通过化学交联和串联质谱揭示AKT激活的跨域构象变化*

  • 比尔X. Huang.
    隶属关系
    从质谱分段,膜生物物理学和生物化学实验室,NIAAA,国家卫生学院,马里兰州,马里兰州,20892-9410
    搜索本作者的文章
  • Hee-Yong Kim
    一致
    应如何解决对应:膜生物物理学和生物化学实验室,NIAAA,国家卫生研究院,5625渔民车道,贝塞斯达,MD 20892-9410的群体。电话:301-402-8746;传真:301-594-0035;
    隶属关系
    从质谱分段,膜生物物理学和生物化学实验室,NIAAA,国家卫生学院,马里兰州,马里兰州,20892-9410
    搜索本作者的文章
  • 作者脚注
    *本文的出版成本部分按付款方式部分支付。因此,本文必须根据18 U.S.c,标明“广告”。第1734节仅表明这一事实。
      AKT,丝氨酸/苏氨酸激酶在细胞存活中起着关键作用。在生长因子受体刺激后,通过磷脂结合募集细胞溶质Akt并通过磷酸化活化308.和Ser473.。尽管已经报道了AKT部分的晶体结构,但已经证明了在激活期间整个分子的三维结构也不是连续的构象变化。在这项研究中,通过使用化学交联和串联质谱法探测溶液中全长AKT的三维结构,证明AKT在激活过程中经历了激活过程中的剧烈互换变化。交联结果不仅提供了新的结构信息,而且还揭示了AKT分子中的个体域的独特空间布置,在静止,膜 - 相互作用,磷酸化和底物结合状态下。我们的数据允许通过AKT激活序列的逐步互补变形变化的新模型,为溶液中进一步研究Akt - 膜,Akt-anc和/或Akt-Buys相互作用的进一步研究,以了解生理和病理生理学的分子机制细胞存活过程。
      丝氨酸/苏氨酸激酶Akt(蛋白激酶B(PKB)
      使用的缩写是:PKB,蛋白激酶B; pip3,磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸盐; pH,Pleckstrin同源性; 3D,三维; BS.3,双(磺琥珀酰亚胺酰亚乙烯)等; DSS,硫氨酸铟氨基苯乙烯; DSG,四琥珀酰亚胺氨基甲酸戊二酸,AMP-PNP,腺苷酰亚胺二磷酸酯; PS,1-PalmItoyl-2-Ooleyl- - 甘油-3-磷丝; PC,1-searoyl-2-linoleyl- - 甘油-3-磷化物; Pe,1-searoyl-2-oxoyl- - 甘油-3-磷酸乙醇胺; GSK3,糖原合成酶激酶3; PDK,磷酸阳性依赖性激酶。
      1使用的缩写是:PKB,蛋白激酶B; pip3,磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸盐; pH,Pleckstrin同源性; 3D,三维; BS.3,双(磺琥珀酰亚胺酰亚乙烯)等; DSS,硫氨酸铟氨基苯乙烯; DSG,四琥珀酰亚胺氨基甲酸戊二酸,AMP-PNP,腺苷酰亚胺二磷酸酯; PS,1-PalmItoyl-2-Ooleyl- - 甘油-3-磷丝; PC,1-searoyl-2-linoleyl- - 甘油-3-磷化物; Pe,1-searoyl-2-oxoyl- - 甘油-3-磷酸乙醇胺; GSK3,糖原合成酶激酶3; PDK,磷酸阳性依赖性激酶。
      )是一种中央介体,用于许多涉及细胞存活,分化,增殖和胰岛素信号传导中的许多细胞反应(
      • 巴西D.P.
      • HEMMINGS B.A.
      十年蛋白激酶B信号:一个坚硬的akt。
      ,
      • 劳拉米
      • Alessi D.R.
      PKB / AKT:细胞增殖,生存和胰岛素反应的关键介质?
      )。在人类中,有两个主要的Akt异构体Akt1(PKBα)和akt2(pkbβ )(
      • Staal S.P.
      Akt癌基因及其人类同源物Akt1和Akt2的分子克隆:初级人胃腺癌中Akt1的扩增。
      ),其表现出约80%的氨基酸序列同一性。每个异构体都具有N-末端Pleckstrin同源性(pH)结构域(残基1-113),激酶结构域(残留物150-408)类似于其他AGC成员中发现的那些,例如CAMP依赖性蛋白激酶和蛋白激酶C. ,含有疏水图案的C末端调节结构域(残留物409-480)(Fig. 1 )(
      • Bellacosa A.
      • testa J.R.
      • Staal S.P.
      • Tsichlis p.n.
      逆转录病毒癌基因,AKT,编码含有SH2样区域的丝氨酸苏氨酸激酶。
      ,
      • Alessi D.R.
      • 科恩P.
      蛋白激酶B的活化和功能机制。
      ,
      • 托马斯C.C.
      • 牛排M.
      • Alessi D.R.
      • 范艾尔滕D.M.F.
      Pleckstrin同源结构域的高分辨率结构蛋白激酶B / Akt结合磷脂酰肌醇(3,4,5) - 三磷酸酯。
      )。在活化过程中,通过将pH结构域与磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(PIP的相互作用,通过其pH结构域的相互作用募集细胞溶质Akt。3),其响应于生长因子受体刺激而通过磷脂酰肌醇3-激酶产生。据认为,膜相互作用导致AKT的构象变化,暴露一对残留物308. 在激酶域和Ser的激活环上473. 在调节结构域的疏水基序,分别用于磷酸阳性依赖性激酶1(PDK1)和推定激酶PDK2的磷酸化(
      • Stokoe D.
      • Stephens L.R.
      • 凯德
      • gaffney p.r.j.
      • Reese C.B.
      • 画家G.F.
      • 福尔摩斯A.B.
      • McCormick F.
      • 霍金斯P.T.
      在蛋白激酶B激活中施磷脂酰肌醇-3,5-三磷酸酯的双重作用。
      ,
      • 和约克科维奇M.
      • Alessi D.R.
      • Meier R.
      • Fermandez A.
      • 羊肉N.J.C.
      • Frech M.
      • Cron P.
      • 科恩P.
      • Lucocq J.M.
      • HEMMINGS B.A.
      易位在蛋白激酶B激活和功能中的作用。
      ,
      • Bellacosa A.
      • Chan T.O.
      • ahmed n.n.
      • 达 tta K.
      • 马尔斯特罗姆S.
      • Stpkoe D.
      • McCormick F.
      • 冯杰恩。
      • Tsichlis P.
      Akt通过生长因子激活是一种多步骤:pH结构域的作用。
      ,
      • Watton S.J.
      • 向下J.
      AKT / PKB定位和3'磷酸阳性在上皮细胞 - 基质和细胞 - 细胞相互作用部位产生。
      )。已经证明了两者都磷酸化308.和Ser473. 需要AKT的完全激活所必需的(
      • 杨杰。
      • Cron P.
      • 汤普森五。
      • 好五点
      • 赫索斯D.
      • HEMMINGS B.A.
      • 巴福德D.
      疏水基序磷酸化对蛋白激酶B / Akt调节的分子机制。
      )。磷酸化的活性Akt反过来磷酸化下游效应器,如GSK3,PFK2和坏(
      • datta s.r.
      • Brunet A.
      • 格林伯格M.E.
      细胞生存:三髋的戏剧。
      ,
      • datta s.r.
      • Dudek H.
      • 陶硕士,X.
      • 傅S.
      • 海安
      • gotoh y。
      • 格林伯格M.E.
      Akt磷酸化坏夫妇生存信号到细胞内在死亡机制。
      )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1AKT1的主要序列显示三个域,N-末端pH结构域(残留物1-113,标记为 黄色的 ),激酶结构域(残留物150-408,标记为 红色的 )和C末端调节结构域(残留物409-480,标记为 绿色 )。 质谱检测对胰蛋白酶的探测器覆盖了85%的氨基酸序列(下划线)在我们的实验条件下。
      理解AKT活化和调节的分子机制的结构研究已经主要使用X射线晶体学进行。迄今为止,已经报道了AKT的高分辨率晶体结构,用于AKT1 pH结构域,没有皮3 binding (
      • 托马斯C.C.
      • 牛排M.
      • Alessi D.R.
      • 范艾尔滕D.M.F.
      Pleckstrin同源结构域的高分辨率结构蛋白激酶B / Akt结合磷脂酰肌醇(3,4,5) - 三磷酸酯。
      ,
      • 米兰C.C.
      • 牛排M.
      • 凯利三。
      • 价格下午点
      • Alessi D.R.
      • 范艾尔滕D.M.F.
      磷脂酰肌醇的结合3,4,5-三磷酸盐蛋白激酶B的Pleckstrin同源结构域诱导构象变化。
      ),可解密的无活性Akt2激酶域(
      • 黄X.
      • Begley M.
      • Morgenstern K.A.
      • 顾y.
      • 玫瑰p.
      • 赵H.
      • 朱克。
      无活性AKT2激酶结构域的晶体结构。
      )和活性Akt2的激酶结构域与GSK3β肽和ATP模拟(
      • 杨杰。
      • Cron P.
      • 好五点
      • 汤普森五。
      • HEMMINGS B.A.
      • 巴福德D.
      具有GSK3肽和AMP-PNP的活化的AKT /蛋白激酶B三元复合物的晶体结构。
      )。使用NMR或圆形二色性的研究还提供了有关AKT结合到PIP的构象的支持性信息3 (
      • 米兰C.C.
      • 牛排M.
      • 凯利三。
      • 价格下午点
      • Alessi D.R.
      • 范艾尔滕D.M.F.
      磷脂酰肌醇的结合3,4,5-三磷酸盐蛋白激酶B的Pleckstrin同源结构域诱导构象变化。
      ,
      • Auguin D.
      • 巴尔斯
      • Auge-Senegas M.
      • 斯特恩米
      • Noguchi M.
      • Roumestand C.
      人蛋白激酶B(PKB / AKT)的Pleckstrin同源结构域的溶液结构和骨干动力学:与肌醇磷酸盐的相互作用。
      )。此外,荧光寿命成像显微镜已被用于监测 原位 响应增长因子刺激的构象变化(
      • Calleja V.
      • ale-beg s.m.
      • vojnovic b.
      • WOSCHOLSKI R.
      • 向下J.
      • Larijani B.
      通过荧光寿命显微镜监测细胞中蛋白质的构象变化。
      )。然而,目前这些方法既不证明整个AKT分子的3D结构也不是激活过程中涉及的顺序构象变化。显然需要探索全长AKT的3D结构的替代技术,以进一步了解该酶。与MS相结合的化学交联最近作为探测溶液中蛋白质的3D结构的敏感工具(
      • 年轻米。
      • 唐ñ。
      • HEMPEL J.C.
      • Oshiro c..
      • 泰勒e.w.
      • kuntz i.d.
      • Gilson B.W.
      • Dollinger G.
      通过使用从分子内交联和质谱法衍生的实验约束来识别高通量蛋白折叠鉴定。
      ,
      • Taverner T.
      • N.E.
      • ohair r.a.j.
      • SIMPSON R.J.
      稳定同位素标记,交联和质谱法表征拮抗剂白细胞介素-6二聚体。
      ,
      • 回J.W.
      • de Jong L.
      • muijsers a.o.
      • Koster C.G.
      蛋白质结构建模的化学交联和质谱。
      ,
      • 黄百克。
      • DASS C.
      • 金H.-Y.
      由化学交联和质谱法引起不饱和脂肪酸结合的探测人血清白蛋白的构象变化。
      ,
      • silva r.a.g.
      • 希拉迪
      • 方J.
      • 马赫卡斯。
      • 戴维森W.S.
      通过交联/质谱和序列螺纹测定的无脂脂蛋白A-1的三维分子模型。
      )。通过MS的交联氨基酸残基的测定提供了空间距离信息,该空间距离信息已被证明是为了阐明蛋白质 - 配体和蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质 -
      • Bennett K.L.
      • Kussmann M.
      • Bjork P.
      • Godzwon M.
      • Mikkelsen M.
      • Sorensen P.
      • Roepstorff P.
      与硫醇可切割的试剂结合差分质谱肽测绘 - 一种评估分子间蛋白质接触的新方法。
      ,
      • SINZ A.
      化学交联和质谱,用于映射蛋白质和蛋白质复合物的三维结构。
      ,
      • 张X.
      • Wehbi H.
      • 罗伯茨M.F.
      交联磷脂酰肌醇特异性磷脂脂蛋白C捕获酶上的两种激活磷脂酰胆碱分子。
      ,
      • Giron-Monzon L.
      • Manelyte L.
      • Ahrends R.
      • Kirsch D.
      • Spengler B.
      • 弗里德霍夫P.
      通过交联通过交联映射麦克尔和锰之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用。
      ,
      • 楚F.
      • 山S.
      • 猛禽D.T.
      • Alber F.
      • EGEA P.F.
      • stroud r.m.
      • 沃尔特P.
      • 伯灵名A.L.
      通过使用化学交联和串联质谱法解开信号识别颗粒及其受体的界面。
      ,
      • 黄百克。
      • DASS C.
      • 金H.-Y.
      通过化学交联和质谱法探测牛血清白蛋白的三维结构。
      )。这种方法补充,有时是X射线晶体学的可行替代方案,特别是当整个蛋白质分子不能容易地结晶时。
      在本研究中,我们使用具有不同间隔臂长度和化学的赖氨酸特异性双官能交联剂探讨了溶液中全长Akt1(akt)的3D结构,包括双(磺琥珀酰亚胺酰亚胺铟)(Bs3),四琥珀酰亚胺酰亚胺(DSS)和戊二醛(DSS)(DSG),以在尚未建立的AKT结构域之间提供空间距离约束。为了进入AKT激活机制的洞察,探测了不同活化阶段的AKT构象,包括非活性,膜相互作用,磷酸化和底物结合状态。通过用静态纳米ESI和HPLC / NANO-ESI串联质谱法明确测定交联赖氨酸残基。 18o标记胰蛋白酶摘要(
      • 姚X.
      • 弗里斯A.
      • Ramirez J.
      • Demirev P.A.
      • Fenselau C.
      蛋白水解 18o对比较蛋白质组学的标记:腺病毒两种血清型的模型研究。
      )用于进一步证实通过空间交联肽(
      • 黄百克。
      • DASS C.
      • 金H.-Y.
      由化学交联和质谱法引起不饱和脂肪酸结合的探测人血清白蛋白的构象变化。
      ,
      • 黄百克。
      • DASS C.
      • 金H.-Y.
      通过化学交联和质谱法探测牛血清白蛋白的三维结构。
      ,
      • 回J.W.
      • Notenboom V.
      • koning l.j.
      • muijsers a.o.
      • Sixma T.K.
      • Koster C.G.
      • Jong L.
      用质谱法鉴定蛋白质相互作用研究的交联肽 18o标签。
      )并比较从AKT在激活的各个阶段产生的交联肽的峰强度。我们识别出两个跨域交联对,使我们能够在激活期间监控跨域的构象变化。这些交联对还提供了在晶体结构中不可用的域之间的空间距离约束。我们的结果首次证明了AKT在每个活化和衬底结合的每个步骤中经历了独特的跨域构象变化。

      实验步骤

       化学品 -

      以90%纯度的无活性和磷酸化的活性AKT1购自Upstate Cell Signaling Solutions(Pallid,NY)或Calbiochem。 BS.3,DSS和DSG购自Pierce。修饰的胰蛋白酶是从Promega(麦迪逊,Wi)购买的。 K-LISA AKT活性套件和腺苷酰亚胺二磷酸(AMP-PNP)Tetraliquium盐购自CalBiochem。磷酸盐308. and -Ser473. AKT抗体购自电池信号技术(贝弗利,MA)。 GSK3β肽底物(Grprttsfae)购自Anaspec Inc.(圣何塞,加利福尼亚州)。 1-palmItoyl-2-oxoyl- - 甘油-3-磷丝素(PS),1-硬脂酰-2-基于Linoleyl- - 甘油-3-磷光啉(PC)和1-硬脂酰-2-油牛 - - 甘油-3-磷乙醇胺(PE)购自Avanti Polar Limids(alabaster,Al)。 l -α- d- 迈诺 -Phosphatidylin00-三种磷酸盐购自A.G.Conitific,Inc。(圣地亚哥,加利福尼亚州)。 HEPES缓冲溶液从Invitrogen购买。纯水是从双子座高纯净水系统(西柏林,NJ)获得的。 H218o(99%)购自IsoTec(迈阿密堡,哦)。二甲基磺砜(ME2所以)从西格玛购买。其他化学品购自Mallinckrodt。

       交联反应和胰蛋白酶消化 -

      Akt样品在5μm 透析过夜,反对50米m HEPES(pH 7.8)含有50米m NaCl在4℃下除去含伯胺的Tris-HCl缓冲液。在使用透析之前或之后的等分试样测量AKT活性并对磷酸化Akt抗体进行蛋白质印迹。透析前后测量的AKT活性是相同的,尽管蛋白质在本研究中使用的条件下损失其活性的〜30%。将样品与50摩尔过量的新制备的BS一起温育3 (在pH 5.0柠檬酸钠),DSS或DSG(在我身上)2因此,在反应混合物中最终浓度为1%)在室温下5分钟。在该交联状态下,根据SDS-PAGE分离数据未观察到分子间交联二聚体或多联器。用1淬灭交联反应 m Tris-HCl(pH 7.4)。用胰蛋白酶在37℃下用胰蛋白酶消化样品,胰蛋白酶为蛋白质比为1:20。或者,用二硫代噻钛糖醇还原样品并在胰蛋白酶消化前用碘乙酰胺烷基化。为了 18o胰蛋白酶摘要标记,将样品透析水,使用真空离心机干燥,并在纯水中重构或99%H218o用胰蛋白酶消化前5%乙腈(
      • 黄百克。
      • DASS C.
      • 金H.-Y.
      通过化学交联和质谱法探测牛血清白蛋白的三维结构。
      ,
      • 回J.W.
      • Notenboom V.
      • koning l.j.
      • muijsers a.o.
      • Sixma T.K.
      • Koster C.G.
      • Jong L.
      用质谱法鉴定蛋白质相互作用研究的交联肽 18o标签。
      )。

       AKT激酶测定和Western Blot-

      用K-LISA AKT活性试剂盒测量激酶活性,其使用链霉蛋白涂覆的96孔板和根据制造商的指示(CALBIOCHEM)的生物素化的肽底物(GRPRTSSFAEG)。使用磷酸-THR蛋白质印迹检查AKT的磷酸化状态308. and -Ser473. Akt antibodies.

       单玻璃囊泡的制备和Akt-脂质体相互作用 -

      含有PE,PC,PS和PIP的Unilamellar囊泡3 根据先前报告的方法制备50:18:30:2的比例(
      • 金H.-y
      • Bigelow J.
      • 凯瓦拉J.H.
      基质偏好在磷脂酰甲杂环基二十二碳甲酸的物种中的生物合成。
      )。透析过夜,过夜50米m HEPES(pH 7.8)含有50米m NaCl在4℃下,在37℃下与新制备的Unilamellar囊泡温育无活性AKT 1小时(
      • Alessi D.R.
      • 詹姆斯S.R.
      • 唐纳姆C.P.
      • 福尔摩斯A.B.
      • gaffney p.r.j.
      • Reese C.B.
      • 科恩P.
      三磷酸肌依赖性蛋白激酶的表征磷酸化蛋白激酶Bα。
      )。

       与GSK3β肽和AMP-PNP的复杂形成

      处于5μ的主动或非活动AKTm 与50μ的等效体积孵育m GSK3β肽基材和200μm AMA-PNP (
      • 杨杰。
      • Cron P.
      • 好五点
      • 汤普森五。
      • HEMMINGS B.A.
      • 巴福德D.
      具有GSK3肽和AMP-PNP的活化的AKT /蛋白激酶B三元复合物的晶体结构。
      )在室温下,1小时,透析过夜,对50米m HEPES(pH 7.8)含有50米m NaCl在4°C时。在用交联剂处理后,对等分试样进行胰蛋白酶消化,然后按照“交联反应和胰蛋白酶消化”下描述的方法进行质谱分析。

       离线静态纳米ESI质谱分析 -

      用C脱幼体饮料18 ZIPTIP(Millipore Corp.)通过高分辨率QSTAR Pulsar QQ-TOF质谱仪(Applied Biosystems / MDS Sciex,Toronto,CA)分析之前的分析之前,配备有纳米电子泵电离源。离子源电压在正离子模式下设置为1100V。通过一个全部质量谱 m/z 500-2000的范围,利用高纯度氩气对感兴趣的离子进行CID,以获得串联MS数据。仪器的性能具有大于8000的分辨率,并且在全MS和串联MS模式下具有小于30ppm的质量准确度。这 m/z 重建数据以使用分析师QS软件(应用生物系统/ MDS SCIEX)生成质谱。

       HPLC /纳米ESI质谱分析 -

      在配备有Agilent 1100纳米洛HPLC系统的安置离子阱质谱仪(XCT)上进行HPLC /纳米ESI MS分析。肽被困在c中18 浓缩栏(ZORBAX 300SB C.18,0.3×5 mm,安捷伦,威尔明顿,de)然后在Zorbax 300sb C上分开18 使用流动相的柱(75μm×150mm,3.5μm),其在300nl / min的流速下含有溶剂A(水溶液中的甲酸)和溶剂B(乙腈中的0.1%甲酸)。最初将流动相组合物在3%B以3%B保持5分钟并分别在8,50,55分钟内逐渐变为15,45和85%B,并以85%保持在5分钟。数据相关的自动扫描模式(“自动MS 2“)被使用了。毛细管电压设定为1750 V.扫描质谱仪300至2000 m/z range.

       分析交联肽 -

      蛋白质分析工作表(爪子)用于分配胰蛋白酶肽的质量值。通过比较从改性样品与来自未改性对照的那些的细胞蛋白肽的质谱来鉴定出现的交联肽。随着蛋白质分析工作表和分析师QS软件的帮助,手动解释交联肽的串联MS数据(应用生物系统/ MDS SCIEX)。

      结果和讨论

       在非活动AKT中的交联残留物的测定 -

      纳米ESI MS检测的AKT的胰蛋白酶肽代表超过85%的序列覆盖率(Fig. 1)。通过比较从来自非改性控制的含有来自交联剂改性的AKT获得的静态纳米ESI质谱来区分交联肽峰。 Fig. 2 显示来自对照和改性的AKT的胰蛋白酶消化的重建质谱。在用DSS改性的AKT样品中鉴定了12个新出现的峰。用BS修改3,DSS的亲水性类似物产生相同的结果,结果表明所有修饰的赖氨酸残基暴露在表面上,并且通过亲水和疏水的交联试剂易于进入。 dsg,包含交联臂(c5H6O2)较短(CH2)3 than that of DSS (C8H12O2)用于改进观察到的赖氨酸对的距离约束。在DSG改性的样品中,除了低于DSS改性样品中观察到的质量值42Da的质量值42da,除了新出现的峰之一。进一步证实了相对于蛋白质折叠更有价值的透过空间交联肽峰 18o标记胰蛋白酶消化。在h中水解时218o,胰蛋白酶肽的每个C末端包含两个 18O原子(
      • 姚X.
      • 弗里斯A.
      • Ramirez J.
      • Demirev P.A.
      • Fenselau C.
      蛋白水解 18o对比较蛋白质组学的标记:腺病毒两种血清型的模型研究。
      )。因此,内部交联或封端的肽显示出4DA的质量偏移,而两种肽之间的通孔交联导致8 -DA质量增加(
      • 黄百克。
      • DASS C.
      • 金H.-Y.
      由化学交联和质谱法引起不饱和脂肪酸结合的探测人血清白蛋白的构象变化。
      ,
      • 黄百克。
      • DASS C.
      • 金H.-Y.
      通过化学交联和质谱法探测牛血清白蛋白的三维结构。
      ,
      • 回J.W.
      • Notenboom V.
      • koning l.j.
      • muijsers a.o.
      • Sixma T.K.
      • Koster C.G.
      • Jong L.
      用质谱法鉴定蛋白质相互作用研究的交联肽 18o标签。
      )。具有2458,3465和3623Da的质量的肽,从相应的乘法电荷的离子重建,当标记时,质量增加了8Da 18o,表明这些肽由通过空间交联引起的这些肽。其余的肽显示出4DA质量偏移,表明它们源于封端或内部交联。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2纳米ESI-QQ-TOF重建的胰蛋白酶消化物的质谱来自未改性或交联剂改性的无活性AKT样品。 新出现的交联肽(标有 星号)在修饰的样品中鉴定。 18o通过显示DSS改性样品所证明的8DA质量偏移,o促进了三个通过空间交联肽的鉴定(大规模偏移对 大胆的 )。
      在DSS和BS中观察到的三个过空间交联对中3 - 根据MS / MS分析,具有2458和3465Da的峰值,具有2458和3465Da的峰值是互联交联肽对(Fig. 3 )。 Fig. 3 ( 最佳 )显示来自肽的MS / MS光谱,质量为2458Da(从三个带电离子重建) m/z 820.4)在DSS和BS中观察到3制定的样品。光谱显示,该肽是由线圈TYR之间的交联引起的26 而且 39 and Asp387 - arg. 391 with Lys30 与Lys相关联的pH域389 通过C的激酶域8H10O2 (derived from C8H12O2,DSS的交联臂,两个氢原子由于交联而减去)。懒惰30 而且 389 从DSS改性样品(2458Da)中观察到的交联,未从DSG改性的AKT(假设2416Da)中检测到。序列分配基于对筛选和含C的离子观察到的片段离子8H10O2。使用下标α和β分别标记来自每个区段的N-末端“B”或“A”离子和C末端“Y”离子(
      • 席克宁B.
      • 行R.H.
      • Glon B.W.
      • 郭X.
      • 勇梅。
      MS2Assign,自动分配和化学交联肽的串联质谱法的命名法。
      )。 MS / MS分析还揭示了LYS之间的其他交联交联284 激酶域和液体426 在用DSS(或BS)修饰后在3465和3423Da下检测到的调节结构域。3分别为dsg(Fig. 2)。 MS / MS光谱表明,3423Da的峰值(从四向电荷离子重建) m/z 856.7)由Leu肽段组成277 而且 289 and Leu421 - arg. 436 交联在Lys之间284 and Lys426 via C5H4O2 (Fig. 3, 底部)。一致性地,在DSS或BS中以质量为3465Da检测到相应的交联肽的MS / MS光谱3制定的样本显示与较长的C桥相同的交联8H10O2 (data not shown).
      图缩略图GR3.
      Fig. 3MS / MS分析与2458 da质量的交联肽( 最佳 )和3423 da(底部)所描绘的 . 肽的质量值衍生自相应的乘法离子( 插入 )。分配肽的序列 单封信 基于对交联肽段观察到的片段离子的缩写。由酰胺键裂解产生的N-末端B离子和C末端Y离子以及由于C-C键的切割引起的N-末端是离子。 最佳 ,MS / MS光谱表明,两个肽段,TYR26 而且 39 (用α标记)和ASP387 - arg. 391 (用β标记),在Lys交联 30 and Lys389 via C8H10O2. 底部 ,MS / MS频谱表明LYS284 乳酸肽段277 而且 289 (用β标记)与Lys相关联426 of Leu421 - arg. 436 (用α标记)通过c5H4O2,来自DSG的交联桥。

       使用交联数据探测非活动AKT的3D结构 -

      表I. 总结通过串联MS鉴定和表征的所有交联肽,包括两个阶段和五个颅内交联对以及五个封端肽。通过HPLC / MS / MS(数据未示出)也明确地证实所有这些由静态纳米ESI MS的修饰肽峰的存在。显示在本研究中确定的每个交联赖氨酸对的α-碳距离约束 表I.. 表I. 还列出了来自非活性AKT1 pH结构域(蛋白质数据库入口1UNP)的晶体结构的相应赖氨酸残基之间的α-碳距离或作为参考的非活性AKT2(蛋白质数据库入口1MRV)的激酶结构域。
      T 有能力的 I非活性AKT分子的交联赖氨酸残基
      由MS / MS鉴定的交联赖氨酸对或终点赖氨酸残基交联胰蛋白酶肽的质量交联的类型 BS. 3 -mod.DSS-Mod。dsg-mod。交联α - 碳的距离约束晶体结构中的α-碳距离
      一种 一种
      Lys. 111(pH)--lys112 (pH) 3120
      a 使用DSS或BS3.
      (3078)
      b 使用DSG。
      拘留所+++≤203.8
      c 从蛋白质数据库入口1UNP获得。
      Lys. 214(亲属)284 (亲属) 3623(3581)拘留所+++≤2017.9
      d 从非活性AKT2(蛋白质数据库入口1MRV)中的等效赖氨酸残基获得。
      Lys. 158(亲属)163 (亲属) 1610(1568)拘留所+++≤204.0
      d 从非活性AKT2(蛋白质数据库入口1MRV)中的等效赖氨酸残基获得。
      Lys. 30(pH)--lys39 (pH) 2939(2897)拘留所+++≤2017.9
      c 从蛋白质数据库入口1UNP获得。
      Lys. 284(亲属)426 (reg) 3465(3423)互联+++≤207.8
      d 从非活性AKT2(蛋白质数据库入口1MRV)中的等效赖氨酸残基获得。
      Lys. 30(pH)--lys389 (亲属) 2458(ND)互联++20–24 NA.
      Lys. 377(亲属)385 (亲属) 1792(1750)拘留所+++≤2012.1
      d 从非活性AKT2(蛋白质数据库入口1MRV)中的等效赖氨酸残基获得。
      Lys. 20 (pH) 1617(1575)封盖+++
      Lys. 189 (亲属) 2079(2037)封盖+++
      Lys. 268 (亲属) 2728(2686)封盖+++
      Lys. 400 (亲属) 1783(1741年)封盖+++
      Lys. 420 (reg) 2086(2044年)封盖+++
      a 使用DSS或BS3.
      b 使用DSG。
      c 从蛋白质数据库入口1UNP获得。
      d 从非活性AKT2(蛋白质数据库入口1MRV)中的等效赖氨酸残基获得。
      我们的结果表明,所有交联或终点赖氨酸残基暴露在表面上,因为它们被疏水性DSS和其亲水性模拟BS改性3。残留物189 and Lys268,由于电子密度的分辨率不足(
      • 黄X.
      • Begley M.
      • Morgenstern K.A.
      • 顾y.
      • 玫瑰p.
      • 赵H.
      • 朱克。
      无活性AKT2激酶结构域的晶体结构。
      )分别或不存在等同的赖氨酸残基,也封闭,揭示这些残留物在易于可接近的环境中。 DSS(或BS生成的空间距离约束3)或者分别用于交联赖氨酸对的DSG,分别考虑赖氨酸残留物的侧链的迁移率(
      • 年轻米。
      • 唐ñ。
      • HEMPEL J.C.
      • Oshiro c..
      • 泰勒e.w.
      • kuntz i.d.
      • Gilson B.W.
      • Dollinger G.
      通过使用从分子内交联和质谱法衍生的实验约束来识别高通量蛋白折叠鉴定。
      ,
      • 黄百克。
      • DASS C.
      • 金H.-Y.
      由化学交联和质谱法引起不饱和脂肪酸结合的探测人血清白蛋白的构象变化。
      )。为Lys观察到交联30 而且 39 ,lys. 111 而且 112 ,lys. 158 而且 163 ,lys. 214 而且 284 ,lys. 284 而且 426和lys.377 而且 385 不仅与DSS和BS3 而且还与DSG,一个较短的交联剂,表明每对赖氨酸残基的α-碳之间的距离小于20埃。该结果与AKT2的pH结构域报道的X射线晶体数据一致,AKT2的激酶结构域。对于Lys之间的互联交联观察了一个例外30 pH域和液体389 仅用较长的交联剂DSS和BS检测到激酶域3 但不在DSG修饰的样品中,表明该赖氨酸对的α-碳之间的距离大于20埃但小于24埃。该域距离约束尚未从现有的X射线晶体数据中获得,对于建模全长AKT分子,这应该是有价值的。两个跨域交叉连接的leys的存在30 而且 389 and Lys284 而且 426 表示pH和激酶结构域以及Akt结构中的调节和激酶结构域之间的空间接近,表明惰性Akt作为折叠分子存在于具有pH和调节结构域的折叠分子。

       膜相互作用,磷酸化和衬底结合的AKT的构象变化。

      两个跨域交叉连接的对Lys30 而且 389 and Lys284 而且 426 允许我们在不同的激活阶段监测AKT构象,包括无活性,膜 - 相互作用,磷酸化和衬底结合的态。通过K-LISA活性测定,蛋白质印迹和质谱法评估活性AKT的活性和磷酸化状态(Fig. 4)。只有活跃的AKT在THR中显示激酶活性和磷酸化308.和Ser473. 由K-LISA测定和“实验程序”描述的蛋白质印迹决定。始终如一的含有磷酸化的胰蛋白酶肽308. (3362 Da) and Ser473. (1732Da)仅在活性Akt样品的质谱中检测。与无活性的AKT,含有THR的非磷酸化胰蛋白肽308. or Ser473. 根据基于的定量,在活性样品中减少〜80% 18o使用已知的未修复的胰蛋白酶肽(未示出的数据)标记和/或强度比较。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4K-LISA活性测定的激酶活性和Western Blotting评估磷酸化状态( 最佳 )和质谱(底部 )。 含有磷酸化的Thr的胰蛋白胨肽308. (3362 Da) and Ser473. (1732Da)仅在活性AKT样品的质谱中检测。 PS. ,磷源; Pt. ,磷酸辛。
      为了观察膜相互作用的构象变化,与含有PE / PC / PIP / PIP的脂质体一起温育无活性AKT3 以50:18:30:2的比例,其在刺激的条件下近似于神经元质膜的内部小叶中的脂质组合物,考虑到PS专门在内部质膜中分别定位的事实,而PC主要是开启外。在这种情况下,两个跨域交联的对Lys30 而且 389 and Lys284 而且 426 在24-å空间距离约束范围内不再观察到(Fig. 5, 最佳 )。由于在这种情况下观察到这些赖氨酸残留物的个体修饰(数据未显示),因此很明显这些残留物仍然可以访问,这表明在Lys中交联伴侣30 而且 389 and Lys284 而且 426 在膜相互作用上彼此进一步移动。在磷酸化活性形式的akt,lys284 而且 426 交联仍然缺失,但懒惰30 而且 389 交联重新出现,表明LYS之间的邻近30 and Lys389 由于磷酸化而重新恢复。与DSG交联时,LYS30 而且 389 (据说是2416Da)的活性形式未观察到(Fig. 5, 底部),表明Lys之间的空间距离30 and Lys389 与非活动AKT的情况保持在20-24Å。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5在不同激活阶段的改性AKT样品中重建纳米ESI-QQ-TOF重建质谱。 最佳 ,在DSS修改的样本中,具有2458和3465Da的质量的峰值代表跨域交联对Lys30 而且 389 and Lys284 而且 426分别根据激活状态检测。 底部 ,在DSG改性的样品中,表示交联对Lys的峰值284 而且 426 在不活跃的akt中观察到,但不在活跃的akt中,而lys30 而且 389 (认为​​两种情况都未观察到2416 DA的质量)。交联肽标记为 星号.
      关于从非相同复杂混合物之间的峰值比较得出的结论的分析问题是由于不同样品中的离子抑制,可以减少或消除感兴趣的峰。无疑证实了观察到的峰的变化,我们利用了 18o标记技术。在H中消化的交联剂改性的无活性Akt样品218o与在正常H中消化的不同激活阶段的改性的AKT样品混合216o水,并将混合物进行MS分析。例如,质谱显示在 Fig. 6 对于DSS修改 18o标记的无效akt摘要混合 16o以1:1的比例摘要DSS改性的活性AKT。正如预期的那样,非交联胰蛋白肽的峰强度比具有2886Da的质量(Thr87 而且 111)在H.216o在h中的2890 da对手摘学218o消化为~1:1。对于交联的一对液体,观察到类似的比率30 而且 389 (2458 相对 2466 da)或峰值封端在lys268 (2728 相对 2732DA),表示在可比水平的非活动和活性形式中存在这些交联对。但是,Lys.284 而且 426 仅在3473Da的非活动AKT中检测到交联链接(18o消化),未在3465Da中检测到H中的活性样品在H中消化216o具有当前设置的乐器敏感性。通过LC / MS / MS进一步证实这些结果(数据未显示)。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6代表性纳米ESI-QQ-TOF重建的质谱,从DSS改性获得 18o标记的胰蛋白酶摘要混合的无效akt 16o以1:1的比例消化活性AKT。 还显示了光谱的放大视图。具有3465 da质量的峰值代表李多尔的交联284 而且 426 from active Akt (16在光谱中未检测到o消化。其他峰,包括非交联肽Thr87 而且 111 (t [87-111] k),端盖肽phe252 - arg. 273 (F [252-273] r)有懒惰的人268 capping, and Lys30 而且 389 被检测到与来自非活动AKT的强度(18o消化)。
      当主动AKT绑定到基板时,也发生了AKT的构象变化。在与基材孵育后,在从活性AKT的胰蛋白酶摘要获得的质谱中表明底物结合状态。将GSK3β肽底物和AMP-PNP,ATP类似物,ATP-PNP与Lys的胰蛋白酶消化干扰307,导致Lys的切片307。用MS / MS为ASP识别3965DA质量的新峰值302 - arg. 328 and Lys290 - 297 通过Cys之间的二硫键连接310 and Cys296 在thr磷酸化308. (数据未显示)。在单独的活性Akt中,在胰蛋白酶中未观察到该峰值(Thr磷酸化308. 单独并没有干扰Lys的胰蛋白水解307)或从与GSK3β肽和AMP-PNP混合的无活性AKT(作为3885Da的相应的不磷酸化峰),表明基材确实与激酶环(残基296-311)区域结合在活性AKT中。在基材染色的形式中,Lys284 而且 426 交联(3465DA),未在可利用的活性AKT形式中观察到,再次与DSS再次出现(Fig. 5, 最佳 )以及BS3 和DSG(数据未显示)。
      在内的pH域和激酶域域交联,包括LYS30(β2)39(β3/β4环),LYS111(α-螺旋)--lys112(α-Helix),Lys158(β1)163(β2),LYS214(β4)284(β7/β8环)和Lys377(α)385(αh/αi环),膜相互作用,磷酸化或底物结合后保持局部。尽管通过使用当前交联剂的探测距离约束的较低分辨率来探测每个域内的局部构象变化,但是使用电流交联剂的探测距离约束,但本研究中观察到的跨域交联的变化清楚地表明了个体域的布置是激活过程中深受深受影响。

       AKT激活的跨互言变化的提出计划 -

      来自目前可用的生物化学数据(
      • 巴西D.P.
      • HEMMINGS B.A.
      十年蛋白激酶B信号:一个坚硬的akt。
      ,
      • Alessi D.R.
      • 科恩P.
      蛋白激酶B的活化和功能机制。
      )已经提出了PIP3 与akt的pH域相互作用,暴露thr308.和Ser473.,又通过上游激酶进行磷酸化以进行激活(
      • 巴西D.P.
      • HEMMINGS B.A.
      十年蛋白激酶B信号:一个坚硬的akt。
      ,
      • Stokoe D.
      • Stephens L.R.
      • 凯德
      • gaffney p.r.j.
      • Reese C.B.
      • 画家G.F.
      • 福尔摩斯A.B.
      • McCormick F.
      • 霍金斯P.T.
      在蛋白激酶B激活中施磷脂酰肌醇-3,5-三磷酸酯的双重作用。
      )。例如,突变pH结构域通过上游激酶消除了磷酸化和活化Akt的活化即使在pip存在下3 (
      • Stokoe D.
      • Stephens L.R.
      • 凯德
      • gaffney p.r.j.
      • Reese C.B.
      • 画家G.F.
      • 福尔摩斯A.B.
      • McCormick F.
      • 霍金斯P.T.
      在蛋白激酶B激活中施磷脂酰肌醇-3,5-三磷酸酯的双重作用。
      )。另一方面,pH域的截短导致磷酸化和AKT的活化没有皮3 (
      • Stokoe D.
      • Stephens L.R.
      • 凯德
      • gaffney p.r.j.
      • Reese C.B.
      • 画家G.F.
      • 福尔摩斯A.B.
      • McCormick F.
      • 霍金斯P.T.
      在蛋白激酶B激活中施磷脂酰肌醇-3,5-三磷酸酯的双重作用。
      )。这些数据表明pH结构域可以阻断上游激酶的访问到AKT的磷酸化位点,以及PIP的结合3 到pH结构域是一种去除这种结构障碍的方法。另外,AN. 原位 使用荧光寿命成像显微镜的研究表明,AKT在完整细胞的生长因子刺激时经历质膜的构象变化(
      • Calleja V.
      • ale-beg s.m.
      • vojnovic b.
      • WOSCHOLSKI R.
      • 向下J.
      • Larijani B.
      通过荧光寿命显微镜监测细胞中蛋白质的构象变化。
      )。然而,没有关于伴随激活序列的跨域安排的改变的结构证据。缺乏Lys的交联30 而且 389 and Lys284 而且 426 在我们的研究中观察到的脂质体相互作用的AKT分子中提供了证据,即AKT确实存在于磷脂结合时的开放构象,可能暴露磷酸化位点。我们的数据还表明,随后通过磷酸化改变了这种膜诱导的开放构象。 Lys的存在30 而且 389 在无活性和磷酸化形式中,表明pH和激酶结构域的空间布置在活性和无活性形式中类似。在磷酸化形式再次检测到膜相互作用之前,这种交联首先消失的事实强烈表明磷酸化引发了pH从膜的分离。没有交联对Lys284 而且 426 在两种膜相互作用和激活的形式中的距离约束中,表明LYS284 and Lys426 在激活期间彼此远离彼此移动,至少在16埃,考虑到相应的残留物(7.8)之间的报告距离非活动AKT2的晶体结构(表I.)。晶体结构透露,底物肽和ATP的结合袋位于激活回路内,并且在n叶(含β1-5,αb和αc)和c-叶(主要是α-)之间的界面螺旋)分别在非活性AKT2分子中封闭(
      • 黄X.
      • Begley M.
      • Morgenstern K.A.
      • 顾y.
      • 玫瑰p.
      • 赵H.
      • 朱克。
      无活性AKT2激酶结构域的晶体结构。
      ,
      • 杨杰。
      • Cron P.
      • 好五点
      • 汤普森五。
      • HEMMINGS B.A.
      • 巴福德D.
      具有GSK3肽和AMP-PNP的活化的AKT /蛋白激酶B三元复合物的晶体结构。
      )与C-末端链覆盖ATP结合位点的一部分。此外,已经提出了诸如PHE之类的残留物439 监管结构域辅助稳定阻断构象(
      • 黄X.
      • Begley M.
      • Morgenstern K.A.
      • 顾y.
      • 玫瑰p.
      • 赵H.
      • 朱克。
      无活性AKT2激酶结构域的晶体结构。
      ),AKT激活需要解除这些绑定站点的戏剧化构象变化(
      • 黄X.
      • Begley M.
      • Morgenstern K.A.
      • 顾y.
      • 玫瑰p.
      • 赵H.
      • 朱克。
      无活性AKT2激酶结构域的晶体结构。
      ,
      • 杨杰。
      • Cron P.
      • 好五点
      • 汤普森五。
      • HEMMINGS B.A.
      • 巴福德D.
      具有GSK3肽和AMP-PNP的活化的AKT /蛋白激酶B三元复合物的晶体结构。
      )。根据我们的数据,通过与膜的相互作用引入调节结构域的这种显着位移,露出结合口袋,并且在磷酸化后持续这种开放构象。最可能,这种开放构象允许对激酶结构域进行底物进入,作为Cytosol中Akt的活性状态的重要决定因素。交联对Lys的存在284 而且 426 在结合GSK3β肽和AMP-PNP后表明在底物结合时重新建立闭合构象。虽然不容易解释肽结合如何如此急剧改变构象,但是这种结果似乎与AKT2的晶体结构一致,其被Thr激活309 磷酸化和S474D突变并与GSK3β肽和AMP-PNP复合,其中Lys之间的距离285 and Lys427 表示为7.0Å(蛋白质数据库入口1O6K)(
      • 杨杰。
      • Cron P.
      • 汤普森五。
      • 好五点
      • 赫索斯D.
      • HEMMINGS B.A.
      • 巴福德D.
      疏水基序磷酸化对蛋白激酶B / Akt调节的分子机制。
      )。
      总之,我们的结果强烈建议AKT在激活序列的每个步骤中经历独特的构象变化。根据我们的数据,提出了以下激活方案(Fig. 7)。非活性Akt存在于细胞质中的折叠结构,其pH和调节结构域至少部分地覆盖激酶结构域。膜易位导致AKT的构象变化,使pH和调节结构域两种pH和调节结构域与激酶域分离以暴露THR308.和Ser473. 用于磷酸化。 Akt的磷酸化可能触发pH从膜的分离,释放Akt到细胞质。在细胞骨AKT的活化形式中调节结构域的开放构象允许底物进入,这是AKT激活状态的重要决定因素。该模型与良好的概念符合AKT活性与构象变化相关,允许在THR处磷酸化308.和Ser473. (
      • 巴西D.P.
      • HEMMINGS B.A.
      十年蛋白激酶B信号:一个坚硬的akt。
      ,
      • Alessi D.R.
      • 科恩P.
      蛋白激酶B的活化和功能机制。
      )。此外,我们的模型可以为先前发现的解释提供说明474 磷酸化是AKT2的全激活所必需的(
      • 杨杰。
      • Cron P.
      • 汤普森五。
      • 好五点
      • 赫索斯D.
      • HEMMINGS B.A.
      • 巴福德D.
      疏水基序磷酸化对蛋白激酶B / Akt调节的分子机制。
      )通过描绘磷酸化后,调节结构域从激酶结构域移动,允许促进的底物进入并增强整体活性。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7AKT激活和衬底结合的跨互相构象变化的示意图。 在细胞溶溶胶中,惰性AKT作为折叠分子存在,具有覆盖激酶结构域的部分的pH和调节结构域。通过与pip的pH域的相互作用募集Akt募集到质膜3。膜相互作用导致构象变化,将pH和调节结构域移离激酶域并暴露308.和Ser473. 用于上游激酶的磷酸化。当通过在两个位点的磷酸化被磷酸化激活Akt时,pH结构域关闭,可能能够从膜中分离Akt。保持打开的调节域允许基板入口,并且在基板上结合时,调节结构域以非活动形式返回到闭合构象。 PIP2,磷脂酰肌醇4,5-双磷酸盐; PI3K,磷脂酰肌醇3-激酶; PS. ,磷源; Pt. ,磷酸辛。
      总之,我们的结果提供了激活和衬底结合期间溶液中全长Akt结构中的剧烈互补构象变化的第一次演示。我们的结果还向该分子的晶体结构提供了有价值的互补信息。更重要的是,我们的结果设定了进一步研究Akt膜,Akt-inc蛋白和/或Akt-药物相互作用的阶段,这是了解涉及细胞存活的生理和病理生理过程的分子机制的关键。

      参考

        • 巴西D.P.
        • HEMMINGS B.A.
        十年蛋白激酶B信号:一个坚硬的akt。
        趋势生物化学。 SCI。 2001; 26: 657-664
        • 劳拉米
        • Alessi D.R.
        PKB / AKT:细胞增殖,生存和胰岛素反应的关键介质?
        J. Cell SCI。 2001; 114: 2903-2910
        • Staal S.P.
        Akt癌基因及其人类同源物Akt1和Akt2的分子克隆:初级人胃腺癌中Akt1的扩增。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 1987; 84: 5034-5037
        • Bellacosa A.
        • testa J.R.
        • Staal S.P.
        • Tsichlis p.n.
        逆转录病毒癌基因,AKT,编码含有SH2样区域的丝氨酸苏氨酸激酶。
        科学。 1991; 254: 274-277
        • Alessi D.R.
        • 科恩P.
        蛋白激酶B的活化和功能机制。
        Curr。拍摄。遗传。开发。 1998; 8: 55-62
        • 托马斯C.C.
        • 牛排M.
        • Alessi D.R.
        • 范艾尔滕D.M.F.
        Pleckstrin同源结构域的高分辨率结构蛋白激酶B / Akt结合磷脂酰肌醇(3,4,5) - 三磷酸酯。
        Curr。 BIOL。 2002; 12: 1256-1262
        • Stokoe D.
        • Stephens L.R.
        • 凯德
        • gaffney p.r.j.
        • Reese C.B.
        • 画家G.F.
        • 福尔摩斯A.B.
        • McCormick F.
        • 霍金斯P.T.
        在蛋白激酶B激活中施磷脂酰肌醇-3,5-三磷酸酯的双重作用。
        科学。 1997; 277: 567-570
        • 和约克科维奇M.
        • Alessi D.R.
        • Meier R.
        • Fermandez A.
        • 羊肉N.J.C.
        • Frech M.
        • Cron P.
        • 科恩P.
        • Lucocq J.M.
        • HEMMINGS B.A.
        易位在蛋白激酶B激活和功能中的作用。
        J. Biol。化学。 1997; 272: 31515-31524
        • Bellacosa A.
        • Chan T.O.
        • ahmed n.n.
        • 达 tta K.
        • 马尔斯特罗姆S.
        • Stpkoe D.
        • McCormick F.
        • 冯杰恩。
        • Tsichlis P.
        Akt通过生长因子激活是一种多步骤:pH结构域的作用。
        oncogene。 1998; 17: 313-325
        • Watton S.J.
        • 向下J.
        AKT / PKB定位和3'磷酸阳性在上皮细胞 - 基质和细胞 - 细胞相互作用部位产生。
        Curr。 BIOL。 1999; 9: 433-436
        • 杨杰。
        • Cron P.
        • 汤普森五。
        • 好五点
        • 赫索斯D.
        • HEMMINGS B.A.
        • 巴福德D.
        疏水基序磷酸化对蛋白激酶B / Akt调节的分子机制。
        摩尔。细胞。 2002; 9: 1227-1240
        • datta s.r.
        • Brunet A.
        • 格林伯格M.E.
        细胞生存:三髋的戏剧。
        基因开发。 1999; 13: 2905-2927
        • datta s.r.
        • Dudek H.
        • 陶硕士,X.
        • 傅S.
        • 海安
        • gotoh y。
        • 格林伯格M.E.
        Akt磷酸化坏夫妇生存信号到细胞内在死亡机制。
        细胞。 1997; 91: 231-241
        • 米兰C.C.
        • 牛排M.
        • 凯利三。
        • 价格下午点
        • Alessi D.R.
        • 范艾尔滕D.M.F.
        磷脂酰肌醇的结合3,4,5-三磷酸盐蛋白激酶B的Pleckstrin同源结构域诱导构象变化。
        生物学习。 j。 2003; 375: 531-538
        • 黄X.
        • Begley M.
        • Morgenstern K.A.
        • 顾y.
        • 玫瑰p.
        • 赵H.
        • 朱克。
        无活性AKT2激酶结构域的晶体结构。
        结构(Lond。)。 2003; 11: 21-30
        • 杨杰。
        • Cron P.
        • 好五点
        • 汤普森五。
        • HEMMINGS B.A.
        • 巴福德D.
        具有GSK3肽和AMP-PNP的活化的AKT /蛋白激酶B三元复合物的晶体结构。
        NA. T。结构。 BIOL。 2002; 12: 940-944
        • Auguin D.
        • 巴尔斯
        • Auge-Senegas M.
        • 斯特恩米
        • Noguchi M.
        • Roumestand C.
        人蛋白激酶B(PKB / AKT)的Pleckstrin同源结构域的溶液结构和骨干动力学:与肌醇磷酸盐的相互作用。
        J. Biomol。 NMR。 2004; 28: 137-155
        • Calleja V.
        • ale-beg s.m.
        • vojnovic b.
        • WOSCHOLSKI R.
        • 向下J.
        • Larijani B.
        通过荧光寿命显微镜监测细胞中蛋白质的构象变化。
        生物学习。 j。 2003; 372: 33-40
        • 年轻米。
        • 唐ñ。
        • HEMPEL J.C.
        • Oshiro c..
        • 泰勒e.w.
        • kuntz i.d.
        • Gilson B.W.
        • Dollinger G.
        通过使用从分子内交联和质谱法衍生的实验约束来识别高通量蛋白折叠鉴定。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2000; 97: 5802-5806
        • Taverner T.
        • N.E.
        • ohair r.a.j.
        • SIMPSON R.J.
        稳定同位素标记,交联和质谱法表征拮抗剂白细胞介素-6二聚体。
        J. Biol。化学。 2002; 277: 46487-46492
        • 回J.W.
        • de Jong L.
        • muijsers a.o.
        • Koster C.G.
        蛋白质结构建模的化学交联和质谱。
        J.Mol。 BIOL。 2003; 331: 303-313
        • 黄百克。
        • DASS C.
        • 金H.-Y.
        由化学交联和质谱法引起不饱和脂肪酸结合的探测人血清白蛋白的构象变化。
        生物学习。 j。 2005; 387: 695-702
        • silva r.a.g.
        • 希拉迪
        • 方J.
        • 马赫卡斯。
        • 戴维森W.S.
        通过交联/质谱和序列螺纹测定的无脂脂蛋白A-1的三维分子模型。
        生物化学。 2005; 44: 2759-2769
        • Bennett K.L.
        • Kussmann M.
        • Bjork P.
        • Godzwon M.
        • Mikkelsen M.
        • Sorensen P.
        • Roepstorff P.
        与硫醇可切割的试剂结合差分质谱肽测绘 - 一种评估分子间蛋白质接触的新方法。
        蛋白质SCI。 2000; 9: 1503-1518
        • SINZ A.
        化学交联和质谱,用于映射蛋白质和蛋白质复合物的三维结构。
        J.质谱。 2003; 38: 1225-1237
        • 张X.
        • Wehbi H.
        • 罗伯茨M.F.
        交联磷脂酰肌醇特异性磷脂脂蛋白C捕获酶上的两种激活磷脂酰胆碱分子。
        J. Biol。化学。 2004; 279: 20490-20500
        • Giron-Monzon L.
        • Manelyte L.
        • Ahrends R.
        • Kirsch D.
        • Spengler B.
        • 弗里德霍夫P.
        通过交联通过交联映射麦克尔和锰之间的蛋白质 - 蛋白质相互作用。
        J. Biol。化学。 2004; 279: 49338-49345
        • 楚F.
        • 山S.
        • 猛禽D.T.
        • Alber F.
        • EGEA P.F.
        • stroud r.m.
        • 沃尔特P.
        • 伯灵名A.L.
        通过使用化学交联和串联质谱法解开信号识别颗粒及其受体的界面。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2004; 101: 16454-16459
        • 黄百克。
        • DASS C.
        • 金H.-Y.
        通过化学交联和质谱法探测牛血清白蛋白的三维结构。
        J.IM。 SOC。质谱。 2004; 15: 1237-1247
        • 姚X.
        • 弗里斯A.
        • Ramirez J.
        • Demirev P.A.
        • Fenselau C.
        蛋白水解 18o对比较蛋白质组学的标记:腺病毒两种血清型的模型研究。
        肛门。化学。 2001; 73: 2836-2842
        • 回J.W.
        • Notenboom V.
        • koning l.j.
        • muijsers a.o.
        • Sixma T.K.
        • Koster C.G.
        • Jong L.
        用质谱法鉴定蛋白质相互作用研究的交联肽 18o标签。
        肛门。化学。 2002; 74: 4417-4422
        • 金H.-y
        • Bigelow J.
        • 凯瓦拉J.H.
        基质偏好在磷脂酰甲杂环基二十二碳甲酸的物种中的生物合成。
        生物化学。 2004; 43: 1030-1036
        • Alessi D.R.
        • 詹姆斯S.R.
        • 唐纳姆C.P.
        • 福尔摩斯A.B.
        • gaffney p.r.j.
        • Reese C.B.
        • 科恩P.
        三磷酸肌依赖性蛋白激酶的表征磷酸化蛋白激酶Bα。
        Curr。 BIOL。 1997; 7: 261-269
        • 席克宁B.
        • 行R.H.
        • Glon B.W.
        • 郭X.
        • 勇梅。
        MS2Assign,自动分配和化学交联肽的串联质谱法的命名法。
        J.IM。 SOC。质谱。 2003; 14: 834-850