谱中的所有四个ITRAQ诊断离子的平均区域。每个Unigene蛋白进入的相对蛋白质表达值是与该进入匹配的所有(非磷酸化)肽的对数平均值。通过相应的相对蛋白质水平正常化相对磷酸化水平来计算相对磷酸化化学测定体。出于量化目的,使用最强烈的ITRAQ峰值≥25计数的MS / MS谱仅有(参见“结果”)。没有删除异常数据点。

       生物信息学分析 -

      使用程序GenePattern(
      • 雷神米
      • Liefeld T.
      • 古怪J.
      • Lerner J.
      • Tamayo P.
      • Mesirov J.P.
      GenePattern 2.0。
      ),在两个生物学复制中分析蛋白质表达模式以产生蛋白质表达簇的自组织地图(SOM)。进行分层聚类以使用程序基因簇聚类两种蛋白质以及脑区域(
      • eisen m.b.
      • 斯派曼P.T.
      • 棕色p.o.
      • Botstein D.
      基因组表达式模式的聚类分析与显示。
      )。相对表达数据是日志2 - 以脑区域为中心,中心为中心,然后由脑区域标准化,然后由基因中位数和标准化。对于SOM和分层聚类分析,平均链接聚类,未受监位相关性被用作相似度量。为了基准于它们对蛋白质 - 蛋白互动剂的能力方面的分层聚类结果,我们利用已知的蛋白质 - 蛋白质相互作用在分子相互作用(薄荷)数据库中注释(
      • Zanzoni A.
      • MonteCchi-Palazzi L.
      • Quondam M.
      • Ausiello G.
      • Helmer-Citterich M.
      • Cesareni G.
      薄荷:分子交互数据库。
      )。该数据库注释蛋白质之间的已知物理相互作用(直接或间接)。在薄荷数据库中产生列表,其中包括在我们的研究中量化了两种条目(共409个独特的蛋白质)。针对这些409蛋白的所有可能的成对组合确定平均连杆相关值。然后将结果分为两种群体:文献 - 注释的相互作用和所有其他相互作用。

       统计分析-

      所有统计分析都是使用RGUI计划进行的,在万维网上自由地提供。因为比率值的分布不一定是通常分布的,所以非参数曼 - 惠特尼 U 测试通常用于评估特定假设。

      结果

       获取和评估定量数据 -

      为了比较脑区蛋白质和磷酸化的相对量,我们制备了来自小脑,皮质,海马和中脑的微粉的PSD样品。用胰蛋白酶消化每个区域PSD制剂,并将所得肽用四种稳定同位素ITRAQ试剂中的四种版本中的一种标记,以允许比较相对丰度水平(
      • 罗斯P.L.
      • 黄玉。
      • Marchese J.N.
      • 威廉姆斯B.
      • 帕克克。
      • 哈桑斯。
      • Khainovski N.
      • Pillai S.
      • 丹尼尔斯S.
      • Purkayastha S.
      • Juhasz P.
      • 马丁斯。
      • Bartlet-Jones M.
      • 雅各布森A.
      • Pappin D.J.
      使用胺 - 反应性的异常标记试剂在酿酒酵母中的多重蛋白质定量。
      )。组合所有四个样品,使用多维分离方法鉴定和定量蛋白质和磷酸化位点,如前所述(
      • 特立尼达J.C.
      • specht c.g.
      • Thalhammer A.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      突触后密度制剂中磷酸化位点的综合鉴定。
      )和示意性地显示在 图。1A 和补充图1.实验的第一次重复导致量化1225个独特蛋白的相对表达(从总共5993个肽鉴定)和来自四个脑区的突触的860个独特的磷酸化位点(补充表S1和S2)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1评估量化精度。A,从以下各个区域中纯化500μg突触后密度蛋白:皮质,中脑区域,小脑和海马。用胰蛋白酶独立地减少,烷基化,用胰蛋白酶消化,然后用ITRAQ试剂的单个版本标记。然后将样品合并并进行强阳离子交换色谱。对每个SCX分数的约5%进行LC-MS / MS以鉴定和定量非磷酸化肽(蛋白)表达。通过通过在二氧化钛柱上通过通过通过通过通过氧化钛柱来富含每个SCX分数的其余部分。然后通过LC-MS / MS分析这些级分。 B,对所有蛋白质(136蛋白,总肽总肽3158个总肽,总比率为12,632个总比率,将各个肽值与其各自的蛋白质值(标准化与特定蛋白质值标准化为特定蛋白质值)的绝对百分比计算。这些数据显示为与每个肽的最丰富的ITRAQ峰的区域对应的平均值的直方图,由每个ITRAQ标签分解( IE。 脑区)。具有低于25计数低于25计数的肽的定量从计算出的蛋白质值为29%的平均误差,而具有超过25个面积的计数的平均误差为13%。与每个ITRAQ试剂相关的特定误差与116标签的略微增加相一致。 C 是显示来自每种肽的四个ITRAQ峰的相对误差的直方图 B 最大面积大于25个计数(来自2839个肽的11,356个比率)。 S.D.与它们各自的蛋白质值相比的肽测量的相对误差为0.18。数据绘制的箱尺寸为0.0175。 D 是显示用于鉴定和量化每种蛋白质的肽数的直方图。使用两种或更多种肽量化746蛋白。 E 显示S.E.的分布。对于单一实验中的每种蛋白质比率测量。计算总共2984个相对蛋白质比(746个蛋白×4 Itraq比/蛋白)。使用单一肽定量479个蛋白质(导致479×4蛋白比),因此S.E.未确定这些蛋白质值的值。假设用单个肽定量的蛋白质具有最大的S.E.,整个数据集的中值值为0.187。中位数。用多于一种肽量化的蛋白质的蛋白质比值为0.102。
      对于来自第一实验重复的数据,我们通过检查我们鉴定了10种或更多种肽的蛋白来检查肽测量的精度。尽管具有少于25计数的最大ITRAQ峰面积的肽的平均误差为29%,但最大面积大于25的肽的平均误差小于13%( 图。1B )。因此,接受区域为至少25个区域的ITRAQ峰作为阈值,并且总体上这些肽显示了S.D。相对于各自计算的蛋白质平均值为0.18( 图1C. )。每种蛋白质鉴定并定量可变数量的肽,其中包含两种或更多种肽鉴定的61%蛋白质(图。1D)。为了评估实验中蛋白质测量的精度,我们计算了S.E.用两种或更多种肽量化蛋白质的蛋白质比率( 图1E. )。中位数。对于该数据集(假设用单个肽定量的蛋白质具有最大值)为0.187(表示中值蛋白质比误差小于19%)。这表明总蛋白质水平定量具有高精度。

       蛋白质和磷酸化量化的再现性 -

      纯化第二种PSD的制备,并分析以解决PSD隔离程序引入的差异以及来自两个独立实验中使用的小鼠批次的差异。这导致总鉴定/定量2024蛋白,其中1090个也在第一复制中鉴定(共2159例,使用总共16,242个肽鉴定)。在至少一种复制中,量化总共1564个独特的磷酸化(具有高于先前定义的阈值的强度的1339个位点)。在两个生物复制中定量这些磷酸肽的637(两者在两者中的509中至少以高于阈值的重复)。相对于量化蛋白质(〜50%)的百分比,在复制(〜41%)中量化了较低百分比的磷酸化位点。这主要是由于它更容易鉴定对复制的给定蛋白质,因为不需要在每个实验中使用相同的肽鉴定蛋白质。这表明尽管我们富集了我们的富集,但仍然仍然鉴定磷酸化部位,特别是那种低丰度蛋白和/或低化学计量的部位。
      为了说明如何复制肽和蛋白质测量值,我们最初分析了在这种情况下在单一蛋白质的水平下获得的值,在这种情况下进行Chapsyn-110( 图2A )。在重复的重复中鉴定了26和28个非磷酸化肽,以及蛋白质丰度的相对阶(海马)> cortex >Midbrain≈Cerebellum)对于两种生物重复都是一样的。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2实验复制的再现性比较。 为了确定数据的再现性,我们执行了第二个独立量化实验。 A 显示单个肽的比率值(单点)以及蛋白质平均值(水平栏)对于来自四个脑区的蛋白质Chapsyn-110。在第一和第二复制中鉴定了21和29个独特的Chapsyn-110肽。与每个大脑区域相关的两组数据代表了实验的两者。 B 展示单个蛋白质比率如何与第二次重复同意。 黑色的 ,皮质; 红色的 ,中脑区; 绿色 ,小脑; 蓝色的 ,海马。 C 仅显示这些数据仅为那些蛋白质 B 在基因本体数据库中被注释为突触(共77个蛋白质)。 D来自不同脑区的PSD制剂的Western印迹比较,说明区域丰富变化。 PSD样品(10μg/ LANE)从鼠皮质(“)获得(” cor “),小脑(” CER. “),中脑区(”“)和海马(” 时髦的 “) 材料。 E,通过定量MS测量的钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIα中每个脑区域的蛋白质水平和磷酸化测量的比较。每次重复的相对磷酸肽表达比例是磷酸Qetvdclk和Qetvdclkk的平均值(小写“t”表示修饰位点)。这些数据允许计算磷酸化的相对化学计量。 Pt. ,磷酸辛。
      对于在两个实验中鉴定的所有蛋白质,中位数S.D.蛋白质比率为0.089,而中位数的S.D.对于在两个实验中鉴定的磷肽的比率为0.16。然而,许多蛋白质的比率从一个实验到下一个实验相当多种多样。蛋白质比在一个实验中对蛋白质比对第二实验中那些值的比较显示了中等程度的涂抹量( 图。2B ),和 r2 整个数据集的值为0.26。检查这些蛋白质的蛋白质显示最贫困的量化再现性,显示出许多人是细胞污染物( 例如 组蛋白蛋白质)预期其存在将从制备中广泛变化。作为量化再现性的粗略指南 善意 因此,PSD组分,我们选择了在突触中表达的基因本体中的那些蛋白质(
      • ashburner m.
      • 球C.A.
      • 布莱克J.A.
      • Botstein D.
      • 巴特勒H.
      • 樱桃准晚
      • 戴维斯A.P.
      • Dolinski K.
      • 德怀特S.S.
      • EPPIG J.T.
      • 哈里斯M.A.
      • 山D.P.
      • ISSEL-TARVER L.
      • Kasarskis A.
      • 刘易斯S.
      • Matese J.C.
      • Richardson J.E.
      • Ringwald M.
      • 鲁宾上午
      • Sherlock G.
      基因本体:生物学统一的工具。基因本体组织。
      )。绘制这种蛋白质的副本证明,在总水平上,我们对突触蛋白的定量非常可再现,中位数S.D。这些蛋白质比率为0.083 r2 value of 0.70 ( 图2C. )。作为我们的定量方法的进一步验证,我们将蛋白质印迹对抗几种蛋白质和磷酸胆碱在Camkiiα上的印迹,所有这些都显示出突出的区域特异性表达( 图2D )。由此获得的表达水平的等级顺序与我们的MS发现(补充表S1和S2)一致,进一步证实了我们定量方法的准确性。

       综合分析蛋白质表达 -

      从微阵列实验获得的数据已经过去,证明可以显着富集基因表达簇用于特定功能类的基因(
      • Tamayo P.
      • Slonim D.
      • Mesirov J.
      • 朱Q.
      • Kitareewan S.
      • Dmitrovsky E.
      • 着陆器E.S.
      • golub t.r.
      用自组织地图解释基因表达模式:造血分化的方法和应用。
      )。为了调查蛋白质功能类的表达中每个大脑区域的突触如何变化,我们将SOM分析通过其表达式模式进行分组功能类。蛋白质在一般层面组织以返回五种不同的地图(Fig. 3, a-e)。 蛋白质表达水平通常在两种脑区之间的一致性,其具有最值得注意的例外是一种蛋白质簇,其在第一皮质样品中具有低表达和第二次(图3E. )。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3蛋白质表达的SOM分析。 A-E. ,分别为270,138,153,295和234蛋白的自组织地图分析的结果。 误差酒吧 表示平均表达的标准偏差。 F-Q. ,对于先前的自组织地图簇中的每种蛋白质,我们使用基因本体进行注释蛋白质功能,并将这些功能分组为12类。对于每个类别,我们绘制了每个不同的SOM集群中存在的蛋白质数量。 cor ,皮质; CER. ,小脑; ,中脑区; 时髦的 ,海马。
      我们检查了通过根据其基因本体苗条分子功能(Getermmapper)分类每种蛋白质,在这些SOM簇中分布不同功能的蛋白质。 Fig. 3, F-Q. ,显示给特定蛋白质功能等级注释的蛋白质的数量。该分析揭示了激酶和磷酸酶的强烈偏差,以存在于索马疫群体中,显示出在海马中最高表达的群体(SO0)。在作为激酶或磷酸酶的87个蛋白质中,37%(32个蛋白质)映射到Som簇0.总体仅25%(总共270个)的蛋白质分组为SOM 0。

       蛋白质表达的分层聚类分析 -

      为了研究特异性蛋白质表达的可能协调行为,我们在每个脑区中表达的相似性使用平均连杆分层聚类对蛋白质(
      • 吉布斯F.D.
      • 罗斯f.p.
      基于基因注释判断基于基于基于基于基于基于基于聚类方法的质量。
      ,
      • Handl J.
      • 知识J.
      • kell d.b.
      后基因组数据分析中的计算群验证。
      )。数据均由大脑区域和各个准备水平聚集(用于评论分层聚类技术,请参阅参考文献。
      • Gollub J.
      • Sherlock G.
      聚类微阵列数据。
      )。 图4A 显示这些结果对于小脑中具有最高表达的蛋白质的副本。符合样品制备和定量中的高水平的再现性(如图所示) Fig. 2),发现个体脑区域复制是彼此最相似的重复(见 图4A , 顶部树图)。该小粒富集的簇含有荷马3,谷氨酸受体δ-2,肌醇3-磷酸受体1型,和MgluR4(等)。单独的簇由蛋白质再次形成小脑中的最高表达,但具有明显的表达模式(图4B.)。这些蛋白质中的许多是核糖体。虽然发生了突触特异性转录(用于审查,请参阅参考文献。
      • pfeiffer b.e.
      • Huber K.m.
      局部蛋白质合成和突触可塑性的目前进展。
      ),该子集可能代表来自细胞溶质核糖体池的污染。未知函数的蛋白质在PSD制剂中的表达谱紧密匹配已知的污染物本身可能是在样品中非特异性的存在。这种方法类似于据报道的免疫沉淀物分析中的污染物判断(
      • Tackett A.J.
      • 降解J.A.
      • Sekedat M.D.
      • Oeffinger M.
      • 溃败M.P.
      • Chait B.T.
      I-DIRT,一种区分特异性和非特异性蛋白质相互作用的一般方法。
      ,
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • ong s.e.
      • 尼尔森M.
      • 福斯特L.J.
      阐明应用于EGF信号传导的功能蛋白质 - 蛋白质相互作用的蛋白质组学策略。
      )。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4平均连杆分层聚类揭示了具有相关表达的蛋白质簇。A 显示突触蛋白质在小脑中具有最高表达的突触蛋白的簇(0.87)。传奇 A-C. 列出颜色方案的相对表达比的数值(在日志转换后和基因和阵列的正常化之后)。 B 显示核糖体蛋白的第二簇(0.78)的核糖瘤蛋白也具有最高表达在小脑中。这两个亚板块(AB)彼此不太相关(0.66)。 C 显示突触蛋白质在海马中最高表达的群体(0.93)的簇(相关性。该簇中的蛋白质相对于小脑在海马中表达2.5-3倍。 D,八个蛋白质对的候选列表,其蛋白质表达在实验的两种重复上高度相关,但未报告为在薄荷数据库中的相互作用。这些对代表潜在的小说 体内 相互作用(身体或代谢水平)。最终对(Enoyl-CoInme A水性酸酶α和β)代表整个数据集中的两种蛋白质,其相关性最高,并且已知与薄荷数据库中未注释)相互作用。 cor ,皮质; CER. ,小脑; ,中脑区; 时髦的 ,海马; 毫米 ,mus musculus;铸造,CAZ相关的结构蛋白。
      图4C. 展示具有高海马和低小脑表达的蛋白质簇的实例,包括先前显示在海马和皮质中高度表达的NMDA受体亚基NR2B(
      • Monyer H.
      • Sprengel R.
      • Schoepfer R.
      • 草本A.
      • Higuchi M.
      • Lomeli H.
      • Burnashev N.
      • Sakmann B.
      • 塞伯格P.H.
      异聚母不同的受体:亚型的分子和功能区别。
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      • Kutsuwada T.
      • kashiwabuchi n。
      • 森林。
      • Sakimura K.
      • Kushiya E.
      • Araki K.
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      • Masaki H.
      • kumanishi t.
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      NMDA受体通道的分子多样性。
      ,
      • Goebel D.J.
      • Poosch M.S.
      大鼠脑中的NMDA受体亚基基因表达:NR1COM,NR2A,NR2B,NR2C,NR2D和NR3A的内源mRNA水平的定量分析。
      )。在所代表的每个集群内 Fig. 4, A-C. ,是在文献中注释的蛋白质对是物理相互作用的。其中的例子包括荷兰3中的Homer 3 图4A ,各种核糖体蛋白 图4B.和NMDA受体1带光盘大型同源物3 图4C.。观察到特定的物理相互作用蛋白在我们分析中显示相关的突触表达,表明,作为更一般的规则蛋白质 - 蛋白质相互作用,可以通过寻找蛋白质之间的相关脑区特异性突触表达来观察到。
      为了评估这种假设,我们使用在薄荷数据库中注释的已发表的蛋白质 - 蛋白质相互作用来基准从平均联系分层聚类分析获得的值。薄荷数据库包含在我们研究中量化的409蛋白之间的629个成对相互作用。对于这些409蛋白的每个可能的成对分组(总共409×408×0.5对),我们确定了包含两个条目的最近分层聚类节点并记录其相关值。然后基于蛋白质对在数据库中作为交互分离,将这些值分成两组。文献注释相互作用的相关性的总体分布显着高于其他蛋白质对的分布(p < 8.88e-7,Mann-Whitney U 测试)。具有大于0.90的平均连杆相关值的可能性注释对的有4.6倍(3.0 相对 非注释对的0.64%)。因此,我们得出结论,我们数据集中的蛋白质对显示高度相关的表达式(尽管未被引入为相互作用)代表新型蛋白质 - 蛋白互联器的潜在候选者。 图4D 显示在各种脑区域中具有高表达的蛋白质对的实例,该脑区域显示出高度相关的表达(并且在薄荷数据库中没有注释为相互作用)。

       蛋白质磷酸化分析 -

      我们在831个蛋白质上鉴定了1564个独特的磷酸化位点。在61%的病例中,我们能够确定从CID光谱磷酸化的精确氨基酸。并不总是可以确定在肽内改性的精确氨基酸。为了肯定地识别修饰的部位,通常相对于仅鉴定与特定磷酸肽匹配的MS / MS光谱所需的量,通常需要较大量的光谱信息。如果给定的磷肽含有多于一种丝氨酸,苏氨酸或酪氨酸,则需要存在于MS / MS光谱中以区分可能的修饰位点。然而,精确的现场分配对于最终的特定网站的生物学测试很重要。在167个蛋白质中发现了三个或更多个磷酸化位点。显着我们在四个AMPA受体亚基之间仅鉴定了两个磷酸化位点(参见“讨论”)。
      图2E. 显示两种实验的结果,该实验定量Camkiiα蛋白表达和苏氨酸磷酸化。在两者中,海马相对磷酸化最高,然后是皮质,中脑区域,最后是小脑细胞。这种整体模式并联对于蛋白质表达。通过相应的相对蛋白质表达分离相对磷酸化水平,得到相对磷酸化的化学计量。这表明,在海马中苏氨酸286磷酸化水平最高,这可以很大程度上解释,蛋白质表达在海马中也最高。用于Camkiiα的Western印迹和苏氨酸的磷酸化286确认了定量MS观察到的趋势( 图2D )。在许多生物学比较( 例如 比较野生类型时 相对 患病样品),给定磷酸化位点的量(例如,通过磷酸化抗体测量)的变化可以是由于蛋白质水平的变化,磷酸化化学计量的变化,或两者。我们能够确定这些因素中的每一个的相对贡献使我们能够调查任何其他目前方法无法获得的水平的突触制剂。
      在许多情况下,我们量化了每种蛋白质的多种磷酸肽。 图5A 显示来自Chapsyn-110的11种磷酸化肽的相对磷酸化化学素。海马相对于小脑的最大变化相对于细胞瘤对应于丝氨酸365,其有一个 >在海马相对于小脑中的2倍相对化学计量。两种重复的11种磷酸肽显示出25%的相对磷酸化化学计量,当作为一个整体时,在海马相对于小脑中(n = 20个总测量, p < 0.02, Mann-Whitney U test).
      图缩略图GR5.
      Fig. 5区域磷酸化分析。A 显示在四个脑区的110氨基肽的相对磷酸化化学测定体。为了计算相对磷酸化化学物质,通过对Chapsyn-110的蛋白质表达标准化各种磷酸肽的相对表达值。图例列出了磷酸化的氨基酸及其在蛋白质内的位置。一种 向前斜线 表示关于磷酸盐部位的模糊性。绘制的是平均值和S.D.两者复制的值。在两种情况下(Ser-106 / Ser-111 / Ser-116和Ser-175)给定的磷肽仅在一次复制中量化。在一个实例(Ser-323和Ser-328)中,给定的磷酸肽是双磷酸化的。 坚实的方块 表示日志平均值的平均值,和 误差酒吧 代表S.D. B 显示用作磷酸酶(15个实例)和激酶(41个实例)并在两种生物重复中量化的蛋白质的相对蛋白质水平比。 单点 代表单个实验中单个蛋白表达的计算。 彩色的酒吧 表示整个分发的日志平均值。 C-F. 从发现在本研究中发现蛋白质的蛋白质的非磷酸化和磷酸化肽的分布显示箱体数据(箱尺寸为0.125)。在第一复制中,量化2716非磷酸化和693次磷酸化肽。在第二复制中,量化10,246个非磷酸化和1325个磷酸化肽。 cor ,皮质; CER. ,小脑; ,中脑区; 时髦的 ,海马。
      为了检查磷酸化和相对磷酸化化学计量的总分布,我们确定了我们数据集中的所有磷酸化位点的相对化学计量(补充表S1)。为了直接比较任何两个脑区域,它们的相对化学测定物可以表示为比例。 表I. 列出了在海马和小脑之间相对磷酸化化学计量的最大增加或减少的10个位点。在显示海马中相对化学计量的位点是Densin 180上的两个位点,脂蛋白α3上的两个位点。相反,Camkiiα显示出四个位点,其相对磷酸化化学测定体在小脑中比海马(总共8位磷酸化位点)更大。
      表I. 代表性的磷酸化位点显示小脑和海马之间的化学计量大变化
      蛋白质名称相对化学计量
      皮质 中脑小脑海马臀部/ cer
      DENSin 180.(Systesygasqtrpvsarpt)Maallek0.75(0.14)0.60(0.12)0.25(0.05)1.55(0.03)6.22
      钙通道α1e.FGEAVVVGRPGSGDGDSDQSR.1.31(0.07)0.87(0.10)0.48(0.17)1.46(0.21)3.06
      DENSin 180.Sqsideidvgtyk.0.83(0.07)0.83(0.01)0.49(0.17)1.31(0.07)2.67
      钙通道γ3 dlspisk. 1.48(0.61)0.99(0.08)0.38(0.20)1.02(0.33)2.66
      Liprin,α3vsssgldslgr.0.97(0.14)0.89(0.03)0.54(0.08)1.44(0.03)2.65
      氨基酸输送器4乙酰 - (SS)HGNSLFLR1.16(0.23)0.90(0.39)0.62(0.22)1.61(0.39)2.62
      d15wsu169e.fl(旋塞)pvgk0.48(0.33)0.64(0.09)0.66(0.21)1.61(0.19)2.46
      CNK2QEVTG(SSAV)Pirk1.01(0.29)0.61(0.04)0.60(0.18)1.41(0.05)2.36
      Liprin,α3slpgsalelr.1.19(0.16)0.93(0.20)0.53(0.07)1.24(0.01)2.31
      Munc13-1esysdsmhsyeefsepr.0.96(0.44)0.88(0.14)0.59(0.05)1.34(0.21)2.29
      Glurδ-2APNGGFFRSPIK.0.80(0.20)0.86(0.12)1.16(0.13)0.58(0.28)0.50
      Connexin 43.VAAGHELQPLAIVDQRP(SS)R0.84(0.33)1.01(0.03)1.70(0.41)0.59(0.26)0.35
      Ankyrin 3.Rqsfaslalr.0.84(0.08)1.02(0.29)1.44(0.12)0.65(0.29)0.46
      Camkii,αmltinpsk.1.22(0.02)1.19(0.12)1.54(0.24)0.69(0.05)0.45
      Camkii,αitaaealkhpwishr.1.14(0.06)1.28(0.22)1.57(0.25)0.69(0.14)0.44
      Camkii,αlkgailttmlatr.0.99(0.03)1.14(0.11)2.44(0.58)0.64(0.16)0.26
      Camkii,αagaydfpspewdtvtpeak.1.06(0.07)1.58(0.12)1.57(0.30)0.63(0.02)0.40
      溶质载体家庭12EIQSI(TDESRGS)IR0.40(0.02)0.82(0.13)1.70(0.00)0.50(0.16)0.29
      二酰基甘油脂肪酶,αllspvaaasaar.0.20(0.11)0.34(0.12)1.61(0.14)0.15(0.04)0.09

       不同脑区的磷酸化状态 -

      为了解决脑区域磷酸化的整体调节,我们将磷酸化水平与发现被磷酸化的那些蛋白质的蛋白质表达变化。 Fig. 5, C-F. ,显示出在每个脑区中的非磷酸化肽和磷酸化肽的分布。从两种生物重复的每种肽测量随着独特的测量显示,与非磷酸化对应物相比,海马在磷酸化肽的总相对表达中增加了13%的增加( p < 2.2e-16,曼恩惠特尼 U 测试, n = 12,962个非磷酸化肽测量和2018次磷酸化肽测量)。 图5B. 显示特异性注释为具有磷酸酶或激酶功能的蛋白质的脑区域的相对表达。其中包含最多肽(这是粗蛋白质丰度的粗略措施),Camkii同种型和蛋白激酶Cγ在海马中表达最高表达。相比之下,双峰素(
      • Gleeson J.G.
      • 艾伦下午茶。
      • 狐狸J.W.
      • Lamperti E.D.
      • 贝尔科维奇S.
      • Scheffer I.
      • Cooper e.c.
      • DOBYNS W.B.
      • Minnerath S.R.
      • 罗斯M.E.
      • 沃尔什C.A.
      DoubleRecortin,在人X型裂致蛋白和双皮质综合征中突变的脑特异性基因编码推定的信令蛋白。
      )钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶样1(DCAMKL1)(
      • 林P.T.
      • Gleeson J.G.
      • cor bo J.C.
      • 弗拉纳曼L.
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      DCamkL1用同源性对双击激素进行同源性的蛋白激酶进行调节,调节微管聚合。
      )在皮质中显示出最高的表达,以及Citron Rho相互作用激酶(
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      )在中脑中显示出最高表达。虽然给定的蛋白质磷酸酶或蛋白激酶的表达不一定与其活性水平相关,但是激酶和磷酸酶的平均表达相对于其他脑区(p < 8.8e-3和<0.026用于激酶和磷酸酶,Mann-Whitney U 测试)。这表明基于磷酸化的信号传导的调节在海马中起比在其他脑区中更突出的作用。

      讨论

      关于特定蛋白质表达的文献中的信息通常集中在有限数量的脑区中存在的个体蛋白质和所选少量磷酸化位点(
      • 诚变。
      • hoogenraad C.C.
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      幼稚刺激小鼠突触体制剂蛋白质磷酸化的定性和定量分析。
      )。相比之下,该研究建立了允许综合鉴定和定量蛋白质表达和磷酸化水平的方法所需的方法,这些方法与突触突触密度等复杂的混合物。当其与多维SCX分馏结合时,无标记量化可以遭受量化伪影,因为单个肽可以在多于一个SCX分数中洗脱。相反,使用ITRAQ策略的量化不受SCX峰值分割的影响,因为签名ITRAQ报告器峰值仍然包含完整量化信息(只要它们的峰强度仍然高于阈值水平)。此外,ITRAQ试剂的多路复用性质允许在与无标签方法相比时LC-MS / MS的数量减少。
      在这里,我们提供2159蛋白和1564位磷酸化的相对量化,跨越皮质,中脑区,小脑和海马和海马分离的突触。大多数蛋白质被鉴定并用相对高的序列覆盖量定量,导致精确的表达测量(参见“结果”),其总体与先前已知的表达模式非常一致。例如,已知在小脑中高度表达的蛋白质,包括Glur2δ,mgluR1,MgluR4,肌醇3-磷酸受体,G蛋白信号调节器RGS8,Homer 3和Munc13-3(
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      大鼠脑中两种新的Munc13蛋白的差异表达。
      ),在大脑中具有最高相对表达的20个蛋白质中观察到。
      虽然我们的调查结果普遍支持迄今为止在文献中所报告的结果,但我们的突触蛋白和磷酸化量化数据集的广泛性质使我们能够与早期,更传统的研究相比,从全球视图中检查突触生物学的问题。例如,我们证明了已知物理缔合的蛋白质显示出高水平的相关表达,因此表明那些在该数据集中非常高的这些蛋白对(目前已知相互作用的那些蛋白质对代表了潜在的新型蛋白质 - 蛋白质相互作用。此外,量化55激酶和磷酸酶的突触表达和1564个磷酸化位点使我们允许我们提供对海马相对于其他脑区的磷酸化的信号传导的微分利用的证据。
      本研究分析的个体脑区远非在其神经元成分中均匀;众所周知,它们由几种不同类型的神经元组成。即使在给定的细胞类型内,也预期分子不同的突触连接的范围非常大。虽然我们的方法不允许在不同的细胞类型或突触连接组之间分化,但是可以观察PSD组分的区域与区域的区域与区域对比进行蛋白质 - 蛋白质相互作用的证据。
      我们观察到,众所周知的蛋白质相互作用对平均呈现脑区域的高度相关性表达。然而,所有这些文献注释的相互作用对都没有高度相关的表达。对于这种观察,存在几个可能的解释。首先,如果每种蛋白质的大多数分子参与形成这些特异性络合物,则直接相互作用的两种蛋白质将仅显示高度相关的突触表达。如果代替特定的蛋白质与两个不同的突触复合物相关,那么其总体表情可能与这些两种络合物中的任何蛋白质不吻合良好。其次,所有蛋白质对都不太可能具有文学注释的相互作用实际上在突触处相互作用。在 图4D ,我们列出了八对蛋白质,其表达模式高度相关,代表了新型蛋白质 - 蛋白质相互作用的候选者。这些潜在的对代表蛋白质,其在我们知识的各种脑区中表达增加,以前尚未报告以前互动。
      为了组装完整的突触蛋白相互作用网络,有必要使用一系列正交探针检查突触( 例如 兴奋性刺激和基因突变研究)并确定蛋白质表达和翻译后修饰水平在独特的生物表型下协调的方式。本研究结果的结果是朝向该目标的第一步,并且让我们详细检查特定的蛋白质组。该蛋白质组的详细分析来自文献的确认预测,并允许制定下面讨论的新假设。
      我们检查的一个这样的基团包括AMPA受体和跨膜AMPA受体调节蛋白(TARPS)。 tarps是在AMPA受体的突触定位中起作用的脚手架分子。 AMPA受体是由Glur亚基1-4组成的四聚体。我们观察到Glur1和Glur2表达之间的高相关,与Glur1 / 2异二聚体是主要突触亚型的观点一致(表二)。在我们的研究中量化的渗纹中,Tarpγ-8的表达与Glur1和Glur2最高度相关。 Tarpγ-2(Stargazin)和Glur4之间也存在高的相关性。这指向Glour亚型与TARP系列的特定成员之间的差异关联,含有γ-2和γ-8缺陷小鼠,显示出这些Glur亚型的表达和功能受损(
      • 陈L.
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      Tarpγ-8控制海马AMPA受体数,分布和突触可塑性。
      )。
      表二显示谷氨酸受体AMPA 1-4和其他AMPA亚基之间的Pearson相关系数以及报告的蛋白质与AMPA受体相互作用
      AMPA 1AMPA 2AMPA 3AMPA 4
      AMPA 20.94
      AMPA 3−0.13−0.13
      AMPA 4−0.13−0.130.57
      tarpγ-2−0.13−0.130.210.21
      tarpγ-3−0.13−0.13−0.03−0.03
      tarpγ-80.660.66−0.13−0.13
      转向NMDA和AMPA受体磷酸化状态,我们检测了相对于AMPA受体家族的NMDA受体成员的相当数量的非磷酸化肽(71 相对 84分别在两种重复的总非磷酸化肽)。这将表明,作为群体,NMDA和AMPA受体亚基以大致相似的数量符合文献中最近的报告(
      • 诚变。
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      大鼠前脑和小脑中分离的突触后密度蛋白质组的亲属和绝对量化。
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      )与AMPA受体相比(
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      信号处理机在突触后密度。
      ),与NMDA受体在检测和处理突触传输模式中的中心作用一致。
      蛋白质磷酸化的协调调节在突触可塑性中起着重要作用(
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      Camkii功能在突触和行为记忆中的分子基础。
      )。为了获得关于特异性磷酸化差异的整体视角,我们研究了在我们的研究中发现蛋白质的磷酸化肽和非磷酸化肽的分布。该分析表明,海马的平均磷酸化水平最高。为了研究如何将其发生分子,我们将激酶和磷酸酶的蛋白质表达与脑区进行了比较,发现这些蛋白质类别的水平在海马中最高( 图5B. )。这些发现表明,基于磷酸化的信号传导在海马中更活跃,表明这些机制在海马突触塑性中发挥更大的作用,而不是在其他脑区域中。在激酶信号传导途径的激活过程中,特定位点的磷酸化化学计量的变化通常在分钟至几天的时间稳定。确切的时间动态来自所涉及的特定激酶和磷酸酶之间的竞争。因此,海马突触塑性基于磷酸化的信号传导机制的较大作用可以为海马在短期记忆中发挥的中心作用提供细胞生物学解释及其固结。
      在这里,我们介绍了大规模地定量检查突触蛋白表达和磷酸化的研究。这种方法对于鉴定突触作用和改变在突触函数的变化下通过发育调节,药理学操纵和疾病状态而不太可能影响单一蛋白质或分离的磷酸化部位的变化。

      致谢

      我们感谢Craig Garner进行稿件的建议。

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