临界盐桥引导彩易福彩组装,稳定性和成熟行为在噬菌体HK97 *

  • 伊利亚戈特斯曼
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  • 志宇福
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  • 瑞克黄
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  • 伊丽莎白A.柯莫尔斯
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  • 约翰·约翰逊
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  • 作者脚注
    *全国卫生机构授予Ro1 AI40101和培训Gran Gm08326,全部或部分支持这项工作。
    本文包含补充图。 1和2。
    1 使用的缩写是:P-IPROHEAD IDSCDifferential扫描量级扫描量级ryp-IiProhead IIH-Ihead IH-IIHead IIWTWILD TypeQ / AE344Q / E363.AeiexPansion中等化电子显微镜。
      HK97是一种双链DNA噬菌体,其在病毒衣壳成熟期间经历显着的构象变化,并且在多种中间体和成熟的衣壳状态下近原子分辨率的X射线结构可获得。酰胺h /2H兑换和结晶比较在预膨胀的子弹II颗粒和噬菌体HK97的膨胀头II之间揭示了在整个成熟过程中保持固定的季醛相互作用,并且似乎在所有准和ICOSAHEDRAL 3折叠轴上保持互脱的完整性。这些3倍钉由Arg和Glu残基和金属结合位点形成。 ARG-347或ARG-194的突变或E344Q和E363A的双突变导致彩易福彩形式(六烷烃和五蛋白)纯化噬菌体。组装的突变体具有降低的热稳定性和降低体外扩张率。 amide h /2H兑换质谱显示,在野生型衣壳中,一些亚基有一个弯曲的“spine”螺旋(高交换),而其他人则是直的(交换较少)。类似的分析从未组装的突变彩易福彩显示出均匀的酰胺交换在所有这些高于直的脊柱螺旋(以更成熟的中间体的特征)中的均匀酰胺交换,表明血管组装之前脊柱螺旋稍微弯曲。结果进一步支持先前提出的衣壳膨胀机制,其中每个亚单位的Δα结构域诱导高能量中间构象,现在似乎在彩易福彩组件期间包括弯曲螺旋。
      病毒衣壳,特别是在双链DNA噬菌体中,需要高稳定的大分子结构,能够在接近液晶密度时封装基因组。病毒衣壳由数百到数千个单独的亚基组成,可有效地组装成高度对称的ICOSAHEDRAL几何形状的封闭式衣壳形式,避免了导致途径增加的动力学陷阱。最近的研究提出,衣壳组装通过核心较大的组装中间体的弱梭骨相互作用介导,导致具有相当更稳定的衣壳形式,由于具有更受约束的相互作用网络的良好几何形状。诸如豇豆氯化斑块病毒,乙型肝炎病毒和噬菌体P22和HK97等系统中的测量估计了2-5千卡/摩尔在2-5千卡/摩尔之间的两个亚基之间的初始组装相互作用的关联能量,这对于坚固的装配产品看似较低(
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      弱蛋白质 - 蛋白质相互作用足以驱动乙型肝炎病毒衣壳的组装。
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      病毒衣壳组装的热力学。
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      解剖ICOSAHEDRAL病毒衣壳中的蛋白质 - 蛋白质界面。
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      噬菌体P22 propapsids与自由涂层蛋白质亚基平衡。
      )。基于疏水性表面的熵驱动的过程被认为是与后续成核和导致完整衣壳组装的伸长反应的初始弱相互作用的驱动力(
      • 卡登斯。
      • Zlotnick A.
      病毒衣壳组装的热力学。
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      • Zlotnick A.
      建立病毒衣壳。多层蛋白复合物自组装的平衡模型。
      )。大多数复杂病毒经历了涉及构象过渡的分阶段装配过程,该过程发生在普通人的初始装配后(
      • DUDA R.L.
      • HEMPEL J.
      • Michel H.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎D.
      • Hendrix R.W.
      噬菌体HK97头组件中的结构转变。
      )。该过程称为病毒素成熟。彩易福彩初始组装进入ProCapsid的相互作用的相互作用和促进衣壳成熟的那些已经明确地理解,但最近的pucapsid和成熟衣壳状态的HK97的晶体结构使我们允许我们评估可能促进成熟的结构性质。
      HK97是用于研究衣壳组装和成熟的可编程系统。可以组装对称的propapsid粒子 大肠杆菌 随着只有两个基因产物,GP4(蛋白酶)和GP5(衣壳亚基)的表达。然后可以遵循成熟 体外 通过降低pH或化学扰动propapsids。与直接从个体单体亚基组装它们的彩易福彩等噬菌体不同,HK97亚基最初组装成由六亚基(六烷烃)或五亚基(五聚体)低聚物组成的彩易福彩。 12个五羟美蛋白和60名六烷烃然后组装成具有三角型披肩的三角型披肩,虽然门尔复合物在其中一个五个五级 体内 集会。在亚基的N末端的残基2-103被认为是与组装过程中其他噬菌体鉴定的支架蛋白相同的角色(
      • DUDA R.L.
      • 马加尔克。
      • Hendrix R.W.
      噬菌体HK97分配机组件的遗传基础。
      )。然后将彩易福彩组装,包装蛋白酶(GP4),形成初始ProCapsid,Prohead I(P-I)。
      使用的缩写是:
      P-I.
      Prohead I.
      DSC.
      差分扫描量热法
      P-I.I
      PROPHEAD II
      你好
      头I.
      你好I
      头II.
      WT.
      野生型
      Q / A.
      E344Q / E363A
      ei.
      扩展中级
      em.
      电子显微镜。
      如果表达没有蛋白酶或用无活性(通过突变)蛋白酶,则该步骤是可逆的(FI.g. 1)。可以控制该组件的平衡 体外 具有有利于彩易福彩或衣壳形式的特异性缓冲液和浓度(
      • 谢Z.
      • Hendrix R.W.
      组装在噬菌体HK97的体外。
      )。用活性蛋白酶的表达导致组装的P-I状态中的δ结构域的蛋白水解,然后是蛋白酶的蛋白酶和来自颗粒的片段的扩散。 P-I然后经历微妙的结构调整,导致完全由切割的GP5 *亚基组成的ProHead II状态(
      • Conway J.f.
      • DUDA R.L.
      • 郑n
      • Hendrix R.W.
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      病毒衣壳成熟的蛋白水解和构象控制:噬菌体HK97系统。
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      • Conway J.f.
      • 郑n
      • 罗斯P.D.
      • Hendrix R.W.
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      • 史蒂文A.C.
      在病毒衣壳中的热诱导的相变转变为六烷烃,使五聚蛋白保持不变。
      )。在这个装配阶段 体内,通过门岩系(由GP3亚基组成)包装粘附型双链DNA,其配合成衣壳的单个5倍的顶点。我们使用了缺乏GP3的HK97构建体,因此纯化的Prohead II衣壳是ICOSAHEDRALLY对称的,不能包装DNA。纯化的P-II可以成熟 体外 使用低pH和其他化学扰动方法。在成熟期间,亚基的构象变化及其相互作用导致衣壳的大规模扩张和形态变化。囊壳壳的直径从P-II中的540埃到660埃在头II(H-II)中,完全膨胀的颗粒形式(
      • Gertsman I.
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      病毒衣壳成熟的意外扭曲。
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      在噬菌体HK97衣壳中拓扑连接的蛋白质环。
      )。中间颗粒形式可以在膨胀期间被捕获,并先前用各种生物物理技术表征,包括低温显微镜(
      • Conway J.f.
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      病毒成熟涉及大的亚基旋转和局部重折叠。
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      病毒衣壳的成熟动力学:过渡中间状态的可视化。
      ),X射线晶体学(
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      在噬菌体HK97衣壳中拓扑连接的蛋白质环。
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      在噬菌体HK97成熟过程中通过季结构变化控制交联。
      )和小角度X射线散射(
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      在噬菌体HK97成熟过程中通过季结构变化控制交联。
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      证据表明,本地重折e事件触发HK97噬菌体衣壳的成熟。
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      420次亚基病毒衣壳的合作重组。
      )。在膨胀过程中,通过位于位于相邻彩易福彩的不同亚基的Lys-169和Asn-356之间的异肽键形成形成自催化的共价交联。
      • DUDA R.L.
      蛋白质链甲醛:病毒衣壳中的被加链蛋白。
      )。通过Glu-363促进反应,其与键合残基相邻并用作质子受体。通过差示扫描量热法(DSC)显示成熟期间的交联,从而大大提高HK97的热稳定性(
      • 罗斯P.D.
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      • Conway J.f.
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      交联渲染噬菌体HK97衣壳成熟不可逆转,有效稳定。
      )。除了共价键合之外,H-II的掩埋表面积明显高于P-II,如前3.44-å的头部II结构中所示的高度插入的intersubUnit相互作用(
      • wikoff w.r.
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      在噬菌体HK97衣壳中拓扑连接的蛋白质环。
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      • 约翰逊J.E.
      通过晶体学和H / 2H交换研究的HK97成熟揭示了放热粒子过渡的结构基础。
      )。缺陷型突变体K169Y仍然经历颗粒膨胀,达到倒数二颗粒形式,称为头I(H-I),其具有几乎相同的六聚体彩易福彩化构象,但比H-II更少挤出的排蛋白(
      • GaN L.
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      • 郑n
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      在噬菌体HK97成熟过程中通过季结构变化控制交联。
      )。 H-I用于所有H /2H兑换研究代替H-II,因为H-II中的交联显着影响了基于质谱的实验所需的蛋白水解效率(
      • Gertsman I.
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      • Speir J.A.
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      通过晶体学和H / 2H交换研究的HK97成熟揭示了放热粒子过渡的结构基础。
      )。
      图缩略图GR1.
      图。1。HK97装配和膨胀路径。 示意图描绘了HK97中的组装和扩展 大肠杆菌 表达系统缺乏门耳蛋白和基因组包装所需的其他机器。 42-KDA亚基组装成六聚体和五聚体彩易福彩,然后组装成初始ICOSAHEDRAL PROCAPSID壳,P-1。每个亚基的δ结构域的蛋白水解裂解导致形成亚稳态中间形式的P-II,其能够进行 体外 通过各种化学试剂扰乱时成熟。 WT扩展通过EI,气球和最终的H-II形式进行,这是一种涉及共价交联的扩展过程。 K169Y突变体P-II通过EI到H-I形式,没有任何交联。除了缺乏交叉链接之外,H-I与气球相同。
      假设是,对于高度插入的成熟衣壳形式,例如在噬菌体中看到的,早期的催乳剂中间体对于亚基的初始定位是必要的,以便在构象变化之前可以促进蛋白质结构增加的稳定性。我们最近展示了amide h /2H兑换和结晶比较在预先扩增的P-II颗粒和成熟的H-II之间,该成熟是由第三结构扭曲和二次结构的改变,周围的围绕所有准和ICOSAHEL6折叠的固定的互联网相互作用改变衣壳壳中的轴(
      • Gertsman I.
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      • Speir J.A.
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      • 约翰逊J.E.
      病毒衣壳成熟的意外扭曲。
      )。似乎有助于这些“3倍钉钉”的主要相互作用包括两组盐桥和推定的金属结合位点(FI.g. 2)。盐桥相互作用在残留物Glu-344和Arg-194之间以及残留物Glu-363和Arg-347之间。谷氨酸363提供双重角色,因为它涉及盐桥和Arg-347,用作质子受体,催化异肽键形成(
      • dierkes l.e.
      • Peebles C.L.
      • FILLK B.A.
      • Hendrix R.W.
      • DUDA R.L.
      抗菌HK97衣壳自催化交联所需保守谷氨酸的突变分析。
      )。金属结合位点在3倍与P-II晶体结构中的高σ水平的相互作用的位置348处的3倍相关的谷氨酸形成(
      • Gertsman I.
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      • Speir J.A.
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      • 约翰逊J.E.
      病毒衣壳成熟的意外扭曲。
      )。尽管金属离子的相当密度不存在于晚期中间体的晶体结构中的等效位置,但谷氨酸的位置几乎相同,表明与用于中和负电荷排斥的一些机制稳定的相互作用。与3倍界面处残留物的近相同构象相反,显示亚基的其余部分经历大规模的扭转运动,导致所有三个p域β-股中的静脉(见 FI.g. 8A 对于域名命名)。这些数据意味着3倍界面处的相互作用可能是至关重要的,在从单个彩易福彩中组装囊囊以及提供亚基弯曲的固定点,同时保持互联网接触。
      图缩略图GR2.
      图2。3倍互联网接触的重要性。一种,来自先前解决的3.65-å晶体结构的P-II衣壳,在嵌合体中以低分辨率呈现。两个exon子单元(亚基a和f, 黄色的绿色,分别为一柱亚基(橙子)形成准3倍相互作用作为色带。 B,鉴于两种六角形亚基之间的准3折叠相互作用和一个突出显示的五个五聚体亚基相互作用 A。视图来自衣壳内部,从图中所示的视图旋转180° A。相应地标记盐桥和推定金属结合位点(Glu-348)的残留物。 C,表识别给扰动3折触点的各种突变。鉴定了蛋白质表达后的表型。将突变体与蛋白表达后是否被纯化为衣壳或彩易福彩(六烷烃和五聚体)。 Glu-363突变体的数据来自Dierkes 等等。 (
      • dierkes l.e.
      • Peebles C.L.
      • FILLK B.A.
      • Hendrix R.W.
      • DUDA R.L.
      抗菌HK97衣壳自催化交联所需保守谷氨酸的突变分析。
      )。
      图缩略图GR8.
      图8。R347N彩易福彩脊柱螺旋的溶剂可达性。一种,Prohead II的亚基C显示,标有主要结构域。脊柱螺旋的残留物206-216是有色的 橙子。 B.,P-II和H-I颗粒形式的质谱和H-I颗粒形式以及5分钟交换后的R347N彩易福彩。这 最佳 光谱是非氘代P-II。 C, H/2H兑换渣滓的结果 橙子 绘制R347N彩易福彩体(橙子 曲线)并与P-II衣壳状态,EI和几乎成熟的H-I衣壳形式相同的溶剂可访问曲线进行比较。 D,相同脊柱螺旋片段的溶剂可通过从P-I状态拆解的R347N彩易福彩和WT彩易福彩分解。
      在这里,我们确认了通过诱变相关残留物的3倍相互作用的作用,并表征了所得组装产品,热稳定性和成熟动力学。在形成彩易福彩体后,一些突变体没有组装成颗粒(例如 R347N)。然后纯化彩易福彩剂,用H /分析脊柱螺旋的酰胺交换2H兑换耦合到质谱(
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      )。以前的数据说明了H /增加的直接相关性2H兑换和螺旋构象的增加弯曲(
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      通过晶体学和H / 2H交换研究的HK97成熟揭示了放热粒子过渡的结构基础。
      )。将脊柱螺旋中的酰胺交换与先前表征粒形式的颗粒形式以及P-I和WT彩易福彩从P-I拆卸的彩易福彩的交换。

      实验步骤

       诱变,蛋白质表达和分析

      使用位点定向诱变引入所有3倍点突变。如前所述进行所有突变体的蛋白质表达和纯化(
      • DUDA R.L.
      • HEMPEL J.
      • Michel H.
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      噬菌体HK97头组件中的结构转变。
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      • 马加尔克。
      • Hendrix R.W.
      噬菌体HK97分配机组件的遗传基础。
      )修饰R194N,R347N和E344Q / E363A突变体的纯化,因为在BL21(DE3)帘布层细胞的表达和裂解之后没有看到颗粒。通过离心溶解并随后去除膜和其他细胞组分,通常沉淀病毒衣壳在暴露于0.5后沉淀并沉淀 m NaCl和6%聚乙二醇(
      • DUDA R.L.
      • HEMPEL J.
      • Michel H.
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      • Hendrix R.W.
      噬菌体HK97头组件中的结构转变。
      )。在细胞裂解后,未组装的突变体在彩易福彩形式中,因此在该步骤期间没有沉淀。通过在Centricon(30-KDA分子质量截止)过滤器中,通过过滤进一步纯化沉淀步骤的上清液,然后用Sephacryl S-300柱进行尺寸排阻色谱。一个20米m TRIS缓冲溶液,pH 7.5,40米m NaCl用于所有过滤和尺寸排阻色谱步骤。使用HK97 Capsid亚基抗体(以兔子升至GP5 *亚基或分离的DELTA结构域蛋白)的4-12%SDS凝胶和蛋白质印迹用于验证表达后蛋白质。使用1%琼脂糖凝胶用于鉴定颗粒形式和时间依赖性膨胀测定。 7.5%天然丙烯酰胺凝胶用于区分R194N样品中的己烷和戊酮的存在。

       epexon和penton互联

      为了产生纯己酮,用终浓度为20米处理1至3mg / ml之间的蛋白质浓度m TRIS,pH 7.5,0.5 m NaSCN (
      • 谢Z.
      • Hendrix R.W.
      组装在噬菌体HK97的体外。
      )。将样品在室温下孵育过夜。为了生产零龙,在100米中温育相同的蛋白质浓度m 柠檬酸钠,pH 5.6,200 mm 胍HCl,1%二甲基甲酰胺在室温下过夜。对于比较研究,野生型pH-1与上述己酮缓冲液脱离,以最初将颗粒拆卸成彩易福彩体。

       差分扫描量热法

      将P-II颗粒稀释至0.5mg / ml,脱气100米m 磷酸钾,pH 7.5,20米m KCL。在微量差分扫描量热仪(VP-DSC微量微量仪)中以1.5℃/ min的速率在样品电池储存器中加热蛋白质样品,使用原始软件版本从各个缓冲器吸热中减去基线5.0。熔化的温度(Tm值)被测量为与原产地分析的每个吸热中的主要热事件峰相关的温度。

       电子显微镜

      将0.02mg / ml的蛋白质在涂有碳膜(电子显微镜科学,目录号CF300-Cu)涂覆的辉光排出的铜网上被吸收2分钟。随后将栅格用过滤的蒸馏水洗涤两次,用2%乙酸甲酯染色45s,完全空气干燥。使用Fei Tecnai F20双透射电子显微镜在120kV的加速电压下以100,000×10×散焦的倍率成像。用Gatan UltraScan 4K×4K电荷耦合器件相机记录图像。

       分析超速离心

      在20℃下在20℃下在20℃下进行突变彩易福彩蛋白的沉降速度实验,蛋白质浓度为1mg / ml。m TRIS缓冲液,pH 7.5,含有40米的m NACL。通过Beckman Optima XL-A分析超速纤维测量40,000 rpm的40,000 rpm的沉降,然后测量280nm的吸光度。通过氨基酸序列计算部分特异性体积,并根据SEDNTERP程序根据溶剂组合物计算溶剂密度。用连续计算沉降系数分布 c(s)SEDFIT计划中实施的LAMM等式解决方案的分布模型。扩散系数通过重量平均摩擦比估计,并且这两个因子与使用Sveberg方程的分子量有关。分子量分布衍生连续 c(M)SEDFIT计划中的分发模型。

       荧光动力学

      用50米稀释将样品(3μl25mg/ ml溶液)的颗粒稀释m 乙酸钠,pH 4.0,200 mm 氯化钾(膨胀缓冲液)(
      • DUDA R.L.
      • HEMPEL J.
      • Michel H.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎D.
      • Hendrix R.W.
      噬菌体HK97头组件中的结构转变。
      )。将混合物快速转移到石英比皿中,然后使用Varian Eclipse荧光光谱仪测量。在295nm处发生激发,然后排放扫描范围为310至400nm。在整个实验期间,比色皿中的温度保持在20℃。混合和排放扫描开始之间有〜30秒的死区时间。数据以ASCII格式写出并在kaleIdagraph(Synergy Software)中进行了处理。如前所述,通过以下等式计算质量光谱中心:质量光谱中心=Σ(Fiλi/σ.FI.。从P-II的膨胀期间,肿块的光谱中心是膨胀中间体(EI)衣壳形式,如图所示 FI.g. 5。转变是由于埋葬色氨酸残留物,并且以与先前确定的粒度的整体形态变化类似的速率发生(
      • 李克。
      • GaN L.
      • Tsuruta H.
      • Hendrix R.W.
      • DUDA R.L.
      • 约翰逊J.E.
      证据表明,本地重折e事件触发HK97噬菌体衣壳的成熟。
      )。绘制了谱的质量中心 相对 每个突变体的时间,并使用kaleidaGraph拟合指数衰减曲线。
      图缩略图GR5.
      图5。荧光监测3倍突变体的扩张动力学。 监测各种突变体和WT的P-II颗粒,以改变质量光谱中心(SCM.)(由衣壳膨胀引起的)与酸性缓冲液(pH 4.0)一起孵育后。一半的WT颗粒膨胀的时间(t½)显示在表格中,与WT膨胀率的一小部分的突变扩张的速率也是如此。

       H/2H兑换耦合到MALDI质谱

      浓缩的HK97彩易福彩(〜10mg / ml)在85%最终D中稀释7倍2o浓度缓冲20米m Tris,pH 7.5,包含200米m 氯化钠或200米m 氯化钾。在d中孵育样品2在pH 7.5处,各种时间段,然后加入pH 2.5非氘代淬火溶液(最终D.2o浓度为9.0%)。淬火后,将所有样品在4°C的冰上处理。用50μL百百百酚涂覆的珠子消化蛋白质5分钟。通过离心除去珠子,并将上清液在液体n中冷冻 2。单独解冻样品,用α-氰基-4-羟基氨基酸基质溶液混合1:1,并在预充电的MALDI靶标上真空结晶,然后根据先前公布的方案分析MALDI-TOF质谱仪(
      • 曼德尔J.G.
      • Falick上午
      • komives e.a.
      MALDI-TOF质谱法测定酰胺氢气交换。
      )。通过使用MS / MS使用Q-Star-XL质谱仪或MALDI TOF-TOF(ABI 4800)质谱仪来鉴定所有胃蛋白酶消化产物。使用N-末端肽(残留物117-126)计算后交换为42%,在20s内完全在氘交换酰胺质子。该肽的钠加合物在光谱中具有更大的丰富。所有未来h / 2因此,对有机物种进行该片段的H测量。通过从每个氘代封装的质心性从非氘化对照中减去质量包膜的质心来计算交换的氘核总数。误差(标准偏差)估计了三个独立实验的平均值,每次实验记录了两到三次测量(每个时间点总共六至九次测量)。如前所述获得数据分析和动力图(
      • 曼德尔J.G.
      • Baerga-ortiz A.
      • Akashi S.
      • Takio K.
      • komives e.a.
      凝血酶血栓调节蛋白界面的溶剂可用性。
      )。
      H/2H兑换反应最多15分钟,使得在快速(>1 min−1)和中间速率(0.01-1分钟−1)(
      • 康S.
      • Prefelige JR,P.E.
      氢气/氘交换的噬菌体P22涂层蛋白的结构域研究及衣壳晶格转化的表征。
      )。较长的孵化测量缓慢的汇率(<0.01 min−1)在本研究中未进行。在中间体以缓慢速率交换的酰胺质子通常是由于次级结构或蛋白质 - 蛋白质相互作用导致溶剂保护的结果。所有片段的测量数据最合适地符合单个或双指示模型,仅适用于仅在快速率或快速和中等速率交换的氘核。以下等式代表双指数拟合,
      D=N快速地(1ek快速地t)+N(1ekt)
      (eq.1)


      在哪里 D 是时候交换的氘核总数 t; N快速地 是以快速汇率交换的氘核数量, k快速地;和 N 是以中等率交换的氘核数量, k。快速交换酰胺质子几乎所有在第一次换成了第一次 k快速地 估计如前所述(
      • 曼德尔J.G.
      • Baerga-ortiz A.
      • Akashi S.
      • Takio K.
      • komives e.a.
      凝血酶血栓调节蛋白界面的溶剂可用性。
      )。跨越残基204-216的螺旋片段的质量包络可以在早期点处作为两个高斯分布的组合来解决。如所示对多个高斯分布的拟合 FI.g. 9 在软件包起源中执行。
      图缩略图GR9.
      图9。双峰 相对 脊柱螺旋中的单透明交换。 答,在用氘交换后1分钟的溶剂交换后,显示出血管螺旋片段204-216的脊柱螺旋片段204-216的质量包膜。这 最佳 迹线代表基于自然同位素丰度的质量分布的非氘化对照。 B,在1分钟的交换时P-II的质量包络显示了双峰分布,适合两个具有程序来源的高斯分布。在后交换计算之后,第一个信封对应于零氘核的交换(D'S.),而大信封对应于七个氘核。 C,在R347N彩易福彩剂和P-I颗粒形式10分钟后的肿块包络比较。虽然彩易福彩显示出稍大的交换,但既不是批量包络,也不显示为P-II中的双峰分布。 迪特,氘核。

      结果

       3倍突变体仍然形成粒子

      “3倍钉钉”的所有残留物突变:E348A,E344Q,E344A,R194N,R347N和双突变体E348A / E344A和E344Q / E363A。 E348A,E344A,E344Q和E344A / E348A的表达 大肠杆菌 导致正常的icosaheDral颗粒形成,而突变体R194N,R347N和E344Q / E363A(Q / A)突变体被纯化为具有可检测的衣壳存在的游离彩易福彩。形成颗粒的突变体,所谓的“衣壳突变体”,在制备中没有显示出显着的彩易福彩群。除了E344A之外,彩易福彩突变体主要产生P-II颗粒,除了E344A,除了用于造粒颗粒的最终高速超速离心步骤(35 kRPM 25)后具有显着的馏分(〜65%)的膨胀颗粒。确定连续的高速造粒步骤负责诱导超出P-II的自发性成熟和E344A的扩展(补充图1)。 E344Q还表现出极轻微的倾向,由于造粒而过早地膨胀(<5%)但与E344A相比,非常低。因此,Glu-344突变体显示出对机械扰动的敏感性增加,导致颗粒膨胀。通过阴离子交换色谱法分离所有突变颗粒,并且仅用于DSC实验和如下所述的膨胀测定,仅使用均匀的P-II颗粒。

       差分扫描量热法

      以前的量热量实验比较了HK97的各种膨胀状态的热稳定性(
      • 罗斯P.D.
      • 郑n
      • Conway J.f.
      • FILLK B.A.
      • Hendrix R.W.
      • DUDA R.L.
      • 史蒂文A.C.
      交联渲染噬菌体HK97衣壳成熟不可逆转,有效稳定。
      ,
      • 罗斯P.D.
      • Conway J.f.
      • 郑n
      • Dierkes L.
      • FILLK B.A.
      • Hendrix R.W.
      • 史蒂文A.C.
      • DUDA R.L.
      带锁的自由能级联驱动组装和噬菌体HK97衣壳的成熟。
      )。研究表明,H-II具有比P-II和P-I颗粒的熔融温度明显较高。研究还揭示了WT H-II中的交联大大稳定了颗粒,其与交叉链路缺陷K169Y突变体(H-1)的成熟形式的变性温度明显更高的变性温度。 P-II结构强烈表明,3倍相互作用对颗粒稳定性至关重要,并且对这些相互作用的扰动会导致较弱的仲蛋白酶联合,导致较少的颗粒。我们对所有3倍突变进行了差分量热法扫描(FI.g. 3)。结果表明,所有突变体都具有较低温度的吸热。除了E344A突变体之外,突变体的吸热均具有类似于WT P-II的形状。 E344a的吸热对应于P-II熔化,但似乎是两个高度重叠峰的组合,其中心在80°处测量。尽管该测量似乎与其他构造相比,尤其是E344A的较低的热稳定性,但由于吸热形状的差异,因此不能产生严格的比较,这可以指示热变性的改性机制。其他三个突变体进入以及WT P-II在吸热开始的开始时具有小肩部,其指示主要熔化前的构象变化或其他事件以及展开过渡。以前的WT P-II研究没有这样的肩膀,但确实显示出非常宽的峰(
      • 罗斯P.D.
      • 郑n
      • Conway J.f.
      • FILLK B.A.
      • Hendrix R.W.
      • DUDA R.L.
      • 史蒂文A.C.
      交联渲染噬菌体HK97衣壳成熟不可逆转,有效稳定。
      )。与目前的研究(1.5°C / min)相比,先前研究的加热速率更快(1.98°C / min)可能会模糊我们现在可以解决的肩部。如图所示 补充图2,主吸收的肩部对应于不可逆转的事件,其进行P-II颗粒的熔化。在对应于肩部的温度下停止反应,然后冷却,然后另一个DSC扫描导致单个吸热,具有相同的熔融温度( Tm值)在初始扫描中确定。测试的所有突变体的熔化温度低于WT P-II的熔化温度,表明热稳定性较低。在每次吸热的峰值下,发生多种不可逆的过渡,主要是病毒颗粒的拆卸和两种彩易福彩和单个亚基的变性。这些过渡发生在非常相似的温度下,无法解决。
      图缩略图GR3.
      图3。3倍突变体的差分扫描量热法。 DSC扫描和WT P-II的相应吸热(1),E344Q P-II(2),E348A P-II(3),E344A / E348A(双突变体)(4)和e344a(5)。扫描覆盖有相应的熔化温度 以上 (Tm值)。这 Tm值 对于E344A,显示出不是确定的(n)由于其不寻常的吸热。

       3倍突变膨胀

      通过荧光光谱和天然琼脂糖凝胶电泳测量P-II突变体颗粒和WT P-II的膨胀率。低pH是用于诱导的最常见的治疗方法 体外 粒子扩张在先前的动力学和结构研究中,是本研究中使用的唯一扰动方法(
      • 拉特拉德。
      • Conway J.f.
      • 郑n
      • DUDA R.L.
      • Hendrix R.W.
      • wikoff w.r.
      • 约翰逊J.E.
      • Tsuruta H.
      • 史蒂文A.C.
      病毒衣壳的成熟动力学:过渡中间状态的可视化。
      ,
      • DUDA R.L.
      蛋白质链甲醛:病毒衣壳中的被加链蛋白。
      ,
      • GaN L.
      • Speir J.A.
      • Conway J.f.
      • 着陆器G.
      • 郑n
      • FILLK B.A.
      • Hendrix R.W.
      • DUDA R.L.
      • Liljas L.
      • 约翰逊J.E.
      通过X射线晶体学和Cryo-EM可视化HK97成熟中的Capsid构象抽样。
      )。低pH-处理的突变体和WT P-II颗粒的凝胶分析显示出其扩展速率的主要差异(FI.g. 4)。将所有颗粒形式用乙酸钠,pH4.0处理,以进行各种时间,然后用TRIS缓冲液中和至pH〜8.0。到达EI状态后,HK97颗粒不能再恢复到P-II状态。因此,测定法测量转化为至少EI形式的颗粒的一部分,其在中和时将其进一步达到H-II(
      • 李克。
      • GaN L.
      • Tsuruta H.
      • Moyer C.
      • Conway J.f.
      • DUDA R.L.
      • Hendrix R.W.
      • 史蒂文A.C.
      • 约翰逊J.E.
      捕获移动表面环的病毒衣壳膨胀驱动。
      ,
      • GaN L.
      • Speir J.A.
      • Conway J.f.
      • 着陆器G.
      • 郑n
      • FILLK B.A.
      • Hendrix R.W.
      • DUDA R.L.
      • Liljas L.
      • 约翰逊J.E.
      通过X射线晶体学和Cryo-EM可视化HK97成熟中的Capsid构象抽样。
      )。凝胶分析表明,在10分钟内几乎所有的WT P-II都已扩大,而所有突变体都需要30分钟和几个小时以在酸性条件下全转化。为了更准确地量化膨胀率,使用荧光光谱来监测酸性条件下的膨胀(FI.g. 5)。以前的研究能够通过测量发射光谱中心量来量化WT扩张的群体动力学,与P-II颗粒相比,EI是蓝色移位的,其内在的色氨酸埋葬在事件期间。发射最大从P-II中的351nm换档到ei中的348nm。结果表明,E348A,E344Q,E344A和E344A / E348A突变体均匀慢于WT。 E344Q是接下来的最快最快,然后是E348A,然后是E344A,最后是最慢的E344A / E348A。扩展率的比较表明,突变越扰动为3倍相互作用,颗粒膨胀的较慢。例如,E344Q扩展比WT慢,但比E344A更快。 Glu至Gln突变可能允许用Arg-194而不是正常盐桥形成氢键,而丙氨酸的突变可能完全破坏这种相互作用。该数据还显示了3倍钉在3倍的累积突变进一步减慢了膨胀过程。 E344A / E348A比单一突变E344A和E348A慢。
      图缩略图GR4.
      图4。低pH诱导的膨胀测定。 显示的是琼脂糖凝胶(1%)比较颗粒形式的变化作为在pH 4.0缓冲液中孵育样品后的时间的函数。这 频段代表扩展粒子,以及 降低 频段代表P-II。 A,凝胶比较WT P-II和E348A P-II(A) 扩张。 B,WT P-II和E344Q的凝胶(Q) 扩张。 C,WT P-II和E344A / E348A的凝胶(DM.) 扩张。

       3倍彩易福彩突变体

      突变体R194N,R347N和Q / A以纯彩易福彩形式纯化,没有明显的颗粒。这些“彩易福彩突变体”在盐沉淀过程中没有颗粒,随后通常导致病毒衣壳沉淀的随后的离心步骤。 SDS凝胶电泳的上清液分析显示出〜42 kDa带的存在,指示未切割的GP5亚基。所有P-II的其他突变体的制剂以及WT的制剂以及GP5 *(31kDA)的几乎纯群,δ通过GP4在组装的P-1颗粒形式内通过GP4的蛋白水解裂解的产物。通过在先前研究中进行的天然丙烯酰胺凝胶电泳进一步评估精氨酸和Q / A突变体的低聚状态(
      • 谢Z.
      • Hendrix R.W.
      组装在噬菌体HK97的体外。
      )并且另外通过分析离心和电子显微镜检查。 FI.g. 6 显示WT彩易福彩剂的电子显微照片和R347N和E344Q / E363A突变体。如所示,突变体的分析超速离心也将低聚状态鉴定为彩易福彩剂 FI.g. 6, DE,其显示Q / A突变体,其具有对应于262kDa的分子量的沉淀系数,在六烷烃的真实分子量(253kDa)的3%误差内。天然丙烯酰胺凝胶分析解决了彩易福彩突变体中存在的六烷烃和五选项(FI.g. 7)。与衍生自拆卸P-I的彩易福彩,用Tris缓冲液,pH7.5的突变体彩易福彩处理,含0.5 m NASCN将均衡转移到六烷烃,而用柠檬酸盐缓冲溶液的处理,pH5.6,含0.2 m 胍HCl和1%二甲基甲酰胺生产主要是五聚体(
      • 谢Z.
      • Hendrix R.W.
      组装在噬菌体HK97的体外。
      )。
      图缩略图GR6.
      图6。突变彩易福彩。 野生型蛋白质彩易福彩的em图像(A),突变Q / a(B)和突变r347n(C)。 D,衣壳蛋白突变体Q / A的沉降速度分析。主要物种具有6.9 s的沉降系数和262kDa的计算分子量(E)。该值在由序列计算的六聚体彩易福彩(253kDa)的理论分子量的3%误差范围内。
      图缩略图GR7.
      图7。将突变彩易福彩转化为六烷烃或五聚体。 在转化为六聚体或五聚体形式后,通过天然丙烯酰胺凝胶(7.5%)显示突变体,从未组装彩易福彩。 A,R347N彩易福彩。 Lane 1 显示蛋白质表达和纯化后的彩易福彩样品, lane 2 在暴露于己酮缓冲液后显示彩易福彩聚合物过夜,然后 lane 3 代表恒顿缓冲液的过夜治疗。用E344Q / E363A彩易福彩体进行类似的实验(B)和R194N彩易福彩(C),两者也从未组装成衣壳。

       H/2H交换突变彩易福彩

      我们检查了amide h /2H交换突变彩易福彩以区分是否存在与WT彩易福彩和先前表征的衣壳颗粒形式有任何重大差异。我们特别专注于脊柱螺旋,以确定P-II中发现的弯曲,高交换形式是否也存在于突变体彩易福彩中。我们分析了螺旋的两个单独重叠的碎片;一个跨越残留物206-216(FI.g. 8),另一个跨度残留物204-216(FI.g. 9)。脊柱螺旋的跨越残基206-216的片段覆盖了n末端区域,这对于P-II中的不对称单元的七个亚基中的五个显着弯曲(
      • Gertsman I.
      • komives e.a.
      • 约翰逊J.E.
      通过晶体学和H / 2H交换研究的HK97成熟揭示了放热粒子过渡的结构基础。
      )(FI.g. 8)。这些数据对应于P-II的晶体结构中所见的内容,其中一些脊柱螺旋弯曲,其他脊柱螺旋是直的。脊柱螺旋的两个不同构象的存在代表了亚基群中的准等同物的戏剧性实例,其中不同亚基(A三通G)在衣壳的不对称单元内具有可区分构象,尽管它们是相同的基因产物的事实。 FI.g. 8B 表明,与成熟颗粒形式H-1和彩易福彩突变体R347N相比,P-II中的残留物206-216的质量包络相当宽。信封代表了一定百分比的多个汇率的组合,亚基比其他百分比显着低于其他百分比。以前描述了用于P-II,EI和H-I颗粒形式的数据(
      • Gertsman I.
      • GaN L.
      • Guttman M.
      • 韭葱。
      • Speir J.A.
      • DUDA R.L.
      • Hendrix R.W.
      • komives e.a.
      • 约翰逊J.E.
      病毒衣壳成熟的意外扭曲。
      ,
      • Gertsman I.
      • komives e.a.
      • 约翰逊J.E.
      通过晶体学和H / 2H交换研究的HK97成熟揭示了放热粒子过渡的结构基础。
      )但是与新获得的彩易福彩数据一起显示为酰胺交换程度的参考。
      FI.g. 9A,我们展示了类似的质量包络,用于跨越含有额外的两个n末端残基的残基204-216的片段。该片段具有突出的双极性,可以比较小的片段更自信地欺骗。从双峰高斯分布的拟合(FI.g. 9B),如前发布(
      • Gertsman I.
      • komives e.a.
      • 约翰逊J.E.
      通过晶体学和H / 2H交换研究的HK97成熟揭示了放热粒子过渡的结构基础。
      计算出,交换较慢的交换罩对应于交换1分钟后的零氘核的净交换,而更明显的信封对应于在“实验程序”下的后交换校正之后的七个氘核的净交换。在规范螺旋中预计如此高水平的酰胺交换。实际上,残留物204-216的酰胺交换在后来的膨胀中间体如H-I的较少,表明H-I中只存在直螺旋。
      酰胺交换的水平和双峰交换曲线在初始扩张期间对EI的初始变化,并且当螺旋经历显着的构象变化时,通过沿其骨架更加广泛的氢粘合,它们保持相同到H-1。 H-I,一种近似成熟的颗粒形式,通过晶体学显示,与P-II相比,具有拉直螺旋(
      • GaN L.
      • Conway J.f.
      • FILLK B.A.
      • 郑n
      • Hendrix R.W.
      • 史蒂文A.C.
      • 约翰逊J.E.
      • DUDA R.L.
      在噬菌体HK97成熟过程中通过季结构变化控制交联。
      )。当酰胺交换作为每个质量封套的质心测定并绘制时,似乎从R347N突变彩易福彩中的残留物206-216平均交换,几乎与P-II州一样多的酰胺(FI.g. 8C)与WT拆卸彩易福彩同样相同(FI.g. 8D)。有趣的是,即使他们的螺旋也显着交换,R347N彩易福彩也没有表现出双峰行为(图。 8.B9A)。 R347N突变体的包络似乎几乎位于P-II中的两个高斯信封的中间,占他们几乎类似的交流曲线。 P-I,由彩易福彩组装形成的初始Propapsid状态,也显示出单向交换曲线(FI.g. 9C)。在P-I中脊柱螺旋的酰胺交换水平略低于自由彩易福彩,但有趣的是,对于P-I不同,没有看到双峰交换,与其后续中间体P-II不同。这是证据表明,在蛋白水解切割事件中发生一些或全部螺旋中的额外弯曲或变形,导致从P-I转变为P-II颗粒状态。

      讨论

      amide h /2预先扩增和扩建状态之间的H兑换和晶体比较确定了几种主要的互脱性相互作用,这些相互作用对于大会和HK97的成立性能至关重要。我们在临界3倍钉中突变残留物,其持续到造成与不同程度的相互作用。该研究表明,Arg-194和Glu-363之间的盐桥以及Arg-347和Glu-344对病毒衣壳组件至关重要。将一个精氨酸突变为天冬酰胺预防彩易福彩组装成衣壳。有趣的是,单独突变谷氨酸残基的突变并未预防组装,但在E344Q / E363A突变体中均匀突变。该结果与打破相应的盐桥的残留物相当有害。解释可能是,因为两个盐桥彼此紧密邻近,因此谷氨酸可能导致自由的精氨酸重新定位以与静谷氨酸残基相互作用,从而降低破坏原始盐桥的成本。当任一精氨酸突变时,剩余的精氨酸可能无法有效地与第二谷氨酸相互作用。然而,具有至少一种盐桥的重要性由双谷氨酸突变体(E344Q / E363A)阐明,其无法组装成衣壳。双突变体E344A / E348A通常组装成与E344Q / E363A突变体相反,其被分离为游离彩易福彩剂。这些结果表明,直接在3倍轴(准和icosaheLral)下坐着的Glu-348,并且先前描述以与来自相邻彩易福彩的另外两个Glu-348残基在推定的金属结合位点中相互作用,这不是至关重要的Capsid组件作为Glu-344和Glu-363。解释可以是盐桥,而不是金属结合位点对于核解骨癌相互作用至关重要,或者在P-II晶体结构中看到的金属结合位点的电子密度是晶体条件的伪像,而不是生理学相关。等温滴定量热法试验探测二价阳离子的结合可能有助于回答推定的金属结合位点的相关性。更重要的是,更重要的是,直接支持先前提出的假设,该假设描述了通过在通过产生衣壳壳的寡聚化过程中获得整体接触能量的各个组分之间的许多弱相互作用的促进。据报道,在衣物组件中据报道,对于几种不同的病毒系统,据报道了2-5kcal / mol结合能量的估计;这是与删除一到两个盐桥相互作用的自由能变化范围一致的范围,这在HK97提示组装过程的平衡中,以极大地利用自由彩易福彩形式。
      与野生型p-II颗粒相比,组装的3倍突变体显示出热稳定性和膨胀动力学的显着差异。 1-3°C熔化温度降低(Tm值)表明3倍盐桥以及推定的金属结合位点对衣壳的稳定性重要。衣壳变性的机制可能涉及在完全亚单位变性之前进行季醛相互作用的分解。在HK97的情况下,从衣壳或中间组装颗粒的下一个最高阶寡聚常规状态是彩易福彩剂。因此,弱化的互联网接触将降低拆卸在差示扫描量热法数据中所见的粒子所需的能量。将这些3倍突变体施加到基因组包装后的可活噬菌体生产的互补测定将进一步解决与衣壳相互作用与衣壳承受伴随噬菌体成熟的高包装力的能力的相对重要性(
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      噬菌体直线Phi29门耳电机可以将DNA包装在大的内部力下。
      )。
      除了较低的热稳定性外,酸诱导的 体外 与wt相比,3倍突变体的扩增率显着降低。低pH是以前的HK97研究中最常用的扩展方法。 HK97病毒病毒座通常在带负电荷的DNA包装后膨胀,这已经被假设以与衣壳的带负电荷的内部相互作用时诱导构象变化(
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      病毒成熟涉及大的亚基旋转和局部重折叠。
      )。通过酸性条件增加质子离子浓度可以模仿该过程,通过中和酸性残基的带电相互作用,通过改变全球静电方法来吸收组氨酸的带电相互作用,或通过改变整个界面来扰动整个界面。结果表明,3倍相互作用越来越多地扰动了衣壳膨胀。 E344Q扩大比WT慢,但比E344A更快,而双突变体E344A / E348A扩大最慢。虽然我们在E363Q和E363A突变体中没有进行扩展测定,但Dierkes 等等。 (
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      抗菌HK97衣壳自催化交联所需保守谷氨酸的突变分析。
      先前通过凝胶分析表明,E363A P-II在酸性膨胀期间慢于WT慢,而E363Q以几乎与WT的速率成熟。该结果类似于我们的Glu-344突变,表明丙氨酸突变对比谷氨酰胺突变的膨胀减慢的效果更大。对于为什么这些突变影响扩张,有几种合理的解释。首先是与HK97膨胀的协同机制有关,其中颗粒通过波状运动膨胀,其中一个区域触发膨胀将通过衣壳晶格(
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      420次亚基病毒衣壳的合作重组。
      )。因为3倍触点似乎对稳定互粘土触点至关重要,所以它们实际上可能是邻近彩易福彩之间的亚基与亚基的中继运动的关键组分。因此,削弱3折触点可以阻碍通过晶格的构象变化的继电器。酸孵育期间突变体缓慢扩增速率的另一种可能的解释是WT形式的谷氨酸质子化对于酸性诱导的膨胀至关重要。在这种情况下,例如,盐桥的部分或瞬间破坏或扰动实际上将促进亚基重折叠和伴随的膨胀。另外,在P-II和H-II之间仍然几乎相同的3倍相互作用比最初假设更加动态。这将是E344A突变体的行为。在E344A P-II制剂期间,在高速造粒期间过早地膨胀的大部分颗粒,这表明对机械扰动的敏感性增加。 E344A突变体膨胀的事实明显比E344Q慢得多,但是,pH对含有含有谷氨酸的pH没有扰动效果,因为谷氨酰胺和丙氨酸均未对质子化敏感,但两个突变体显然具有不同的膨胀率。先前已经显示了许多溶剂条件以诱导HK97膨胀,尽管显然,P-II状态需要扰乱以进行膨胀,但发现膨胀的分子触发可能很困难,因为它们可能因扰动溶剂条件而异到另一个。
      偶然使突变体中的一些突变体能够纯化以前从未组装的彩易福彩体,使我们能够通过H /来研究蛋白质构象状态2H兑换耦合到质谱。主要感兴趣的区域是脊柱螺旋,其涉及先前的研究,以在成熟时从弯曲到直的构象转变。虽然彩易福彩从WT P-II拆解显示出高水平的酰胺交换,但类似于P-II,尚不清楚弯曲螺旋是否更容易交换,是初始彩易福彩地层的结果或彩易福彩聚合物整合到全衣壳中的结果形式。 amide h /2Hexch兑换关于在此介绍彩易福彩形式的突变体的数据示出,实际上,实际上,在组装彩易福彩中的构造中,从未在脊柱螺旋和亚基的其他区域中具有类似的WT拆卸彩易福彩的构象。
      P-I.I中脊柱螺旋的双峰交换行为是由具有不同螺旋构象的不同亚基引起的,导致非均匀的汇率。通常,这种双峰酰胺交换分布归因于蛋白质折叠现象,其中一部分蛋白质的折叠显着慢于酰胺质子的化学交换的内在速率,也称为EX1限制(
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      )。我们观察到的双极性显然不是EX1交换机制的结果,而是斗篷组件中的准等同亚基的结果。有趣的是,R347N彩易福彩突变体和WT拆卸彩易福彩的均未显示出这种双极性。单向大气封套表明,在彩易福彩状态下,所有亚基的螺旋表现相对相似。虽然彩易福彩和P-II的平均整体交换是相似的,但肿块包络显着不同。彩易福彩包络出现在P-II中的两个高斯分布的中间,表明螺旋的一部分变得更良好折叠,另一部分变得越来越折叠。
      H/2h在p-i中兑换螺旋的数据(FI.g. 9C)在将彩易福彩组装成P-1期间,在脊柱螺旋中略微增加。增加可能是骨涂体变化的结果,而不是基于P-II的先前晶体结构的互粘物关联的结果,表明脊柱螺旋的所有季六脉冲相互作用发生在同一彩易福彩的亚基之间。对于P-I的低分辨率数据,这可能是P-I的低分辨率数据,显示彩易福彩构象与P-II的彩易福彩构象比成熟颗粒形式更相似(
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      在病毒衣壳中的热诱导的相变转变为六烷烃,使五聚蛋白保持不变。
      )。此外,P-I的Cryo-EM实验表明,来自同一彩易福彩的亚基的δ结构域似乎彼此相互作用(而不是来自其他彩易福彩的δ结构域)直接在彩易福彩(衣壳的内部区域)中。
      虽然群众包膜的比较表明,彩易福彩中的螺旋在P-II中的几个亚基的螺旋中交换较少的酰胺,但它仍然比膨胀颗粒形式的直线螺旋更大地交换,而不是在eI和h-1中交换。更重要的是,质量包络是单峰的,表明P-I中的所有脊柱螺旋可能弯曲(FI.g. 9C)。这些数据进一步支持先前提出的假设,即由δ结构域的季触点引导的彩易福彩形成的形成是负责弯曲亚基构象的原因。弯曲构象可能对应于HK97亚基的更高能态状态,其可以通过Δ结构域之间的强相互作用而促进。 P-I的P-II过渡的蛋白水解裂解最有可能降低该菌株,使大多数亚基中的脊柱螺旋伸直到较低的能量状态。这意味着DELTA结构域以及其他病毒系统中的其他脚手架结构域或甚至的脚手架蛋白是至关重要的,这不仅适用于组装,而且也可能通过捕获更高的能量状态下的pradapsid来赋予衣壳成熟的能量景观而不是存在于此成熟的衣壳形式。
      双链DNA噬菌体如P22和λ以及病毒如疱疹,在基因组包装和随后的成熟期间从Propapsid到衣壳中的显着构象变化。这些系统中的一些,例如λ和t4,分别使用附件蛋白质,称为GPD和SoC,其在3倍顶点的表面结合以稳定衣壳(
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      致谢

      我们感谢Joshua Price和Jeff Kelly寻求分析超速离心的帮助。我们感谢斯蒂芬Edgcomb和Jamie Williamson进行DSC实验。我们感谢Kelly Lee帮助 体外 衣壳成熟方案和荧光测量。我们还感谢Lu Gan,Bob Duda和Roger Hendrix有用的讨论。

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