朝着综合糖粉测序的平台*

      从一系列最近发表的报告中,已经提出了一个分析平台,用于定量和定性测量N- 和O-糖基化,完全含有肽 - 聚糖连接和详细的彩易福彩理解。如此遥远,因为这可能出现,将出现最好的方法,必须使我们超越彩易福彩理解的卡通阶段。因此,通过考虑到这一统一目标,我们总结了一系列单独举报的样品制备的第一相方案(释放,纯化和定量),其与结论阶段保持一致(甲基化和MSn)用于记录的彩易福彩细节。序贯酶促N-Glycan和化学O-通过中间固相萃取和衍生化的糖肽从糖肽释放,将提供糖基化的比较定量测量。这O-聚糖释放将是未重示性的,并与吡唑酮类似物(1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮)的麦芽酮添加,用肽和甘露甘油标记。产物聚糖对甲基化稳定并适合顺序拆卸(MSn)。使用人血清和癌症样品的应用已经详细表征了SLEx和相当的价位表。该集成平台将在可变点提供对比,分享和推进替代协议的可变点,这是一个非常需要的协作努力。该集成平台提供了终点机会,以确认由综合标准编制的彩易福彩细节,并通过MS进行详细的生物学n.

      统一的糖类平台

      国家卫生院校的NHLBI建立了糖类卓越方案,支持对所有哺乳动物细胞表面上发现的聚糖研究。这种彩易福彩影响各种细胞和疾病相关的过程,该方法受到相互作用伙伴的组成和配置的控制,以及在该超分子环境中的彩易福彩和构象的细节。这些群组的一个例子是与在其各自的聚糖上显示的唾液酸糖基化的配体结合的选择汀(E-,L-和P-)(
      • Lühnk。
      • 野生M.K.
      岩藻糖基化和唾液酸唾液酸化的人类缺陷。
      ,
      • Sackstein R.
      糖基转移酶编程的立体声(GPS)创建HCell:工程用于细胞迁移的路线图。
      )。在尼格斯和国家卫生研究院的NCI早期的重点之后,NHLBI介绍了糖类课程的卓越纲领,以带来更全面的含量努力,支持甘草彩易福彩在心脏,肺和血液疾病研究中越来越重要。卓越方案建立了三个基本目标,如下所示:(i)在全国开发和扩大核心设施; (ii)促进合作和分发研究结果,(iii)培养后代科学家在甘草生物学和化学中被认识到。这些是可应对目标的任何措施,但努力和前锋势头的努力必须是最后一个目标的考虑因素。通过扩展贡献曾经扩大的新应用程序的工具列表,应用程序中聚焦培训的目标出现脱节和遥远。因此,我们介绍了本综述的基本动机,如下所示:首先,一个平台将在定量和定性水平上允许对分析工具进行比较评估;其次,有机会考虑一个迷人的不注足性 O-甘草释放策略伴随着肽位点标签;最后,暴露彩易福彩细节的平台,可以针对合成标准和众所周知的商业产品的光谱库记录( Fig. 1)。该测序申请的讲座方面将在2013年7月17日至2012年7月17日至2012年7月17日至2012年7月17日至2012年7月17日举行的Charles Warren教程中审查。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1具有产品文档的定量和定性测序平台。 建议综合糖粉排序平台概述。可以加工干组织或培养的细胞(A)。方案包括顺序蛋白质释放的处理步骤。 B,色团/荧光团标记单独释放 N - 链接和无重写 O-用于HPLC定量的链接聚糖(数据未显示)。 C,对于定性理解和彩易福彩询问,可以收集HPLC峰面积,甲基化,芯片喷射注入和质量分布(D)对于ITMS的详细彩易福彩理解n。这旨在根据数据要求提供不同的进入点和出口点的全面工作流程。拆卸碎片(E)由片段图书馆匹配记录(F)由已知标准编制。这种两相方法,与第二相彩易福彩测定耦合的样品制备/净化,可以为研究人员之间的比较合作提供改进的选择。

      糖甘蔗释放

      异常的糖基化和疾病关系已经与所有糖缀合物相关联,并且已经公布了方案以分别分离并部分地表征每个糖型。为了应用程序的分析进步和连续性,我们分享并描述这些协议如何有效地绘制并同样适用于寻求比较量化(Fig. 1)。从干冰粉碎的细胞,组织或液体样品开始,初始氯仿/甲醇提取或分区将选择性地除去糖脂等级进行独立分析。这些样品可以直接甲基化并通过ITMS分析n.
      使用的缩写是:
      ITMS.n
      离子阱质谱法
      PMP.
      1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮
      DMA
      二甲胺
      Imms.
      离子迁移率质谱。
      前体离子(ESI)的碰撞活化和拆卸提供共轭产品,允许每个(
      • 杠杆S.B.
      糖磷脂彩易福彩分析和糖磷脂素。
      )。因此,在本次审查中不会进一步考虑GSL。
      残留蛋白(亲脂性萃取后)的多种溶解度和构象性能使酶促聚糖释放变量使得可以通过减少,烷基化和蛋白水解的容易化学步骤来大量消除这些反复性问题。这种成熟的程序提供了一种稳定的糖肽,用于有效酶促(N - 链接)和随后的化学物质(O - 链接)释放。第一个酶促步骤利用肽:N - 糖苷酶F,一个非常有效的肽:N - 糖苷酶,发现哪些发现必须被认为是哺乳动物彩易福彩性糖生物学进步的主要里程碑(
      • tarentino a.l.
      • Gómez下午
      • Plummer Jr.,T.H.。
      通过肽的柿酰胺连接的聚糖的脱糖基化:N - 糖苷酶F.
      )。肼释放(
      • Patel T.P.
      • Parekh R.B.
      通过肼分解从糖蛋白释放寡糖。
      )虽然技术上更具挑战性和敏感性更少,但确实提供了一种正交评估,这些评价应该始终与新的样品,特别是非酰胺原产地的新样品形成鲜明对比。

      发色标签, N-Glycans.

      游离聚糖(肽:N释放的糖苷酶F释放)可以荧光标记和提供定量丰度比率的HPLC-Impliled(Fig. 1C)(
      • Anumula K.r.
      正常人血浆衍生免疫球蛋白及其片段Fab和Fc的定量甘油分析。
      )。仅在肽的范围内注释档案建议彩易福彩的漫画:N通过质量分析获得的糖苷酶F和离子组合物(
      • Zauner G.
      • Kozak R.P.
      • 加德纳R.A.
      • Fernandes D.L.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      蛋白质 O-糖基化分析。
      )。峰值重叠,肩部,糖类,甚至是等离的(在更高分辨率下)可以通过切割分数来识别(Fig. 1D),甲基化(Fig. 1E)(
      • Mechref Y.
      • 康P.
      • Novotny M.v.
      用于拟合分析的固相渗透液。
      ),并直接输注如下所述的彩易福彩进行详细检查。

      耦合发色释放和标记 O-Glycans.

      强大的基础释放 O-来自丝氨酸和苏氨酸糖肽的聚糖已经存在,并且仍然是一种僵硬的技术(
      • 卡尔森下午
      从猪亚夏粘蛋白分离的寡糖。
      )。对相应的alditol的释放半缩醛的减少是许多研究的一部分,但这可以防止任何机会增强检测灵敏度或实现严格的发色定量。已经考虑了这种问题的许多变化已经取得了一些成功。然而,最有趣的溶液可以是吡唑酮衍生化,具体与PMP(
      • 本田S.
      • Akao E.
      • Suzuki S.
      • okuda m.
      • Kakehi K.
      • Nakamura J.
      高效液相色谱,减少碳水化合物,如强烈紫外线吸收和电化学敏感的1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮衍生物。
      ),允许直接丰富的对比度 N- 和O-糖基化。早期成功用轻度碱催化单糖的衍生化,最近具有较大的低聚物; N- 和O-Glycans(
      • Kakehi K.
      • Suzuki S.
      • 本田S.
      • 李玉。
      用1-减少碳水化合物的预柱标记(p - 甲氧基)苯基-3-甲基-5-吡唑酮:分析糖蛋白中的中性和含唾液酸的寡糖。
      ,
      • 沉X.
      • perreault H.
      使用衍生化,高性能液相色谱和质谱法的组合表征碳水化合物。
      )支持这种兴趣。 PMP凝结和甘草的同步揭示王 等等。 (
      • 王C.
      • 风扇W.
      • 张P.
      • 王Z.
      • 黄兰
      单锅无重量容性 O-用1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮释放和标记,然后用ESI-MS分析。
      )(西北大学,中国县)将其带入一个罐式反应中。催化的β-消除和快速迈克尔加入还原末端似乎在降低剥离的可能性,选择聚糖的重要考虑因素。可能已经实现了类似的洞察力(
      • Zauner G.
      • Kozak R.P.
      • 加德纳R.A.
      • Fernandes D.L.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      蛋白质 O-糖基化分析。
      ),进一步的应用程序将令人兴奋阅读和申请。细节可能会有变化和改进(
      • Furukawa J.
      • 富士坦N.
      • Araki K.
      • Takegawa Y.
      • Kodama K.
      • Shinohara Y.
      在吡唑啉酮类似物存在下通过β-消除分析丝氨酸/苏氨酸后翻版改性的通用方法。
      ,
      • Zauner G.
      • Koeleman C.A.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      质谱 O-合并后的甘草分析 O-聚糖通过β-消除和1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮标记释放。
      ),这里聚集的初步数据表明随后的甲基化和顺序拆卸将比较框架一起用于对两者进行定量和定性评估的比较框架 N- 和O-如图所示,蛋白质的链接聚糖 Fig. 1.

      糖基化现场鉴定 O-链接

      N - 链接的糖基化位点通常具有共分序列,而 O-链接不。为了充分了解其生物学意义,甘草和肽都需要详细说明他们的特定起源。当应用于糖肽时,这种PMP / DMA释放/衍生方案现在似乎是合理的期望(
      • Furukawa J.
      • 富士坦N.
      • Araki K.
      • Takegawa Y.
      • Kodama K.
      • Shinohara Y.
      在吡唑啉酮类似物存在下通过β-消除分析丝氨酸/苏氨酸后翻版改性的通用方法。
      )。在本申请中,易受β-消除的所有基团仅成为仅磷酸和磺族的产品未被标记。该反应基本上是组合的β-消除/迈克尔添加,其中使用碳 - 碳键形成迈克尔供体(互相补充的研究),但在这里释放 O-聚糖作为双吡唑酮衍生物回收,具有最小的副反应(剥离)。使用这种技术, O-成功分析了模型粘蛋白型糖蛋白的聚糖型材(
      • Furukawa J.
      • 富士坦N.
      • Araki K.
      • Takegawa Y.
      • Kodama K.
      • Shinohara Y.
      在吡唑啉酮类似物存在下通过β-消除分析丝氨酸/苏氨酸后翻版改性的通用方法。
      ,
      • Zauner G.
      • Koeleman C.A.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      质谱 O-合并后的甘草分析 O-聚糖通过β-消除和1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮标记释放。
      )。在硫醇(2-巯基乙醇)的存在下进行,为肽添加迈克尔(
      • Furukawa J.
      • 富士坦N.
      • Araki K.
      • Takegawa Y.
      • Kodama K.
      • Shinohara Y.
      在吡唑啉酮类似物存在下通过β-消除分析丝氨酸/苏氨酸后翻版改性的通用方法。
      ,
      • Zauner G.
      • Koeleman C.A.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      质谱 O-合并后的甘草分析 O-聚糖通过β-消除和1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮标记释放。
      )类似于早些时候 O-GLCN研究(
      • Vosseller K.
      • 汉森K.C.
      • Chalkley R.J.
      • 特立尼达J.C.
      • 井L.
      • 哈特G.W.
      • 伯灵名A.L.
      通过稳定同位素标记用二噻唑啉稳定同位素标记的蛋白质表达和丝氨酸/苏氨酸的定量分析。
      )。用单位糖肽,这具体而言 O-Glycan到特定序列,一个功能丢失了多个站点。

       序列文档,ITMSn 一般考虑因素

      聚糖以多种方式表现出它们的活性,包括调节蛋白质的构象和溶解度,或用作缀合物受体,活化剂或阻断剂。然而,它很清楚,大部分功能在脂质和蛋白质外表面上的具有非常特异性彩易福彩的适当定位的价位内。列出估计为3000(
      • Cummings R.D.
      甘草综合征在人类Glyce中的曲目。
      )。这种有限数与警告有迷恋,即许多糖分功能可能存在于特异性位于所选缀合物上的有限表位上。以特征为特征,这些表位的重点努力将是功能性糖生物学的捷径;但是,缺乏孤立和确认这些细节的敏感程序。单独的准确的质量组成和色谱分离不能满足生物工程的定性需求,渴望设计阻断类似物,疫苗和抗体以控制疾病进展。这种缀合物具有血红蛋白的异构体,两个立体和彩易福彩,细节,其细节举例说明了对序列的理解的主要障碍,无论是否体现在表位中。当代MS研究可以总结为实现糖苷和横环片段的组合以确定具有分支信息的单体序列的组合。粘合破裂与能量沉积有关(尽管自由基化学改变该特征),其中分子分散是立即切割第一键(酮苷和氨基喹啉),最后是交叉环键。在操作上,追求和期望彩易福彩的所有组分可以在一个或二维MS谱中表示,可能是短视的,特别是在考虑不同的粘合强度和未提高立体声和彩易福彩异构复杂性的情况下。乐于乐于乐于乐意,似乎仔细控制能量沉积可以选择性地拆卸聚糖,但是这种精度和速度目前是不可用的。
      在早期追求测序目标时,我们在1985年促进了我们的第一次冒险融入碳水化合物彩易福彩的碰撞激活(
      • carr s.a.
      • reinhold v.n.
      • 绿色B.N.
      • 哈斯J.R.
      中性气体碰撞增强晶圆化碳水化合物样品中的彩易福彩信息。
      ),我们在20世纪90年代初期实现了ESI和MALDI软离子化技术的机会。但是,迷住了我们最大兴趣的仪器一直是离子陷阱顺序拆卸的独特能力。来自这些仪器的数据输出的是,特别是与MS / MS分析中错过的连锁和支链异构体的透明度对比时。制备样品作为甲基衍生物,详细研究具有已知的生物学,并且许多应用令人信服(
      • 安东尼下午
      • nimmerjahn f.
      • Ashli​​ne D.J.
      • reinhold v.n.
      • 保尔森J.C.
      • Ravetch J.v.
      具有重组IgG Fc的IVIG抗炎活性的综合。
      ,
      • Sheeley d.m.
      • reinhold v.n.
      碳水化合物序列,连杆和支链中的彩易福彩表征在四极离子阱质谱仪中的分支:中性低聚糖和 N - 链接的聚糖。
      ,
      • Stumpo K.A.
      • reinhold v.n.
      N - 人血浆的凝血。
      ,
      • Spaink H.P.
      • Sheeley d.m.
      • van brussel a.a.
      • Glushka J.
      • 约克W.S.
      • 塔克
      • 盖杰奥。
      • 肯尼迪e.p.
      • reinhold v.n.
      • Lugtenberg B.J.
      一种新的高度不饱和脂肪酸部分的脂质 - 寡糖信号决定了宿主特异性 根序.
      ),这些和相关研究的生长是,即使在经典的糖蛋白标准品,RNase B和卵磷酸铵中,甘草异构体已被普遍忽视,即
      • Prien J.M.
      • Ashli​​ne D.J.
      • Lapadula A.J.
      • 张H.
      • reinhold v.n.
      来自牛核糖核酸酶B异构体的高甘露糖苷族通过离子阱MS表征。
      ,
      • 娇杰
      • 张H.
      • reinhold v.n.
      聚糖的高性能IT-MS测序(卵磷酸异构体的空间分辨率)。
      )。在两个例子中,最近使用HPLC的广泛正交努力确认了这种发现(
      • Prien J.M.
      • Prater B.D.
      • Cockrill S.L.
      一种多方法方法 德诺维 聚糖表征:一个Man-5案例研究。
      )和imms(
      • 朱F.
      • 李斯。
      • 情人节S.J.
      • 赖利J.P.
      • CLEMMER D.E.
      IMS-MS / MS分析的Mannose7 Glycan异构体表征。
      )。通过这些前面的发现,我们开始了从市售的小低聚体编制的可搜索碎片库(
      • 张H.
      • Singh S.
      • reinhold v.n.
      碳水化合物测序的一致策略。 2. fromlib:一个ms n spectral library.
      ),主要由主要合成团队提供支持的持续努力(见致谢)。未报告的异构体(
      • Ashli​​ne D.J.
      • Lapadula A.J.
      • 刘Y.H.
      • 林米
      • 格蕾丝
      • Pramanik B.
      • reinhold v.n.
      通过顺序质谱法分析碳水化合物彩易福彩异构体。
      )在这种研究的IgG Fc-Glycans中,提出了专注于功能疫苗和抗生素的设计和合成但缺乏详细的彩易福彩理解的巨大生物工程努力。
      离子阱中的序贯拆卸是有趣的,其操作原理与聚糖拆卸最同步。在向突出的离子提供能量时,唯一定义的变量是它们的尺寸(更少的振荡器),用于能量分散。较小的离子可容纳具有更大碎片的激发(准均衡理论的单词描述,Qet)。在这种反比关系中,位于离子陷阱的美丽;最小的碎片破裂了最稳定的债券。这在三个有利的离子的MS光谱中是最明显的,冰淇淋,二聚体和单体(Fig. 2)。差异是鲜明的,追随Qet理论。离子质量和中性损失的图案是提供良好的彩易福彩感。但是,与绘制的丰度光谱相结合,猜测工作消失了。连锁点增加环不稳定性,经常在复古酰胺 - 桤木子降解模式之后。通过选择不同的拆卸途径并显示匹配的产品光谱,可以接近这些最终产品彩易福彩的确认。钾和锂可以用作替代阳离子,尽管一些理解和经验很重要。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2振荡器和能量关系,Qet。 三种不同的前体离子及其随后的CID光谱的呈现支持Qet的Qet理论,具有较少的振荡器的更大不稳定性(碎片)。小姐2, m/z 1235.9+2,双电荷离子提供了频谱(左上角)显示神经氨基苯基和甲己键的主要碎片。较小的碎片, m/z 486和472,表示LACNAC彩易福彩,后部离子14da Da下降指示前连接位点并定位神经氨氨基。在该光谱中也显而易见为B / Y离子连接(非终末端)单糖片段, m/z 227.这种片段的拆卸(右下)提供了将羟基定位为6的交叉环切割的组合。
      总之,有些讽刺意味的是,以顺序方式操作的质量测量仪器可以被利用,以优于大多数,如果不是全部,电流的色谱系统,并且由此基于离子碎片提供不同类型的分辨率,可以优于大多数情况来解决彩易福彩细节。他们的关系。这些细节已编译在可搜索的库中,从而记录了拆卸和细节营养不良的步骤(Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6)。这些不断发展的结果提示我们超越分辨率(不同的色谱介质)到空间中的分辨率(离子陷阱的碰撞空间),我们有多年的时间被认为是具有最大的承诺提供最大的承诺一种综合的碳水化合物序列。许多批评者主要涉及真空空间可能导致彩易福彩理解的概念。进一步关注的是需要甲基化和无法看到异端。然而,甲基化只是未经训练的难以困难,并且有限的做法通常解决了这些问题。固相甲基化(
      • Mechref Y.
      • 康P.
      • Novotny M.v.
      用于拟合分析的固相渗透液。
      )现在使这是一个理想的本科练习。在金属离子结合特异性的基础上观察并合理地观察到反映异常和立体异构体差异的片段光谱,但需要进行多少来定义限制。这些问题提出了良好的研究问题和C型离子(
      • Domon B.
      • Costello C.E.
      使用高性能串联质谱法阐明糖磷脂和神经节苷脂的彩易福彩。
      )可能是一个开始的好地方。太空中的碰撞是瞬间的,几乎没有机会的平衡;与液体中的异常问题不同,因此没有理由彻底拒绝这样的研究。虽然许多细节仍有待澄清,但我们向前搬家组装了一组已经汇总的支持工具和技术(
      • reinhold v.n.
      • Ashli​​ne D.J.
      • 张H.
      被捕获的离子质谱法的实际方面。
      )。已经编制了一个片段图书馆,该图书馆的组成综合性标准数量有限,用于功能综合征(J.Paulson),复杂的碳水化合物研究中心(G. Boons)和众多众多的商业样品。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4人血清 N-Glycans;详细的异构体包括SLEx, m/z 1502.8+2. 制备释放的聚糖作为还原和甲基化的类似物制备,并直接注入芯片的纳米电池电离系统并通过ITMS分析n。得到的质量型材(小姐1)对比,IgG耗尽和非料等血浆样品形成对比,并将这些结果与最近的文献报告相比再次。在耗尽之前,检测到〜50〜50〜50个独立的聚糖离子;在耗尽后,这增加到106。体积范围的分析为1-5kDa,其中包括通过更高的MS分辨率解决的许多双倍和三次带电离子。拆卸耗尽样品中的选定离子以定义它们的详细彩易福彩(
      • Stumpo K.A.
      • reinhold v.n.
      N - 人血浆的凝血。
      )。这种非粗糙度,直接输注和气相彩易福彩表征的简单性与使用替代仪器和辅助技术的最新报告有利地比较。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6透析末端SiaLyl乳糖基的模拟。 在复杂彩易福彩上定义详细彩易福彩通常需要多个拆卸步骤。样本纯度是通常的问题, IE。 没有检测灵敏度。不纯的分数是常见的,但重要的问题确实得到解决了(
      • 安东尼下午
      • nimmerjahn f.
      • Ashli​​ne D.J.
      • reinhold v.n.
      • 保尔森J.C.
      • Ravetch J.v.
      具有重组IgG Fc的IVIG抗炎活性的综合。
      )。芯片输液(促销 - Triversa)是增加占空比时间的重要方法,较新的仪器肯定会接近这个问题。然而,存在拆卸的途径以满足全部表征。中止的唾液酸(2-3 / 6)联系问题()可以通过在B / Y加仑部分的碎片期间形成的定义横环片段来解析,分离为锂化 m/z 211离子。单独拆卸两个唾液酸乳糖标准以暴露GAL残基。显示所得光谱,以及与一个SLE分离的相同片段x 标准和IVIG样品。羟基对3-或6个位置的定位产生明显不同的质谱。

      超出MS / MS之外的彩易福彩细节

      质谱仍然是糖蛋白分析的选择仪器。所有索赔的灵敏度,灵活性和中等成本保证。在上一节中,我们总结了几个因素,使顺序拆卸成为暴露碳水化合物细节的更有效的策略。在本节中,我们将该理解扩展到从人血清IgG和培养的乳腺癌细胞中分离的异构聚糖彩易福彩。 N - 溶解,甲基化和质量分布。普通的 m/z 观察到2260.3离子具有加仑的组成2GLCNAC.2DHEX + MAN3GLCNAC.2 和一款双重带电的离子, m/z 1141.8+2,预期的IgG-G2F Glycan。该离子的MS / MS分析显示在 Fig. 3一个,左上面板。 与培养的乳腺癌细胞分离相同的离子,并以类似的方式工作 Fig. 3B。我们之前已经表明,在进一步分析(MS3,4)IgG样品主要由G2彩易福彩组成,具有两个较小的异构体(
      • Ashli​​ne D.J.
      • Lapadula A.J.
      • 刘Y.H.
      • 林米
      • 格蕾丝
      • Pramanik B.
      • reinhold v.n.
      通过顺序质谱法分析碳水化合物彩易福彩异构体。
      )。女士2 来自培养的乳腺癌细胞的光谱显示额外的碎片 m/z 660 and 690 (Fig. 3B),从IgG谱中不存在(Fig. 3A)。隔离和cid的 m/z 660离子提供了MS3 spectrum (Fig. 3D)。这些光谱结果表明了LE的混合物x 和H2抗原和B型片段(
      • Domon B.
      • Costello C.E.
      使用高性能串联质谱法阐明糖磷脂和神经节苷脂的彩易福彩。
      )彩易福彩显示在 Fig. 3C,右上面板。这 m/z 690片段表示GAL-GLCNAC B型片段。拆卸生产了MS3 和 MS4 Spectra显示。重要的是,MS4 光谱清楚地识别半乳糖残留物之间的4个连杆;这很难确定早期的MSn 阶段。这些片段通过光谱匹配确认(
      • 张H.
      • Singh S.
      • reinhold v.n.
      碳水化合物测序的一致策略。 2. fromlib:一个ms n spectral library.
      )。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3两种不同样品异构体的比较分析。 释放释放的聚糖制备的甲基化类似物,并直接注入基于芯片的纳米电池电离系统并通过ITMS分析n。异构体的比较分析来自两种不同的样品,IgG(A)和乳腺癌细胞(B)。每个样本提供频谱,MS2 (AB),带有gal的组成2GLCNAC.2DHEX + MAN3GLCNAC表明G2F GLYCAN(预期损失的还原终端GLCNACOL)提供 m/z 1141.8离子。额外的拆卸,MS3–5,IgG样本(A)证明了纠正的假设,G2F(
      • Ashli​​ne D.J.
      • Lapadula A.J.
      • 刘Y.H.
      • 林米
      • 格蕾丝
      • Pramanik B.
      • reinhold v.n.
      通过顺序质谱法分析碳水化合物彩易福彩异构体。
      )。从频谱中隔离相同的离子 B 提供光谱 C-E.在检查上,其分别表明了初始聚糖离子分别由两种不同的末端价表位,Lewis X和H 2抗原,异构I和II组成。消息是,分析限于MS / MS可能不是一种综合方法。

       结肠直肠癌细胞系和SLEx 表位彩易福彩细节

      SLE的高表达a 似乎是预测结肠直肠癌患者复发的预后措施。有人建议对SLE的临床评价a Ca-19-9抗原可用于手术切除后的Coadjuvant疗法的规划,特别是在高SLE的患者中a expression. ITMSn 有能力在彩易福彩上区分异构SLEa/ SLE.x 抗原和同样重要的,指定它们在不同的糖凝固术平台上的环境(脂质, N-, 或者 O-连接的糖蛋白)。在平台大纲之后(Fig. 1),首先用亲脂溶剂提取干燥样品(Fig. 1B)除去可溶性GSL,并溶解残基用于单独释放 N- 和O-聚糖。我们没有仔细评估PMP不重复释放,因此使用经典的基础还原消除来制备这些 O-聚糖。发布 N-glycans是固相萃取纯化,减少,直接甲基化ITMSn 分析。离子组合物H5N4A2F1(Fig. 4)拟合岩藻糖基化,雌性酸酯和双甘油,由MS分成两种异构体2 (Fig. 5)。生产, m/z 1356+2,通过损失还原终端GlcNAc形成的H5N3A2F1保留岩藻糖,因此选择了MS3 analyses (Fig. 5, 中频),提供了片段组合物,表明SLEx,就在 m/z 646.4和1021.6。但证据只能通过额外的拆卸步骤来实现4/5。该光谱提供了最佳的产品离子, m/z 315.2。这种片段通常提供横环 3,5X离子固定三个彩易福彩部件,确认为SLEx 彩易福彩体。不幸的是,来自该50μL血清样品的离子电流不足以在单体水平上评估。这些SiaLyl联动细节如图所示 Fig. 6.
      图缩略图GR5.
      Fig. 5顺序拆卸, m/z 1502.8+2. 制备释放的聚糖作为还原和甲基化的类似物制备,并直接注入芯片的纳米电池电离系统并通过ITMS分析n (
      • Stumpo K.A.
      • reinhold v.n.
      N - 人血浆的凝血。
      )。检查一个岩氧化离子, m/z 1502.8+2,2982.6+1 (红星)被拆卸用于彩易福彩细节。该组合物的两种异构体在岩藻糖位置(终端核心GLCNAC和抗绕组)不同。后者拥有一个slex 表位,详细说明 Fig. 5, Fig. 6。可以从MS中的片段离子中考虑两个所提出的彩易福彩3,4,5。倒数第二次破裂(MS / MS)定义异构体, m/z 1269.6和1356.1,而 m/z 646.4和1021.6(MS / MS)建议SLE x 表位。这些只能在进一步拆卸时被证明。孤立的孤立 m/z 1346.1 for MS3 提供标记离子 m/z 646和1021定位岩藻糖基 - LACNAC部分。提出的半乳糖基残留物(B)必须孤立以定义SiaLyl连杆。在这种血液样本中,离子电流不足,并且无法回答该问题。看 .

       较小低聚物中的唾液酸胶质细节

      拆卸到小的低聚体和光谱匹配是对彩易福彩的全面了解的必要条件。样品杂质是生物学研究的一个事实,但通过包括额外的净化步骤(
      • 安东尼下午
      • nimmerjahn f.
      • Ashli​​ne D.J.
      • reinhold v.n.
      • 保尔森J.C.
      • Ravetch J.v.
      具有重组IgG Fc的IVIG抗炎活性的综合。
      )。芯片输液(Auvivion-Triversa)是一种增加占空比时间的方法,较新的仪器肯定会开发可比的灵敏度增强功能。但是,拆卸的途径确实存在具有纯样品和较小的低聚物的完全表征。 SiaLyl(2-3 / 6)联系问题(Fig. 5)在血清样品中,可以用一个另外的步骤解决。如图所示 Fig. 6,可以解决唾液酸连杆,如图所示 Fig. 6 通过暴露B / Y型半乳糖部分。在该策略中,锂添加在优异的离子电流和光谱分析方面证明有利。单独拆解两个唾液酸乳糖标准以通过选择B / Y型离子来暴露连接加仑残基, m/z 211,其与Sicchiate的彩易福彩相同 m/z 227离子 Fig. 5。底部两个光谱是与SLE分离的相同片段x 标准和IVIG样品。

      小姐n 光谱处理和库搜索

      图书馆谱数据的确认是一个基本组件,支撑了这个开始技术。该图书馆主要从许多小型市售的低聚物和标准糖蛋白组成,但合成贡献定期到达。这些结果也得到了证明,当拆卸的替代途径以及与合作者提供的合成标准造影时(James Paulson,Consoral Glycomics的联盟; Geert-Jan Boons,复杂的碳水化合物研究中心)。软件组工具(Fraglib工具包)设计用于构建MSn 图书馆并促进原始光谱文件的管理(
      • 张H.
      • Singh S.
      • reinhold v.n.
      碳水化合物测序的一致策略。 2. fromlib:一个ms n spectral library.
      ,
      • reinhold v.n.
      • Ashli​​ne D.J.
      • 张H.
      被捕获的离子质谱法的实际方面。
      )。该工具捕获每个频谱的原始数据文件,路径和峰值/丰度列表,将它们转换成具有较小磁盘占地面积的单个光谱库组件。工具支持各种社区接受的频谱格式。因此,可以选择NIST MS搜索工具和其他常用软件作为库搜索引擎,以将未知数匹配到累计的Glycan标准。用小碎片和增强的碎片,一个msn 图书馆提供了甘草彩易福彩的详细光谱证据。

      结论

      在当代糖蛋白组的报告中,碳水化合物异构体,连杆和分支细节通常是未解决的和仪器透明的,即使加上一系列连字技术。这种无法检测到缺席的经常项目,但没有证据不是缺席的证据。替代信息,例如高分辨率(质量或色谱),生物推断,统计,串联MS或联系分析确实提供了更多的数据,但是确凿的和可重复的彩易福彩信息仍然难以捉摸。终端价胸部(
      • Cummings R.D.
      甘草综合征在人类Glyce中的曲目。
      )是常见的并且可以驱动大量组分的糖生物学,并且非常重视这种彩易福彩的核算。然而,实现此类目标的差距是相当大的,特别是在试图匹配生物工程者所需的细节时以及从个性化医学所设想的承诺。在考虑这些细节的障碍时,列表中的不同样品制备必须高,并且随着样品量变小,问题接近不可能。这是合作努力仍然至关重要的地方,也许一开始就是样品准备的统一方式。从这些样本中,对彩易福彩细节的攻击可以最有效地进步,我们想建议ITMSn 显然是选择的技术。这种方法虽然质量非常高,但它有所限制,因为它需要稍微大量的样品,每个样本的时间大量投资,特定的MS仪器以及一定程度的专业知识和数据库查询。在MS应用程序的短期内,这些问题将清楚地解决。然而,通过更广泛地采用此类方法,改进样品处理,仪器和软件自动化,这些障碍最终可以克服。

      致谢

      我们非常感谢Jim Paulson(Consortium for Timinal Glycomics)提供的合成标准,Geert-Jan Boons(复杂的碳水化合物研究中心),以及Khushi Matta博士。

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