癌细胞适应代谢应激的机制

一种新型甲状腺激素介导的胃癌致致通途径的蛋白质组学鉴定
      胃癌是全世界第二次常见的癌症,预后差。为了确定适应癌细胞中代谢应激的机制,我们使用胃癌作为模型系统,以揭示所涉及的潜在信号通路。使用与ESI-Q-TOF MS / MS分析偶联的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳用于鉴定胃肿瘤组织和相应的非癌组织之间的差异表达蛋白质。总共有107个斑点,具有显着变化(±超过2折,p <MS / MS分析呈阳性鉴定0.05)。通过RT-PCR和Western印迹验证了代表性蛋白质的改变表达。改变的蛋白质的聚类分析显示了一种有趣的代谢蛋白组,这提出了三碘罗酮的积累(T3;甲状腺激素的主要功能成分及胃癌缺氧诱导因子(HIF)的过表达。通过电化学发光免疫测定和免疫组织化学进一步证实这些观察结果。 T.3 - 使用胃癌细胞系进一步验证了诱导HIF1-α和血管内皮生长因子的表达体内鼠标模型。因为发现HIF1-α的早期积累是独立的德诺维转录,我们还发现细胞溶质级联磷脂酰肌醇3-激酶/ AKT致敏对T敏感3刺激涉及。此外,我们证明了3 - 诱导HIF1-α的过表达被富马酸盐积聚介导,并且可以通过富马酸盐水溶液灭活而增强,但抑制2-氧氧化或抑制。这些结果提供了胃肿瘤中代谢蛋白质和甲状腺激素调节功能障碍的证据,提出了一种新的甲状腺激素介导的致瘤信号传导途径。我们的研究结果被认为是更好地理解胃癌中的代谢应激的改善性的重要措施。
      在许多癌症类型中观察到细胞缺氧和代谢应激(
      • Birner P.
      • 施林
      • Obermair A.
      • 木板C.
      • Breitenecker G.
      • Oberhuber G.
      缺氧诱导因子1α的过度表达是早期侵入性宫颈癌中不利预后的标志物。
      • 谈谈K.L.
      • 托利H.
      • 工平k.c.。
      • Maxwell P.H.
      • pugh c.w.
      • Ratcliffe P.J.
      • 哈里斯A.L.
      缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α在正常人体组织,癌症和肿瘤相关巨噬细胞中的表达和分布。
      • 钟H.
      • Marzo上午
      • 笑E.
      • 林米
      • 希尔顿D.A.
      • Zagzag D.
      • Buechler P.
      • isaacs w.b.
      • Semenza G.L.
      • 西蒙斯J.W.
      常见人类癌症中缺氧诱导因子1α的过度表达及其转移。
      )。缺氧诱导因子(HIF)
      使用的缩写是:HIF,缺氧诱导的因子; 2-de,二维聚丙烯酰胺凝胶电泳; Th,甲状腺激素; T.3,三碘罗酮; Ecli,电化学发光免疫测定; vhl,von hippel-lindau蛋白; HPH,HIF脯氨酰羟化酶; VEGF,血管内皮生长因子; PI3K,磷脂酰肌醇3-激酶; fumh,富马酸水溶液; tthy,transthyretin; CBB,Coomassie辉煌的蓝色;割草,分子量搜索; p-,磷酸; Aldoa,aldolase a; LDHA, l - 脱氢脱氢酶链; hyou1,缺氧上调蛋白1; GRP78,78-KDA葡萄糖调节蛋白; MAPK,丝裂剂激活蛋白激酶; CBP,CAMP响应元素结合蛋白(CREB) - 粘合蛋白; 2-D,二维; TNM,肿瘤,淋巴结,转移; Kegg,Kyoto基因组百科全书; KPYM,丙酮酸激酶肌肉同工酶。
      1使用的缩写是:HIF,缺氧诱导的因子; 2-de,二维聚丙烯酰胺凝胶电泳; Th,甲状腺激素; T.3,三碘罗酮; Ecli,电化学发光免疫测定; vhl,von hippel-lindau蛋白; HPH,HIF脯氨酰羟化酶; VEGF,血管内皮生长因子; PI3K,磷脂酰肌醇3-激酶; fumh,富马酸水溶液; tthy,transthyretin; CBB,Coomassie辉煌的蓝色;割草,分子量搜索; p-,磷酸; Aldoa,aldolase a; LDHA, l - 脱氢脱氢酶链; hyou1,缺氧上调蛋白1; GRP78,78-KDA葡萄糖调节蛋白; MAPK,丝裂剂激活蛋白激酶; CBP,CAMP响应元素结合蛋白(CREB) - 粘合蛋白; 2-D,二维; TNM,肿瘤,淋巴结,转移; Kegg,Kyoto基因组百科全书; KPYM,丙酮酸激酶肌肉同工酶。
      被认为是氧气稳态的中央调节因子。 HIF1-α或HIF2-α与HIF1-β一起形成有源转录复合物,其控制许多靶基因,其在糖酵解,血管生成和肿瘤转移中具有作用(
      • Semenza G.L.
      • 江佛兰语
      • 梁S.W.
      • Passantino R.
      • Concordet J.P.
      • Maire P.
      • Giallongo A.
      脱氧酶A,烯醇酶1和乳酸脱氢酶中的缺氧响应元素基因启动子含有缺氧诱导因子1的基本结合位点。
      )。以前的研究表明,HIF1-α在许多癌症类型中过表达,例如结肠,肺,肾和甲状腺,而HIF蛋白质介导细胞适应缺氧(
      • Birner P.
      • 施林
      • Obermair A.
      • 木板C.
      • Breitenecker G.
      • Oberhuber G.
      缺氧诱导因子1α的过度表达是早期侵入性宫颈癌中不利预后的标志物。
      • 谈谈K.L.
      • 托利H.
      • 工平k.c.。
      • Maxwell P.H.
      • pugh c.w.
      • Ratcliffe P.J.
      • 哈里斯A.L.
      缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α在正常人体组织,癌症和肿瘤相关巨噬细胞中的表达和分布。
      • 钟H.
      • Marzo上午
      • 笑E.
      • 林米
      • 希尔顿D.A.
      • Zagzag D.
      • Buechler P.
      • isaacs w.b.
      • Semenza G.L.
      • 西蒙斯J.W.
      常见人类癌症中缺氧诱导因子1α的过度表达及其转移。
      )。 HIF1-α和HIF2-α都在常氧条件下是不稳定的;这是因为在von hippel-lindau蛋白(VHL)靶向HIF的泛素连接酶复合物后,依赖于氧依赖性泛素的普遍突出,(
      • Maxwell P.H.
      • 威森尔M.S.
      • 昌G.W.
      • Clifford S.C.
      • VAUX E.C.
      • 凶手M.E.
      • Wykoff C.C.
      • pugh c.w.
      • maher e.r.
      • Ratcliffe P.J.
      肿瘤抑制蛋白VHL针对氧依赖性蛋白水解的缺氧诱导因子。
      ,
      • 公园C.W.
      • Ivan M.
      • 霍夫曼M.A.
      • Kim T.Y.
      • 黄L.E.
      • Pavletich N.
      • 洲五。
      • Kaelin W.G.
      缺氧诱导因子的普遍需要直接结合von Hippel-Lindau蛋白的β-结构域。
      )。 HIF1-α的VHL识别需要HIF脯氨酰羟化酶(HPH)介导的HIF1-α上的两个转化残基的酶促羟化羟基化酶(HPH)(
      • 布鲁克r.k.
      • Mcknight S.L.
      脯氨酰-4-羟基酶的保守家庭,其改性HIF。
      ,
      • Ivan M.
      • Kondo K.
      • 杨H.
      • 金W.
      • valiando J.
      • Salic A.
      • asara j.m.
      • 泳道W.S.
      • Kaelin W.G.
      HIF-α针对脯氨酸羟基化的VHL介导的破坏:对O的影响2 sensing.
      )。 HPH活性要求辅助弧菌和铁和氧化合物2-氧杂管和分子氧。这种优雅的系统是HIF稳定下缺氧下的基础,因为HPH功能,随后在没有氧气的情况下损害了低羟基化HIF的VHL识别(
      • jaakkola p.
      • 鼹鼠D.R.
      • 田边
      • 威尔逊M.I.
      • Gielbert J.
      • Gaskell S.J.
      • Kriegsheim A.v.
      • hebestreit h.f.
      • Mukherji M.
      • Schofield C.J.
      • Maxwell P.H.
      • pugh c.w.
      • Ratcliffe P.J.
      通过O的von Hippel-lindau ubiquitylation复合物的靶向HIF-α2 - 解冻的脯氨酰化。
      ,
      • yu f.
      • 白人S.B.
      • 赵Q.
      • 李F.S.
      HIF-1α与VHL结合是通过刺激敏感的脯氨酸羟化的调节。
      )。
      甲状腺激素(Th)在激素稳态中起重要作用,是线粒体活动的主要调节因子。通过在启动子区域中结合受体元素来影响基因表达。最近的一项研究表明,三碘罗酮(T3)Th的主要功能组分,也可以通过激活细胞质途径来影响线粒体体育活动(
      • Wrutniak-Cabello C.
      • Casas F.
      • Cabello G.
      甲状腺激素作用在线粒体。
      )。 T.3 - 在肝癌细胞系和原发性成纤维细胞中单独观察到HIF过表达。但是,潜在机制仍然定义不足(
      • 奥托T.
      • Fandrey J.
      甲状腺激素诱导缺氧诱导因子1α基因表达通过肝白血病因子的Trβ/RxRα依赖性活化。
      ,
      • Moeller L.C.
      • dumitrescu上午
      • recetoff s.
      甲状腺激素的细胞溶质作用导致缺氧诱导因子-1α和糖酵解基因的诱导。
      )。鉴于线粒体呼吸混淆的普遍特征是T的累积3 stimuli (
      • Wrutniak-Cabello C.
      • Casas F.
      • Cabello G.
      甲状腺激素作用在线粒体。
      ),识别理性信号通路解释T之间的关系3 需要呼吸困难,HIF1-α过表达,糖酵解升高和线粒体功能障碍。
      三羧酸循环和糖酵解在细胞能量提供中起主要作用。三羧酸循环的主要功能是通过糖醇提供的丙酮酸的氧化。在氧化磷酸化期间最终在ATP中固定从三羧酸循环中释放的能量(
      • eng c.
      • Kiuru M.
      • Fernandez M.J.
      • Aaltonen L.A.
      线粒体酶在遗传瘤和超越中的作用。
      ,
      • Shulman R.G.
      • Rothman D.L.
      • Behar K.L.
      • HYDER F.
      大脑活动的精力充沛基础:神经影像的影响。
      )。早在20世纪30年代,在癌细胞中观察到增强的有氧糖酵解(
      • Warburg O.
      关于癌细胞的起源。
      )和链接无序能量代谢和致癌作用的证据积累(
      • 阿尔滕贝格B.
      • Greulich K.O.
      糖酵解基因在24级癌症课程中普遍存在过表达。
      ,
      • selak m.a.
      • armor s.m.
      • Mackenzie E.D.
      • Boulahbel H.
      • Watson D.G.
      通过抑制HIF-α脯氨酰羟化酶,琥珀酸酯将TCA循环功能障碍与血管生成。
      )。然而,仍然缺乏分子证据,例如改变酶的分析,以说明所代谢偏移的致癌机制。
      富马酸盐是三羧酸循环中的重要中间体。在三羧酸循环期间,通过富马酸盐水解酶(FUMH)转化富马酸盐,其基本的代谢酶。以前的研究表明,富马酸甘塔的细胞内水平受到FUMH的紧密控制,并且沉默的表达富马产生了快速富马酸核积累(
      • Ratcliffe P.J.
      富马酸盐水合酶缺乏和癌症:缺氧信号的激活?
      )。肾癌的最新研究表明,通过损害HPH活性,富马酸富马酸富马酸盐掺杂与遗传性FUMH失活显着消除了HIF1-α的VHL降解(
      • Isaacs J.s.
      • jungy.j.
      • 鼹鼠D.R.
      • 李斯。
      • Torres-Cabala C.
      • Chung Y.L.
      • Merino M.
      • Trepel J.
      • ZBAR B.
      • 托罗J.
      • Ratcliffe P.J.
      • LINEHAN W.M.
      • 鳄鱼L.
      HIF过表达与肾癌中富马酸盐水溶液的双裂损失相关:富马酸盐在HIF稳定性调节中的新作用。
      )。然而,没有数据支持胃癌中的富马酸骨骼的类似作用。
      胃癌是一种常见的恶性肿瘤,代表全世界癌症相关死亡的第二个主要原因。问题在亚洲特别标志着胃癌包含23%恶性肿瘤死亡(
      • Miyashita M.
      • Tajiri T.
      • Maruyama H.
      • Makino H.
      • 野蛮T.
      • Sasajima K.
      • yamashita k。
      用于治疗早期胃癌的内镜粘膜切除术。
      )。然而,胃癌的早期诊断是有问题的,大多数胃癌天然抗抗癌药物。虽然慢性胃炎和重申溃疡被认为是胃癌发展的主要风险,但仍需要研究胃癌的替代机制(
      • Schenk B.E.
      • kuipers e.j.
      • Nelis G.F.
      • Bloemena E.
      • Thijs J.C.
      • 幸运者A.E.
      • klinkenberg-knol e.c.
      • FSTEN H.P.
      • Viergever P.P.
      • 林曼J.
      • Meuwissen S.G.
      幽门螺杆菌根除对奥美拉唑治疗期间慢性胃炎的影响。
      )。
      基于2-de的蛋白质组学方法提供了一种强大的工具,可以同时分析组织样品中数百种蛋白质的表达水平。这可以使癌症相关蛋白质鉴定治疗干预,并建立早期诊断的生物标志物(
      • 霍莉M.K.
      • 亲爱的J.W.
      • 胡X.
      • Schechter A.N.
      • 格兰德维文
      • 呵呵
      • yuen p.s.
      • 明星r.a.
      使用蛋白质组学在脓毒症诱导的急性肾功能衰竭的新大鼠模型中使用蛋白质组学的生物标志物和药物 - 靶点。
      ,
      • Kabuyama Y.
      • resing K.A.
      • ahn n.g.
      将蛋白质组学应用于信令网络。
      )。几个组进行了胃癌的蛋白质组学研究,并鉴定了许多具有改变改变的表达水平的蛋白质。虽然单个蛋白质的异常已经深入研究了胃癌的更详细剖析,以确定对代谢应激的反应中涉及的信号通路以及致癌作用的多步骤过程(
      • Miyashita M.
      • Tajiri T.
      • Maruyama H.
      • Makino H.
      • 野蛮T.
      • Sasajima K.
      • yamashita k。
      用于治疗早期胃癌的内镜粘膜切除术。
      ,
      • Roukos D.H.
      胃癌管理中的现状和未来观点。
      )。在本研究中,我们证明胃癌显示出T的积累3 HIF1-α蛋白的表达和HIF调节基因VEGF的蛋白质产物升高。此外,我们表明了3 累积结果在HIF1-α过表达的结果 体外体内。最后,我们确认了3 可以通过富马酸盐积聚提升HIF1-α;这个高度明显增强了t3 - 由2-氧杂露碱处理抑制和抑制的烟雾灭活。

      材料和方法

       胃肿瘤组织样本 -

      四川大学西部医院(中国成都)获得40对胃癌和相邻的非癌症胃样品。在用苏木精和曙红染色后,将试样在组织学上诊断,并根据国际联盟的TNM分类系统确定外科病理阶段。列入了患者的详细信息,如年龄,性别,组织细胞化和外科病理阶段 表I.。在实验之前,将所有对样品在液氮中冷冻。所有40对样品进行验证实验,包括(i)蛋白质印迹检测Transthyretin(Tthy),缺氧上调蛋白1(Hyou1),FumH和丙酮酸激酶肌肉同工酶(Kpym); (ii)T的ECLI3; (iii)富马酸盐和柠檬酸盐的HPLC测定; (IV)HIF1-α和VEGF的免疫组织化学分析。另外,随机选择包含六对样品的子样本进行2-DE分析。本研究由四川大学制度伦理委员会批准,并在分析之前从所有患者获得知情同谋。
      表I.患者信息
      患者不。年龄性别
      a m,男; F,女性。
      组织细胞化
      b 经验丰富的专家证实了供体患者的组织细胞化。
      外科病理阶段
      c 外科病理阶段根据国际联盟的TNM分类制度对抗癌症。
      肿瘤体积(W×L×T)
      d 估计宽度×长度×厚度。
      yr.厘米3
      Z0702201.53M较差的III3×6×1
      Z0702242.47M几乎正常II2.5×4×1
      Z0702476.49F几乎正常I1.5×2×0.5
      Z070328061F缓和I2×2.5×0.5
      Z0703365.46M几乎正常I2×3×0.5
      Z0704071.
      e 在2-DE分析中使用组织样品。
      63M缓和II3×4.5×1
      Z0704126.48F缓和I2.5×2.5×0.5
      Z0705645.
      e 在2-DE分析中使用组织样品。
      48F几乎正常I1.5×2×0.5
      Z0705734.43F较差的III3.5×6×1.5
      Z0705806.65F缓和II2.5×4×1
      Z0706081.52M几乎正常II2×3×0.5
      Z0706086.
      e 在2-DE分析中使用组织样品。
      45F较差的III6×7×1.5
      Z0706524
      e 在2-DE分析中使用组织样品。
      39M较差的II3×6.5×1.5
      Z0706577.58F缓和I1×1.5×0.5
      Z0706601.58M几乎正常II3×7×1.5
      Z070622251M缓和I1.5×2.5×0.5
      Z0706830.49F缓和I2×2.5×0.5
      Z0707977.
      e 在2-DE分析中使用组织样品。
      40F几乎正常I2.5×3×0.5
      Z0708009.
      e 在2-DE分析中使用组织样品。
      47M缓和III4×7×1.5
      Z0708558.48M缓和I2×2.5×1
      Z0708669.57M几乎正常I1.5×3.5×1
      Z0709208.38M较差的III3.5×6×1.5
      Z0709258.57M几乎正常II2×3×1
      Z0709332.52M缓和II3×5.5×1.5
      Z0709335.52F较差的III4×6×1.5
      Z0709407.46M几乎正常I1×1.5×0.5
      Z0709632.49M较差的III5×7×1.5
      Z0710376.53F几乎正常II2×5×0.5
      Z0710512.46F缓和II2.5×4×0.5
      Z071140958M较差的III4×7×1
      Z071169250F几乎正常I2×5×1
      Z0712287.52F较差的III4×4.5×1
      Z0712583.58M缓和II3×5×1
      Z0712601.45M几乎正常I2.5×4.5×1
      Z0801265.44M缓和I2×5×0.5
      Z0801643.61M缓和II2.5×3.5×0.5
      Z0802445.57M几乎正常II2×5×0.5
      Z0802721.41F较差的II3×4.5×1
      Z0803111.46F几乎正常I2.5×4×1
      Z0803409.52M缓和III3.5×6×1.5
      a m,男; F,女性。
      b 经验丰富的专家证实了供体患者的组织细胞化。
      c 外科病理阶段根据国际联盟的TNM分类制度对抗癌症。
      d 估计宽度×长度×厚度。
      e 在2-DE分析中使用组织样品。

       2-DE—

      将100mg组织样品切成约2毫米3,在液氮中均化,并在1ml裂解缓冲液中裂解(7 m 尿素,2 m 硫脲,4%的乳房; Bio-rad)含有蛋白酶抑制剂混合物8340(Sigma)。然后将样品保持在冰上,在10个循环中超声处理,每个循环组成10-S超声,然后突破30秒,最后在冰上保持30分钟,偶尔涡旋混合。在4℃下以14,000rpm离心1小时后,在20℃下用冷丙酮沉淀蛋白质1小时,然后用反应缓冲液溶解(8 m 尿素,2 m 硫脲,4%乳液,100米m DTT,2%两种透晶体)。使用DC蛋白质测定试剂盒(Bio-rad)测定蛋白质浓度。通过在相同的再水化缓冲液中稀释来调节各种样品浓度。样品立即施用至IEF或在分析之前在等分试样中储存在-80℃。使用被动补液方法将蛋白质样品(2.5mg,300μl)施加到IPG条带(17cm,pH 3-10,非线性,Bio-rad)上。在再水化12-16小时后,将条带转移到IEF细胞(Bio-rad)中。 IEF如下进行:250 V 30分钟,线性; 1000 v持续1小时,快速;线性斜坡到10,000 v 5小时;最后10,000 v 6小时(
      • rabilloud t.
      • Adessi C.
      • Giraudel A.
      • Lunardi J.
      固定性化pH梯度改善二维电泳中​​蛋白质中溶解的溶解。
      )。一旦IEF完成,条带在均衡缓冲液中平衡(25米m Tris-HCl,pH 8.8,6 m 尿素,20%甘油,2%SDS,130米m dtt)15分钟,然后是含有200米的相同缓冲液m 碘乙酰胺代替DTT另外15分钟(
      • Gorg A.
      • 帖子
      • Weser J.
      • Gunther S.
      • Strahler J.R.
      • 汉尚三
      • Somerlot L.
      通过加入碘乙酰胺在平衡缓冲液中消除银染色的二维凝胶上的点条纹。
      )。使用12%SDS-PAGE以30 mA恒定电流每凝胶进行第二尺寸。使用CBB R-250(Merck)染色凝胶。对于2-de分析,每个配对样本一式三份运行,以确保数据的一致性。

       图像分析-

      使用Bio-Rad GS-800扫描仪(400-750nm)扫描图像,并且使用PDQuest 2-D分析软件(Bio-rad)识别差异表达的蛋白质。根据其OD值,凝胶中每个斑点的量标准化为地图中总量的百分比。仅选择始终和显着(超过2倍以上)的那些斑点进行MS / MS分析。

       胰蛋白酶凝胶消化 -

      根据制造商的说明,使用质谱级胰蛋白酶金(Promega,Madison,Wi)进行蛋白质的凝胶灭绝。使用剃刀刀片切出凝胶(直径1-2毫米)的简短斑点,并用100米抵抗两次m NH4HCO3,每次治疗中,37℃的50%ACN 45分钟。在用100%ACN和干燥脱水后,将凝胶预孵育在10-20μl胰蛋白酶溶液(10ng /μl)中1小时。然后是足够的消化缓冲液(40米m NH4HCO3加入10%ACN)以覆盖凝胶,将其在37℃(12-14小时)下孵育过夜。用毫Q水提取胰蛋白酶摘要,然后用50%ACN,5%TFA进行双重提取,每次1小时。将合并的萃取液在4℃下在SpeedVac浓缩器(Thermo Scientific)中干燥。然后对样品进行质谱法。

       ESI-Q-TOF-

      使用Q-TOF质谱仪(Micromass,曼彻斯特,英国)获得质谱,配有ESI源(水域)。胰蛋白酶消化溶解在18μl50%罐中。 MS / MS以数据相关模式执行,其中选择每个MS扫描的前10个最丰富的离子用于MS / MS分析。胰蛋白酶自溶剂产品和角蛋白衍生的前体离子被自动排除在外。使用MassLynx软件(Micromass)获取和处理MS / MS数据,并使用Mascot搜索数据库。使用以下参数执行数据库搜索:数据库,瑞士语法;分类, HOMO SAPIENS.;酶,胰蛋白酶;质量耐受,±0.1 da; MS / MS耐受性,±0.05 da;和一个错过的乳沟的津贴。固定修饰半胱氨酸氨基甲酰化和可变改性的甲硫氨酸氧化。选择数据格式作为Micromass峰值列表,并选择仪器作为ESI-Q-TOF。基于概率的蛋白质的肥大分数超过其阈值(p <认为0.05)被认为是积极的。为了消除不同名称或加入号码的数据库中出现的蛋白质的冗余,一个蛋白质成员,吉祥物评分最高,属于物种 H. Sapiens. 进一步选自相关的多个成员蛋白质。

       细胞培养和药物治疗 -

      人胃癌细胞系MKN28购自ATCC。 MKN28在补充有10%胎牛血清的RPM I1640培养基(Invitrogen)中培养MKN28。在80%的细胞汇合下,通过用阴离子交换树脂处理胎儿牛血清所产生的Th耗尽牛血清。用T.处理3在更换Th耗尽的细胞培养基后,分别在48小时下进行,富马酸盐和2-氧代氟醚。

       动物治疗 -

      8周龄Balb / c小鼠用于T3 treatment. T3 在含有5%羧甲基纤维素和1%吐温20的糊状物中混合,并以2mg / ml的终浓度。用进料针直接进料到胃中300μl糊状/小鼠。每24小时进行这种处理直至牺牲,胃组织立即固定在福尔马林中或在液氮中冷冻。

       半定量RT-PCR-

      根据制造商的说明,使用Trizol试剂(Invitrogen)分离总RNA。根据制造商的说明,使用逆转录酶和随机六烷烃(Takara,Dian,China)的逆转录酶和随机六聚体,第一链CDNA以1μg的总RNA转录为20μl的总RNA。使用Primer Premier 5软件设计了引物。列出了引物和退火温度 表二。根据标准方案如下,用DNA热循环仪(Bio-rad)中的RTAQ(Takara)在DNA热循环仪(Bio-rad)中进行PCR:一个95℃的一个循环3分钟; 23循环为94℃,45秒,45秒退火,72℃持续1分钟;最终延伸在72℃下10分钟;并持4°C。用于每个PCR的cDNA的量为20ng,在25μl反应体积中。通过电泳通过2%琼脂糖凝胶来分析PCR产物(5μl),并被Sybr Gold(分子探针,丁烯或)染色可视化。
      表二选择基因的RT-PCR信息
      靶蛋白底漆序列(感测(+)和反义( - ))退火温度产品长度
      °CBP.
      Aldoa.(+)5'-ACATCGCTCACCGCATCG-3'58214
      ( - )5'-tccgccttctggtagagtgtc-3'
      LDHA(+)5'-acaacaggattctaggtggagg-3'55224
      ( - )5'-agtggtgcgtcagaggtggc-3'
      GRP78(+)5'-ctgcccttcgcctggttcgt-3'62322
      ( - )5'-ccaatcagacgttcccttcaggag-3'
      福音(+)5'-ATACCTGTGCATCCCAACG-3'54533
      ( - )5'-cgaggaccagaacccaaa-3'
      Tthy.(+)5'-cggtgaatccaagtgtcctc-3'56414
      ( - )5'-aaatcccatccctcgtcct-3'
      kpym.(+)5'-agggggggttcggagggttg-3'58416
      ( - )5'-ggcggtggctttcgtggg-3'
      HYOU1(+)5'-GGCAAAAGTGACTCGTGT-3'56446
      ( - )5'-ggctgtagcggttaaagg-3'
      β-肌动蛋白(+)5'-cacgatggagggggcggactcatc-3'50–60512
      ( - )5'-taaagacctctatgccaacacagt-3'

       Western Blotting-

      在RIPA缓冲液中提取蛋白质(50米m Tris base, 1.0 mm EDTA, 150 mm NaCl,0.1%SDS,1%Triton X-100,1%脱氧胆酸钠,1米m PMSF)由DC蛋白质测定试剂盒(BIO-RAD)量化。将样品分离12%SDS-PAGE并转移至PVDF膜(Amersham Biosciences)。将膜在4℃下含有0.1%脱脂乳的PBS含有0.1%吐温20的PBS,随后通过以下一抗:兔抗TTHY(稀释1:1000;圣克鲁斯生物技术),兔抗KPYM(稀释1:1000;圣克鲁斯生物技术),兔抗kpym(稀释1:5000;细胞信号传导技术),小鼠抗hyou1(稀释1:5000;亚诺狗)和兔子抗VEGF(稀释1:1000;圣诞老人Cruz Biotechnology)。抗体兔抗P-P44 / 42-MAPK(THR-202 / THR-204),兔抗P44 / 42-MAPK,兔抗P-P85 / P55-PI3K(THR-458 / THR-199),和兔抗P-AKT,兔抗AKT(SER-473)购自电池信号技术,并且它们中的每一个用于稀释1:2000。将印迹与各自的一抗孵育在室温下2小时。在用吐温20的TBS中洗涤三次后,将印迹与二抗(1:10,000; Santa Cruz生物技术稀释)温育,在室温下与辣根过氧化物酶缀合2小时。通过增强的化学发光试剂(Amersham Biosciences)可视化印迹。 β-肌动蛋白用作内部对照。

       T3 ECLI—

      在RIPA缓冲液中提取蛋白质并通过DC蛋白质测定试剂盒(Bio-rad)进行量化。 T.3 ECLI套件是从罗氏应用的应用科学购买的,实验程序如下。 30μl样品和一个3使用用钌配合物标记的特异性抗体。约束T.3 通过8-苯基-1-萘磺酸从样品中的结合蛋白释放。加入链霉蛋白涂覆的微粒和生物素化的T后 3,标记抗体的剩余自由结合位点被形成为抗体 - 海森复合物的形成。然后通过生物素和链霉抗生物素蛋白的相互作用,该络合物与固相结合。将反应混合物吸入测量细胞,其中将微粒磁性捕获到电极的表面上。然后用Procell除去未结合的物质。将电压施加到电极,然后诱导由光电倍增管测量的化学发光发射。结果通过校准曲线确定,该校准曲线是由两点校准和通过试剂条形码提供的主曲线特异性产生的仪器。 T.3 ECLI以各种样品一式三份进行。

       生命值LC-

      Waters 2695-2487 LC系统(Waters Corp.)与亚特兰蒂斯C18 柱以1mL / min的流速操作。 LC用于等级模式;流动相由95%磷酸钾(20米)组成m),5%乙腈。使用标准物质标准化保持时间。通过Empower软件分析原始数据,并且根据对应于峰面积的预定公式计算浓度。

       福音酶测定 -

      在其他地方描述了富马酸果水溶酶活性的测量(
      • 孵化M.D.
      粗组织提取物中富马酸水解酶的简单分光光度法测定。
      )。将含有定义量的总蛋白质(30-100μg)的细胞裂解物加入到含有25μm的200μl测定缓冲液的最终体积中m hepes-koh(ph 7.5; sigma),0.4米m NADP (Sigma), 4 mm MgCl2, 5 mm KH24,0.4单位/ ml NADP:苹果酶(Sigma),10米m 富马酸盐。由于NADPH的形成,在UV光透明的96孔平底微量滴定板(Costar)的室温下监测到340nm的吸光度增加,在EL×808微孔板读取器(Bio-Tek)中,在室温下监测。升温酶活性表示为NMOL形成的Nmol形成/μg蛋白/分钟。缺乏细胞蛋白或富马酸盐的样品用于确定空白值。

       免疫组化 -

      使用Dako Envision Systems(Dako Cytomation GmbH,汉堡,德国)进行免疫组化。将连续的石蜡包埋的组织切片(3-5μm)脱蜡并再水化。通过在微波炉中的柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中的载玻片进行12分钟来进行抗原检索。然后将载玻片冷却至去离子水中的室温5分钟。通过将含有0.6%过氧化氢的甲醇中的载玻片温育,然后在去离子水中洗涤3分钟后淬灭内源性过氧化物酶活性,然后用正常的山羊血清在室温下孵育1小时,随后在4℃下温育过夜。随后用主要抗体兔抗TTHY(稀释1:1000;圣克鲁斯技术)和兔抗VEGF(稀释1:1000;圣克鲁斯生物技术)。接下来,用洗涤缓冲液(TBS的TBS与0.1%牛血清白蛋白)冲洗并与辣根过氧化物酶连接的山羊抗兔抗体一起孵育,然后与二氨基苯甲酸反应并用MURER的血红素染色。根据制造商的说明,使用3,3'-二氨基丙氨酸底物溶液(Dako Cytomation GmbH)检测免疫染色。

      结果

       在胃癌中差异表达蛋白质的2-de谱分析 -

      通过2-de获得胃癌和相邻正常组织中的蛋白质表达谱。凝胶图像和六对样本的子样本的代表性2-de映射,由PDQuest软件明确匹配,如图所示 图。1A。在单个2-de凝胶中的CBB R-250染色检测约1500-1600个蛋白质点。凝胶中的每个斑点的量被标准化为凝胶中所有斑点的总量的百分比。与2-de模式相比,差异表达的蛋白质被定义为统计上有意义(p <0.05)基于以下两个标准:1)强度改变>2.0倍和2)在检查六对样品中复发超过三次。通过施加这些标准,将总共107个斑点鉴定为差异表达,并且这些57个蛋白质是上调的,而50个蛋白质在胃癌中抑制了50个蛋白质。主凝胶图像由PDQuest软件生成(图。1A)和代表性的斑点,标有 箭头,显示在 图。1B。在最显着的改变中显示了20个代表性蛋白质(10个上调和下调10个下调) 图。1D,他们的相应斑点是 盒装扩大 在周边地区(图1C.)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1A,人胃癌的代表性2-D凝胶图像和相邻的正常组织。在第一尺寸的pH 3-10非线性IPG条上分离总蛋白质提取物,然后在第二维中进行12%SDS-PAGE,并被CBB染色可视化。 B,引用地图是生成的 A 使用pdquest软件。 65差异表达的斑点(31个上调和34个下调)标记为 数字。报告了每个改变点的信息 . C,20的表达谱明显改变蛋白质的复发超过三次。所选区域对称 盒装, 和 箭头 表示每种蛋白质点或其理论位置。这 上部 显示胃癌中调节的10个蛋白质,以及 下部 显示10个蛋白质下调胃癌。 D,20改变的蛋白质的表达谱如图1所示。1C。使用PDQuest 2-D分析软件量化斑点的强度。 E,将107个鉴定的蛋白质在功能上分为10组。许多人参与新陈代谢(23%),蛋白质折叠(16%),增殖和凋亡(5%),细胞骨架(4%)等功能(52%)。 F,根据其亚细胞位置将所鉴定的蛋白质分为几个蛋白质基团。总蛋白质的79%位于细胞质中,其余部分位于核或细胞膜中。 G,由群集软件生成的蛋白质群集地图。正常组中蛋白质的表达在0时恒定,而在癌组织中上调的蛋白质在 红色的,下调蛋白质 绿色。这 强度 颜色 绿色 或者 红色的 根据该对应于改变程度 彩色条带底部 图。 T,肿瘤; N, 普通的。所有数据显示为平均值±S.D.

       差异表达蛋白质的质谱鉴定 -

      随后对差异表达的蛋白质斑点进行MS / MS分析。使用搜索算法吉祥物对扩展蛋白序列数据库进行检索MS / MS数据。使用包括PI,分子量,匹配肽,序列覆盖率的数量,序列覆盖率和蜂蜜分数的数量鉴定蛋白质;列出了所有信息 表III。蛋白质基于其功能和亚细胞定位分类为不同的组(Fig. 1, EF)。
      表IIIESI-Q-TOF鉴定的蛋白质
      现货没有。加入否。
      a 加入号码来自扩展数据库。
      蛋白质名称
      b 对于几种蛋白质,在同一个体中鉴定了一些同种型。
      基因名称理论分子量
      c 来自expasy数据库的理论分子量(DA)和PI。
      理论pi.
      c 来自expasy数据库的理论分子量(DA)和PI。
      肽数量覆盖范围分数
      d 基于概率的蜂蜜分数。
      %
      1P21333菲素-α.Flna.283,3015.731156
      2Q9Y4L1缺氧上调蛋白1(前体)HYOU1111,4945.071171
      3O7589110-甲酰基四氢溶胶脱氢酶ALDH199,6225.631140
      4P12830上皮钙粘蛋白(前体)CDH197,8524.2422131
      5P55072过渡因内质网ATP酶VCP.89,9505.143445
      6P06396戈尔洛林(前体)GSN.86,0435.7251695
      7P07237蛋白质 - 二硫键异构酶(前体)P4HB57,4804.7634105
      8P1102178-KDA葡萄糖调节蛋白(前体)HSPA572,4025.074381
      9P15311ezrinVIL269,4845.942329290
      10P30837醛脱氢酶X,线粒体(前体)ALDH1B155,3135.96919125
      11P07954富马酸水溶酶,线粒体(前体)FH.54,7738.851473
      12Q9UQ80增殖相关蛋白2G4PA2G444,1016.131219171
      13P06733α-烯醇化酶ENO147,4816.9949105
      14P09972果糖 - 双磷酸醛磷酸酶C.aldoc39,3246.46314234
      15P37837transaldolase.TALDO137,6886.3637150
      16Q96JD6Aldo-keto还原酶家庭1成员C样蛋白2akr1cl2.37,1226.892257
      17P07355一个 nexin A2ANXA238,8127.5721590
      18P12429一个 nexin A3ANXA336,3935.63656249
      19P04179超氧化物歧化酶(锰)SOD224,8788.3532689
      20P02511α-晶体B链cry20,1466.761751
      21P02766Transthyretin(前体)TTR.15,9915.521765403
      22P26447蛋白质S100-α4S100A411,9495.8543647
      23P31949蛋白质S100-α11S100A1111,7406.6615128
      24P16219短链特异性酰基-CoA脱氢酶,线粒体(前体)44,6118.1337521,142
      25Q9NS71胃科碱-1(前体)GKN120,5465.651716282
      26P42025β-centractinACTR1B42,3815.9851486
      27P61163α-centractinACTR1A42,7016.191223227
      28O95994前梯度蛋白2同源物(前体)AGR220,0249.033538255
      29Q8TD06前梯度蛋白3同源物(前体)AGR319,2737.7923110
      30P14550醇脱氢酶(NADP+)AKR1A136,8926.323561499
      31P00352视网膜脱氢酶1ALDH1A155,4546.329341,166
      32O75390柠檬酸合酶,线粒体(前体)CS49,006.177.391715187
      33P02647载脂蛋白A-I(前体)APOA130,7595.27325632
      34P07741腺嘌呤磷酰基转移酶4 APRT.19,7665.782755
      35O95154黄曲霉毒素B1醛还原酶3AKR7A337,5826.672777
      36P25705ATP合酶亚单位α,线粒体(前体)ATP5A159,8288.2831068
      37P06576ATP合成酶亚单位β,线粒体(前体)ATP5B56,5255.002249
      38Q07021补体组分1 q子组分结合蛋白,线粒体(前体)C1QBP31,7424.74726175
      39P62988泛素RPS27A8,5606.5623253
      40P00918碳酸酐酶2CA229,2856.8731378
      41P16152羰基还原酶(NADPH)1CBR130,6418.551128327
      42P23528Cofilin-1CFL118,7238.22216170
      43P20674细胞色素 c 氧化酶亚基5a,线粒体(前体)COX5A16,9356.312069
      44P14854细胞色素 c 氧化酶亚单位VIB同种型1COX6B110,4146.5422351
      45Q7L576细胞质FMR1相互作用蛋白1CYFIP1146,7426.466392
      46Q96F07细胞质FMR1相互作用蛋白2CYFIP2148,3987.0376116
      47Q01523防御素5(前体)DEFA510,4078.3212110
      48P16930Fumarylacetoacetase.FAAA46,3746.46915126
      49P49411伸长因子TU,线粒体(前体)TUFM.49,8587.26153519
      50P04075果糖 - 二磷酸醛糖酶aAldoa.39,8518.392152687
      51P14625内皮素(前体)HSP90B192,6964.7323358
      52P30042谷胱甘肽 S-Transferase P1GSTP125,6728.32616244
      53P09467果糖-1,6-双磷酸酶1FBP137,1906.54715212
      54A1XBS5蛋白质FAM92A1FAM92A133,5955.892543
      55P20930Filaggrin.FLG.435,1699.2431132
      56P02792铁链灯链FTL.20,0645.51217122
      57P50395RAB GDP解离抑制剂βGDI251,0876.111728239
      58P52565Rho GDP解离抑制剂1arhgdia23,2505.021430465
      59P52566Rho GDP解离抑制剂2arhgdib.23,0315.10839142
      60P14136胶质纤维酸性蛋白,星形胶质细胞GFAP.49,9075.4245132
      61P15104谷氨酰胺合成酶格林42,6656.433630348
      62P08263谷胱甘肽 S-Transferase A1GSTA125,6728.91416240
      %
      63Q16836羟基乙酰辅酶脱氢酶,线粒体(前体)哈希34,3138.381520342
      64Q9UGV6高迁移率组蛋白1状10HMG1L1024,3746.992444
      65P31943异质核核糖核糖蛋白hHNRPH149,4845.891346
      66P00738Haptoglobin(前体)生命值45,8616.13361436
      67Q9UBQ5真核翻译开始因子3亚基12EIF3S1225,3294.81861186
      68P01876IGα-1链C地区IGHA138,4866.081465
      69P01857IGγ-1链C区域IGHG136,5968.4661598
      70P04406甘油醛-3-磷酸脱氢酶GAPDH.36,0538.57816129
      71P30740白细胞弹性蛋白酶抑制剂SerpinB1.42,8295.941070
      72P05556整合素β1(前体)ITGB191,7145.334128
      73P01834IGκ链C地区IGKC.11,7735.581280459
      74P12532肌酸激酶,无处不在的线粒体(前体)ckmt1a / ckmt1b.47,4068.6612331
      75P14618丙酮酸激酶同工酶M1 / M2PKM258,4707.96531128
      76P01620Igκ链V-III地区SIE没有基因名称11,8828.7331231
      77Q14847LIM和SH3域蛋白1LASP130,0976.61418100
      78P00338l - 脱氢酶A链LDHA36,9508.442681
      79P07195l - 递乳脱氢酶B链LDHB.36,9005.712235430
      80P09382Galectin-1LGALS115,0485.343464607
      81P56470Galectin-4.LGALS436,0329.2191645
      82P07098胃三酰基甘油脂肪酶(前体)Lipf.45,3806.83711120
      83P02545Lamin-α/ clmna.74,3806.57410144
      84Q02252甲基丙酸酯 - 半醛脱氢酶(酰化),线粒体(前体)Aldh6a1.58,2598.013467
      85P04181鸟氨酸氨基转移酶,线粒体(前体)燕麦48,8465.972262
      86Q96CV9Optineurinoptn.66,2805.122244
      87P30101蛋白质 - 二硫化物异构酶A3(前体)PDIA357,1465.9811692
      88O60925prefoldin亚基1.PFDN114,2026.321951
      89P1542815-羟丙基芽蛋白脱氢酶(NAD+)生命值GD.29,1875.563749
      90P14923交界处普拉克戈班蛋白jup.82,3765.951263
      91P62937肽基 - 脯氨酰顺式 - 反式异构酶APPIA.18,2297.6821067
      92P30048肝癌依赖过氧化物还原酶,线粒体(前体)PRDX328,0237.672135207
      93P30044过氧杂志毒素-2PRDX222,2988.855056801
      94P30084eNoyl-CoA水解酶,线粒体(前体)echm.31,8238.341931473
      95P60891核糖 - 磷酸催化磷酸氨基酶IPRPS135,3256.5614117
      96P25787蛋白酶体亚基α型2PSMA225,9966.92614210
      97Q53QN5假设蛋白质nckap1(片段)NCKAP146,2955.213552
      98P11233RAS相关蛋白RAL-α(前体)拉拉23,7236.661991
      99P0538860 S酸性核糖体蛋白P0RPLP034,4235.71822263
      100P09651异质核核糖核蛋白A1HNRPA138,9369.26514177
      101P22626异质核核糖核糖蛋白A2 / B1HNRPA2B137,4648.97722248
      102P6285740 S核糖体蛋白S28RPS287,89310.721753
      103Q9NR45唾液酸合成酶纳尼斯40,7386.291319407
      104Q96P63Serpin B12.SerpinB12.46,6465.361438
      105Q01995Transgelin.tagln.22,6538.87543230
      106Q03403三叶子因子2(前体)TFF215,1305.5211166
      107P61088泛素缀合酶E2 nUBE2N17,1846.1332648
      a 加入号码来自扩展数据库。
      b 对于几种蛋白质,在同一个体中鉴定了一些同种型。
      c 来自expasy数据库的理论分子量(DA)和PI。
      d 基于概率的蜂蜜分数。
      特别是在一组代谢蛋白中发现了显着的改变。这些蛋白质在不同代谢过程中起作用,例如甲状腺激素调节,糖酵解,三羧酸循环,氧化磷酸化,电子传输和脂肪代谢。群集地图(图1G.显示通过集群软件产生这些蛋白质的改变表达,并列出了细节位置和生物功能的详细信息 表IV..
      表IV.能量代谢相关蛋白在胃肿瘤中改变
      现货没有。蛋白质名称加入否。平均比率(t / m
      a 相对 normal sample.
      )
      亚细胞位置
      b 扩展数据库的亚细胞位置的信息。
      代谢过程
      c 扩展数据库和Kegg Pathway数据库的代谢过程信息。
      310-甲酰基四氢溶胶脱氢酶O758910.216细胞质叶酸新陈代谢
      30醇脱氢酶(NADP+)P145503.285细胞质糖酵解/葡糖生成
      10醛脱氢酶X,线粒体前体P308370.148线粒体矩阵糖酵解/葡糖生成/脂肪酸代谢
      16Aldo-keto还原酶家庭1成员C样蛋白2Q96JD60.133细胞质糖酵解/三羧酸循环
      50α-烯醇化酶P0673312.343细胞质糖酵解/丙酮酸代谢
      36ATP合酶亚单位α,线粒体(前体)P257050.115线粒体内膜氧化磷酸化
      37ATP合成酶亚单位β,线粒体(前体)P065760.318线粒体内膜氧化磷酸化
      38补体组分1 q子组分结合蛋白,线粒体(前体)Q070215.835线粒体矩阵氧化磷酸化
      74肌酸激酶,无处不在的线粒体(前体)P125320.289线粒体内膜肌酸新陈代谢
      43细胞色素 c 氧化酶亚基5a,线粒体(前体)P206740.326线粒体内膜氧化磷酸化
      44细胞色素 c 氧化酶亚单位VIB同种型1P148540.458线粒体互相空间氧化磷酸化
      32柠檬酸合酶,线粒体(前体)O753900.325线粒体矩阵三羧酸周期
      53果糖-1,6-双磷酸酶1P094670.282细胞质葡糖生成
      13果糖 - 二磷酸醛糖酶aP040754.362细胞质糖酵解
      14果糖 - 双磷酸醛磷酸酶C.P099724.155细胞质糖酵解
      11富马酸水溶酶,线粒体(前体)P079540.261线粒体矩阵三羧酸周期
      48Fumarylacetoacetase.P169303.371线粒体矩阵三羧酸周期
      63羟基乙酰辅酶脱氢酶,线粒体(前体)Q168364.588线粒体矩阵脂肪酸新陈代谢
      78l - 脱氢酶A链P003384.336细胞质丙酮酸代谢
      79l - 递乳脱氢酶B链P071953.946细胞质丙酮酸代谢
      75丙酮酸激酶同工酶M1 / M2P1461815.603细胞质糖酵解
      24短链特异性酰基-CoA脱氢酶,线粒体(前体)P162193.116线粒体矩阵脂肪酸新陈代谢
      15transaldolase.P378372.163细胞质糖酵解
      70甘油醛-3-磷酸脱氢酶P044065.337细胞质糖酵解
      a 相对 normal sample.
      b 扩展数据库的亚细胞位置的信息。
      c 扩展数据库和Kegg Pathway数据库的代谢过程信息。

       通过半定量RT-PCR和Western印迹分析验证改变的蛋白质 -

      检查这些代谢蛋白的蛋白质组学鉴定是否相当于转录水平和平移水平的变化,7种蛋白质(Hyou1,Tthy,KPYM,78-KDA葡萄糖调节蛋白(GRP78),FUMH,AldoA和LDHA)具有重要意义选择表达改变以通过半定量RT-PCR验证,并通过Western印迹进一步证实其中一些(FUMH,Tthy,Kpym和Hyou1)。如图所示 Fig. 2, A (RT-PCR)和 B (Western Blotting),发现表达水平与2-DE分析中的观察结果一致。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2A,七种蛋白质(Tthy,Kpym,Hyou1,FumH,Aldha,LDHA和GRP78)的半定量RT-PCR确认。通过β-肌动蛋白归一化总mRNA对。每条电泳条通过质量 - 一种软件确定,以及 X轴 显示三个并行RT-PCR运行的平均强度。 B,涉及所涉及的途径的四种蛋白质(Tthy,Kpym,Hyou1和FumH)的蛋白质印迹确认。通过β-肌动蛋白归一化总蛋白对。每个印迹条由质量一体的软件确定 X轴 显示三个平行实验运行的平均强度。 T,肿瘤; N, 普通的。所有数据显示为平均值±S.D.

       累积T.3,富马酸盐和胃癌中的柠檬酸盐 -

      在那些所改变的蛋白质中发现在肿瘤组织中表达的蛋白质,Tthy对TH具有高亲和力,并且在组织中运输的功能(
      • Palha J.A.
      Transthyretin作为甲状腺激素载体:重新审视功能。
      )。此外,观察到已知的能量代谢酶的改变(Kpym,F16P1等)(
      • Ashizawa K.
      • 麦克利P.
      • 关联。
      • 郑科
      一个 体外 用甲状腺激素调节丙酮酸激酶M2活性的新机制及果糖1,6-双磷酸盐。
      )。因此,考虑了令人不安的Th稳态涉及胃癌的假设。为了评估该假设,对Ecli进行40对胃肿瘤和正常组织以量化它们的总T.3。所有的供体患者通过临床检查进行正常的血浆水平。总共,27个肿瘤样本显示出更高的t3 水平比它们相应的正常样品,19个肿瘤样本显示出超过1.5倍的升高。
      如图所示 表IV.,观察到几种三羧酸循环相关酶的改变。值得注意的是,在胃肿瘤中显着抑制了富马酸氢酶和柠檬酸合酶。因此,检查样品以确定它们各自的底物,富马酸盐和柠檬酸盐是否相对变化。进行HPLC以测量组织中富马酸盐和柠檬酸盐的含量。几乎所有胃肿瘤样品都升高了有趣的富马酸和柠檬酸水平。 -fold变化(癌症/正常)的t 3胃肿瘤组织中的富马酸盐和柠檬酸盐显示在 图3A.
      图缩略图GR3.
      Fig. 3A,进行ECLI和HPLC验证以验证总T.3 (红色的),富马酸盐(棕色的)和柠檬酸盐(蓝色的)40对胃肿瘤组织。强度在 - 折叠变化(癌症/正常(C / N.)))。 B通过免疫组织化学验证了HIF1-α和VEGF在胃肿瘤中的表达。 C,MKN28细胞用2N待处理m T3 从1〜6小时和12小时,而正常的MKN28细胞用作未处理的对照。 RT-PCR和Western印迹用于验证RNA水平和蛋白质水平的HIF1-α的表达。 β-肌动蛋白用作同等的加载控制。 D,Balb / c小鼠用t喂养3 每24小时直到牺牲。免疫组化检查了小鼠胃组织中HIF1-α的表达。所有数据显示为平均值±S.D.

       HIF1-α和VEGF在胃癌中过表达 -

      两个缺氧应激蛋白,Hyou1和GRP78在蛋白质组学分析中上调。另外还升高了糖酵解中涉及拟合糖酵解的簇。由于HIF-1α被报告为这些蛋白质的潜在活化剂(
      • Semenza G.L.
      • 江佛兰语
      • 梁S.W.
      • Passantino R.
      • Concordet J.P.
      • Maire P.
      • Giallongo A.
      脱氧酶A,烯醇酶1和乳酸脱氢酶中的缺氧响应元素基因启动子含有缺氧诱导因子1的基本结合位点。
      ),检查HIF-1α是否在胃癌中改变的表达特别感兴趣,尽管尚未向胃肿瘤报告HIF-1α的作用。 40对胃肿瘤组织,以前使用过3 测定法固定并制备免疫组化分析。 HIF1-α及其靶癌蛋白VEGF(
      • Semenza G.
      HIF-1,o2,和3个博语:动物细胞如何向细胞核发出缺氧。
      )在肿瘤组织中显着过表达,尤其是胃髓。连续切片表明,HIF1-α和VEGF的阳性限制均匀匹配,并且肿瘤和正常组织的代表性染色 图3B..

       T3 在体外和体内诱导HIF1-α的上调

      以前的研究表明T3 增强肝瘤细胞系HepG2中的HIF1-α表达(
      • 奥托T.
      • Fandrey J.
      甲状腺激素诱导缺氧诱导因子1α基因表达通过肝白血病因子的Trβ/RxRα依赖性活化。
      )。因此,在本研究中进行测定以确定胃肿瘤中是否存在这种关系。 MKN28细胞在TH缺失的培养基中预先升级48小时,以避免血清TH的干扰。随后用T处理MKN28细胞3 最终浓度为2 nm并且在1至12小时的时间课程中收获细胞。在mRNA和蛋白质水平下监测HIF1-α的表达。如图所示 图3C.,HIF1-α的表达以时间依赖的方式增加。可检测的升高早在2小时上出现并以5小时达到峰值。观察到mRNA水平的类似变化,但可检测到的升高延迟直至5小时(图3B.)。
      进一步确认3 - 依赖HIF1-α诱导 体内,我们用t治疗Balb / c小鼠3并且监测HIF1-α的改变。 T.3 - 每24小时,以适当剂量的糊状剂直接喂入小鼠的胃中。小鼠胃组织的免疫组织化学分析揭示了胃髓中HIF1-α的显着提高。

       pi3k / akt途径参与其中3 信号细胞溶质级联 -

      如图所示 图3B.,在蛋白质水平上的HIF1-α的升高表达之前,在RNA水平,表明核 - 无关的信号通路可能对其早期积累负责。结肠癌细胞系和成纤维细胞的近期研究表明,在细胞内刺激下PI3K / AKT途径和MAPK途径可以通过PI3K / AKT途径和MAPK途径来激活HIF1-α,例如活性氧物质和缺氧,以及细胞外刺激,例如胰岛素和T3 (
      • 奥托T.
      • Fandrey J.
      甲状腺激素诱导缺氧诱导因子1α基因表达通过肝白血病因子的Trβ/RxRα依赖性活化。
      ,
      • Moeller L.C.
      • dumitrescu上午
      • recetoff s.
      甲状腺激素的细胞溶质作用导致缺氧诱导因子-1α和糖酵解基因的诱导。
      )。鉴于这些观察结果,两个通道对T的响应3 检查刺激。 MKN28细胞用T处理3 通过快速时间过程,使用磷酸化位点特异性抗体来通过蛋白质印迹监测这些途径的活化。如图所示 Fig. 4,与其背景形式相比,PI3K的磷酸化形式及其下游受体AKT显着升高。然而,磷酸化MAPK和背景MAPK之间的比率几乎不变。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4用2 n处理MKN28细胞m T3 15,30和45分钟。 通过蛋白质印迹使用特异于磷酸化位点的抗体来监测细胞溶质级联MAPK和PI3K / AKT的活化。 Mapk,PI3K和AKT的背景形式被设定为等于加载控制。

       T3 通过影响FUMH的表达和活性来诱导细胞内富马酸盐积累

      T3 被认为是线粒体呼吸的主要调节因素。因此T.3 在三羧酸循环期间,突出导致中间体的积累(
      • Wrutniak-Cabello C.
      • Casas F.
      • Cabello G.
      甲状腺激素作用在线粒体。
      )。由于富马酸盐是三羧酸循环中的主要中间体,接下来进行工作以检查是否t3 影响富马特水平。走向这个目标,t3通过迭代超声处理裂解-Treated MKN28细胞,通过HPLC监测细胞内富马酸盐水平。正如预期的那样,早在2小时后急性升高升温3,与未经处理的对照相比,升高保持在〜2.5倍的水平,至少48小时。显示出3小时,6小时和未处理控制的代表性HPLC映射 图5A.
      图缩略图GR5.
      Fig. 5A,MKN28细胞用2N待处理m T3 1-6和12小时。通过HPLC监测富马酸盐的细胞内积聚。表示3小时,6小时和未处理控制的代表性HPLC映射如图所示 左窗格湖更改模式显示在 右侧面板. B,MKN28细胞用2N待处理m T3 24小时。 RT-PCR验证了FUMH的表达。 C,如图所示测试酶活性。 TBL.,用2 n处理的mkn28细胞m T3 裂解前2小时; 塔尔,正常mkn28裂解物与t3 添加到最终浓度为10 nm. D,MKN28细胞用5米处理m 富马酸盐30和60分钟。通过RT-PCR和Western印迹检查HIF1-α的表达。 E,用T选择性地处理MKN28细胞3 (2 nm),富马酸盐(5米m)和2-氧代流(5米m),通过蛋白质印迹监测HIF1-α的表达。 Au.,吸光度单位。所有数据显示为平均值±S.D.
      接下来的效果3 检查了对FUMH表达的治疗,特别是在确定底层机制的背景下3 - 诱导的富马酸盐积聚。在24小时内检测到RNA水平的中度抑制FUMH(图5B.),但在12小时内没有观察到显着的变化(数据未显示)。这些数据表明FUMH抑制可能有助于稳定富马达富裕的环境,但不对富马酸盐的早期积累负责。
      接下来的可能性3 影响FUMH活动而不是考虑表达。如图所示 图5C., 2 nm T3 减少菌落活性减少〜30%,此类抑制行为迅速。非常引人注目,裂解物3 - 即使在T的情况下,均匀的MKN28细胞也表现出正常的FUMH活性3,这可能表明T的完整细胞结构是必要的3 - 诱导的fumh失活。

       T3 - 引起的HIF1-α过表达是富马酸富核 -

      因为通过在成纤维细胞中灭活HPH(
      • Isaacs J.s.
      • jungy.j.
      • 鼹鼠D.R.
      • 李斯。
      • Torres-Cabala C.
      • Chung Y.L.
      • Merino M.
      • Trepel J.
      • ZBAR B.
      • 托罗J.
      • Ratcliffe P.J.
      • LINEHAN W.M.
      • 鳄鱼L.
      HIF过表达与肾癌中富马酸盐水溶液的双裂损失相关:富马酸盐在HIF稳定性调节中的新作用。
      ),有必要检查T是否3 - 诱导HIF1-α的过表达依赖于胃肿瘤内酯中的富马酸盐。 MKN28细胞用富马酸盐单独处理或与T组合处理3。通过Western印迹和RT-PCR监测HIF1-α的表达。如图所示 图5D,只要30分钟观察到HIF1-α蛋白的快速积累。然而,HIF1-α的转录物在转录水平上没有改变,这与本研究中的前一个结果一致(图3C.)。
      三羧酸循环中的另一种中间体,2-氧代摩托酸,是针对HPH的富马酸盐的竞争基材(
      • Isaacs J.s.
      • jungy.j.
      • 鼹鼠D.R.
      • 李斯。
      • Torres-Cabala C.
      • Chung Y.L.
      • Merino M.
      • Trepel J.
      • ZBAR B.
      • 托罗J.
      • Ratcliffe P.J.
      • LINEHAN W.M.
      • 鳄鱼L.
      HIF过表达与肾癌中富马酸盐水溶液的双裂损失相关:富马酸盐在HIF稳定性调节中的新作用。
      )。因此,它被认为是相关的,以检查是否由T介导的HIF1-α诱导3 可以通过增加2-氧缺乏率的水平来消除。用5米的组合治疗MKN28细胞m fumarate and 5 mm 2- oboglutarate或2 n的组合m T3 和 5 mm 2- oboglutarate。如预期的是,2-氧代或完全废除HIF1-α感应介导的3 或者 fumarate (图6E.)。甚至低浓度的2-氧缺乏率显着抑制HIF1-α积累(数据未显示)。进行HPLC以监测MKN28细胞中的外源性富马酸盐的细胞内积聚,表明HIF1-α诱导的废除不是由抑制富马酸壳吸收(数据未显示)引起的。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6A,MKN28细胞用2N待处理m T3 24小时。通过RT-PCR和Western印迹验证VEGF的表达。 B,Balb / c小鼠用t喂养3 每24小时直到牺牲。通过免疫组织化学检查VEGF在小鼠胃组织中的表达。

       T3 促进癌基因VEGF的表达,其由HIF-α-介导

      VEGF由HIF1-α激活(
      • Semenza G.
      HIF-1,o2,和3个博语:动物细胞如何向细胞核发出缺氧。
      ),在t下的VEGF表达3 检查了政府。在MKN28细胞模型中,RT-PCR分析显示,在12小时内VEGF表达的中等增加,长时间处理导致VEGF表达的更强调节(图6A)。在Western印迹分析中观察到类似的改变。在鼠标模型中,发现VEGF在t后明显升高3 治疗,VEGF的上调与HIF1-α的高表达重合(图6B.)。

      讨论

      基于3个基于频谱的蛋白质组学策略提供了数百种蛋白质同时鉴定的高通量(
      • Celis J.E.
      • GROMOV P.
      翻译癌症研究中的蛋白质组学研究:朝着综合方法。
      ,
      • Nishigaki R.
      • 大阪M.
      • Hiratsuka M.
      • Toda T.
      • Murakami K.
      • Jeang K.T.
      • ITO H.
      • in
      • Oshimura M.
      人胃癌中差异表达基因的蛋白质组学鉴定。
      )。早期的研究旨在思考胃癌中的改变蛋白质,并且已经获得了几种潜在的生物标志物,例如Mad1L1(
      • Nishigaki R.
      • 大阪M.
      • Hiratsuka M.
      • Toda T.
      • Murakami K.
      • Jeang K.T.
      • ITO H.
      • in
      • Oshimura M.
      人胃癌中差异表达基因的蛋白质组学鉴定。
      • 李恩
      • 郭r.
      • 李W.
      • 邵杰。
      • 李S.
      • 陈X.
      • 徐恩
      • 刘S.
      • 卢y.
      用二烯丙基三硫醚处理的人胃癌细胞系BGC823的蛋白质组学研究。
      • 他Q.Y.
      • 张Y.H.
      • 梁S.Y.
      • yuen s.t.
      • Chiu J.f.
      胃腺癌中的不同蛋白质组学改变。
      )。在本研究中,107个蛋白质显示出改变的表达水平,并且这些蛋白质在不同代谢过程中起作用。该作品集中于四组蛋白质:与调节,缺氧胁迫,三羧酸循环和糖溶解相关的那些。这是第一次报告3,HIF1-α和富马酸盐在胃泌肿瘤中同时升高。
      糖酵解已被证明在几乎所有癌症类型中都升高,即使在常氧菊类下,也是一种称为Warburg效应的现象(
      • Warburg O.
      关于癌细胞的起源。
      )。通过缺氧,氧化磷酸化的解耦和关键酶的遗传失活的阻断,琥珀酸脱氢酶等遗传失活,应增强糖溶解的细胞依赖性,并选择展示该途径激活的细胞(
      • selak m.a.
      • armor s.m.
      • Mackenzie E.D.
      • Boulahbel H.
      • Watson D.G.
      通过抑制HIF-α脯氨酰羟化酶,琥珀酸酯将TCA循环功能障碍与血管生成。
      ,
      • 徐R.H.
      • Pelicano H.
      • 周Y.
      • 克服J.S.
      • 冯L.
      • Bhalla K.N.
      • Keating M.J.
      • 黄P.
      抑制癌细胞中的糖酵解:一种克服与线粒体呼吸缺陷和缺氧相关的耐药性的新策略。
      ,
      • pugh c.w.
      • Ratcliffe P.J.
      缺氧调节血管生成:HIF系统的作用。
      )。实际上,我们的蛋白质组学分析提供了分子水平的这些变化的详细分析,并且一些改变的蛋白质与先前的研究一致。其中,糖酵解酶如α-烯醇酶,果糖 - 双磷酸醛糖酶C,果糖 - 双磷酸醛糖酶A和甘氨醛-3-磷酸脱氢酶的过表达表明糖酵解率升高。抑制关键酶富马酸盐水解酶和直接增强其基材,富马酸盐,掺杂具有电子传输相关蛋白的异常表达,例如Akr7a3,提出了损伤的三羧酸循环并阻断氧化磷酸化。同时改变了丙酮酸激酶同工酶M1 / M2和常常数酶的表达,尤其是过表达 l - 脱氢脱氢酶链和 l - 乳酸脱氢酶B链表明从三羧酸循环到乳酸的丙酮酸代谢选择性转移。另外,果糖-1,6-双磷酸酶1,醛脱氢酶x和赤霉素戊酰裂解酶的下调以及eNoyl-CoA水解酶的上调,短链特异性酰基-CoA脱氢酶和羟基酰基 - 辅酶A脱氢酶葡糖生成,葡糖醛酸合成和脂肪酸β氧化的变化。这种变化可能是由糖酵解期间改变的中间体和三羧酸循环引起的。
      虽然早在20世纪30年代观察到Warburg效果,但解释癌细胞适应这种代谢应激的精确致癌机制仍然是定义差。最近几条证据指出了HIF作为潜在控制元件。 HIF通过激活该途径中的几个关键底物和酶来在维持糖酵解代谢方面发挥重要作用(
      • 奥巴赫姆
      • Navarro-SabateéA。
      • Caro J.
      • 孔X.
      • Duran J.
      • GoémezM.
      • 误会J.C.
      • Ventura F.
      • 罗莎J.L.
      • Bartrons R.
      6-磷胶 - 2-激酶(PFKFB3)基因启动子含有缺氧诱导的因子-1结合位点,其响应于缺氧的反应性。
      • Ryan H.E.
      • 罗杰。
      • 约翰逊R.S.
      固体肿瘤形成和胚胎血管化所需的HIF-1α。
      • Minchenko A.
      • Leshchinsky I.
      • Opentanova I.
      • 桑第三。
      • Srinivas V.
      • Armstead V.
      • Caro J.
      缺氧诱导因子-1-介导的6-磷胶-2-激酶/果糖-2,6-双磷酶-3(PFKFB3)基因的表达。它在Warburg效应中的作用。
      )。本数据为胃肿瘤的HIF-1α过表达提供了新的探测。在本研究中也证明了HIF靶癌烯VEGF显着上调 体内体外 对应于HIF的积累;然而,它仍然可以确定是否需要HIF的过表达和/或足以用于胃癌的发展。
      th,它的主要效果是通过t3 - 介导的信号通路,调节许多细胞体育活动,包括呼吸(
      • 支柱下午
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      线粒体呼吸功能调控中的甲状腺激素和基因表达。
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      基本转录元件结合蛋白是在Xenopus Laevis的变态期间表达的甲状腺激素调节转录因子。
      )。在本研究中,蜂窝富马酸盐的积累被证实为T的现象特征3 - 诱导的三羧酸循环功能障碍。此外,在T之后也观察到酶活性水平的FUMH灭活3 行政。考虑到以前发现RNA干扰导致FUMH沉默和急高升高的富马酸盐水平(
      • Ratcliffe P.J.
      富马酸盐水合酶缺乏和癌症:缺氧信号的激活?
      ),建议是合理的3 通过抑制FUMH诱导富马酸盐积累。
      通过抑制VHL依赖性降解途径的富塔稳定HIF1-α已经在肾肿瘤中观察到(
      • Isaacs J.s.
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      HIF过表达与肾癌中富马酸盐水溶液的双裂损失相关:富马酸盐在HIF稳定性调节中的新作用。
      )。数据表明,类似机制在胃肿瘤中运作。此外,即使在T存在下,富马酸常规诱导的HIF1-α诱导也可以通过其竞争性宇核酸溶解的2-氧代或诱导完全废除 3,表明t的富马酸蓄积是必要的3 - 引起的HIF1-α诱导。
      以前的研究表明细胞T3 通过在其核受体结合促进基因表达的作用(
      • Hoopfer E.D.
      • 黄兰
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      基本转录元件结合蛋白是在Xenopus Laevis的变态期间表达的甲状腺激素调节转录因子。
      )。相比之下,最近的研究表明,细胞溶质级联途径也负责t3 (
      • Moeller L.C.
      • dumitrescu上午
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      甲状腺激素的细胞溶质作用导致缺氧诱导因子-1α和糖酵解基因的诱导。
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      甲状腺激素通过在人成纤维细胞中的磷脂酰肌醇3-激酶诱导雷帕霉素-P70S6K级联的AKT /蛋白激酶B-哺乳动物的快速激活。
      )。本研究的数据表明,T的HIF早期积累3 可能依赖于PI3K / AKT信号通路,因此是核心无关的。
      已经努力探索TH功能障碍和致癌物之间的关系,但到目前为止没有建立合理的信号通路(
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      甲状腺激素对乳腺癌细胞中肿瘤抑制蛋白,P53和视网膜母细胞瘤调节的雌激素样效果。
      • Semenza G.L.
      靶向HIF-1用于癌症治疗。
      )。这里描述的蛋白质组学鉴定提供了一种指向Th失衡,HIF过表达和三羧酸循环损伤的新线索。因此,在胃癌的基础上,在胃癌中提出了一种新的甲状腺激素介导的致癌信号通路,并在此处提出的蛋白质组学鉴定和功能研究(Fig. 7)。 Thy的过度表达主要导致T的细胞积累3。回应T3,迅速激活细胞溶质级联PI3K / AKT以向线粒体输送信号,因此使三羧酸循环的方法被阻断。结果,主要在酶活性水平和后面的表达水平下抑制FUMH,这两者都导致富马酸盐积累。通过抑制HDH,升高的升温降低了HIF1-α的VHL依赖性降解。通过与HSP90-P300 / CBP复合物结合并随后激活其靶基因的表达(
      • Semenza G.L.
      靶向HIF-1用于癌症治疗。
      ),包括VEGF。 VEGF在瘤血管生成的功能(
      • 法拉拉N.
      • 格柏H.P.
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      VEGF及其受体的生物学。
      )。另外,另一个缺氧诱导的蛋白质,促进了VEGF的活性折叠和改性(
      • ozawa K.
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      氧调节蛋白ORP150的表达通过调节细胞内VEGF传输来加速伤口愈合。
      )。 HIF还促进糖酵解中几种关键酶的表达,并将来自三羧酸循环的能量代谢切换到糖醇分解,保护细胞免受能量短缺。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7胃癌发生过程中潜在的甲状腺激素介导的信号通路的示意图。 不同的途径和它们的相互依赖性主要基于对Kegg途径和发表的文献的理解。蛋白质 深灰色 代表胃肿瘤中调节的那些,蛋白质 浅灰 受到了下调的。 虚线箭头 表示假设的相互关系(有关详细信息,请参阅文本)。
      在本研究中表达的许多蛋白质被鉴定为在本研究中属于家庭,其中成员被Petrak引用 。 (
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      Deéjaèvu在蛋白质组学中。反复鉴定的差异表达蛋白质的次级探伤。
      )在许多2-de蛋白质组学研究中修改,无论实验目标,组织或物种如何。这些作者表明,这些蛋白质的修饰可能是由于对应力或技术像差的一般反应。在解释目前的结果中,必须注意这些要点。本研究检测了Petrak未列出的蛋白质 。 (
      • Petrak J.
      • Ivanek R.
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      Deéjaèvu在蛋白质组学中。反复鉴定的差异表达蛋白质的次级探伤。
      ),例如与甲状腺激素调节和呋喃酚在三羧酸循环中相关的Tthy。此外,这里提出的工作已经为涉及该癌症的应力相关的信号通路提供了新的见解,从而深入了解导致表达修改的机制。鉴于此,我们甚至对培养皿上市的一些蛋白质即使对结果的有效性增加了令人信心 。 (
      • Petrak J.
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      Deéjaèvu在蛋白质组学中。反复鉴定的差异表达蛋白质的次级探伤。
      )。需要进一步的工作来确定他们对诸如我们的研究的研究的含义。

      结论

      在该研究中,胃癌的比较蛋白质组学分析和相邻的正常组织揭示了107个差异表达的蛋白质。聚类分析显示了与多糖抑制的多糖抑制相关的一组代谢酶的失调,甲状腺激素的积累和缺氧诱导因子的过度表达。代谢改变的内在相互作用的分子分析表明潜在的新型胃癌致癌途径,其被甲状腺激素诱导并由缺氧诱导因子介导。

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