PP2A磷酸酶高密度相互作用网络识别与脑海绵状畸形3(CCM3)蛋白有关的新型纹状体相互作用的磷酸酶和激酶复合物

  • 作者脚注
    b 这两个作者同样贡献了这项工作。
    Marilyn Goudreault
    脚注
    B两位作者同样贡献了这项工作。
    隶属关系
    Samuel Lunenfeld研究院在西奈山医院,多伦多,安大略省M5G 1X5,加拿大
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  • 作者脚注
    b 这两个作者同样贡献了这项工作。
    Lisa M. D'Ambrosio
    脚注
    B两位作者同样贡献了这项工作。
    隶属关系
    Samuel Lunenfeld研究院在西奈山医院,多伦多,安大略省M5G 1X5,加拿大

    多伦多大学分子遗传学系,多伦多,安大略省M5S 1A8,加拿大
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  • 作者脚注
    d 由安大略省研究生奖学金支持。
    Michelle J. Kean.
    脚注
    D由安大略省研究生奖学金奖提供支持。
    隶属关系
    Samuel Lunenfeld研究院在西奈山医院,多伦多,安大略省M5G 1X5,加拿大

    多伦多大学分子遗传学系,多伦多,安大略省M5S 1A8,加拿大
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  • 作者脚注
    e 由早期研究员奖(对A. C. G.)提供支持。
    迈克尔J. Mullin.
    脚注
    E早期研究员奖(对A. C. G.)提供支持。
    隶属关系
    Samuel Lunenfeld研究院在西奈山医院,多伦多,安大略省M5G 1X5,加拿大
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  • 布雷特G. Larsen.
    隶属关系
    Samuel Lunenfeld研究院在西奈山医院,多伦多,安大略省M5G 1X5,加拿大
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  • 艾米·桑切斯
    隶属关系
    Systems Biology研究所,西雅图,华盛顿98103
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  • 作者脚注
    g 目前地址:加拿大安大略省多伦多多伦多大学医学研究的闲聊和最佳部门。
    Sidharth Chaudhry.
    脚注
    G现址:加拿大安大略省多伦多大学多伦多大学医学研究的闲聊和最佳部门。
    隶属关系
    多伦多大学分子遗传学系,多伦多,安大略省M5S 1A8,加拿大
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  • 作者脚注
    h 由安大略省学生机会信托基金的学生支持。
    金妮I.陈
    脚注
    H Ontario学生机会信托基金的学生支持H支持。
    隶属关系
    Samuel Lunenfeld研究院在西奈山医院,多伦多,安大略省M5G 1X5,加拿大

    多伦多大学分子遗传学系,多伦多,安大略省M5S 1A8,加拿大
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  • 弗兰克斯希尔蒂
    隶属关系
    Samuel Lunenfeld研究院在西奈山医院,多伦多,安大略省M5G 1X5,加拿大

    多伦多大学分子遗传学系,多伦多,安大略省M5S 1A8,加拿大
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  • Alexey I. Nesvizhskii.
    隶属关系
    密歇根州密歇根大学,密歇根州立琴根大学计算医学与生物学科学与生物科病理学与生物科。48109
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  • Ruedi Aebbersold.
    隶属关系
    Systems Biology研究所,西雅图,华盛顿98103

    Eth苏黎世,Systems生理和代谢疾病能力中心的分子系统生物学研究所,以及苏黎世大学学院,瑞士苏黎世CH-8093
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  • 布莱恩越过
    隶属关系
    安大略癌癌症研究所和McLaughlin分子医学中心,多伦多,安大略省M5G 1L7加拿大
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  • Anne-Claude Gingras
    一致
    持有Canada研究椅子在功能蛋白质组学中。应解决对应的通信:Samuel Lunenfeld Research Inst。在西奈山医院,600万大学,RM。 992,多伦多,安大略省M5G 1X5,加拿大。电话:416-586-5027;传真:416-586-8869
    隶属关系
    Samuel Lunenfeld研究院在西奈山医院,多伦多,安大略省M5G 1X5,加拿大

    多伦多大学分子遗传学系,多伦多,安大略省M5S 1A8,加拿大
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  • 作者脚注
    b 这两个作者同样贡献了这项工作。
    d 由安大略省研究生奖学金支持。
    e 由早期研究员奖(对A. C. G.)提供支持。
    g 目前地址:加拿大安大略省多伦多多伦多大学医学研究的闲聊和最佳部门。
    h 由安大略省学生机会信托基金的学生支持。
      丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶部分通过与各种调节蛋白的相互作用部分地靶向特定的亚细胞位置和底物。因此,理解这些相互作用对于了解磷酸酶功能至关重要。使用迭代亲和纯化/质谱法,我们产生了围绕蛋白质磷酸酶2a催化亚基的高密度相互作用图。这种方法将PP2A催化亚基的组装综合为许多不同的三聚体复合物,但也揭示了几种新的蛋白质 - 蛋白质相互作用。在这里,我们定义了一种新型的大型多蛋白组件,称为STRIATIN - 相互作用的磷酸酶和激酶(Stripak)复合物。 Stripak含有pp2a催化(pp2ac)和支架(pp2a a)亚基,纹毒素(pp2a调节b'亚基),序列相关蛋白质mob3,新型蛋白质条带1和条带2(以前的FAM40a和FAM40b),脑海绵状畸形3(CCM3)蛋白质,以及生发中心激酶III系列STE20激酶的成员。虽然CCM3蛋白的功能未知,但CCM3基因在家族性脑海绵状畸形中突变,其与癫痫发作和中风相关的病症。我们的蛋白质组学调查表明,大部分CCM3蛋白质在Stripak复合物中居中,为进一步研究CCM3生物学开辟了途径。 Stripak组件建立与CTTNBP2蛋白(与细胞骨骼蛋白质皮质蛋白相互作用)的相互排斥的相互作用或由Sarcolemmal膜相关蛋白(SLMAP)和Ikkɛ(Sike)的相关卷轴蛋白抑制器组成的第二子蛋白和FGFR1OP2。因此,我们确定了几种含有新型PP2A的蛋白质复合物,包括将激酶和磷酸酶连接到人类疾病中的基因中的大组件。
      蛋白质磷酸酶2a(pp2a)
      所用的缩写是:PP2A,蛋白质磷酸酶2a; pp2ac,pp2a催化; Stripak,Sriatin相互作用的磷酸酶和激酶;条带1,略带杂交蛋白1(以前的FAM40A);条带2,略带杂交蛋白2(以前的FAM40B); GCK-III,生发中心激酶,亚组III; CCM,脑海绵状畸形; AP,亲和纯化;点击,串联亲和力净化; Sike,Ikkɛ的抑制器; Ikkɛ,iκB激酶ɛ; Slmap,Sarcolemmal膜相关蛋白; IP,免疫沉淀; IPI,国际蛋白质指数; HA,Hemagglutinin; CCT,含有TCP1的伴侣素; FOP,成纤维细胞生长因子受体1癌基因伴侣; Cttnbp2,cortactin结合蛋白2; CTTNBP2NL,Cortactin结合蛋白2,N-末端状; AA,氨基酸; FHA,Forkhead相关; FGFR1,成纤维细胞生长因子受体1; Camkiv,钙 - 钙调蛋白依赖性激酶IV; strn,striatin。查看基因名称的补充材料; LTQ,线性Trapquadrupole; XML,广泛的标记语言。
      1所用的缩写是:PP2A,蛋白质磷酸酶2a; pp2ac,pp2a催化; Stripak,Sriatin相互作用的磷酸酶和激酶;条带1,略带杂交蛋白1(以前的FAM40A);条带2,略带杂交蛋白2(以前的FAM40B); GCK-III,生发中心激酶,亚组III; CCM,脑海绵状畸形; AP,亲和纯化;点击,串联亲和力净化; Sike,Ikkɛ的抑制器; Ikkɛ,iκB激酶ɛ; Slmap,Sarcolemmal膜相关蛋白; IP,免疫沉淀; IPI,国际蛋白质指数; HA,Hemagglutinin; CCT,含有TCP1的伴侣素; FOP,成纤维细胞生长因子受体1癌基因伴侣; Cttnbp2,cortactin结合蛋白2; CTTNBP2NL,Cortactin结合蛋白2,N-末端状; AA,氨基酸; FHA,Forkhead相关; FGFR1,成纤维细胞生长因子受体1; Camkiv,钙 - 钙调蛋白依赖性激酶IV; strn,striatin。查看基因名称的补充材料; LTQ,线性Trapquadrupole; XML,广泛的标记语言。
      是一种主要的真核丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,其涉及控制细胞生长,增殖和分化(
      • 范蹄C.
      • Goris J.
      PP2A符合肿瘤抑制器的承诺:哪个亚基很重要?
      • Janssens V.
      • Goris J.
      • 范蹄C.
      PP2A:预期的肿瘤抑制剂。
      • virshup d.m.
      蛋白质磷酸酶2a:酶的胰蛋白酶。
      • Mumby M.
      PP2A:揭示不情愿的肿瘤抑制器。
      )。 PP2A的催化亚基由人类中的两个基因表示(基因名称在补充材料中;这里的基因产物称为PP2Acα和PP2Acβ)在蛋白质水平上分享97%的同一性(
      • 石S.R.
      • Hofsteenge J.
      • HEMMINGS B.A.
      编码蛋白质磷酸酶2A催化亚基两种同种型CDNA的分子克隆。
      )。许多含有PP2A家族催化亚基的相互排斥的蛋白质复合物已经表征了生物化学(
      • virshup d.m.
      蛋白质磷酸酶2a:酶的胰蛋白酶。
      ,
      • 戈德伯格y.
      蛋白质磷酸酶2a:谁应调节调节剂?
      )。 PP2A催化剂(PP2AC)亚单位直接与PP2A结合到PP2A A支架亚基(两种85%相同的蛋白质,PP2Aα和PP2AAβ中存在,以形成所谓的PP2A二聚体核心(
      • HEMMINGS B.A.
      • Adams-Pearson C.
      • Maurer F.
      • Muller P.
      • Goris J.
      • Merlevede W.
      • Hofsteenge J.
      • 石S.R.
      蛋白磷酸酶2a的65kDa亚基的α-和β-形式具有类似的39个氨基酸重复结构。
      • Mumby M.C.
      • 沃尔特G.
      蛋白质丝氨酸/苏氨酸磷酸酶:细胞生长的结构,调节和功能。
      • 兴Y.
      • 徐Y.
      • 陈Y.
      • 杰弗里P.D.
      • ch y。
      • 林Z.
      • 李Z.
      • str.
      • 股票J.B.
      • 施y.
      结合肿瘤诱导毒素的蛋白质磷酸酶2A核糖酶的结构。
      )。该核心用作调节或B亚基的关联的平台,以产生对于底物募集和亚细胞靶向重要的三聚体复合物。人体细胞(B,B',B“和B'中存在四个B亚基的系列; B'成员通常称为striatis),共编码至少15个基因(用于评论,参见参考文献。
      • Janssens V.
      • Goris J.
      • 范蹄C.
      PP2A:预期的肿瘤抑制剂。
      ,
      • virshup d.m.
      蛋白质磷酸酶2a:酶的胰蛋白酶。
      , 和
      • 戈德伯格y.
      蛋白质磷酸酶2a:谁应调节调节剂?
      ;对于三聚结构,请参阅参考文献。
      • 徐Y.
      • 兴Y.
      • 陈Y.
      • ch y。
      • 林Z.
      • 风扇E.
      • yu J.W.
      • str.
      • 杰弗里P.D.
      • 施y.
      蛋白质磷酸酶2a全酶的结构。
      • 杰尔。
      • 徐W.
      蛋白质磷酸酶2a异络晶体酶的晶体结构。
      )。已经针对PP2A全酶的组分描述了几种剪接变体和翻译后修饰,并向磷酸酶的调节和特异性增加了另一种复杂程度。还报道了非三聚物PP2A含含族聚合物(除了PP2AC的二聚体核心·PP2A A(
      • 克雷默E.
      • k。
      • Kiefer J.
      • 布鲁斯·斯。
      • 沃尔特G.
      将PP2A核心酶与单克隆抗体与调节亚基的分离分离:细胞中两种形式的丰富表达。
      )))。例如,抗曝气蛋白α4可以在不存在脚手架亚基的情况下直接与PP2A催化亚基相互作用(
      • 穆塔塔克。
      • 吴j.
      • Brautigan D.L.
      B细胞受体相关蛋白α4将雷帕霉素敏感性直接显示到蛋白质磷酸酶2a的催化亚基。
      ,
      • 陈杰。
      • Peterson R.T.
      • 舍瑞斯S.L.
      α4与蛋白质磷酸酶2a,4和6的关联。
      )。此外,MOB3,MOB系列的小分子量蛋白(也称为Phocein或Phoceplantation抗原3),稳定地组装含有至少四种蛋白质的络合物中的绞喉(B')分子,PP2Ac和PP2A A(
      • Baillat G.
      • Moqrich A.
      • 铸件F.
      • Baude A.
      • 纾困
      • Benmerah A.
      • 蒙诺伦A.
      Phocein的分子克隆与表征,从Golgi络合物中发现树突刺的蛋白质。
      ,
      • Moreno C.S.
      • 泳道W.S.
      • Pallas D.C.
      酵母MOB1的哺乳动物同源物是构件和施联家族蛋白质磷酸酶2a配合物的推定衬底。
      )。最近的研究突出了监管亚基作为特异性和生物活性的关键决定因素的作用。例如,PP2AB'δ针对有丝分裂期间去磷酸化的CDC25蛋白(
      • MARGOLIS S.S.
      • 佩里J.A.
      • 林部蛋白质。
      • 坚果l.k.
      • 郭y.
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      • Darbandi R.
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      • 哈恩W.C.
      • virshup d.m.
      • Kornbluth S.
      PP2A /B56δ磷酸酶在调节CDC25释放中的作用以控制有丝分裂。
      ,
      • 林部蛋白质。
      • Maddox J.
      • Louis J.v.
      • Goris J.
      • virshup d.m.
      用CDC25C和CDK1的PP2A调控控制丝分裂出口。
      )。此外,证明PP2AB'γ亚基被人体细胞转化中SV40的小T抗原靶向(
      • 陈W.
      • possemato r.
      • 坎贝尔K.T.
      • 普拉特纳C.A.
      • Pallas D.C.
      • 哈恩W.C.
      鉴定人细胞转化中涉及的特异性PP2A络合物。
      )。细胞内定位也是重要的,并且PP2ABβ2的接头变体,含有N末端线粒体定位信号,组装参与神经元存活信令的全酶(
      • 达格达r.k.
      • Zaucha J.A.
      • Wadzinski B.E.
      • str.
      可变亚单位Bβ的发育鉴定神经元特异性剪接变体靶向蛋白磷酸酶2a,并调节细胞凋亡。
      )。
      鉴于蛋白质复合物的组成在PP2A的生物学功能中的相关性,重要的是设计含有许多PP2A的分子组件的方法。与质谱(AP-MS)偶联的亲和净化是识别和表征互动伙伴(
      • Gingras A.c.
      • Gstaiger M.
      • 骑B.
      • Aeberberold R.
      用质谱分析蛋白质复合物。
      • Gingras A.c.
      • Aeberberold R.
      • 骑B.
      蛋白质复合物分析使用质谱分析研究进展。
      • 鲍尔A.
      • Kuster B.
      亲和纯化 - 质谱。强大的工具,用于表征蛋白质复合物。
      • Dziembowski A.
      • SERAphin B.
      蛋白质复合物分析的最新发展。
      • chang i.f.
      基于质谱的基于谱系蛋白质组学分析的Epitope标签亲和纯化蛋白复合物在真核生物中。
      • vasilescu J.
      • FIGEYS D.
      通过质谱法测定蛋白质 - 蛋白质相互作用。
      )。然而,尽管单个AP-MS可以成功识别多个交互运动,但是该方法是关于含有感兴趣蛋白质的多烃蛋白复合物的组分之间的关​​系的无色性。例如,PP2AC或PP2A A的AP-MS将在相同纯化中产生B和B'蛋白的鉴定,但B和B'蛋白是PP2AC·PP2A的相互排斥的合作伙伴,并且从未发现相同的复杂(
      • Janssens V.
      • Goris J.
      • 范蹄C.
      PP2A:预期的肿瘤抑制剂。
      )。产生高密度相互作用图,其中最多,理想情况下,所有相互作用的伴侣在由互殖纯化组成的并行实验中纯化,可以有助于分解各个配合物的组分。这里使用的策略描述于 图。1A。简而言之,感兴趣的蛋白质是在人体细胞中标记的表位标记和稳定地表达。纯化蛋白质及其相互作用的伴侣,进行蛋白水解消解,并使用质谱法(无凝胶法)鉴定。高置信互动者反过来克隆,表达和纯化,并鉴定它们的互动伴侣。该过程可以以迭代方式重复,以产生以感兴趣的蛋白质为中心的高密度局部副间。相互作用的高密度允许更精确地理解含有特定感兴趣的蛋白质的众多替代复合物,在较低密度的全局相互作用研究中不总是解决的问题(
      • 何Y.
      • Gruhler A.
      • Heilbut A.
      • 糟糕的G.D.
      • 摩尔L.
      • 亚当斯S.L.
      • Millar A.
      • 泰勒P.
      • Bennett K.
      • Butilier K.
      • 杨L.
      • Wolting C.
      • Donaldson I.
      • Schandorff S.
      • 棚车J.
      • vo m.
      • Taggart J.
      • Goudreault M.
      • 穆斯克特B.
      • Alfarano C.
      • 杜瓦D.
      • 林Z.
      • Michalickova K.
      • Willems A.R.
      • Sassi H.
      • 尼尔森P.A.
      • 拉斯穆森k.j.
      • 安德森J.R.
      • 约翰森L.E.
      • 汉森L.H.
      • jespersen h.
      • Podtelejnikov A.
      • 尼尔森E.
      • Crawford J.
      • Poulsen V.
      • Sorensen B.D.
      • Matthiesen J.
      • Hendrickson R.C.
      • Gleeson F.
      • Pawson T.
      • 莫兰姆。
      • DUROCHER D.
      • 高清C.W.
      • FIGEYS D.
      • 泰尔斯米
      质谱法鉴定酿酒酵母酿酒酵母中的蛋白质复合物。
      • Gavin A.c.
      • aloy p.
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      • krause r.
      • Boesche M.
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      • Edelmann A.
      • Heurtier M.A.
      • 霍夫曼五
      • Hoefert C.
      • Klein K.
      • 哈德克姆
      • Michon A.M.
      • 赫尔德姆
      • Schirle M.
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      • 鲁迪T.
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      • bouwmeester t.
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      蛋白质组调查显示酵母细胞机械的模块化。
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      • Michon A.M.
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      • remor M.
      • Hofert C.
      • 赫尔德姆
      • Brajenovic M.
      • Ruffner H.
      • 梅里诺A.
      • Klein K.
      • 哈德克姆
      • 迪克森D.
      • 鲁迪T.
      • GNAU V.
      • 鲍奇A.
      • 巴斯克S.
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      • Leutwein C.
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      蛋白质复合物的系统分析酵母蛋白质的功能组织。
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      • 戴夫米
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      • 布雷德J.E.
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      • 理查兹D.P.
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      • 黄P.
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      • vlasblom J.
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      • haw
      • Rilstone J.J.
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      酵母酿酒酵母中蛋白质复合物的全球风景。
      )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1点击PP2A磷酸酶的相互作用网络。A,迭代挖掘标记方法以鉴定蛋白质复合物。蛋白质A在HEK293细胞中稳定地表达,并且通过LC-MS / MS检测相互作用伙伴B,C和D.蛋白质B,C和D又克隆并稳定地表达,并鉴定它们的交互运动。这里的蛋白质B和C仅彼此相互作用,蛋白质A.蛋白质D与新蛋白质e相互作用,这是通过抽头标记测试的。该高密度网络的质谱数据建议在两个相互独家复合物中的关联:(a)带B和C或(b用D的二聚体。蛋白质D在二聚体中的缔约调与蛋白质e在单独的复合物中具有与蛋白质e的关系相互排斥。 B,通过抽头标记检测PP2A的磷酸酶交互网络。用作诱饵的蛋白质显示在 绿色。出于显示目的(因为我们没有检测到与TAP标记的副葡萄拷贝特异性相互作用的证据),属于同一亚乙二醇的蛋白质(定义为 )折叠到一个节点(在这种情况下,它们由 矩形,而没有寄生虫的蛋白质显示为 椭圆形)。这 方向性箭头 代表诱饵关系的诱饵。 C,通过互动点击标记检测的经典PP2A三制剂。 D,pp2ac,pp2a a,striatin4和mob3与两种新的蛋白质,strip1 / strip2相互作用( 橙子)和cttnbp2 / cttnbp2nl(蓝色的)。
      在这里,我们利用串联亲和纯化(Tap)和标志亲和纯化(
      • Rigaut G.
      • 舍甫琴科A.
      • rutz b.
      • 威尔m。
      • SERAphin B.
      一种蛋白质复合物特征和蛋白质组探索的通用蛋白质纯化方法。
      ,
      • 陈G.I.
      • Gingras A.c.
      丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的亲和纯化质谱(AP-MS)。
      )制备围绕PP2A催化亚基的高密度相互作用图(我们之前报道了以与研究PP4C的相同方法(
      • Gingras A.c.
      • Caballero M.
      • Zarske M.
      • 桑切斯A.
      • hazbun t.r.
      • 领域S.
      • Sonenberg N.
      • Hafen E.
      • 骑B.
      • Aeberberold R.
      一种新的,进化的保守蛋白质磷酸酶复合物,参与顺铂敏感性。
      )))。我们的地图重新承载先前表征的PP2A组件,但也允许发现以前所表征的PP2AC·PP2A A·STIATIN·MOB3组件周围的大型复合物。这件综合体,我们称之为 str.IATIN-i任命 p磷酶 an kinase(Stripak),含有无表称蛋白质FAM40A / FAM40B,我们更名 str.IATIN-i任命 p尖叫1和2(条带1和条带2)。此外,Stripak包含STE20蛋白激酶(STK24,STK25和MST4)以及脑海绵状畸形3(CCM3;基因名称的所有成员 PDCD10),通过在脑海绵状畸形的家族性病例中突变的基因编码的蛋白质(
      • GUCLU B.
      • ozturk A.K.
      • Pricola K.L.
      • Bilguvar K.
      • Shin D.
      • o'roak b.j.
      • 枪子M.
      凋亡相关基因的突变,PDCD10,引起脑海绵状畸形3。
      ,
      • 贝格纳迪F.
      • 丹尼尔C.
      • 吊带P.
      • 阿尔恩州
      • Boetto S.
      • clanet m.
      • Coubes P.
      • echenne b.
      • 易卜拉欣R.
      • irthum b.
      • 雅克G.
      • 朗州米
      • 莫鲁J.J.
      • Neeau J.P.
      • 帕克F.
      • Tremoulet M.
      • Tournier-Lasserve E.
      程序化细胞死亡10基因内的突变导致脑海绵状畸形。
      )。此外,我们介绍了CTRIPAK可以与Cortactin结合蛋白皮质蛋白结合蛋白2(CTTNBP2)/皮质蛋白结合蛋白2,N-末端状(CTTNBP2NL)的相互排他性相互作用或用纱拉瘤膜的组件建立相关蛋白质(SLMAP)和相关蛋白质SKE / FGFR1OP2。

      实验步骤

       cDNA和稳定的细胞系 -

      本研究中使用的结构描述于 补充表S2;所有插入件完整地测序。简而言之,通过PCR使用扩增感兴趣的蛋白质的编码序列 PFU. 来自Hela细胞cDNA文库(Stratagene)或来自哺乳动物基因收集或图像收集的cDNA克隆的超(或其他高保真聚合酶)。每当可以使用人类CDNA时,它们都被使用了;在某些情况下,使用小鼠ORF。与最长的小鼠cDNA相比,我们对小鼠FAM40A / Strip1的原始克隆缺少引发剂蛋氨酸和谷氨酸密码子(GenBank™登录号 nm_153563.)。因此,通过在PCR引物中添加甲硫氨酸和谷氨酸的编码序列来产生MFAM40A /条带1的全长构建体。得到的序列对应于GenBank登录号 nm_153653. (编码序列)。将插入框架克隆到pcdna3-flag,pcdna3-3ha或pcdna3-ntap载体中。测序构建体并发现与MST4外,符合MST4的原始CDNA的序列,其携带单个氨基酸取代(ILE-356至THR;没有获得野生型克隆)。如前所述,这些构建体在低通道HEK293细胞中稳定地表达(
      • Gingras A.c.
      • Caballero M.
      • Zarske M.
      • 桑切斯A.
      • hazbun t.r.
      • 领域S.
      • Sonenberg N.
      • Hafen E.
      • 骑B.
      • Aeberberold R.
      一种新的,进化的保守蛋白质磷酸酶复合物,参与顺铂敏感性。
      )生成和所选细胞系的池。通过使用正兔血清(用于敲击标记的构建体)或针对标志表位的抗血清的蛋白质印迹监测表达。为了确定在我们的萃取程序中溶解的旗帜标记蛋白质的近似百分比,我们分别分析了沉淀后颗粒和上清液;在每种情况下,萃取至少一半的蛋白质,与在两个膜相关和可溶室中分布的许多复合组分的先前注释一致。

       抗体 -

      兔抗GST-alpha4(兔子2972,来自N. Sonenberg博士的善意的礼物)在HEK293细胞提取物(未显示)中识别单个主要带。商业抗体如下(目录号是括号中):抗PP2Acα(610555),抗striatin(610838)和抗MST4(612684)来自BD转导实验室;抗pp2a a来自upstate生物技术(07-250);抗SG2NA(STRN3)来自细胞信号传导技术(S68);抗PP4R2来自苯乙酸实验室(A300-838A),抗标志来自Sigma(F3165);反哈是来自Covance研究产品(MMS-101P)。用于免疫印迹的二抗是甜菜抗小鼠IgG和驴抗兔IgG,与辣根过氧化物酶(GE Healthcare)缀合。对于MST4的IP / Western 图3A,使用来自eBioscience(88-8817-31)的抗小鼠IgG Trueblot Ultra辣根过氧化物酶缀合物作为二抗。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3Stripak复杂的相互作用。A,MST4与Stripak的相互作用。旗帜净化如此 进行免疫沉淀物中内源MST4的检测。 B,验证内源蛋白之间的相互作用。来自未转化的HEK293细胞的裂解物(每IP 1mg)用于使用所示的抗体和蛋白G-琼脂糖(全细胞裂解物=30μg)免疫沉淀免疫沉淀。在Laemmli样品中直接洗脱蛋白质,通过SDS-PAGE分离,转移到硝酸纤维素,并通过用特定抗体免疫印迹检测。 PP4R2是这里用于阴性对照的PP4C相互作用蛋白。 C,通过旗帜标记蛋白检测的AP-MS相互作用的概述。 绿色节点 代表PP2Ac,PP2A,纹纹体和MOB3之间的先前表征相关联; 粉色的 表明先前表征了CCM3与CGK-III子组的STE20激酶之间的相互作用。这 方向性箭头 代表诱饵关系的诱饵。当存在蛋白质家庭内自相互作用的证据时, 自指向箭头 are depicted.

       串联亲和纯化和质谱分析 -

      如前所述,基本上进行串联亲和纯化(
      • Gingras A.c.
      • Caballero M.
      • Zarske M.
      • 桑切斯A.
      • hazbun t.r.
      • 领域S.
      • Sonenberg N.
      • Hafen E.
      • 骑B.
      • Aeberberold R.
      一种新的,进化的保守蛋白质磷酸酶复合物,参与顺铂敏感性。
      )),通过在25米中孵育洗脱蛋白质m EGTA in 50 mm 碳酸氢铵,pH 8.测序级改性胰蛋白酶(0.5-1μg; promega)直接加入洗脱液中。在37℃下进行消化过夜。在消化之后,将样品冻干,然后重悬于反相HPLC缓冲液A1(20μL; 0.4%AcOH,0.005%庚二氟丁酸酐中H.2o)。在加载到反相色谱柱之前,将样品以13,000rpm离心10分钟,并将上清液转移到新鲜管中。微毛细管反向相柱(内径为75微米,363-μm外径;多元技术)切成15-20厘米的最终长度,并用手储存喷雾尖端。用魔法C包装柱子(12厘米)18 使用压力炸弹100-Å,5-μm二氧化硅颗粒(MICHROM)。在加载样品之前,在HPLC缓冲液A1中平均柱。使用压力炸弹将一半样品施加到柱上,然后在缓冲液A1 + 5%乙腈中洗掉30-60分钟。然后将LC柱置于用于数据相关的MS / MS采集的Finnigan LCQ质谱仪前面(一个测量扫描,三个MS / MS最丰富的离子)。测序后相同 m/z 物种(±3 da)三次,它被放置在排除列表中3分钟。使用多相洗脱梯度(5分钟超过5分钟,14-40%超过60分钟,40-80%超过10分钟)从反相柱中从反相柱中洗脱肽。以相同的方式处理样品的剩余一半。为了防止交叉污染,在新制备的反相色谱柱上分析每个样品。 MS搜索是在Gingras中执行的 等等。 (
      • Gingras A.c.
      • Caballero M.
      • Zarske M.
      • 桑切斯A.
      • hazbun t.r.
      • 领域S.
      • Sonenberg N.
      • Hafen E.
      • 骑B.
      • Aeberberold R.
      一种新的,进化的保守蛋白质磷酸酶复合物,参与顺铂敏感性。
      )这样结果直接可比:Xcalibur(FINNigan)生成的原始文件转换为MZXML格式(
      • Pedrioli P.G.
      • ENG J.K.
      • Hubley R.
      • Vogelzang M.
      • 德意曲e.w.
      • 骑B.
      • 普拉特B.
      • Nilsson E.
      • Angeletti R.H.
      • APWEILER R.
      • 张克。
      • Costello C.E.
      • Hermjakob H.
      • 黄S.
      • 朱利安r.k.
      • Kapp E.
      • McComb M.E.
      • 奥利弗S.G.
      • omenn g.
      • Paton n.w.
      • 辛普森r.
      • 史密斯r.
      • 泰勒C.F.
      • 朱W.
      • Aeberberold R.
      质谱数据的共同开放表示及其在蛋白质组学研究中的应用。
      ),并使用对人类国际蛋白质指数(IPI)数据库的最续集搜索和搜索组合运行(来自相同的样本),版本3.01(搜索55,140个条目)。在不约束胰蛋白酶末端的数量的情况下进行续集搜索,在±2的前体离子和甲硫氨酸氧化(+16)中具有质量耐受性。用Peptipeprophet分析续集的HTML输出(
      • 凯勒阿。
      • nesvizhskii a.i.
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      经验统计模型来估计MS / MS和数据库搜索的肽识别的准确性。
      )和蛋白质反应(
      • nesvizhskii a.i.
      • 凯勒阿。
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      用串联质谱法鉴定蛋白质的统计模型。
      )使用每个程序的默认参数。 补充表S4 包含实验数据; 补充表S6和S7 列出基于单一肽鉴定的蛋白质以及相互作用的额外证据。 补充图S7 呈现由单个独特肽鉴定的那些蛋白质的注释光谱。

       国旗亲和纯化,使用抗体对内源蛋白的免疫沉淀,以及质谱分析 -

      标志亲和纯化基本上如前所述进行(
      • 陈G.I.
      • Gingras A.c.
      丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的亲和纯化质谱(AP-MS)。
      )随着以下修改。裂解缓冲液中的洗涤剂浓度为0.5%Nonidet P-40,将裂解缓冲液加入4ml / g的湿细胞沉淀,对细胞进行被动裂解(30分钟),然后进行一次冻融循环。对于内源蛋白的AP-MS,重悬于2.7ml裂解缓冲液中,将0.3mg来自未转染HEK293细胞的细胞沉淀物重新悬浮。如上所述制备细胞提取物。对于每种IP,使用7mg粗裂解物。将裂解物进行两种定位步骤:在20μL填充蛋白G珠粒1小时,1次,其中20μl填充蛋白G珠粒,预孵育为4μg抗HA抗体1小时。通过将抗MST4(16μL),抗绞喉(8μL)或抗标志(8μL)抗体和蛋白G-Sepharose(25μl包装珠)添加到Preclexed裂解物并孵育2来进行IP。 H。珠子在裂解缓冲液中洗涤三次,50米的三次洗涤m 碳酸氢铵。用氢氧化铵洗脱样品(从标志或内源性免疫沉淀),在速度vac中冻干,重悬于50米m 碳酸氢铵(pH8-8.3),并在37℃下用胰蛋白酶孵育过夜。蒸发碳酸氢铵,并将样品重悬于HPLC缓冲液A2(2%乙腈,0.1%甲酸)中,然后直接装载到内部的毛细管柱上,用魔术5μm,100埃,C18aq。 MS / MS数据在Thermofnigan LTQ上的数据依赖性模式(在2-H乙腈2-40%梯度上),或者是配备有Proxeon Nanosource和Agilent 1100毛细管泵的Thermofinnigan LTQ-Orbillap。使用TrantProteMic管道平台中可用的REACOFINNIGAN * .RAW文件生成MZXML文件。搜索到的数据库包含人类IPI Fasta序列文件(版本3.38; 70,856条目,并搜索相同的数字)和常见的污染物,并附上相同IPI数据库的反向版本。使用x!串联搜索mzxml文件(
      • 克雷格r.
      • Beavis R.C.
      串联:匹配具有串联质谱的蛋白质。
      ) 和 k-score插件(
      • 麦克莱恩B.
      • ENG J.K.
      • Beavis R.C.
      • McIntosh M.
      使用Tandem Search引擎开发和评估数据库评分算法的一般框架。
      )使用以下参数:B&Y离子系列,部分胰蛋白酶消化,允许一个错过的切割位点,并指定为可变修饰的甲硫氨酸氧化和N-末端乙酰化。片段质量耐受为0.8Da(单异位缺失),并且在LTQ数据的情况下,前体的质量窗是-1至4Da(平均质量),在-100至100ppm(单同间位质)的情况下LTQ-orbitrap数据。
      使用TandeM2XML将搜索结果转换为PepXML格式。 peptipeprophet(
      • 凯勒阿。
      • nesvizhskii a.i.
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      经验统计模型来估计MS / MS和数据库搜索的肽识别的准确性。
      )在每个结果集上运行,为每个搜索结果生成概率分数,这些搜索结果将添加到PepxmL文档中。在orbitrap数据的情况下,使用高质量精度选择。将得到的肽列表用蛋白质分子组装成蛋白质(
      • nesvizhskii a.i.
      • 凯勒阿。
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      用串联质谱法鉴定蛋白质的统计模型。
      )。解析域文件并导出到本地MySQL数据库中,以进一步分析和提取光谱计数信息。
      数据被导出到Excel文件并手动策略。分析生物重复的标志-PP2Ac(n = 3)单独标志(n = 3)验证程序的再现性(未显示)。为了生成高置信特异性交互式的列表,从最终列表中减去任何标志中检测到的任何标志中的蛋白质。只有那些用光谱计数检测到的蛋白质>20报告了至少两种诱饵。通过蛋白质分子和使用诱饵分数测量的错误率为0%。 补充表S5 包含实验数据; 补充表S6和S7 列出基于单一肽鉴定的蛋白质以及相互作用的额外证据。 补充图S7 呈现由单个独特肽鉴定的那些蛋白质的注释光谱。 补充表S8 包含基于单个独特肽鉴定的那些蛋白质的内源性IPS的MS数据。这里报告的高信心相互作用提交给生物格栅(
      • Breitkreutz B.J.
      • 斯塔克C.
      • 温典州T.
      • 鲍克尔L.
      • Breitkreutz A.
      • Livstone M.
      • ooughtred R.
      • 缺乏D.H.
      • 巴勒J.
      • 木头V.
      • Dolinski K.
      • 泰尔斯米
      BioGrid交互数据库:2008更新。
      )。

       免疫沉淀/ Western Blot-

      从稳定细胞系(如上制备)的裂解物与1.5小时的标志M2-琼脂糖珠一起温育,如上洗涤,并通过沸腾在Laemmli或标准XT样品缓冲液中直接洗脱。作为未转染的HEK293细胞的裂解物与蛋白质G-Sepharose(GE Healthcare)和抗体与内源纹蛋白(5μl),striatis3(2.5μl),MST4(2.5μl),PP4R2(5μl)或标志表位( 2.5μl)2小时并在裂解缓冲液中洗涤三次,并在PBS中洗脱,在25μl2×Laemmli样品缓冲液中洗脱。通过SDS-PAGE分离沉淀的蛋白质,转移到硝酸纤维素,并用针对标志或HA表位或内源蛋白的抗体检测。

      结果

       PP2A高密度相互作用网络 -

      PP2A(PP2Acα和PP2Acβ)的催化亚基被克隆到嵌入式C末端到龙头盒,并在HEK293细胞中稳定地表达。裂解细胞,并如前所述通过质谱法通过质谱法分析在双重纯化后回收的蛋白质(
      • Gingras A.c.
      • Caballero M.
      • Zarske M.
      • 桑切斯A.
      • hazbun t.r.
      • 领域S.
      • Sonenberg N.
      • Hafen E.
      • 骑B.
      • Aeberberold R.
      一种新的,进化的保守蛋白质磷酸酶复合物,参与顺铂敏感性。
      )。在背景减法之后(如参考文章。
      • Gingras A.c.
      • Caballero M.
      • Zarske M.
      • 桑切斯A.
      • hazbun t.r.
      • 领域S.
      • Sonenberg N.
      • Hafen E.
      • 骑B.
      • Aeberberold R.
      一种新的,进化的保守蛋白质磷酸酶复合物,参与顺铂敏感性。
      ),我们确定了这些催化亚基的高置信交互式互动剂(表I.)。先前用PP4C检测若干交互仪(α4和多管CCT副综合素复合物(注意,我们以前检测到PP2AC,PP4C和PP6C肽中的另一种蛋白质HTIP41,但我们未检测到HTIP41纯化中的肽催化亚基)(
      • Gingras A.c.
      • Caballero M.
      • Zarske M.
      • 桑切斯A.
      • hazbun t.r.
      • 领域S.
      • Sonenberg N.
      • Hafen E.
      • 骑B.
      • Aeberberold R.
      一种新的,进化的保守蛋白质磷酸酶复合物,参与顺铂敏感性。
      )。所有其他交互式均对PP2Acα和PP2Acβ特异。两种PP2A催化亚基基本上与以前研究预期的相同的互动剂(
      • 周J.
      • PHAM H.T.
      • 沃尔特G.
      PP2A全酶的形成和活性不依赖于催化亚基的同种型。
      ,
      • Ikehara T.
      • Shinjo F.
      • Ikehara S.
      • Imamura S.
      • Yasumoto T.
      杆状病毒的表达,纯化和人蛋白磷酸酶2a催化亚基α和β的表征。
      )。
      表I.人PP2A型磷酸酶相互作用网络
      为了表征磷酸酶复合组织,我们产生了这些磷酸酶周围的高密度相互作用网络。为此,我们克隆到TAP载体中并稳定地在HEK293细胞中表达一些已识别的交流剂(α4,PP2ABα,PP2AB'α,PP2A B'Striatin4和MOB3;基因名称在 补充表S1)。点击和质谱分析这些交互式的分析产生了PP2A催化亚基周围的相互作用的详细图(表I.图。1B)。我们鉴定了几种不同的原型三聚体复合物,其含有PP2Ac催化亚基,PP2A A支腿亚基和调节B,B'或B'(Striatin4)亚基。请注意,我们没有在这套实验中检测与B“家庭的关联,但我们在随后使用国旗亲和纯化(补充表S5)。每个调节亚基与PP2Ac·PP2A相关的核酸核心,并没有与监管亚基的其他家庭联系起来(见下文用于讨论略微思维二元化)。总体而言,该实验综述了PP2A三聚体的已知组织,其由一种催化蛋白,单个支架蛋白和单一调节分子(用于B和B'家族; 图1C.)。此外,在不存在PP2A A的情况下,我们将α4与PP2Ac相互作用综合,表示α4和PP2A A和B亚基之间的明显相互互相相互作用。这些结果表明,我们的方法可以通过生化方法成功识别先前描述的复合物,并且可以扩展这种类型的分析以识别可能的新互动。
      除了经典的PP2A家族三聚体之外,我们的网络也检测了许多额外的蛋白质。例如,在PP2A A纯化(PP2Ac纯化中的少数)中鉴定了用于脂蛋白α(PPFIA1)的几种肽。脂脂是多畴支架蛋白首先被鉴定为白细胞抗原相关(蛋白酪氨酸磷酸酶,受体类型F)酪氨酸磷酸酶(
      • 麦克莱恩B.
      • ENG J.K.
      • Beavis R.C.
      • McIntosh M.
      使用Tandem Search引擎开发和评估数据库评分算法的一般框架。
      )与若干生物中的突触功能相关联(
      • 麦克莱恩B.
      • ENG J.K.
      • Beavis R.C.
      • McIntosh M.
      使用Tandem Search引擎开发和评估数据库评分算法的一般框架。
      ,
      • Spangler S.A.
      • hoogenraad C.C.
      Liprin-α蛋白:用于突触成熟的支架分子。
      )。最近的出版物报告了利脂蛋白α与B'γPP2A调节亚基相互作用(
      • Arroyo J.D.
      • 李地下。
      • 哈恩W.C.
      Liprinα1与PP2AB56γ相互作用。
      )。 pp2acβ的另一个相互作用伙伴是fop(也看到 补充表S5),与CAP350相关的蛋白质,用于锚固到中心体(
      • yan x.
      • Habedanck R.
      • nigg e.a.
      两种中央蛋白,CAP350和FOP的复合物,与EB1配合在微管锚固中。
      )。最初发现FOP作为茎细胞肌培养性疾病中的成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)的融合伙伴,并赋予FGFR1的二聚化(和组成型活化)(
      • Mikolajka A.
      • yan x.
      • popowicz g.m.
      • Smialowski P.
      • nigg e.a.
      • holak t.a.
      FOP(FGFR1OP)蛋白的N-末端结构域的结构和其二聚化和中心定位的影响。
      • Popovici C.
      • 张B.
      • Gregoire M.J.
      • jonveaux p.
      • Lafage-Pochitaloff M.
      • Birnbaum D.
      • Pebusque M.J.
      干细胞肌酚肌鳞状病症中的T(6; 8)(Q27; P11)易位融合了一种新的基因FOP,对成纤维细胞生长因子受体1。
      • guasch g。
      • Deraval B.
      • Arnoulet C.
      • 谢米杰。
      • Xerri L.
      • 萨蒂D.
      • Birnbaum D.
      • Pebusque M.J.
      FOP-FGFR1酪氨酸激酶,T(6; 8)易位的产物,诱导小鼠的致命野生鳞状疾病。
      )。除了脂利蛋白和FOP之外,所有其他新的PP2A交流剂与STRIATIN4和MOB3共同纯化;下面更详细地描述这些互动器。 FOP和Liprins没有与Mob3和Striatin4联系,并将成为单独进行的主题。

       pp2a,striatis和mob3稳定地与新的组件缔合 -

      我们特别感兴地呼吸含有催化和支腿PP2A亚基的表观高阶络合物,调节剂B'分子STIATIN4和MOB3蛋白。人类存在三个纹状体蛋白质(基因名称 斯特克恩, 斯特克恩3, 和 斯特克恩4)。综合表达水平在大脑中是最高的,其中它涉及突触函数(
      • Moreno C.S.
      • 公园S.
      • 纳尔逊K.
      • ashby d.
      • Hubalek F.
      • 泳道W.S.
      • Pallas D.C.
      WD40重复蛋白质纹胞蛋白和S / g(2)核自身抗原是与蛋白质磷酸酶2a相关联的新型钙调蛋白结合蛋白质的成员。
      • 铸件F.
      • rakitina t.
      • 盖尔德S.
      • Moqrich A.
      • 马特里M.G.
      • 蒙诺伦A.
      Zinedin,Sg2Na和Striatin是钙调蛋白结合的,主要在大脑中主要表达WD重复蛋白质。
      • 铸件F.
      • Bartoli M.
      • Barnier J.v.
      • Baillat G.
      • Salin P.
      • Moqrich A.
      • Bourgeois J.P.
      • 丹尼兹F.
      • 鲁格·克
      • 蔚蓝的G.
      • 蒙诺伦A.
      属于WD-Repeed系列的新型钙调蛋白结合蛋白质在CNS神经元的颗粒中局部化。
      • Bartoli M.
      • Ternaux J.P.
      • Forni C.
      • Portalier P.
      • Salin P.
      • amalric m.
      • 蒙诺伦A.
      Sriatin的下调,神经元钙调蛋白结合蛋白,损害大鼠运动活性。
      • Benoist M.
      • 盖尔德S.
      • 铸件F.
      Striatin家族:树突刺的新信号平台。
      )。早期的共同降水研究(
      • Moreno C.S.
      • 泳道W.S.
      • Pallas D.C.
      酵母MOB1的哺乳动物同源物是构件和施联家族蛋白质磷酸酶2a配合物的推定衬底。
      )确定小MOB3蛋白(在初始出版物中称为Phocein或Hmob1,基因名称 MOBKL3 (
      • Baillat G.
      • Moqrich A.
      • 铸件F.
      • Baude A.
      • 纾困
      • Benmerah A.
      • 蒙诺伦A.
      Phocein的分子克隆与表征,从Golgi络合物中发现树突刺的蛋白质。
      ,
      • 巴布利Y.J.
      • 铸件F.
      Phocein:Purkinje细胞树突刺的脉湿贩运中的潜在演员。
      ))作为氏族相互作用的伴侣。较高的真核生物存在多种暴徒蛋白质,其似乎通过直接结合调节相关的核哑铃形成(DBF)2相关和大型肿瘤抑制作用的激酶(
      • Hergovich A.
      • Cornils H.
      • HEMMINGS B.A.
      哺乳动物NDR蛋白激酶:从调节到中心复制中的作用。
      )。通过共免疫沉淀和二维凝胶电泳在这些早期的研究中检测到的其他纹状体相互动器残留有不起作道的(
      • Moreno C.S.
      • 泳道W.S.
      • Pallas D.C.
      酵母MOB1的哺乳动物同源物是构件和施联家族蛋白质磷酸酶2a配合物的推定衬底。
      )。
      我们的Triatin4和MOB3(以及PP2Ac和PP2A A)的Tap标记和AP-MS分析产生了许多对应于两种不同蛋白质家族的肽:1)FAM40A / FAM40B,我们重命名了Strip1和Strip2(也见下文), 2)CTTNBP2NL / CTTNBP2(Fig. 1, BD;还检测到额外的不相关蛋白的少量肽)。 Strip1和Strib2是高度相关的蛋白质(68%的身份; 补充图。S1)未知功能与人类基因组中的其他蛋白质没有显着同源性,没有可识别的序列基序。然而,条带1/2蛋白与酵母蛋白贝尔11重量13%,与信息素信号传导相连,以及21%的同一性 神经孢子仓库 HAM-2基因产物,其含有悬垂融合(补充图。S1)。 CTTNBP2和CTTNBP2NL也相关; CTTNBP2的N末端是38%相同的,53%与CTTNBP2NL相似,超过649 AA(补充图S2)。预测该N末端部分包含〜200-AA卷绕线圈图案。对应于N-末端630 AA的CTTNBP2(也称为CBP90)的较短变体首先被鉴定为与覆盖测定和GST下拉的SRC同源性3结构域与皮质蛋白(皮质肌动蛋白结合蛋白)的SRC同源性3结构域相互作用(
      • 哦好的。
      • 塔凯y.
      Cortactin同种型的分离和表征和新型皮质蛋白结合蛋白,CBP90。
      )。该相互作用显然是由富含CTTNBP2的富含脯氨酸的区域介导的,所述CTTNBP2在CTTNBP2NL(补充图S2)。请注意,我们在任何互动研究中都没有检测到Cortactin。
      因为我们在Tap实验中获得了比其各自的常规蛋白酶在其各自的副病剂中获得了更多的肽,所以我们使用这两种蛋白质进行随后的IP / Western验证研究。克隆到PCDNA3-FLAG载体中的条带1和CTTNBP2NL(参见“实验过程”)并在HEK293细胞中稳定地表达。利用标志M2-琼脂糖珠子对裂解物进行免疫纯净,然后使用针对内源绞喉蛋白的抗体和PP2Ac(带有PP2AAα的条带1的相互作用的免疫印迹 补充图S3)。作为对照,单独用标志载体转染细胞或Flag-α4(根据我们的MS结果,alpha4与pp2ac相互作用,但不用股骨苷)。如图所示 Fig. 2 (尽管标志-CTTNBP2NL的表达低,但CTTNBP2NL共沉淀的绞喉和PP2Ac,但PP2Ac(和PP2A A; 补充图S3)共沉淀低。这与我们的MS结果一致,其中STRIATIN4和MOB3纯化在其上具有最高的条带1和CTTNBP2NL肽。 PP2AC和PP2A中的脱脂型和CTTNBP2N1肽的相对较低的浓度(每种具有PP2Ac的13个)可以通过含有相同PP2Ac和PP2A A子单元的替代配合物来计算(
      • Janssens V.
      • Goris J.
      • 范蹄C.
      PP2A:预期的肿瘤抑制剂。
      • virshup d.m.
      蛋白质磷酸酶2a:酶的胰蛋白酶。
      • Mumby M.
      PP2A:揭示不情愿的肿瘤抑制器。
      )。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2具有PP2Ac和STRIATIN的条带和CTTNBP2NL的关联。 单独用稳定表达标志的细胞池制备萃取物,对每个条件(全细胞裂解物为25μg)的300μg裂解物进行M2-琼脂糖珠子上的标志纯化。(全细胞裂解物为25μg) 。直接在Laemmli样品缓冲液中洗脱蛋白质,通过SDS-PAGE分离,转移到硝酸纤维素中,并通过用内源纹蛋白的抗体免疫印迹(A),pp2ac(B),alpha4(C)或标志标签(D)。蛋白质的位置由AN表示 打开箭头, 和 星号 表示IgG重链和轻链。标志标记的CTTNBP2NL在非常低的级别表示,其位置由AN表示 开圈.

       Strip1和Cttnbp2nl-的互动伙伴 -

      接下来,我们的重点是蛋白质的表征与条带1和CTTNBP2NL相关联。为了增加产量并潜在富集较弱的交互运动,我们使用单个N末端标志表位使用净化策略。虽然这种方法产生了背景污染物的显着增加(
      • 陈G.I.
      • Gingras A.c.
      丝氨酸/苏氨酸磷酸酶的亲和纯化质谱(AP-MS)。
      ,
      • 陈G.I.
      • TisayaKorn S.
      • Jorgensen C.
      • d'ambrosio l.m.
      • Goudreault M.
      • Gingras A.-​​C.
      PP4R4 / Kiaa1622与磷蛋白磷酸酶4形成新型稳定的胞质络合物。
      ),它还使我们能够在我们的复合物中获得每个蛋白质的肽覆盖率显着增加。在HEK293细胞中稳定表达的标志标记的Strib1和CTTNBP2NL(如 Fig. 2)用于AP-MS,如“实验程序”下所述,减去污染蛋白,以产生注释的互动仪列表(表二补充表S5)。
      表二矩阵分布在一个代表实验中的旗帜下拉(列)跨标志
      •对于基于单个独特肽的识别,提出了实验证据的列表 补充表S6和S7;注释光谱显示在 补充图S7.
      ••蛋白质分子检测到该蛋白质对应的光谱,但没有谱可以唯一地分配给该条目。
      如图所示 表二,纯化旗标标记的小鼠剥离蛋白有效回收PP2A催化和支架亚基以及所有三个纹体和MOB3,证实这些相互作用(Fig. 1)。 CTTNBP2NL和CTTNBP2也被检测到条带1AP-MS中,表明这些蛋白质可以存在于与条带1相同的复合物中。几种肽也鉴定了另外的蛋白质(表III 下面的文本是关于这些蛋白质的简要描述),包括SLMAP;两个小相关蛋白,Sike和FGFR1Op2; STE20激酶的GCK-III亚家族的成员(STK24,STK25和MST4);和CCM3蛋白质。 CTTNBP2NL的纯化也恢复了所有这些蛋白质(包括Strip1 / FAM40A和Strip2 / FAM40B),除了SLMAP,FGFR1OP2和SIKE(图。 3.4)。以下每个互动者的简要描述。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4与Tillak相互独家协会。AB,Stripak以互斥的方式与CTTNBP2NL或TRAF3IP3组装。在瞬时共同共同共同表达所示的标志和HA标记构建体的HEK293细胞上对抗标岛琼脂糖珠的免疫沉淀。为了监视交互的特异性,负控是单独的标志以及FLAG-PP4R2。通过SDS-PAGE分解免疫复合物,然后转移到硝酸纤维素。通过免疫印迹检测HA标记蛋白的共沉淀( IB.)对于HA表现(顶面板;标记蛋白的位置由一个表示 . 星号 表示沉重的链条。)。用抗标志抗体检测沉淀的旗帜标记的蛋白质(中间板)。所有样品中HA标记蛋白的表达是可比的(底板)。 CD,用于与Stripak相互独家交互的模型。我们的数据表明条带蛋白质(橙子)与纹状体,MOB3和磷酸酶缔合(绿色)在稳定的综合体中。与这种复合物相关的是CCM3和GCK-III激酶(粉色的);这些可能更弱相关,因为它们没有在水龙头中恢复。该核心综合体Stripak可能会与CTTNBP2家族蛋白质相关联(C)或含有含有SLMAP和SIKE Family蛋白的第二个复合物(D)。
      最初鉴定为参与肌细胞融合和肌肉收缩的心脏Sarcolemma的组分(
      • Wigle J.T.
      • Demchyshyn L.
      • Pratt M.A.
      • 污渍w.a.
      • SALIH M.
      • Tuana B.S.
      Sarcolemmal相关蛋白的分子克隆,表达和染色体分配。与膜相关的酸性两亲α-螺旋蛋白的家族。
      • wielowieyski p.a.
      • 塞斯克斯。
      • Guzzo R.
      • SALIH M.
      • Wigle J.T.
      • Tuana B.S.
      替代的剪接,表达和编码Sarcolemmal相关蛋白(锁链)的基因的区域的基因组结构限定了一种新型卷曲线圈尾锚膜蛋白。
      • guzzo r.m.
      • Wigle J.
      • SALIH M.
      • 摩尔E.D.
      • Tuana B.S.
      尾锚式的Sarclemmal膜相关蛋白的调节表达和时间诱导对于肌细胞融合至关重要。
      )。已经研究了四个SLMAP拼接变体;所有人都向C末端和两个推定的亮氨酸拉链编码,但在它们的N末端变化:最长的同种型之一编码推定的FHA结构域并定位到中心组(
      • guzzo r.m.
      • 塞斯克斯。
      • SALIH M.
      • Tuana B.S.
      一种新的Sarclemmal膜相关蛋白(SLMAP)的同种型是微管组织中心的组分。
      )。
      Sike是一种含小的卷绕线圈的蛋白质,首先表征为激酶TBK1和Ikk1和作为干扰素途径的负调节剂的相互作用伴侣(
      • 黄杰。
      • 刘涛。
      • Xu L.G.
      • 陈德。
      • 翟Z.
      • 舒H.B.
      Sike是TLR3和病毒触发的IRF-3激活路径的IKK epsilon / TBK1相关抑制器。
      )。 Sike与另一种共沉淀蛋白FGFR1OP2相同的50%。在整个Metazoa中检测到Sike和FGFR1OP2 Orthologs,但在模型生物体中没有任何功能归因于这些蛋白质(补充图S4)。有趣的是,FGFR1OP2涉及8P11肌酚综合征,一种难得和激进的血液恶性肿瘤,其特征在于不相关基因对FGFR1的融合,导致FGFR1以配体无关的方式的二聚化和活化。 FGFR1OP2融合涉及来自FGFR1OP2的两个卷曲线圈结构域,其可能促进FGFR1OP2-FGFR1蛋白的二聚化(
      • 盛大e.k.
      • 盛大F.H.
      • 追逐a.j.
      • 罗斯。
      • Corcoran M.M.
      • 奥斯蒂尔D.G.
      • 十字架N.C.
      鉴定新型基因FGFR1OP2,融合在8P11野生酚综合征中的FGFR1。
      )。
      CCM3蛋白由基因编码 PDCD10,其突变在具有脑海绵状畸形的家庭中发现(
      • GUCLU B.
      • ozturk A.K.
      • Pricola K.L.
      • Bilguvar K.
      • Shin D.
      • o'roak b.j.
      • 枪子M.
      凋亡相关基因的突变,PDCD10,引起脑海绵状畸形3。
      ,
      • 贝格纳迪F.
      • 丹尼尔C.
      • 吊带P.
      • 阿尔恩州
      • Boetto S.
      • clanet m.
      • Coubes P.
      • echenne b.
      • 易卜拉欣R.
      • irthum b.
      • 雅克G.
      • 朗州米
      • 莫鲁J.J.
      • Neeau J.P.
      • 帕克F.
      • Tremoulet M.
      • Tournier-Lasserve E.
      程序化细胞死亡10基因内的突变导致脑海绵状畸形。
      ,
      • 克雷格H.D.
      • 枪子M.
      • Cepeda O.
      • 约翰逊e.w.
      • Ptacek L.
      • Steinberg G.K.
      • Ogilvy C.S.
      • Berg M.J.
      • Crawford S.C.
      • 斯科特·丽鱼
      • Steichen-Gersdorf E.
      • Sabroe R.
      • 肯尼迪C.T.
      • 梅特勒G.
      • Beis M.J.
      • 炸锅A.
      • awad i.a.
      • Lifton R.P.
      Multilocus Linkage识别孟德尔中风,脑海绵状畸形,7p15-13和3Q25.2-27的孟德尔型畸形形式的两个新位置。
      )。脑海绵状畸形是一种影响人口0.5-1%的血管瘤(
      • plummer n.w.
      • Zawistowski J.s.
      • marchuk d.a.
      脑海绵状畸形的遗传学。
      • Revencu N.
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      脑海绵状畸形:新的分子和临床洞察。
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      • 丹尼尔C.
      • 贝格纳迪F.
      • Tournier-Lasserve E.
      海绵状血管瘤的遗传学。
      )。虽然大多数人无症状,但大约30%的人会产生从头痛癫痫发作,中风甚至死亡的症状。先前证明了CCM3蛋白与STE20家族激酶的GCK-III亚组相互作用,两种杂交测定(首次报道相互作用)和通过共免疫沉淀,然后是蛋白质印迹(
      • 最大限度。
      • 赵H.
      • 山J.
      • 长f。
      • 陈Y.
      • 陈Y.
      • 张Y.
      • 汉X.
      • 疯狂的。
      PDCD10与STE20相关激酶MST4相互作用,以通过调制ERK途径来促进细胞生长和转化。
      ,
      • 沃斯·克。
      • 斯塔尔斯。
      • 施莱德e.
      • Ullrich S.
      • 镍J.
      • 穆勒T.D.
      • 菲尔堡U.
      CCM3与CCM2相互作用,表明脑海绵状畸形的常见发病机理。
      )。与此一致,在我们的研究中,发现了这三种STE20激酶(STK24,STK25和MST4)的几种肽(STK24,STK25和MST4)。这三个激酶限定了由N-末端激酶结构域的发芽中心激酶(GCK-III)的亚组,然后是未知功能的C末端尾。 GCK-III激酶已与增殖,凋亡和应激反应相关联,但基材和分子机制仍然很大程度上是未知的(
      • 林J.L.
      • 陈H.C.
      • 方。
      • 罗宾逊D.
      • Kung H.J.
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      MST4,一种新的STE20相关激酶,通过调节ERK途径介导细胞生长和转化。
      • 奥萨达S.
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      • SAITO R.
      • Mizuno K.
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      YSK1,一种与STE20和SPS1结构相关的新型哺乳动物蛋白激酶,但不参与已知的MAPK途径。
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      • Blagoev B.
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      掩盖克隆,哺乳动物发芽中心激酶III亚家族的新成员,具有凋亡诱导性能。
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      MST4的克隆与表征,一种新型STE20样激酶。
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      • l
      • 郭杰。
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      • 吴y.l.
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      鉴定哺乳动物STE20样激酶3的人脑特异性同种型,其由CAMP依赖性蛋白激酶调节调节。
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      • Molnar A.
      • Kyriiakis J.
      • 强制T.
      通过氧化剂应力激活人类ste20样激酶限定了一种新的应力响应途径。
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      • 强制T.
      • Kyriiakis J.
      • nogueira E.
      • Fidalgo M.
      • Zalvide J.
      STE20群激酶的GCK II和III亚颗粒。
      )。
      通过免疫沉淀/免疫印迹证实了条带1和CTTNBP2NL与内源MST4的相互作用(图3A);标志-α4用作阴性对照,未能共析出MST4。我们还监测了内源性蛋白质之间的相互作用。针对MST4,STIATIN和STRIATIN3(但不是抗PP4R2或抗标志)的抗血清,所有回收的STIATIN和STRIATIN3来自未经传播的HEK293细胞(图3B.),表明MST4激酶和纹体之间检测的相互作用不是由于表位标签或轻度过表达的存在。我们还使抗MST4和抗痉挛3免疫沉淀物进行质谱,并且能够恢复在FLAP AP-MS中也看到的许多结合伴侣(补充表S8)。
      总之,条带1和CTTNBP2N1的AP-MS证实了与PP2Ac,PP2A A,纹体和MOB3的相互作用,但也显示出这些蛋白质能够彼此相互作用。此外,激酶的SLMAP,SIKE,FGFR1OP2,CCM3和Kinases的GCK-III亚家族能够与这些蛋白质相互作用,并且是该综合体的推定组分(图。 3.4)。

       复杂组件之间的互易相互作用 -

      为了进一步表征许多新检测到的蛋白质 - 蛋白质相互作用,Flag-pp2acα,Flag-pp2acβ,Flag-pp2a A,Flags-striatin,Flag stiatin3,Flag-STK24,Flag-Stk25,Flag-Cttnbp2和旗子在HEK293细胞中稳定地表达第二轮相互作用研究。我们无法在HEK293细胞中表达SLMAP(补充图S6 和数据未显示),因此克隆并表达了SLMAP的唯一相关的家庭成员,即TRAF3IP3(补充图S5)。 SLMAP和TRAF3IP3在氨基酸水平上共享22%的同一性(一段343个氨基酸表现出28%同一性和50%相似性),并且两种蛋白质含有预测的卷绕线圈区域。 TRAF3IP3最初被克隆为通过C-JUM N-末端激酶(JNK)途径所涉及的信号传导的TRAF3交流剂,通常限于淋巴原源的细胞,并且在HEK293细胞中没有内源性地表达。在这些研究的开始(并且因为SLMAP和TRAF3IP3之间的相似性相当低),我们不知道TRAF3IP3是否将与与SLMAP相同的合作伙伴相互作用。在包含Flag-Traf3ip3的情况下,诱饵列表表示在我们的条带1和CTTNBP2NL AP-MS分析中检测到的每种副杀蛋白家族的至少一个成员。
      通过IP / Western从每个旗帜标记的稳定细胞系(补充图S6 和数据未显示)。对于每个标志标记的蛋白质的AP-MS也被执行以彼此检测它们的关联(表二; MS数据的完整列表 补充表S5;以前通过ewing报道了一些用STK24的一些蛋白质的相互作用 等等。 (
      • e
      • 楚P.
      • Elisma F.
      • 李H.
      • 泰勒P.
      • 生长。
      • 麦格罗姆 - Cerajewski L.
      • 罗宾逊M.D.
      • O'Connor L.
      • 李米
      • 泰勒r.
      • dharsee m.
      • 何Y.
      • Heilbut A.
      • 摩尔L.
      • 张某。
      • Ornatsky O.
      • Bukhman Y.v.
      • 梯队M.
      • 盛Y.
      • vasilescu J.
      • 阿布 - 法哈姆
      • 兰伯特J.P.
      • DEDWEL H.S.
      • 斯图尔特二,
      • Kuehl B.
      • 高清K.
      • Colwill K.
      • 格兰德维克
      • 穆斯克特B.
      • Kinach R.
      • 亚当斯S.L.
      • 莫兰姆。
      • Morin G.B.
      • 最佳aloglou T.
      • FIGEYS D.
      质谱法的大规模映射人蛋白 - 蛋白质相互作用。
      )但是数据的低密度不允许测定复杂的组合物)。纹体以及MOB3蛋白,PP2A支架亚基,CCM3和GCK-III组的STE20激酶共沉淀到该大群中的其他蛋白质,表明这些蛋白质具有与每个成员形成相互作用的能力复杂。此外,如上所述,如前所述,我们观察到纹章可以相互关联; STIATIN为Striatin3和Striatin4带来了独特的肽,反之亦然。 PP2AC·PP2A A·施联·MOB3·条带·CCM3·GCK-III蛋白,因此形成了大量多蛋白复合物 体内 我们称之为Stripak复合物。
      有趣的是CTTNBP2的AP(与上述CTTNBP2N1)不含可检测量的SLMAP,SIKE或FGFR1OP2。相反,与SLMAP相关的蛋白质TRAF3IP3的免疫沉淀物没有屈服于可检测量的CTTNBP2或CTTNBP2NL,但确实产生了大量的SIKE和FGFR1OP2。 Sike免疫沉淀物含有大量的SLMAP和FGFR1OP2肽,但没有可检测的CTTNBP2或CTTNBP2NL肽。这些数据表明CTTNBP2NL或CTTNBP2与剩余的Stripak复合物的关联可以排除SLMAP / TRAF3IP3和SIKE / FGFR1OP2的关联,反之亦然; IE。 这些互动似乎是相互排斥的。为了验证这些发现,通过针标记的蛋白(Sike,Mob3,Striatin3,Strip1,STK24,CTTNBP2NL,TRAF3IP3,PP4R2或标志,对所述CTTNBP2NL或TRAF3IP3的HA标记版本的CTTNBP2NL或TRAF3IP3的瞬态转染。重组标记标记的蛋白质是免疫沉淀的,并且通过用抗HA表位的抗体免疫引起HA标记蛋白的共析出。如所预期的,HA-CTTNBP2NL和HA-TRAF3IP3在MOB3,STRIATIN3,Strip1和STK24下拉有效回收,但不在阴性对照中(单独标志和PP4R2; Fig. 4, AB)。然而,与我们的质谱结果一致,HA-CTTNBP2NL在SIKE或TRAF3IP3下拉中未被检测到(图4A, 顶面板, 车道12)。相反,在CTTNBP2NL下拉中,HA-TRAF3IP3在CTTNBP2NL下拉中不可检测,但在SIKE下拉( 图4B., 车道12)与Sike / FGFR1OP2和SLMAP / TRAF3IP3可以存在于相同的复合物中但不与CTTNBP2NL / CTTNBP2一起存在的概念一致。
      我们的数据突出显示含有PP2A催化和脚手架亚基的稳定,核心络合物,斯特迪赖汀(S),MOB3和条带(Fig. 4, CD)。因为我们在我们的龙头实验中没有检测到CCM3和STE20激酶,因此它们不太可能形成该核心复合物,并且可能与其更加松散地形成Tripak复合物。 Stripak组件似乎与CTTNBP2系列的成员或使用SLMAP / TRAF3IP3与SIKE / FGFR1OP2组合相关联。

      讨论

       CCM3及其GCK-III激酶亚家族合作伙伴与PP2A复合物物理相关 -

      在这里,我们报告了链接的大分子组件(Stripak)的识别 PDCD10 基因产物CCM3和相关的GCK-III激酶到PP2A·striatin·MOB3·条状复合物。 CCM1,CCM2和CCM3基因中的突变占几乎所有家族脑海绵状畸形的病例(
      • 吊带P.
      • 丹尼尔C.
      • 贝格纳迪F.
      • Tournier-Lasserve E.
      海绵状血管瘤的遗传学。
      )。以前的蛋白质组学研究检测到CCM3,CCM1和CCM2之间的相互作用,表明所有三种蛋白质的共同作用方式(
      • 沃斯·克。
      • 斯塔尔斯。
      • 施莱德e.
      • Ullrich S.
      • 镍J.
      • 穆勒T.D.
      • 菲尔堡U.
      CCM3与CCM2相互作用,表明脑海绵状畸形的常见发病机理。
      ,
      • 亨利德T.L.
      • 马龙M.H.
      • 奔驰S.
      • Colicelli J.
      • Haystead T.A.
      • 约翰逊G.L.
      • 吴C.C.
      脑海绵状畸形信号复合物的蛋白质组学鉴定。
      )。然而,在这里,我们证明(至少在HEK293细胞中)CCM3优先与GCK-III激酶和新定义的PP2A·striatin·MOB3·条带复合物相关联。在通过CCM3或其他条纹部件的分析中检测到NO CCM1或CCM2肽。但是,我们在使用CCM2(而不是CCM3)作为诱饵时,在执行AP-MS时,我们确实获得了CCM3和CCM2之间的交互。在这种情况下,标志标记的CCM2下拉队使CCM1产生了许多肽;还检测到少数CCM3肽(未示出)。这些数据表明,CCM1和CCM2形成了一个丰富的复合体,其可能与CCM3以替代量相关联,而大部分CCM3与Tripak复合物相关联。因此,应对PP2A·striatin·MOB3·剥离复合物的成员应分析其参与CCM的非家族性病例,其中疾病的遗传基础未知(CCM1-3中的突变仅占零星的60%案例(
      • 吊带P.
      • 丹尼尔C.
      • 贝格纳迪F.
      • Tournier-Lasserve E.
      海绵状血管瘤的遗传学。
      )))。

       GCK-III激酶与PP2A之间的相互作用

      它是有趣的,Timtak络合物含有磷酸酶和激酶组分。先前已经报道了PP2A和几种冲突之间的关联。酪蛋白激酶II,核糖体S6蛋白激酶(S6K1),钙钙调蛋白依赖性激酶IV(CAMKIV)和RAF蛋白全部被描述为PP2A的催化亚基的交互式(
      • Westphal R.S.
      • 安德森克.A.
      • 意味着A.R.
      • Wadzinski B.E.
      CA的信号综合体2+-calmodulin依赖性蛋白激酶IV和蛋白质磷酸酶2a。
      • Westphal R.S.
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      • Marotta A.
      • Pelech S.L.
      • Wadzinski B.E.
      由P70S6激酶 - 蛋白磷酸酶2A(PP2A)和P21-活化激酶-PP2A组成的激酶 - 磷酸酶信号调节模块的鉴定。
      • Heriche J.K.
      • lebrin f.
      • rabilloud t.
      • Leroy D.
      • Chambaz e.m.
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      用酪蛋白激酶2α直接相互作用调节蛋白质磷酸酶2A。
      • 亚伯拉罕D.
      • Podar K.
      • 靠钉锤
      • Kubicek M.
      • Welzel N.
      • HEMMINGS B.A.
      • Dilworth S.M.
      • Mischak H.
      • KOLCH W.
      • Baccarini M.
      Raf-1-相关蛋白磷酸酶2a作为激酶活化的正调节剂。
      )但没有被识别为本研究中PP2A的互动伙伴。这种明显的差异可能是由于所用生物系统的差异(例如,在T细胞中进行CAMKIV-PP2A相互作用的初始鉴定(
      • Westphal R.S.
      • 安德森克.A.
      • 意味着A.R.
      • Wadzinski B.E.
      CA的信号综合体2+-calmodulin依赖性蛋白激酶IV和蛋白质磷酸酶2a。
      ))或更可能由于使用的分析方法的差异灵敏度。以前的研究通过亲和纯化一种组分(通常是激酶)的亲和纯化,然后对另一个因子(PP2A)进行免疫印迹。相比之下,我们依赖于偶联的PP2A磷酸酶的免疫沉淀到直接MS分析。因为PP2A是一种高度丰富的蛋白质,并且能够与多个结合伴侣相互作用,所以用特定蛋白质络合的PP2a的级分可能低于我们方法的检测限。在这方面,甚至在每次分析中都没有检测到pp2ac与ste20激酶的相互作用;当从纹状体或主要在RILTAK中的其他复合组分开始时,旨在更容易地检测到GCK-III激酶的共沉淀。
      单个复合物内的GCK-III激酶和PP2A磷酸酶的存在提高了酶/衬底关系的有兴趣问题。调节磷酸酶的激酶是否反之亦然?这两种酶的基材是其他条纹部件,或者是尚未识别的基板吗?有趣的是许多达纹组件是磷蛋白(
      • Moreno C.S.
      • 泳道W.S.
      • Pallas D.C.
      酵母MOB1的哺乳动物同源物是构件和施联家族蛋白质磷酸酶2a配合物的推定衬底。
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      • 沃斯·克。
      • 斯塔尔斯。
      • 施莱德e.
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      通过氧化剂应力激活人类ste20样激酶限定了一种新的应力响应途径。
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      • de Corte V.
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      • Kopajtich R.
      • gettemans J.
      • 巴尔F.A.
      YSK1由Golgi矩阵蛋白GM130激活,并在细胞迁移中通过其基材在14-3-3℃下起作用。
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      • Schinkmann K.
      • Blenis J.
      具有异常辅因子要求的人体STE20样蛋白激酶的克隆与表征。
      );已知的磷酸肽显示在 补充图S1,S2和S4。此外,先前建议纹胞苷和MOB3蛋白是PP2A靶标作为其磷酸化(如通过SDS-PAGE上的移动移位检测到的磷酸化) 32P PP2A抑制剂冈田酸治疗后,P标记增加(
      • Moreno C.S.
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      • Pallas D.C.
      酵母MOB1的哺乳动物同源物是构件和施联家族蛋白质磷酸酶2a配合物的推定衬底。
      )。在三个纹体中的每一个上鉴定出磷酸化位点,分别位于氨基酸Ser-245,Ser-229和Ser-206上(
      • 蒙顿r.p.
      • tweedie-cullen r.
      • Livingstone-Zatchej M.
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      • Gygi S.P.
      基于概率的高通量蛋白磷酸化分析和现场定位方法。
      )。进一步的研究旨在定义这些磷酸化事件对与Tripak相关的磷酸酶和激酶的依赖性。

       蒂普拉克的功能是什么? -

      虽然我们的研究使我们能够定义大分子复合物,其中大部分CCM3蛋白质所在,但该复合物的功能仍有待阐明。几种复杂的组分局部局部化为胞质溶细胞和细胞内膜,并且报告将它们与细胞内运输联系在哺乳动物细胞中。例如,MOB3(Phocein)与Clathrin适配器共享有限的同源性,并且可以与EPS15(Clathrin介导的内吞作用的蛋白质)和核苷 - 二磷酸激酶(其产品,GTP,用于发动型突触囊泡囊泡再循环中所需的核苷类 - 二磷酸酯激酶)相互作用(
      • Baillat G.
      • 盖尔德S.
      • 铸件F.
      • 蒙诺伦A.
      Phocein与核苷 - 二磷酸激酶,EPS15和发电机I的相互作用。
      ,
      • 克里希南K.S.
      • Rikhy R.
      • 饶科斯
      • Shivalkar M.
      • 莫斯科米
      • Narayanan R.
      • etter p.
      • 埃斯特雷斯第3夫
      • Ramaswami M.
      Nucleoside二磷酸激酶,GTP的来源是发电机依赖性突触囊泡回收所必需的。
      )。类似地,具有外周内组蛋白,GIPC的IP / MS实验最近将Strn和Strn3鉴定为绑定伙伴(
      • varsano t.
      • 董M.Q.
      • niesman i.
      • Gacula H.
      • lou x.
      • 马T.
      • testa J.R.
      • YALES III,J.R.
      • Farquhar M.G.
      GIPC由AppT到外周Trka内核糖招募并调节TRKA贩运和信号。
      )。这是显着的,因为GIPC调节内吞作用和贩运神经生长因子受体TRKA。
      有趣的是,有趣的地带1/2 orthologs从酵母中保存给人类; Budding Yeast Start Orthologog,FAR11(信息素停止11)是蛋白质复合物(FAR3-11)的组分,其涉及在信息素信号传导后细胞周期滞留(
      • Kemp H.A.
      • Sprague Jr.,G.F.
      AR3和五种相互作用的蛋白质可防止发电酵母酿酒酵母酿酒酵母中的信息素捕获过早恢复。
      )。可以在额外的远蛋白,FAR8和纹体之间检测一些序列相似性(尽管WD域不存在于FAR8)。在FAR9 / VPS64和FAR10之间使用SLMAP检测有限的序列相似性。最后,通过酵母双杂化测定检测PP2A A Ortholog(TPD3)和FAR11之间的链接(
      • Uetz P.
      • 爱情L.
      • Cagney G.
      • Mansfield T.A.
      • 犹太森r.s.
      • 骑士J.R.
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      • Narayan V.
      • Srinivasan M.
      • Pochart P.
      • Qureshi-Emili A.
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      • Godwin B.
      • Conover D.
      • kalbfleisch t.
      • Vijayadamodar G.
      • 杨米
      • 约翰斯顿M.
      • 领域S.
      • Rothberg J.M.
      综合分析酿酒酵母中蛋白质 - 蛋白质相互作用。
      )和点击ms,
      A. B. MAK,未发表的数据。
      表明在整个进化过程中,蒂普拉克组件的一部分被保守。
      两种蒂普拉克组分(条带和纹素)具有正常的丝状真菌在丝状真菌中独立分离的直肠。唯一的 Sordaria macrospora. PRIATIN ORTHOOLOG,PRO11调节真菌细胞分化,是生育和果实形成所必需的(
      • Poggeler S.
      • 克克U.
      WD40重复蛋白调节真菌细胞分化,可以通过哺乳动物同源序列综合取代。
      )。人纹素cDNA可以在功能上取代Pro11基因产物,表明功能储存(
      • Poggeler S.
      • 克克U.
      WD40重复蛋白调节真菌细胞分化,可以通过哺乳动物同源序列综合取代。
      )。唯一的剥离正轨 神经孢子仓库, HAM-2 也从遗传筛中克隆: HAM-2 突变体是雌性无菌,生长缓慢,具有短菌丝,并在悬垂融合中具有明显的缺陷(
      • 湘Q.
      • 拉斯穆森C.
      • 玻璃N.L.
      在Neurospora Crassa中的悬崖融合需要,编码推定的跨膜蛋白的Ham-2基因座。
      )。重要的是纹状体同源物中的突变 HAM-3 和slmap / vps64同源物 HAM-4具有FHA域的FHA域,导致具有与之相同的融合表型的菌株 HAM-2 mutants.
      A. Simonin,C.G.Rasmussen和N.L.L.玻璃,个人沟通。
      这些结果表明Stripak复合物的组分在中介悬垂融合中的份额份额。由于悬崖融合可以是研究膜融合事件的模型系统,推测Stripak复合物可能会影响其他系统中的细胞融合。与这种可能性一致,SLMAP的过表达阻止肌细胞肌细胞在C2C12细胞中肌细胞过渡,而不排除分化标志物的表达(
      • guzzo r.m.
      • Wigle J.
      • SALIH M.
      • 摩尔E.D.
      • Tuana B.S.
      尾锚式的Sarclemmal膜相关蛋白的调节表达和时间诱导对于肌细胞融合至关重要。
      )。
      虽然这项研究突出显示Tripak的组成,但该大型多蛋白复合物的拓扑仍有待定义。例如,证明纹胞苷用于二胺(或可能多电缆)(参考。
      • Moreno C.S.
      • 泳道W.S.
      • Pallas D.C.
      酵母MOB1的哺乳动物同源物是构件和施联家族蛋白质磷酸酶2a配合物的推定衬底。
      表I.II),提高蒂普拉克复合物可能不对称的可能性。如此多的寄生蛋白质物种的存在可能表明含有不同副病毒的子通络具有略微不同的功能。例如,在RILTAK中发现的三个STE20激酶的功能很可能是非常不同的:STK25并在较小程度上发现了MST4但不是STK24,并且没有与GOLGI设备相关联,并且需要GOLGI完整性(
      • 预想赛C.
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      • de Corte V.
      • 布鲁伊斯州E.
      • 哈斯A.
      • Kopajtich R.
      • gettemans J.
      • 巴尔F.A.
      YSK1由Golgi矩阵蛋白GM130激活,并在细胞迁移中通过其基材在14-3-3℃下起作用。
      )将需要深入的分析来进一步阐明该复合物中各种寄生虫的功能。

      致谢

      我们感谢N Sonenberg博士的抗-alpha4抗体的善意; D. FERMIN和G. LIU进行编程援助;和博士。 L.引擎盖,K. Colwill和T. Pawson进入哺乳动物基因收集克隆。我们感谢A. Simonin,C. G. Rasmussen,N.L. L. Glass博士和A. B. Mak分享未发表的数据。我们感谢D. Ceccarelli博士的批判阅读手稿和愤怒博士,以获得有用的讨论。

      补充材料

      参考

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