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抗体的糖蛋白分析*

  • Gerhild Zauner.
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    生物分子质谱仪,后期9600,2300RC莱顿大学医学中心,莱顿,荷兰
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  • 莫里斯H.J.Selman.
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    生物分子质谱仪,后期9600,2300RC莱顿大学医学中心,莱顿,荷兰
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  • 阿尔伯特邦德
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    生物分子质谱仪,后期9600,2300RC莱顿大学医学中心,莱顿,荷兰

    荷兰鹿特丹3000CA大学医学中心风湿病系
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  • yoann rombouts.
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    莱顿大学医学中心风湿病学系9600,2300RC莱顿,荷兰
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  • 丹尼斯空白
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    生物分子质谱仪,后期9600,2300RC莱顿大学医学中心,莱顿,荷兰
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  • AndréM.Deelder.
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    生物分子质谱仪,后期9600,2300RC莱顿大学医学中心,莱顿,荷兰
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  • 曼弗雷德武力
    一致
    应如何解决对应的通信:生物分子质谱单元,寄生虫学系,莱顿大学医疗中心,Postbus 9600,2300RC Leiden,荷兰,
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    生物分子质谱仪,后期9600,2300RC莱顿大学医学中心,莱顿,荷兰
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了欧洲联盟第七框架计划(FP7-Health-F5-2011)的资金支持,授予协议No.278535(Highglycan)和荷兰运动炎基础项目NR。 NR 10-1-411(适用于Albert Bondt)和NR 10-1-204(对于Yoann Rombouts)。 Maurice H. J. Selman感谢Hoffmann La Roche进行财务支持。
    本文含有补充材料。
    § 这些作者同等贡献这项工作。
      已显示抗体糖基化与各种方法改变。该综述提供了释放的聚糖,糖肽和完整蛋白质水平的抗体糖基化分析的质谱方法。关于彩易福彩片段可结晶的糖基化,质谱表明其特异性高通量分析的潜力。相比之下,由于肽部分的巨大异质性,多克隆彩易福彩的片段抗原结合糖基化分析完全依赖于聚糖释放。在彩易福彩旁边,IgA的注意力揭示了其O-和N-糖基化的研究显示出疾病相关的糖基化变化。 IgM和IgE的糖蛋白分析在后面滞后,但应该完成我们的糖基化的图片'S对抗体功能的影响。

      免疫球蛋白糖基化的生物学作用

      免疫球蛋白(IGS)
      使用的缩写是:
      ecd.
      电子捕获解离
      ESI
      电喷雾电离
      工厂
      片段抗原结合
      FC.
      片段结冰
      FTICR.
      傅里叶变换离子回旋谐振
      加尔
      半乳糖
      GLCNAC.
      N-乙酰葡糖胺
      HILIC.
      亲水性相互作用液相色谱
      人力资源
      铰链区
      IG.
      Immunglobulin.
      m
      单克隆抗体
      rp.
      反转阶段。
      由自适应免疫系统产生,以鉴定和中和外部抗原和宿主已经暴露的病原体。在人类中,在免疫应答期间通过B细胞以可变量分泌了五类已知的Ig(彩易福彩,IgM,IgA,IgE和IgD)。虽然这些IG类是由IG结构域构建的,因此在结构上相关,但它们在若干方面而异,例如它们的糖基化(
      • 阿诺德J.N.
      • Wormald M.R.
      • SIM R.B.
      • rudd下午
      • DWEK R.A.
      糖基化对人免疫球蛋白生物学功能和结构的影响。
      )。在过去的30年中,众多研究探索了IG糖基化的结构,生物学和临床作用,主要关注彩易福彩分子,即最丰富的血清Ig,在10至15mg / ml(彩易福彩1的值)中发生人类流通(
      • 阿诺德J.N.
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      • SIM R.B.
      • rudd下午
      • DWEK R.A.
      糖基化对人免疫球蛋白生物学功能和结构的影响。
      )。每个彩易福彩分子由两种重和两个轻链组成,它们一起形成两个片段抗原结合(Fab)部分和一个片段可结晶(Fc)部分( Fig. 1)。两种N-Glycans在C中与ASN 297的重链有关H2个蛋白质骨干(FC部件)的结构域。这些Fc聚糖部分位于两条重链之间的腔体中并影响蛋白质的构象(
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      人彩易福彩-Fc糖族的结构分析揭示了糖基化与结构完整性之间的相关性。
      )。它们通过糖苷酶或通过糖基化位点的突变除去降低彩易福彩与Fc-γ受体(FcγR)的结合(
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      糖苷化嵌合小鼠 - 人彩易福彩的研究。碳水化合物在人彩易福彩恒定区域介导的结构和效应功能中的作用。
      )。 Fc连接的碳水化合物是具有高水平核 - 岩藻糖基化的复合型碳化碳,具有高水平的半乳糖(GAL),导致普照的甘油膜G0F(NO GAL),G1F(一个GAL)和G2F(两个gal)。这些聚糖的次要比例可能含有分别的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基和/或末端唾液酸,其替代天线GAL(
      • Parekh R.B.
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      • Kobata A.
      类风湿性关节炎和初级骨关节炎与总血清彩易福彩的糖基化模式的变化。
      ) (看 Fig. 1)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1人彩易福彩和IgA的糖蛋白分析。 彩易福彩1(P01857),彩易福彩2(P01859),彩易福彩3(P01860),彩易福彩4(P01861),IgA1(P01876)的彩易福彩3(P01861),IGA1(P01876)和IgA2(P01877)的糖基化。重链以灰色,紫色的分泌物组分(P01833)的灰色,轻质链条,橙色的连接链(P01591)。糖基化位点分别由各自的氨基酸数和示意性N-和O-聚糖表示。除了分泌组分和SIGA的连接链之外,给出了所有恒定区域糖基化位点的胰蛋白酶肽。根据CFG符号表示糖类;蓝色正方形,N-乙酰葡糖胺;绿色圆圈,甘露糖;黄色圆圈,半乳糖;红色三角形,岩藻糖;紫色金刚石,唾液酸。如果已知,给出了关于N-Glycan结构的更多信息(
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      人血清IgD和IgE的糖基化和鉴定的低哥域结构与甘露结合凝集素相互作用的可及性。
      )。对于IgA,括号中的值表明血浆IgA / SIGA中的丰度。根据DeshPande报道了IgA HR肽上的O-聚糖的组合物 等等。 (
      • deshpande n。
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      GlycoSpectrumscan:来自人初乳蛋白酶消化的MS Spectra的捕鱼糖肽。
      )。
      许多报告描述了彩易福彩 Fc糖基化的变异,特别是与年龄,性别,遗传性和怀孕,以及自身免疫疾病,传染病和癌症相关的含半乳糖基化程度的变化,以及自身免疫性疾病(例如 参考。
      • Parekh R.
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      血清彩易福彩半乳糖基化疾病相关变化的比较分析。
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      多重幼年特发性关节炎亚型证明促炎彩易福彩糖基化。
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      IG.G - 可变异性和彩易福彩 Glycome中彩易福彩 Glyce中彩易福彩变异性的高通量分离和糖基化分析。
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      血清N-聚糖的超高性能液相色谱分析,用于快速有效地鉴定糖基化的癌症相关改变。
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      IG.G糖基化分析。
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      • Parekh R.B.
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      类风湿性关节炎和初级骨关节炎与总血清彩易福彩的糖基化模式的变化。
      )和与疾病进展和严重程度相关(
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      IG.G的早期羟甲酰基化与类风湿性关节炎患者的更加渐进的疾病课程有关:随访研究的结果。
      )。这些临床观察引领研究人员详细研究了Fc甘油结构,彩易福彩的生物学性质与炎症程度之间的关系。发现不存在唾液酸和低水平的半乳糖基化可以通过促进免疫复合物的形成并赞成彩易福彩与激活FcγR的结合(
      • 杰弗里斯r.
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      IG.G-FC介导的效应功能:效应配体的相互作用位点的分子定义和糖基化的作用。
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      氨酰胺化彩易福彩抗体取决于体内活性的细胞Fc受体。
      )。类似地,不存在核 - 岩藻或分化GlcNAC的存在改善了Fc尾部对FcγIIA的亲和力,从而提高了依赖于抗体依赖性细胞毒性(
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      人彩易福彩1 N-连接的寡糖上缺乏岩藻糖,改善了对人FcγRIII和抗体依赖性细胞毒性的结合。
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      需要独特的碳水化合物 - 碳水化合物相互作用在缺乏缺乏芯岩藻糖的抗体之间的高亲和力结合。
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      抗体Fc结构域均匀糖族化学酶合成与Fcγ受体结合。分数糖部分的存在增强了Fc对FcγAIIA受体的亲和力。
      )。在此基础上,携带逐渐消耗的Fc聚糖的新的甘油化抗癌抗体目前在临床开发中,例如用于对B细胞淋巴瘤(GA101)的抗CD20单克隆抗体(MAb)Obinutuzumab(Ga101)(
      • Salles G.
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      II型甘油型人源化抗CD20单克隆抗体ObInutuzumab(Ga101)的第1次研究结果在B细胞淋巴瘤患者中。
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      obInutuzumab诱导的第1期研究,然后进行了2年的复发CD20阳性B细胞恶性肿瘤患者的维持。
      )。
      此外,Fc-Linked Glycans似乎调节了补体系统的激活。而典型的补体途径可以通过C1Q对完全半乳糖基化彩易福彩的优先结合触发,因此通过甘露糖结合凝集素识别羟乙酰化彩易福彩募集凝集素途径(
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      与类风湿性关节炎相关的彩易福彩的糖基化变化可以通过甘露糖结合蛋白激活补体。
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      FC. Glycans的末端糖影响彩易福彩S的抗体效应功能。
      )。相反,Fc聚糖上的末端半乳糖和/或唾液酸残基的存在可能通过与人凝集素-1的相互作用赋予彩易福彩的抗炎性质(
      • karsten c.m.
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      FC半乳糖基化和Fcγ1iib和Dectin-1介导的彩易福彩1的抗炎活性。
      )树枝状细胞特异性细胞间粘附分子-3-抓住非整合蛋白(
      • Kaneko Y.
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      FC.唾液酸溶胶产生免疫球蛋白G的抗炎活性。
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      IG.G Fc Glycan的一种新颖作用:唾液酸化彩易福彩 Fcs的抗炎活性。
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      静脉内伽膜蛋白通过新型T(H)2途径抑制炎症。
      )。因此,通过调节彩易福彩与几种免疫成分的相互作用,包括FCγR,补体因子和凝集素,可以通过调节彩易福彩的相互作用来使免疫系统倾斜免疫系统朝向预炎症或抗炎反应。有趣的是,它最近建立了彩易福彩 Fc糖基化可以通过诸如激素等因素来调节(例如 雌二醇和黄体酮),细胞因子(例如 IFN-γ和IL-21),细菌DNA(CPG寡脱氧核苷酸)和食品代谢物(例如 全反式视黄酸和药物)(
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      • SIM R.B.
      • rudd下午
      • DWEK R.A.
      糖基化对人免疫球蛋白生物学功能和结构的影响。
      )。临床研究的结果还支持了糖基化在所有类别中存在一些结构和功能性作用的想法。一个例子是IgA1,其在其铰链区肽的各个位点上呈现O-糖基化(参见 Fig. 1)。在肾病中,已经观察到降低的IgA1 O-聚糖唾液酸和半乳糖基化(
      • 诺瓦克J.
      • 朱利安B.A.
      • Tomana M.
      • 默塞德J.
      IG.A糖基化和IgA免疫复合物在IgA肾病的发病机制中。
      )。这些异常糖基化的IgA1s被显示为具有较长的半衰期,以自聚集,并与免疫系统的其他分子形成复合物,包括彩易福彩和甘露糖结合凝集素,从而促进肾脏髓原率和加剧炎症中的IgA沉积(
      • 阿诺德J.N.
      • Wormald M.R.
      • SIM R.B.
      • rudd下午
      • DWEK R.A.
      糖基化对人免疫球蛋白生物学功能和结构的影响。
      )。

      IG糖基化分析分析方法

      通常可以通过(a)完整的糖蛋白分析,(b)糖肽的表征,或(c)化学或酶促释放的聚糖的结构分析(b)所述糖蛋白的糖基化分析
      • Huhn C.
      • Selman M.H.
      • Ruhaak L.R.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      IG.G糖基化分析。
      ,
      • Dalpathado D.S.
      • Desaire H.
      质谱法分析糖肽。
      ,
      • Morelle W.
      • Michalski J.C.
      质谱法分析蛋白质糖基化。
      )。糖肽或释放的聚糖水平糖蛋白的质谱分析目前是从复杂的生物样品中获得敏感和综合糖基化信息的选择方法(
      • Kolarich D.
      • Jensen P.H.
      • altmann f.
      • 包装机N.H.
      糖蛋白对特异性甘油异质性的测定。
      )。
      糖肽水平的分析是最有利的方法,因为可以表征特异性糖类异质性,并且可以将聚糖组合物与其附着位点相关联(
      • Dalpathado D.S.
      • Desaire H.
      质谱法分析糖肽。
      )。特别地,液相色谱 - 质谱(LC / MS)已广泛用于糖肽分析。 LC-Electrospray电离(ESI)-MS分析的优点是在MS分析之前(Glyco)肽的上前接线色谱分离。显然,在蛋白水解消化后,在蛋白水解物消化后的高效色谱分离方法的选择是至关重要的。为此目的,C18反相(RP)HPLC广泛使用,在亲水相互作用液相色谱(HILIC)和石墨化碳HPLC(
      • Huhn C.
      • Selman M.H.
      • Ruhaak L.R.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      IG.G糖基化分析。
      ,
      • Zauner G.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      亲水性相互作用液相色谱(HILIC)对结构性糖的最新进展。
      ,
      • NWOSU C.C.
      • Seipert r.r.
      • strum J.s.
      • 华氏
      • 一个H.J.
      • Zivkovic上午
      • 德国B.J.
      • lebrilla c.b.
      蛋白质混合物中同时和广泛的位点特异性N-和O-糖基化分析。
      )。
      释放的聚糖样品通常具有比糖肽样品较低的复杂性,并且各种靶向和未明确的糖类方法通常在释放的聚糖水平上施加。常见的高通量方法涉及C18RP和碳固相萃取纯化聚糖的渗透溶解,然后进行基质辅助激光的解吸电离(MALDI)飞行时间(TOF)MS分析(
      • Morelle W.
      • Michalski J.C.
      质谱法分析蛋白质糖基化。
      ,
      • Mechref Y.
      • 胡Y.
      • 加西亚A.
      • 周S.
      • Desantos-Garcia J.L.
      • 侯赛因A.
      用MS定义推定的甘草癌生物标志物。
      )。本综述主要集中在通过甘肽MS MS的Ig糖基化分析,并指出更多关于释放甘草分析的更深入覆盖的其他评论(
      • Mechref Y.
      • Muzikar J.
      • Novotny M.v.
      衍生自鼠单克隆抗体的N-聚糖的综合评价:一种多水滴水性方法的案例。
      ,
      • Ruhaak L.R.
      • Zauner G.
      • Huhn C.
      • Bruggink C.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      甘草标签策略及其在识别和量化方面的用途。
      ,
      • 哈维D.J.
      基质辅助激光解吸/电离质谱分析碳水化合物和糖缀合物的分析:2007-2008的更新。
      ,
      • Leymarie N.
      • Zaia J.
      有效利用质谱法进行聚糖和糖肽结构分析。
      )。

       总彩易福彩糖基化分析

      已经在释放的N-聚糖水平下广泛地研究了多克隆人彩易福彩 N-糖基化。 1985年的一纯1985年由Parekh工作 等等。 表现出与类风湿性关节炎和骨关节炎相关的胆溶胶化聚糖水平增加(
      • Parekh R.B.
      • DWEK R.A.
      • 萨顿B.J.
      • Fernandes D.L.
      • 梁A。
      • 斯坦沃思D.
      • Rademacher T.W.
      • Mizuochi T.
      • Taniguchi T.
      • Matsuta K.
      • Takeuchi F.
      • 长野Y.
      • Miyamoto T.
      • Kobata A.
      类风湿性关节炎和初级骨关节炎与总血清彩易福彩的糖基化模式的变化。
      )。该论文代表了彩易福彩研究中的主要里程碑,并利用多种方法对人彩易福彩糖基化进行了持续的研究,使用荧光检测,激光诱导的荧光检测,毛细管凝胶电泳等多种糖类分析。 ,展示彩易福彩糖基化随着年龄,性别,妊娠和疾病的变化(
      • 骨头J.
      • mittermayr s.
      • o'donoghue n。
      • Guttman A.
      • rudd下午
      血清N-聚糖的超高性能液相色谱分析,用于快速有效地鉴定糖基化的癌症相关改变。
      ,
      • Huhn C.
      • Selman M.H.
      • Ruhaak L.R.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      IG.G糖基化分析。
      )。
      IG.G的高通量分离和糖基化分析最近由催碱发布 等等。 (
      • knezevic A.
      • vidic J.
      • Adamczyk B.
      • Novokmet M.
      • Polasek O.
      • Gornik O.
      • Supraha-Goreta S.
      • Wormald M.R.
      • Redzic I.
      • 坎贝尔H.
      • Wright A.
      • 哈斯蒂N.D.
      • 威尔逊J.F.
      • 鲁丹一世。
      • Wuhrer M.
      • rudd下午
      • josic d.
      • Lauc G.
      IG.G - 可变异性和彩易福彩 Glycome中彩易福彩 Glyce中彩易福彩变异性的高通量分离和糖基化分析。
      ):使用96孔蛋白G单片板从等离子体有效地分离2298个个体的彩易福彩。使用具有2-氨基苯甲酰胺标记的PNGase F释放的N-聚合物,并通过HILIC HPLC进行荧光检测分析。观察到个体中彩易福彩糖基化的高变异性,并发现比总血浆N-Glycome高约三倍。在这种情况下,遗传性被发现在30%和50%之间,性别似乎是任何彩易福彩聚糖的重要预测因素。发现唾液酸化是最内源性定义的糖基化特征,可遗传性解释的差异高达60%。
      释放聚糖水平的彩易福彩糖基化的总彩易福彩糖基化分析从彩易福彩的不同亚类寄存来自Fc和Fab聚糖的混合物。提供更多关于彩易福彩糖基化的方法的方法在以下两部分中提出。

       IG.G Fc糖基化分析

      对胰蛋白酶糖糖肽的质谱分析允许基于氨基酸序列的微小差异来辨别不同人彩易福彩亚类(Fig. 2)。对于彩易福彩3,不同的异型似乎在不同的族群中占上风(
      • Dard P.
      • Lefranc M.P.
      • Osipova L.
      • Sanchez-Mazas A.
      DNA序列的IGHG3等位基因与人群主要G3M单倍型相关的等位基因。
      ,
      • 杰弗里斯r.
      • Lefranc M.P.
      人免疫球蛋白同质型:可能对免疫原性的影响。
      )。分析来自高加索人的彩易福彩3主要揭示了同组型G3M(B *),其在296(
      • Balbin M.
      • Grubb A.
      • de lange g.g.
      • Grubb R.
      特异于白种人G3M(B)和(G)同质型的DNA序列:基因组水平的均等。
      )。因此,彩易福彩2和彩易福彩3的所得胰蛋白酶蛋白酶糖肽显示出相同的肽部分。相比之下,据报道,来自亚洲供体的彩易福彩3在296中表现出酪氨酸(Y),导致彩易福彩3和彩易福彩4的相同肽部分(
      • Dard P.
      • Lefranc M.P.
      • Osipova L.
      • Sanchez-Mazas A.
      DNA序列的IGHG3等位基因与人群主要G3M单倍型相关的等位基因。
      )。因此,当比较遗传不同组的亚类特异性彩易福彩 Fc-糖基化谱时,必须考虑等型变化。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2小鼠和人血浆彩易福彩 Fc糖基化差异。 胰蛋白酶糖肽(A)小鼠(彩易福彩1,Bae25911,Bac30871; 彩易福彩2A,P01863,P01864; 彩易福彩2B,P01867; 彩易福彩3,P03987)和人()使用0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈的梯度通过RP-NANO-LC SHEATH-流量ESI-MS分析多克隆彩易福彩。光谱表示描绘的45-S洗脱窗口的总和[m + 3h]3+ 鼠彩易福彩2a / b的种类(B)和人彩易福彩1(C)Fc糖蛋白。
      IG.G Fc糖基化分析的一种非常方便的方法是测量(胰蛋白酶)Fc糖肽,其通常通过RP-LC-MS / MS(
      • Kolarich D.
      • Jensen P.H.
      • altmann f.
      • 包装机N.H.
      糖蛋白对特异性甘油异质性的测定。
      ,
      • Perdivara I.
      • 弄脏L.J.
      • Cozma C.
      • Tomer K.B.
      • Przybylski M.
      表位特异性抗β-淀粉样蛋白抗体的糖基化曲线液相色谱 - 质谱分析。
      ,
      • Stadlmann J.
      • PABST M.
      • Kolarich D.
      • kunert r.
      • altmann f.
      糖肽和低聚糖LC-ESI-MS的免疫球蛋白糖基化分析。
      ,
      • Wuhrer M.
      • STAM J.C.
      • van de geijn f.e.
      • Koeleman C.A.
      • Verrips C.T.
      • Dolhain R.J.
      • Hokke C.H.
      • 雷德德·芬
      人血清免疫球蛋白G(彩易福彩)亚类的糖基化分析。
      )。基于单个氨基酸侧链的小结构差异观察到色谱分离。 彩易福彩1携带酪氨酸残基的胰蛋白酶粉糖糖肽在胰蛋白酶彩易福彩3 / 4糖肽(F296和Y300)前面的296和300次洗脱中,其再次在胰蛋白酶彩易福彩2 / 3 Fc糖肽(F296和F300)中洗脱。相反,聚集糖结构的变化关于半乳糖基化,岩藻糖基化和分等几乎不会影响RP保留时间。因此,在不同的保留时间窗口中观察到彩易福彩1,彩易福彩2 / 3和彩易福彩3 / 4糖肽簇。属于不同彩易福彩亚类的异构胰蛋白酶Fc糖肽物种(IE。 岩藻糖基化的彩易福彩1和非岩藻糖基化的彩易福彩3 / 4,或岩藻糖基化的彩易福彩3 / 4和非岩石化彩易福彩2 / 3)通过RP-LC始终分离,允许它们在质谱检测时对特定彩易福彩亚类的明确分配。然而,根据溶剂系统,唾液酸可对彩易福彩 Fc糖肽保留产生强烈影响。在0.1%甲酸水溶液中使用乙腈梯度导致唾液酸化物种的含量大于中性糖肽(
      • Perdivara I.
      • 弄脏L.J.
      • Cozma C.
      • Tomer K.B.
      • Przybylski M.
      表位特异性抗β-淀粉样蛋白抗体的糖基化曲线液相色谱 - 质谱分析。
      ,
      • Wuhrer M.
      • STAM J.C.
      • van de geijn f.e.
      • Koeleman C.A.
      • Verrips C.T.
      • Dolhain R.J.
      • Hokke C.H.
      • 雷德德·芬
      人血清免疫球蛋白G(彩易福彩)亚类的糖基化分析。
      )。我们最近优化了RP-Nano-LC-ESI-MS设置,用于大型彩易福彩样品中的快速和强大的亚类特异性Fc-糖基化分析(
      • Selman M.H.
      • Derks R.J.
      • 邦德A.
      • Palmblad M.
      • Schoenmaker B.
      • Koeleman C.A.
      • van de geijn f.e.
      • Dolhain R.J.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      FC特异性彩易福彩糖基化通过使用护套流动ESI喷雾器接口的鲁棒纳米反相HPLC-MS分析。
      )。将蛋白A或蛋白G亲和纯化的多克隆彩易福彩的胰蛋白酶A或蛋白质G亲和纯化的多克隆柱上收集到多孔粒子C18捕集柱上,并使用0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈(总共16分钟)在熔融核心C18柱上分离(16分钟分析时间)。当用三氟乙酸代替甲酸时,唾液酸化糖肽与其非唾液酸化对应物一起洗脱。通过使用具有异丙醇的护套流量喷雾器:水:丙酸(50:30:20; V:V)作为鞘液来实现长期稳定和稳健的质谱分析。八个主要观察到的糖肽物种的相对标准偏差在几个月的时间范围内仍然小于4%,从而允许分析成千上万的样品,具有高精度。
      HILIC.-LC-MS也被报告为用于分离聚糖和糖肽的多功能工具(
      • 吉拉姆
      • yu y.q.
      • Ahn J.
      • 谢H.
      • 韩H.
      • ying w.
      • 钱X.
      具有亲水相互作用色谱法和质谱法的糖蛋白消化的表征。
      ,
      • 辛格C.
      • Zampronio C.G.
      • Creese A.J.
      • Cooper H.J.
      较高的能量碰撞解离(HCD)产物离子触发的电子传递解离(ETD)质谱分析N-连接糖蛋白。
      ,
      • Takegawa Y.
      • Deguchi K.
      • Keira T.
      • ITO H.
      • Nakagawa H.
      • Nishimura S.
      用两性离子型亲水相互作用色谱法将异构2-氨基吡啶衍生化的N-聚糖和人血清免疫球蛋白G的N-糖肽分离。
      )。胰蛋白酶彩易福彩1 Fc糖肽经历比彩易福彩2 Fc糖肽的保留更多,因为酪氨酸残基在第296和300位(
      • Takegawa Y.
      • Deguchi K.
      • Keira T.
      • ITO H.
      • Nakagawa H.
      • Nishimura S.
      用两性离子型亲水相互作用色谱法将异构2-氨基吡啶衍生化的N-聚糖和人血清免疫球蛋白G的N-糖肽分离。
      )。此外,随着甘草尺寸/复杂性的增加,观察到更大的保留,并且由于3臂异构体的保留略微较大,因此可以往往可能在单亚烷基化物质的3臂和6臂异构体之间进行色谱区分。
      • Takegawa Y.
      • Deguchi K.
      • Keira T.
      • ITO H.
      • Nakagawa H.
      • Nishimura S.
      用两性离子型亲水相互作用色谱法将异构2-氨基吡啶衍生化的N-聚糖和人血清免疫球蛋白G的N-糖肽分离。
      ,
      • omtvedt l.a.
      • 罗伊尔L.
      • Husby G.
      • 斜线k。
      • radcliffe c.m.
      • 哈维D.J.
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      沉积疾病分泌的单克隆抗体的聚糖分析表明血浆细胞差异地处理彩易福彩聚糖的子集。
      )。在HILIC移动相中施加的高有机改性剂含量使得该分离技术特别适用于MS接口。
      通过使用HILIC固相萃取,然后直接输注ESI-MS(/ MS)来实现对彩易福彩 FC糖基化的快速和直接分析。通过直接输注ESI-MS(
      • neue k。
      • Mormann M.
      • Peter-Katalinic J.
      • Pohlentz G.
      纯化蛋白烯肽的非特异性蛋白水解和直接纳米型质谱分析阐明ZIC-HILIC型糖肽的阐明。
      ,
      • Reusch D.
      • Haberger M.
      • Selman M.H.
      • Bulau P.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      • Engler N.
      生物技术样品彩易福彩 FC-糖基化分析的高通量工作流程。
      )。或者,可以用正面或负模电离进行纯化的Fc-糖肽的MALDI-MS(
      • Kolarich D.
      • Jensen P.H.
      • altmann f.
      • 包装机N.H.
      糖蛋白对特异性甘油异质性的测定。
      ,
      • 迈尔辛S.
      • Palmisano G.
      • HOJRUP P.
      • Thaysen-Andersen M.
      利用离子配对亲水性相互作用色谱分离固相萃取,以高效糖肽富集在糖蛋白质中的富集。
      ,
      • Selman M.H.
      • McDonnell L.A.
      • Palmblad M.
      • Ruhaak L.R.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      免疫球蛋白G通过基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋谐振质谱法的免疫球蛋白曲肽分析。
      ,
      • Wada Y.
      • Tajiri M.
      • 吉达斯。
      亲水性亲和力分离和MALDI对糖蛋白酶糖肽的多阶段串联质谱。
      )。当与延迟提取TOF检测结合时,唾液酸化的Fc-甘油肽的MALDI分析可能导致大量的源极衰减,很大程度上取决于所选择的样品制备的基质。当使用α-氰基-4-羟基氨基酸时,唾液酸化物质几乎完全降解。相反,唾液酸化的Fc糖肽的分析是可以用2,5-二羟基苯甲酸和4-氯-α-氰基氨基酸,特别是当与负模电离相结合时(
      • Selman M.H.
      • Hoffmann M.
      • Zauner G.
      • McDonnell L.A.
      • Balog C.I.
      • RAPP E.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      使用4-氯 - α-氰基氨基酸基质的Maldi-Tof-MS分析唾液酸化聚糖和糖肽。
      )。有趣的是,具有中间压离子源的马尔迪傅立叶变换离子回应(FTICR)MS,允许使用2,5-二羟基苯甲酸和α-氰基-4-羟基氨基酸(
      • Selman M.H.
      • McDonnell L.A.
      • Palmblad M.
      • Ruhaak L.R.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      免疫球蛋白G通过基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋谐振质谱法的免疫球蛋白曲肽分析。
      )。这可能归因于新生离子的有效冷却,这限制了源极衰减(
      • O'Connor P.B.
      • Budnik B.A.
      • Ivleva V.B.
      • kaur p.
      • Moyer S.C.
      • 皮特曼J.L.
      • Costello C.E.
      用于傅里叶变换质谱法的高压矩阵辅助激光解吸离子源,其旨在容纳具有多样化表面的大目标。
      )。尽管直接输注-ESI-MS和MALDI-MS相对于LC / MS接近具有卓越的产量,但是通过不同彩易福彩亚类的异构胰蛋白酶糖苷的存在,可以损害多克隆人彩易福彩 Fc糖族的准确相对定量。但是,这不是MAB的问题。这些高通量方法表明了对生物制药质量控制和发酵监测的特别高潜力(
      • Reusch D.
      • Haberger M.
      • Selman M.H.
      • Bulau P.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      • Engler N.
      生物技术样品彩易福彩 FC-糖基化分析的高通量工作流程。
      )。然而,必须考虑到,与Fc部分中超过99%糖基化的人多克隆彩易福彩不同,生物制备的彩易福彩可能含有含有糖基化但缺乏糖基化的Fc肽但缺乏糖基化的Fc肽。由于大多数非糖基化肽在HILIC固相萃取时损失,RP和多孔石墨化 - 碳的样品制剂可能对这些样品有利,以便允许同时分析糖基化和非糖基化版本的FC肽覆盖物N-糖基化位点。
      用于分析生物制药上彩易福彩 Fc糖基化的另一种策略涉及通过还原或酶消化制备的完整MAb或Fc部分的ESI高分辨率-SmS(/ MS)(
      • Reusch D.
      • Haberger M.
      • Selman M.H.
      • Bulau P.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      • Engler N.
      生物技术样品彩易福彩 FC-糖基化分析的高通量工作流程。
      ,
      • Bondarenko P.V.
      • 第二个T.P.
      • Zabrouskov V.
      • makarov a.a.
      • 张Z.
      杂化线性四极离子阱 - 横谱仪对完整单克隆抗体的质量测量和倒下HPLC / MS分析。
      ,
      • Fornelli L.
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      • Kelleher N.L.
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      • Makarov A.
      • Tsybin Y.O.
      电子转移解离抗体FTMS的完整单克隆抗体彩易福彩1分析。
      )。利用电流高分辨率质谱仪获得的高质量精度允许基于典型的15-ppm的精确质量来确定完整单克隆抗体上的糖族组合物(
      • Bondarenko P.V.
      • 第二个T.P.
      • Zabrouskov V.
      • makarov a.a.
      • 张Z.
      杂化线性四极离子阱 - 横谱仪对完整单克隆抗体的质量测量和倒下HPLC / MS分析。
      )至2-ppm(
      • Fornelli L.
      • 达莫e.
      • 托马斯下午
      • Kelleher N.L.
      • Aizikov K.
      • Denisov E.
      • Makarov A.
      • Tsybin Y.O.
      电子转移解离抗体FTMS的完整单克隆抗体彩易福彩1分析。
      )质量准确性错误。此外,通过使用LC-ESI-Electron转移解离高分辨率MS / MS方法,据报道了最多33%的肽序列覆盖率,其中用于在不同LC-MS / MS实验中记录的时域瞬变在傅立叶变换信号处理之前平均(
      • Fornelli L.
      • 达莫e.
      • 托马斯下午
      • Kelleher N.L.
      • Aizikov K.
      • Denisov E.
      • Makarov A.
      • Tsybin Y.O.
      电子转移解离抗体FTMS的完整单克隆抗体彩易福彩1分析。
      )。尽管完整的糖蛋白分析适用于概况MAb上的Fc糖型糖粉,但它可能不适用于高度复杂的样品,例如人多克隆彩易福彩。
      为了阐明彩易福彩 Fc糖基化在自身免疫,炎症性疾病和癌症中的作用,许多研究使用小鼠疾病模型。然而,与唾液酸化,岩藻糖基化和分配的人彩易福彩( Fig. 2)。鼠彩易福彩上的唾液酸似乎仅是N-甘油酰胺酸,而人彩易福彩专门表现出N-乙酰氨氨酸(
      • Raju T.S.
      FC. Glycans的末端糖影响彩易福彩S的抗体效应功能。
      ,
      • Blomme B.
      • van S.C.
      • Grassi P.
      • 哈斯林三。
      • 戴尔A.
      • Callewaert N.
      • van V.H.
      慢性肝病两种小鼠模型中血清蛋白N-糖基化的改变是肝细胞,而不是B细胞驱动。
      )。此外,血清衍生的鼠彩易福彩1和彩易福彩2A / B均显示出高水平的松弛Fc糖肽(信号在 m/z 1127.41; Fig. 2A)(
      • Blomme B.
      • van S.C.
      • Grassi P.
      • 哈斯林三。
      • 戴尔A.
      • Callewaert N.
      • van V.H.
      慢性肝病两种小鼠模型中血清蛋白N-糖基化的改变是肝细胞,而不是B细胞驱动。
      ,
      • Mizuochi T.
      • 哈木乔J.
      • Titani K.
      小鼠免疫球蛋白G的糖链的结构。
      ,
      • Mizuochi T.
      • 哈木乔J.
      • 鼻梁
      • Titani K.
      自身免疫MRL / MP-LPR / LPR小鼠彩易福彩寡糖链中的结构变化。
      )。在人彩易福彩上,暂时仅据报道纯酸化的Fc N-糖肽在低相对丰度下重组表达MAB(
      • Reusch D.
      • Haberger M.
      • Selman M.H.
      • Bulau P.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      • Engler N.
      生物技术样品彩易福彩 FC-糖基化分析的高通量工作流程。
      ),但它们也可以在来自人循环的多克隆彩易福彩上发现,尽管处于低相对强度(信号) m/z 1180.79; Fig. 2B)。鼠彩易福彩上的岩藻丝化甚至高于人彩易福彩,具有非岩氧化糖型几乎完全缺失。此外,小鼠彩易福彩 Fc部分缺乏分化的物种,使得鼠彩易福彩的整体甘油曲线曲目比人彩易福彩更受限制。因此,在鼠模型中观察到的彩易福彩 Fc糖基化变异可能不会直接转化为人类情况。
      从人循环产生或衍生自人循环的彩易福彩样品通常以相对大量的(通常是微克数量),因此MS方法的敏感性不是一个问题。然而,已经证明了彩易福彩亚步骤可能在Fc糖基化型材方面从血清彩易福彩总比血清彩易福彩分散(
      • Scherer H.U.
      • 王J.
      • 脚趾r.e.
      • 范德沃德D.
      • Koeleman C.A.
      • de boer a.r.
      • Huizatea T.W.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      免疫球蛋白1(彩易福彩1)来自人血清的抗瓜氨酸肽抗体的Fc-糖基化谱。
      ,
      • Scherer H.U.
      • 范德沃德D.
      • ioan-facsinay A.
      • El Bannoudi H.
      • dr.a.a.
      • 王J.
      • Haupl T.
      • 缅因斯特G.R.
      • 雷德德·芬
      • Huizatea T.W.
      • Wuhrer M.
      • 脚趾r.e.
      从人血清和滑膜液中分离的抗瓜氨酸抗体蛋白抗体的糖粉。
      ,
      • Selman M.H.
      • de Jong S.E.
      • 凌乱的人。
      • Kroon F.P.
      • adegnika a.a.
      • 雷德德·芬
      • Hokke C.H.
      • Yazdanbakhsh M.
      • Wuhrer M.
      流感和破伤风疫苗接种抗原特异性彩易福彩1 Fc N-糖基化的变化。
      ,
      • Wuhrer M.
      • Porcelijn L.
      • Kapur R.
      • Koeleman C.A.
      • 雷德德A.
      • de haas m.
      • Vidarsson G.
      对人血小板抗原的同种疫应答期间彩易福彩的调节糖基化模式。
      )。因此,已经发现对彩易福彩的特异性亚群的分析是有益的,并且重复揭示了可能对例如致病性自身抗体和AlloAlibodies的生物活性产生深远影响的偏移糖基化曲线(
      • Scherer H.U.
      • 王J.
      • 脚趾r.e.
      • 范德沃德D.
      • Koeleman C.A.
      • de boer a.r.
      • Huizatea T.W.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      免疫球蛋白1(彩易福彩1)来自人血清的抗瓜氨酸肽抗体的Fc-糖基化谱。
      ,
      • Scherer H.U.
      • 范德沃德D.
      • ioan-facsinay A.
      • El Bannoudi H.
      • dr.a.a.
      • 王J.
      • Haupl T.
      • 缅因斯特G.R.
      • 雷德德·芬
      • Huizatea T.W.
      • Wuhrer M.
      • 脚趾r.e.
      从人血清和滑膜液中分离的抗瓜氨酸抗体蛋白抗体的糖粉。
      ,
      • Wuhrer M.
      • Porcelijn L.
      • Kapur R.
      • Koeleman C.A.
      • 雷德德A.
      • de haas m.
      • Vidarsson G.
      对人血小板抗原的同种疫应答期间彩易福彩的调节糖基化模式。
      )。值得注意的是,这些抗体通常可以通过亲和纯化仅在微量纯化中获得,并且在某些情况下发现常规的纳米LC / MS具有不充分的敏感性来分析其Fc糖基化。最近报告的瞬时涂层毛细血管分离在中性涂层毛细血管中,具有与超高分辨率TOF质谱仪接口的多孔护套喷雾器解决了这个问题,将检测的下限降至〜20 amol(
      • Heemskerk A.A.
      • Wuhrer M.
      • 布线J.M.
      • Koeleman C.A.
      • Selman M.H.
      • Vidarsson G.
      • Kapur R.
      • Schoenmaker B.
      • Derks R.J.
      • 雷德德·芬
      • Mayboroda O.A.
      耦合多孔均匀界面质谱与中性毛细血管中的瞬态 - 同胞术,提高糖肽分析敏感性。
      )。由于降低离子抑制而达到这种高灵敏度,这是典型的ESI在非常低的流速下,例如与毛细管电泳均匀的ISI-MS一起使用(
      • 布线J.M.
      • Schoenmaker B.
      • ramautar r.
      • Carrasco-pancorbo A.
      • Ratnayake C.
      • Feitelson J.s.
      • 查普曼J.D.
      • 雷德德·芬
      • Mayboroda O.A.
      高容量毛细管电泳 - 电喷雾电离质谱:偶联具有瞬时同住的多孔均匀界面。
      )。

       工厂糖基化分析

      除了FC部分上保守的N-糖基化位点外,还可以将另外的碳水化合物链与Ig的高变区域连接。例如,据报道,已经报道了从健康人受试者的血清中分离的15%至25%的彩易福彩分子以在其可变域上携带N-聚糖(
      • Anumula K.r.
      正常人血浆衍生免疫球蛋白及其片段Fab和Fc的定量甘油分析。
      ,
      • 荷兰M.
      • yagi h.
      • Takahashi N.
      • kato k。
      • 野蛮的c.o.
      • 祝大事
      • 杰弗里斯r.
      从ANCA相关的系统性血管炎患者血清中分离的多克隆彩易福彩,彩易福彩-Fc和彩易福彩-Fab的差分糖基化。
      ,
      • Stadlmann J.
      • PABST M.
      • altmann f.
      抗体唾液酸化的分析与功能方面。
      )。具有Fab Glycans的彩易福彩群已被称为不对称抗体,并被发现由凝集素康丹林A(
      • 马兰B.I.
      • 外邦人
      • Angelucci J.
      • pividori J.
      • Guala M.C.
      • Binaghi R.A.
      • Margni R.A.
      IG.G非对称分子与妊娠人的血清和胎盘分离的抗过剂活性。
      ,
      • Margni R.A.
      • 马兰B.I.
      不对称彩易福彩抗体的矛盾行为。
      )。有趣的是,发现不对称彩易福彩的量在妊娠期间增加,以及用荷尔蒙治疗产生抗体的细胞(例如 黄体酮,雌激素)和细胞因子(例如 IL-6) (
      • CANELLADA A.
      • 布洛伊斯州
      • 外邦人
      • Margni Idehu R.A.
      通过雌激素,孕酮和白细胞介素-6的保护性抗体反应的体外调节。
      ,
      • Gutierrez G.
      • 马兰B.I.
      • Margni R.A.
      非对称彩易福彩抗体合成中涉及的胎盘调节因子应对IL-6特征进行响应。
      ,
      • Zenclussen A.c。
      • 外邦人
      • kortebani g。
      • Mazzolli A.
      • Margni R.
      不对称抗体和妊娠。
      )。最近,HPLC和来自人血清彩易福彩的Fab连接的聚糖的MS分析主要透露了具有高核 - 岩藻糖(〜80%)的复合型的双炔N-聚糖,分别为GLCNAC(>50%)和唾液酸(〜80%)(
      • Anumula K.r.
      正常人血浆衍生免疫球蛋白及其片段Fab和Fc的定量甘油分析。
      ,
      • 荷兰M.
      • yagi h.
      • Takahashi N.
      • kato k。
      • 野蛮的c.o.
      • 祝大事
      • 杰弗里斯r.
      从ANCA相关的系统性血管炎患者血清中分离的多克隆彩易福彩,彩易福彩-Fc和彩易福彩-Fab的差分糖基化。
      ,
      • Stadlmann J.
      • 韦伯A.
      • PABST M.
      • 安德莱赫
      • kunert r.
      • ehrlich h.j.
      • 彼得S.H.
      • altmann f.
      凝集素分馏后,仔细研究人彩易福彩唾液酸化和亚类分布。
      )。根据其结构和位置,Fab聚糖可以通过增加或减少对抗原的亲和力来影响彩易福彩效应器功能(
      • 阿诺德J.N.
      • Wormald M.R.
      • SIM R.B.
      • rudd下午
      • DWEK R.A.
      糖基化对人免疫球蛋白生物学功能和结构的影响。
      )。另外一份报告表明Fab糖基化可以调节抗体半衰期(
      • 黄兰
      • Biolsi S.
      • BALES K.R.
      • Kuchibhotla U.
      可变结构域糖基化对抗体间隙的影响:LC / MS表征。
      )。因此,更好地理解彩易福彩功能需要对Fab特异性糖基化的详细分析。
      通过生物源(单克隆彩易福彩,确定彩易福彩 Fab糖基化分析的适当策略 相对 多克隆彩易福彩抗体)。可以在糖肽和彩易福彩部分(Fc,Fab,重链)的水平下分析具有明确定义的Fab糖基化位点的单克隆彩易福彩,以及使用糖苷酶选择性释放Fab-聚糖的选择性释放。 LC / MS允许同时分析Fc-和Fab-糖肽,从而揭示治疗性抗体上的特异性N-聚糖微观物质性(
      • 富山A.
      • Nakagawa H.
      • Matsuda K.
      • sato t.a.
      • Nakamura Y.
      • UEDA K.
      通过能量分辨的氧铵离子监测进行治疗抗体局部N-聚糖微孔性的定量结构表征。
      )。或者,可以在减少后通过LC / MS或直接输注ESI-MS进行彩易福彩 MAb的重链和轻链的糖基化(
      • Chevreux G.
      • 蒂莉n ..
      • Bihoreau N.
      使用IDES蛋白水解消化和电喷雾质谱法快速分析重组单克隆抗体。
      ,
      • Mimura Y.
      • ashton p.r.
      • Takahashi N.
      • 哈维D.J.
      • 杰弗里斯r.
      用电喷雾电离质谱法研究的人彩易福彩蛋白的Fab和Fc之间的对比糖基化曲线。
      )。 彩易福彩的Fab和Fc片段的分离通常使用酶木瓜蛋白酶(
      • 荷兰M.
      • yagi h.
      • Takahashi N.
      • kato k。
      • 野蛮的c.o.
      • 祝大事
      • 杰弗里斯r.
      从ANCA相关的系统性血管炎患者血清中分离的多克隆彩易福彩,彩易福彩-Fc和彩易福彩-Fab的差分糖基化。
      ,
      • 黄兰
      • Biolsi S.
      • BALES K.R.
      • Kuchibhotla U.
      可变结构域糖基化对抗体间隙的影响:LC / MS表征。
      ,
      • Mimura Y.
      • ashton p.r.
      • Takahashi N.
      • 哈维D.J.
      • 杰弗里斯r.
      用电喷雾电离质谱法研究的人彩易福彩蛋白的Fab和Fc之间的对比糖基化曲线。
      ,
      • 钱J.
      • 刘涛。
      • 杨L.
      • 大四A.
      • 克劳利R.
      • 周问
      正交基质辅助激光解吸/电离杂交杂交型飞行时间串联质谱和序酶消化的结合通过正交基质辅助激光解吸/电离杂交型串联串联串联串联质谱和序贯酶消化的组合表征单克隆抗体辛酸纤维蛋白糖苷的结构表征。
      )或百事可乐(
      • 荷兰M.
      • yagi h.
      • Takahashi N.
      • kato k。
      • 野蛮的c.o.
      • 祝大事
      • 杰弗里斯r.
      从ANCA相关的系统性血管炎患者血清中分离的多克隆彩易福彩,彩易福彩-Fc和彩易福彩-Fab的差分糖基化。
      )。木瓜蛋白酶在两条重链之间的二硫桥上方切割彩易福彩,导致两个Fab部分和类似分子量的Fc部分(每个〜50kDa)。 Pepsin切割二硫化物桥,产生F(AB')2(±100kDA)和两½Fc部分(每个±25 kda)。 2002年,据报道,据据报告了一种链球菌半胱氨酸蛋白酶IDE,特别是在铰链区下方的独特位点处切割彩易福彩,导致形成具有较高产量和特异性的F(AB')2片段(
      • von pawel-rammingen u.
      • 约翰逊B.P.
      • Bjorck L.
      IDES,一种新型链球菌半胱氨酸蛋白酶,具有独特的免疫球蛋白G.
      )。该酶的重组版本现在可以在品牌名称制造商(Genovis,Lund,Sweden)下商购。已经使用多种方法来纯化F(AB)和F(AB')2片段。在Pepsin消化后,使用尺寸排除分离Fc糖肽和F(AB')2部分(
      • 荷兰M.
      • yagi h.
      • Takahashi N.
      • kato k。
      • 野蛮的c.o.
      • 祝大事
      • 杰弗里斯r.
      从ANCA相关的系统性血管炎患者血清中分离的多克隆彩易福彩,彩易福彩-Fc和彩易福彩-Fab的差分糖基化。
      )。用离子交换色谱法进行蛋白蛋白酶消化(
      • 荷兰M.
      • yagi h.
      • Takahashi N.
      • kato k。
      • 野蛮的c.o.
      • 祝大事
      • 杰弗里斯r.
      从ANCA相关的系统性血管炎患者血清中分离的多克隆彩易福彩,彩易福彩-Fc和彩易福彩-Fab的差分糖基化。
      )或使用蛋白A的亲和层析(
      • Stadlmann J.
      • 韦伯A.
      • PABST M.
      • 安德莱赫
      • kunert r.
      • ehrlich h.j.
      • 彼得S.H.
      • altmann f.
      凝集素分馏后,仔细研究人彩易福彩唾液酸化和亚类分布。
      ,
      • 钱J.
      • 刘涛。
      • 杨L.
      • 大四A.
      • 克劳利R.
      • 周问
      正交基质辅助激光解吸/电离杂交杂交型飞行时间串联质谱和序酶消化的结合通过正交基质辅助激光解吸/电离杂交型串联串联串联串联质谱和序贯酶消化的组合表征单克隆抗体辛酸纤维蛋白糖苷的结构表征。
      )。在所有情况下,使用Pngase F释放Fab连接的N-聚糖并通过HPLC或MS进行分析。
      分离分析MAB的Fc和Fab聚糖的另一种方法是使用鉴别糖苷酶和/或酶促条件从整个彩易福彩分子中释放它们。例如,据报道,PNGase F和内糖苷酶F2分别在天然条件,Fc和Fab聚糖中选择性地释放(
      • Mimura Y.
      • ashton p.r.
      • Takahashi N.
      • 哈维D.J.
      • 杰弗里斯r.
      用电喷雾电离质谱法研究的人彩易福彩蛋白的Fab和Fc之间的对比糖基化曲线。
      )。
      多克隆彩易福彩s表现出在体细胞增强期间产生的可变区的氨基酸序列的巨大多样性,导致数量的Fab-糖基化位点,其数量和位置不同,以及它们的聚糖的性质。这种巨大的异质性使Fab糖基化分析在糖肽水平下复杂化。因此,多克隆彩易福彩的Fab糖基化分析迄今为止依赖于来自彩易福彩份或整个彩易福彩分子的释放的聚糖的分析。
      最近,报道了使用使用Fc聚糖和Fab聚糖的顺序酶促释放的方法(
      • Anumula K.r.
      正常人血浆衍生免疫球蛋白及其片段Fab和Fc的定量甘油分析。
      )。 Fab Glycans,但不是Fc糖,发现在天然条件下抵抗Pngase F裂解(
      • Anumula K.r.
      正常人血浆衍生免疫球蛋白及其片段Fab和Fc的定量甘油分析。
      )。因此,首先在天然条件下释放彩易福彩 Fc聚糖,并且在彩易福彩分离后,变性条件使Fab聚糖释放。
      对于使用释放的聚糖的所有技术,主要缺点是样品必须非常纯净。 Fc糖基化接近100%,而Fab糖基化是在多克隆彩易福彩的仅次要部分上发现的。 Fab样品中的次要FC污染可以偏见结果。释放的聚糖水平的Fab和Fc糖基化分析可能通过其他糖蛋白污染物的存在而类似地受损。这强调了高度特定的净化方法的重要性。

       免疫球蛋白糖基化分析

      免疫球蛋白A具有几种N-(IgA1和2)和O-糖基化位点(仅限IgA1;见 Fig. 1),并在释放的聚糖水平上分析了N-和O-糖基化(
      • Mattu T.S.
      • 请求r.j.
      • 威利斯A.c.
      • 克里安米
      • Wormald M.R.
      • lellouch a.c.
      • rudd下午
      • Woof J.M.
      • DWEK R.A.
      人血清IgA1,Fab和Fc区的糖基化和结构及N-糖基化对Fcα受体相互作用的作用。
      ,
      • 罗伊尔L.
      • Roos A.
      • 哈维D.J.
      • Wormald M.R.
      • van gijlswijk-janssen d。
      • 雷维e。
      • 威尔逊I.A.
      • 达哈姆。
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      分泌IGA和O-聚糖提供先天和自适应免疫系统之间的联系。
      )。在分泌物液中,例如粘膜和牛奶,通过N-糖基化的分泌物组分和连接(J-)链二聚,将两个IgA分子二聚集(
      • deshpande n。
      • Jensen P.H.
      • 包装机N.H.
      • Kolarich D.
      GlycoSpectrumscan:来自人初乳蛋白酶消化的MS Spectra的捕鱼糖肽。
      )。
      在使用ASP-N内蛋白酶后,在糖肽水平下进行了特异性N-糖基化分析(
      • 田纳卡A.
      • iwase h.
      • Hiki Y.
      • Kokubo T.
      • Ishii-Karakasa I.
      • Toma K.
      • Kobayashi Y.
      • Hotta K.
      来自正常人血清的免疫球蛋白A1的N-连接寡糖的特异性岩卷烷化的证据。
      )。鉴定出两种N-糖肽,通过Edman降解获得肽序列。基于所计算的这些序列的质量,从脱脂糖肽的MALDI-TOF-MS中推导出不同的聚糖组合物。用C18和酰胺塔用半乳糖苷酶和岩藻糖苷酶以及二维HPLC的二维HPLC,揭示了完全半乳糖基化的复合型Biannarary结构,具有或不直接直播和岩藻糖(
      • 田纳卡A.
      • iwase h.
      • Hiki Y.
      • Kokubo T.
      • Ishii-Karakasa I.
      • Toma K.
      • Kobayashi Y.
      • Hotta K.
      来自正常人血清的免疫球蛋白A1的N-连接寡糖的特异性岩卷烷化的证据。
      )。最近,使用LC-FTICR-MS分析了大小排除色谱纯化的IgA1的胰蛋白酶糖肽,使用电子捕获解离(ECD)-FTICR-MS / MS进行序列确认(
      • 戈麦斯半。
      • 墙面S.B.
      • Takahashi K.
      • 诺瓦克J.
      • renfrow m.b.
      • Herr A.B.
      IGA1 N-糖基化分析及其对Fcalphari结合的贡献。
      )。通过气液色谱法建立聚糖组合物和键。有趣的是,观察到Bi-,Treadnanry复合物型聚糖(
      • 戈麦斯半。
      • 墙面S.B.
      • Takahashi K.
      • 诺瓦克J.
      • renfrow m.b.
      • Herr A.B.
      IGA1 N-糖基化分析及其对Fcalphari结合的贡献。
      )。最近使用凝胶胰蛋白酶消化和随后的LC / MS和LC-MS / MS(以下)在糖蛋白酶水平和随后的LC / MS和LC-MS / MS(
      • deshpande n。
      • Jensen P.H.
      • 包装机N.H.
      • Kolarich D.
      GlycoSpectrumscan:来自人初乳蛋白酶消化的MS Spectra的捕鱼糖肽。
      ),揭示糖基化的明显特异性差异。
      此外,在糖肽水平上广泛研究了IgA的O-糖基化(
      • deshpande n。
      • Jensen P.H.
      • 包装机N.H.
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      GlycoSpectrumscan:来自人初乳蛋白酶消化的MS Spectra的捕鱼糖肽。
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      • Marshall A.G.
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      电子捕获解离傅里叶变换离子回旋谐振质谱法测定IgA1铰链区中异常O-糖基化。
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      • renfrow m.b.
      • Mackay C.L.
      • Chalmers M.J.
      • 朱利安B.A.
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      • 克里安米
      • Poulsen K.
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      • Marshall A.G.
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      傅立叶变换离子回旋谐振质谱法分析IgA1骨髓瘤蛋白质中的O-聚糖异质性:IgA肾病的影响。
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      • Poulsen K.
      • 克里安米
      • Mobley J.A.
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      IGA1的聚集O-聚糖:通过使用电子捕获/转移解离定义宏观和微渗透性。
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      • 后退strom M.
      • Costello C.E.
      • Hansson G.C.
      • Hiki Y.
      • Ishihara M.
      • ITO H.
      • Kakehi K.
      • Karlsson N.
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      分析卵糖基化方法的比较:人类蛋白质组织人类疾病术语/蛋白质组倡议的IGA1促进多制度研究。
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      • Wada Y.
      • Tajiri M.
      • ohshima s.
      糖肽质谱与甘油肽的质谱法测定O-聚糖的糖组合物及其对类风湿性关节炎的应用。
      )。在IgA肾病中发现了特定的O-糖基化变化(
      • 诺瓦克J.
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      • 默塞德J.
      IG.A糖基化和IgA免疫复合物在IgA肾病的发病机制中。
      )。更具体地,具有GAL缺陷型铰链区(HR)O-聚糖的异常糖基化IgA1在IgA肾病的发病机制中起枢转作用(
      • renfrow m.b.
      • Mackay C.L.
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      傅立叶变换离子回旋谐振质谱法分析IgA1骨髓瘤蛋白质中的O-聚糖异质性:IgA肾病的影响。
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      IGA1的聚集O-聚糖:通过使用电子捕获/转移解离定义宏观和微渗透性。
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      IG.A1的糖基化和IgA肾病的发病机制。
      )。通过使用FTICR-MS和LC-FTICR-MS来从三种不同IGA1骨髓瘤蛋白获得IGA1 HR糖肽的精确质量曲线(
      • renfrow m.b.
      • Mackay C.L.
      • Chalmers M.J.
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      • 诺瓦克J.
      傅立叶变换离子回旋谐振质谱法分析IgA1骨髓瘤蛋白质中的O-聚糖异质性:IgA肾病的影响。
      )。另外,在该研究中,获得了来自用于每个IGA1骨髓瘤蛋白的IGA1 HR制剂的单个IgA1 O-糖肽上的第一ECD碎片方法(Fig. 3)。这些结果表明,来自IgA肾病患者和健康对照的IgA1 HR的未来分析应该是可行的。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3人力资源 IgA肽的ECD MS / MS光谱。 O-糖基化胰蛋白酶HR肽离子[肽+ 2 Galnac + 2 Gal + 4h]4+ 通过ESI-FTICR ECD MS / MS分析IGA1。从一系列差异糖基化产物离子中鉴定O-糖基化的部位。产物离子明确地将一个镀锌加仑二糖定位为T225。第二加仑加仑缩小到三个可能的位点T228,S230或S232。剩余的8个SER / THR残基被消除为O-Glycan附件的部位(以蓝色为蓝色)。 N-末端片段离子(C和B)和C末端片段离子(Z)分别在IGA1 HR序列之上表示。并非所有检测到的ECD片段都标记在光谱中。广场,Galnac;圈子,gal。从数量采取 等等。 with permission (
      • renfrow m.b.
      • Mackay C.L.
      • Chalmers M.J.
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      • Poulsen K.
      • Emmett M.R.
      • Marshall A.G.
      • 诺瓦克J.
      傅立叶变换离子回旋谐振质谱法分析IgA1骨髓瘤蛋白质中的O-聚糖异质性:IgA肾病的影响。
      )。
      分析聚类O-聚糖的新策略涉及使用IGA特异性蛋白酶和胰蛋白酶和ECD-FTICR-MS / MS的组合。它们提供了各种IGA1 HR片段,使所有O-糖基化位点的明确定位为六种最丰富的糖族,导致覆盖含量缺陷位点(
      • Takahashi K.
      • 墙面S.B.
      • Suzuki H.
      • 史密斯A.D.
      • 大厅S.
      • Poulsen K.
      • 克里安米
      • Mobley J.A.
      • 朱利安B.A.
      • 默塞德J.
      • 诺瓦克J.
      • renfrow m.b.
      IGA1的聚集O-聚糖:通过使用电子捕获/转移解离定义宏观和微渗透性。
      )。另外,已公布的方案适用于在线LC-ECD-MS / MS和LC-电子转移解离-SMS / MS分析。这项工作似乎是一种相关的临床方法,用于定义导致慢性肾病发病机制的分子事件,同时它通常适用于分析O-糖基化的聚集位点(
      • Takahashi K.
      • 墙面S.B.
      • Suzuki H.
      • 史密斯A.D.
      • 大厅S.
      • Poulsen K.
      • 克里安米
      • Mobley J.A.
      • 朱利安B.A.
      • 默塞德J.
      • 诺瓦克J.
      • renfrow m.b.
      IGA1的聚集O-聚糖:通过使用电子捕获/转移解离定义宏观和微渗透性。
      )。

      透视

      如对于彩易福彩的广泛说明,以及一些IgA,需要对N-和O-糖基化的详细结构分析,以便一个理解其三维结构和免疫功能。据我们所知,其他Ig(IgD,IgE,IgM)的糖基化迄今未在糖蛋白水平上寻址。 IgM和IgE中IGD HR和N-糖基化位点(≥5甘糖基化位点)中的许多O-糖基化位点在糖肽水平具有挑战性的情况下使其综合的糖基化分析。另外,来自人循环的IgE和IgD的分析特别需要,因为这些抗体通常仅在微量量(
      • 阿诺德J.N.
      • radcliffe c.m.
      • Wormald M.R.
      • 罗伊尔L.
      • 哈维D.J.
      • Crispin M.
      • DWEK R.A.
      • SIM R.B.
      • rudd下午
      人血清IgD和IgE的糖基化和鉴定的低哥域结构与甘露结合凝集素相互作用的可及性。
      )。对于IGE,需要糖蛋白酶分析,以便将其复杂的型和低聚砜酸酯聚糖分配给其特定部位并分析383上的NXS位点,预计已被占用(
      • Dorrington K.J.
      • Bennich H.H.
      人免疫球蛋白E.的结构功能关系。
      )。特定的分析挑战将是分析除彩易福彩之外的Ig亚类的可变区糖基化。
      IG.糖基化研究经常在许多不同的实验室中进行,因此产生的数据量正在增加巨大增加。最近的方法与三种种群队列中的2705个个体相结合的基因组 - 宽协会和高通量糖类分析的血浆样品的分析表明,某些基因中的常见变体可以影响人血浆中的N-聚糖水平(
      • Lauc G.
      • 埃斯法迪A.
      • 霍夫曼J.E.
      • 海沃德C.
      • knezevic A.
      • Kattla J.J.
      • Polasek O.
      • Gornik O.
      • VITART V.
      • 亚伯拉罕J.L.
      • Novokmet M.
      • Redzic I.
      • 坎贝尔S.
      • 野生S.H.
      • Borovecki F.
      • 王W.
      • KOLCIC I.
      • Zgaga L.
      • Gyllensten U.
      • 威尔逊J.F.
      • 赖特A.F.
      • 哈斯蒂N.D.
      • 坎贝尔H.
      • rudd下午
      • 鲁丹一世。
      基因组学符合糖类 - 人N-Glycame的第一个GWAS研究将HNF1Alpha鉴定为血浆蛋白岩藻糖基化的主调节剂。
      )。基于随访研究,公布了三种不同群体彩易福彩 Glyce的彩易福彩变异性和彩易福彩 Glyce的可遗传性的高通量分离和糖基化分析(
      • knezevic A.
      • vidic J.
      • Adamczyk B.
      • Novokmet M.
      • Polasek O.
      • Gornik O.
      • Supraha-Goreta S.
      • Wormald M.R.
      • Redzic I.
      • 坎贝尔H.
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      IG.G - 可变异性和彩易福彩 Glycome中彩易福彩 Glyce中彩易福彩变异性的高通量分离和糖基化分析。
      )。尽管已经建立了具有IG糖基化的临床和生理参数的各种关联,但我们认为,更多的过程和疾病标志着IG糖基化变化,并且我们只看到了冰山的尖端。通过糖肽的质谱分析,当施用于人类疾病队列时,通过质谱分析在特定于特异性水平的未来Ig糖基化分析。 体外体内 预计免疫过程的模型将为IG糖基化的调节作用提供有价值的新见解。

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