肌营养侧面硬化剂的转基因小鼠模型中的信息辅助蛋白质分析* S.

  • 托马斯J. Lukas.
    一致
    应如何解决谁:分子药理学和生物化学,西北大学,病房8-200,303 E.芝加哥Ave.,Chicago,IL 60611.电话:312-503-0847;
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    来自西北大学分子药理学与生物化学的部门,伊利诺伊州芝加哥60611
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  • 魏伟罗
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  • Teepu Siddique
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  • 作者脚注
    *这项工作是由Ninds,国家卫生机构授予NS050641和NS046535以及LES Turner Als Foundation的支持,为als Research,ve Schaff Als Research Fund,H. Post Research专业,Wenske Foundation ,Falk Medical Research Trust,Abbott Labs Duane和Susan Burnham教授,以及David C. Asselin MD纪念基金。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
    是本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)含有补充材料。
      “OMIC”数据。
      肌营养的外侧硬化(ALS)
      使用的缩写是:Als,肌萎缩的外侧硬化;去,基因本体; SOD1,Cu,Zn-超氧化物歧化酶; TG,转基因; Rabgdi,Rab鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂; wt,野生型;地图,丝裂原激活激酶; PKC,蛋白激酶C; TNF-R,肿瘤坏死因子受体; IAP,凋亡蛋白的抑制剂。
      1使用的缩写是:Als,肌萎缩的外侧硬化;去,基因本体; SOD1,Cu,Zn-超氧化物歧化酶; TG,转基因; Rabgdi,Rab鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂; wt,野生型;地图,丝裂原激活激酶; PKC,蛋白激酶C; TNF-R,肿瘤坏死因子受体; IAP,凋亡蛋白的抑制剂。
      是一种致命的疾病,其特征在于来自脊髓,脑干和电机皮层的运动神经元的渐进性丧失。该疾病研究中的一个重要发现是在患有ALS的家族形式的患者中编码Cu,Zn-超氧化物歧化酶(SOD1)的基因中的突变存在(
      • rosen d.r.
      • Siddique T.
      • 帕特森D.
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      Cu / Zn超氧化物歧化酶基因的突变与家族性肌萎缩侧面硬化有关。
      )。在Als中发现的SOD1突变主要是沿氨基酸序列的近70个个体位点发生的畸形点突变。这些SOD1突变体中的大多数保留酶活性,表明突变体的效果不是由于正常功能的损失,而是对运动神经元有毒的性质的增益。这种有毒功能的性质尚未理解,尽管最近的工作意味着SOD1聚集体的形成作为因果现象(
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      突变体超氧化物歧化酶1聚集在家族性肌萎缩外硬化的转基因小鼠模型中的神经肌肉积累。
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      肌萎缩侧碳酸化相关Cu / Zn超氧化物歧化酶1聚集体的结构性和神经元毒性。
      )。然而,突变体SOD1如何启动ALS的机制尚不清楚。
      表达突变体SOD1基因的转基因(Tg)小鼠可以发育运动神经元疾病,并用作人类ALS的模型系统(
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      表达人Cu,Zn超氧化物歧化酶突变的小鼠中的运动神经元变性。
      )。几种SOD1突变体的表征表明,疾病发病的严重程度和时间高度依赖于特异性突变和表达水平。在SOD1突变小鼠的脊髓内,在腹侧喇叭运动神经元中出现最高水平的表达(
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      SOD1-G93A转基因小鼠脊髓转录分析揭示的疾病机制。
      )。怀疑,这种局部表达与运动神经元的生化特性相结合,使它们易受突变体SOD1(
      • 邓H.X.
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      • Pericak-Vance M.A.
      • Siddique T.
      铜,Zn超氧化物歧化酶的肌营养侧向硬化和结构缺陷。
      )。最佳表征的SOD1 TG小鼠之一是携带G93A-SOD1突变的菌株(
      • Gurney M.E.
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      表达人Cu,Zn超氧化物歧化酶突变的小鼠中的运动神经元变性。
      )。这些小鼠显然是健康,直至大约90天的年龄,在此时它们在悬浮时产生运动神经元疾病的症状,例如摇摆四肢。 120天后,大多数这些小鼠在完全瘫痪时患有疾病的最终阶段。虽然60天的症状无症状,G93A-SOD1小鼠表现出脊髓病理学,其特征是碎裂的GOLGI(
      • Mourelatos Z.
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      在表达突变体Cu的转基因小鼠中的脊髓电脊电机神经元的高尔基装置,Zn超氧化物歧化酶早期脱落,疾病的临床前阶段。
      ),线粒体肿胀和液泡形成(
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      小鼠的人Cu / Zn超氧化物歧化酶(SOD1)过表达导致线粒体循环,轴突变性和早产Motoneuron死亡,并加速表达家族肌萎缩侧硬化突变体SOD1的小鼠的Motoneuron病。
      )。在90天内也突出是存在细胞质夹杂物的存在,其中许多含SOD1(
      • Johnston J.A.
      • 道尔顿M.J.
      • Gurney M.E.
      • kopito r.r.
      突变体铜,Zn-超氧化物歧化酶的高分子量复合物在小鼠模型中进行家族性肌萎缩外壳中毒。
      )。突变体SOD1蛋白的生物物理学研究表明它们具有比野生型SOD1的聚集趋势更大,并且具有改变的金属结合特性(
      • 邓H.X.
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      • Tainer J.A.
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      用与家族/族族连接的SOD1突变蛋白形成的淀粉样蛋白样细丝和含水纳米管。
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      人超氧化物歧化酶的Als突变体通过框架稳定化形成纤维聚集体。
      )。因此,疾病过程与在突变体SOD1聚集体和包涵体存在之前发生的细胞生物化学的变化有关(
      • Johnston J.A.
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      突变体铜,Zn-超氧化物歧化酶的高分子量复合物在小鼠模型中进行家族性肌萎缩外壳中毒。
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      突变体SOD1小鼠中脊髓电池神经元的功能障碍归因于累积细胞应激,似乎会聚在线粒体上作为关键目标(
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      电动机神经元的大规模线粒体变性触发表达突变体SOD1的小鼠中的肌营养侧面硬化症的发病。
      )。在培养细胞中表达的SOD1突变体导致SOD1突变体TG小鼠脊髓中的胱天蛋白酶的活化(
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      肌营养侧面硬化症中的细胞凋亡:证据综述。
      )但只有在少数人类als(
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      肌营养侧面硬化症中的细胞凋亡:证据综述。
      )。虽然它们减缓了疾病进展,但既不促进神经元生存的药剂则(
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      药理学方法治疗肌营养侧升硬化症。
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      Xaliproden在肌营养的外侧硬化症中的功效和安全性:两期III试验的结果。
      )也不表达抗污染蛋白(
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      BCL-2:延长家族肌萎缩侧硬化的转基因小鼠模型中的寿命。
      )防止SOD1突变小鼠的死亡。虽然过去十年的激烈研究主题,但是由突变体SOD1引发的事件序列,即启动细胞功能障碍和患有ALS症状和介导细胞死亡仍有仍有待确定。
      基因表达研究(
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      SOD1-G93A转基因小鼠脊髓转录分析揭示的疾病机制。
      )和信号通路研究(
      • 胡锦涛。
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      肌萎缩侧面硬化脊髓中蛋白激酶和蛋白质磷酸酶表达。
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      磷脂酰肌醇3-激酶:肌营养侧面硬化症中的活性和蛋白质水平增加。
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      • 胡锦涛。
      • Pelech S.
      异常蛋白激酶和肌营养侧面硬化的磷蛋白质。
      )在来自正常和SOD1突变小鼠的小鼠脊髓上完成的,为已经开始的细胞损伤的性质提供了一些线索。 G93A-SOD1小鼠在90和120天内的转录分析显示出与胶质激活,激活蛋白质和脂质的清除剂的激活,以及改变少数金属离子结合蛋白的表达(
      • 奥尔森M.K.
      • roberds s.l.
      • Ellerbrock B.R.
      • Fleck T.J.
      • McKinley D.K.
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      SOD1-G93A转基因小鼠脊髓转录分析揭示的疾病机制。
      )。然而,这些mRNA表达分析未能指向导致神经元功能障碍的常见途径。这是对神经退行性疾病表征的表征面临的问题之一,因为与正常状态相比,所有蛋白质中的所有蛋白质中的原因和效果关系都被断开。因此,我们寻求一种潜在的统一方法,使用蛋白质组学和信息学研究了神经变性疾病进展过程中发生的功能变化。我们使用了一种方法,其可以与源自表达不同转基因的动物或来自不同年龄的常见转基因动物的多种蛋白质谱以及基于mRNA的微阵列数据。
      目前的作品是使用直接评估在表达野生型和G93A-SOD1蛋白的转基因小鼠的脊髓中的蛋白质表达的改变来解决ALS中的原因效应关系问题的初步步骤。与表达野生型的那些人类SOD1和正常的非转基因小鼠。使用基因本体关系分析蛋白质简谱数据。这些分析表明,与对照动物相比,患有患病(G93A-SOD1)的几种蛋白质基团的富集。以前在突变体SOD1小鼠脊髓中未识别出G蛋白调控和溶酶体酶的变化。通过改变ATP合成所需的电子传输链中所需的电子传输链中的所选线粒体蛋白质,突变突变体G93a-sod1的过表达似乎加速了疾病的过程,而不平衡涉及细胞通信系统中所涉及的蛋白质的光谱,特别是参与调控的蛋白质神经递质分泌。

      实验步骤

       脊髓提取物的分馏 -

      先前已经描述了G93A-SOD1和WT SOD1小鼠(
      • Gurney M.E.
      • PU H.
      • Chiu A.Y.
      • Dal Canto M.C.
      • polchow c.y.
      • 亚历山大D.D.D.
      • Caliendo J.
      • 亨塔蒂A.
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      • 陈W.
      • 翟P.
      • Sufit R.L.
      • Siddique T.
      表达人Cu,Zn超氧化物歧化酶突变的小鼠中的运动神经元变性。
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      • 大厅E.D.
      • Andrus p.k.
      • Oostveen J.A.
      • Fleck T.J.
      • Gurney M.E.
      氧自由基诱导的脂质过氧化损伤对家族式转基因模型中疾病发作和进展的关系。
      )。非TG小鼠是背景菌株B6SJL。根据西北大学批准的动物护理方案,在安乐死后,从60-70-或〜120(末期)日老鼠中仔细解剖脊髓。将溶解组织立即冷冻(-70℃)并储存在-80℃直至使用。制备,脊髓迅速解冻并使用Teflon玻璃液(四冲程)在裂解缓冲液中由25米组成m TRIS,0.1 m sucrose, 1 mm EDTA,冰上的pH7.5。将提取物以600×离心 g 沉积物细胞颗粒(P1颗粒)20分钟,然后以10,000× g 20分钟以产生清除上清液(S2)和颗粒级分(P2)。将颗粒级分重悬于裂解缓冲液中,并使用BCA试剂(Pierce)和牛血清白蛋白作为标准的所有级分测定蛋白质浓度。
      通过在25-30%区的脊髓髓型梯度上富集P2分数来制备线粒体(
      • 好的 ado-Matsumoto A.
      • 弗里维奇I.
      大鼠肝脏超氧化物歧化酶(SOD)的亚细胞分布:Cu,线粒体中的Zn-SOD。
      )。基于洗涤剂的分馏方法用于制备三个线粒体子分子。用0.1%二硫脲提取线粒体提供外膜+内膜空间馏分,然后是1%的非致膜P-40萃取,得到内膜馏分和代表剩余线粒体蛋白的颗粒馏分。然后在4-12%丙烯酰胺梯度凝胶上进行每个级分的一维SDS-PAGE。然后将单个泳道切成14-18条带,每个轨道用胰蛋白酶消化,提取并浓缩。然后通过如下所述的LC-MS分析从每个带中获得的肽。

       蛋白质消化的制备 -

      每馏分P1,P2和S2的等分试样,含有0.5mg蛋白质的稀释量等体积为6 m 盐酸胍25米m 三,pH 7.5。向这些溶解的级分中加入二硫醇至25米的浓度m。在室温下温育1小时后,碘乙酰胺(准备为0.5 m 向乙腈中的储备溶液加入到55米的最终浓度m,并将溶液在室温下温育1小时。然后将还原和烷基化级分透析(10,000分子量截止膜),对50米m 碳酸氢铵溶液在4℃下15小时。用0.03mg / ml胰蛋白酶消化级分(l-1-甲苯基酰胺-2-苯基乙基氯甲基丙酮处理)在37℃下持续6小时,然后将另一种等分试样加入到0.045mg / ml的终浓度中。消化在37℃下继续额外12-15小时。通过将冰醋酸添加到最终体积为2%,终止反应。然后将样品施用于C.18 用0.1%(v / v)三氟乙酸预先挤压的旋转柱(巢组)。样品施用后,用3×0.6ml 0.1%三氟乙酸洗涤柱。通过在0.1%三氟乙酸的0.1%三氟乙酸中施加2×0.3ml 60%(v / v)乙腈,在0.1%三氟乙酸中施用1×0.3ml 80%(v / v)乙腈的肽洗脱。将组合的洗脱剂蒸发至速度WAC,并将残余物在0.1%(v / v)甲酸中以50μl10%(v / v)乙腈重新溶解。将每种重新溶解的洗脱液的1-2-μL等分试样稀释至100μl,记录280nm处的吸光度。该值用于通过二维LC-MS对每个洗脱剂进行标准化。

       离子陷阱LC-MS-

      以下列方式偶联到纳米涂布质谱法的二维色谱。将样品施加到20μL/ min的强阳离子交换柱(聚阳离子,0.3×50mm)上。未绑定的肽被C捕获18 将柱(0.3×5mm,ZORBAX)纳入离子交换柱。然后将捕获柱与分析柱线输入(ZORBAX C.18 300SB,0.075×150mm)连接到Agilent XCT 1100质谱仪配有纳米Pray界面,以0.3μL/ min的流速洗脱。在80分钟内以0.1%(v / v)甲酸的梯度为5-65%(v / v)乙腈的梯度洗脱肽。在26,000收集质谱 m/z/ s。在每个光谱采集周期期间,在洗脱谱中的所选峰上完成四到五个MS / MS采集。动态排除实施了 m/z 在仪器数据采集周期的分析后,信号被排除在0.8分钟后。在二维LC-MS实验中,在离子交换柱的洗脱时重复反相分析,步骤为25,50,75,100和500米m 醋酸铵。以类似的方式分析来自凝胶电泳的样品,而不使用离子交换预提缩步骤。肽在Zorbax C上进行色谱分离 18 SB300柱(0.075×50mm)用45分钟的梯度洗脱,梯度为25-65%乙腈(0.1%(v / v)甲酸)。

       数据处理和半定量分析 -

      二维色谱 - 质谱数据被提交给Spectrum Mill程序(Agilent Technologies)以进行处理和数据库搜索。从离子陷阱仪器获得的MS / MS数据的一个潜在问题是由数据库搜索具有差的质量质谱数据的误报。光谱磨机合并峰的光谱与相同的峰值 m/z 并且拒绝具有MS / MS碎片模式的光谱,其包括肽片段剖面中的一串三个氨基酸残基。过滤的MS / MS光谱用于搜索Swiss-Prot蛋白数据库。阳性肽命中需要最小得分6-8,并且在数据库中鉴定的肽的预测MS / MS数据中发现了至少70%的25大MS / MS峰。
      通过使用每种分析的标准量的蛋白质提取物进行蛋白质分析数据的半定量分析,并调整通过LC-MS分析的量,以最大化从每个样品中鉴定的蛋白质数量。从数据库评分中的每个阳性击中获得平均肽强度数据。总结这些值,然后除以肽命中的数量,以获得蛋白质的平均强度。然后通过鉴定的平均整体蛋白质除以鉴定的相对表达值,单个蛋白质分数 补充表1。通常针对给定蛋白质鉴定相同的肽组。如果仅从给定蛋白质鉴定单个肽,则基于手动检查MS / MS光谱的质量和与鉴定的肽MH的最大偏差的手动检查,这些肽包括为次数+ ±1.9质量单位。因此,对于常用的+2和+3电荷肽,偏差小于质量单元。为了估计从多个实验获得的肽信号强度的变化,G93A-SOD1小鼠脊髓和来自非TG小鼠脊髓的可溶性级分的可溶性级分的摘要次数次。含有~100标准化(信号/平均值)的列表,编制并在运行之间进行比较并比较了术语的常规蛋白质(两种或更多种肽)的强度。在两个单独的运行中鉴定的相同蛋白质的信号强度的平均变化小于1.8-2倍。 补充表1 包含G93A-SOD1和WT SOD1小鼠的命中列表和归一化表达值。

       信息辅助数据分析 -

      对于基因本体分析,将归一化比例数据转化为对应于蛋白质不足的蛋白质的单一值,没有变化或过度呈现的蛋白质。我们过滤数据以获得蛋白质,其归一化比率至少为1.8-2倍。这是基于在多个相同样本的多次运行中观察到的变化。因此,进口到巨液体分析的“改变的蛋白质”数据被“扁平化”与甘油酮相兼容。
      从10μg总mRNA开始,我们在Affymetrix Mg_u74a(版本2)芯片上产生微阵列数据(75-110天)(第2版)芯片。根据标准伴侣协议处理mRNA,并为后续分析生成标准化(.cel)数据文件。我们还使用了从国家生物技术信息(NCBI)基因表达综合症(GEO)数据库(GEA)数据库(
      • 巴雷特T.
      • Suzek T.O.
      • TROUP D.B.
      • Wilhite S.E.
      • NGAU W.C.
      • Ledoux P.
      • Rudnev D.
      • 睫毛A.E.
      • 富士井W.
      • Edgar R.
      NCBI Geo:挖掘数百万表达配置文件 - 数据库和工具。
      ,
      • Edgar R.
      • Domrachev M.
      • 睫毛A.E.
      基因表达综合症:NCBI基因表达和杂交阵列数据储存库。
      )。这些数据集来自70天历史的假设SOD1小鼠GSM75505,-6和-7,并控制GSM75486和-7。这些数据使用了Affymetrix鼠标430A(2.2版)芯片。通过Microsoft Excel在Microsoft Excel中分析了Microsoft Excel的Brb Arraytools与BRB Arraytools进行了分析了Microsoft Excel。单个通道值缩放并分类为疾病或对照组。 MRNA表达数据的基因本体分析是使用BRB ArrayTools中的插件模块进行的,并使用Gominer(
      • Zeeberg B.R.
      • 冯W.
      • 王G.
      • 王M.D.
      • fojo a.t.
      • 阳光M.
      • Narasimhan S.
      • 凯恩D.W.
      • 重温W.C.
      • Lababidi S.
      • Bussey K.J.
      • riss J.
      • 巴雷特J.C.
      • Weinstein J.N.
      龙头:基因组和蛋白质组学数据的生物学解释资源。
      )。在巨酮分析中,过滤表达数据以仅包括改变大于1.5倍的基因,并且被分配-1或1用于巨码分析。本出版物中提出的新微阵列数据已存入NCBI Geo( www.ncbi.nlm.nih.gov/geo.)通过Geo系列登录号访问 GSE4390..

       Western Blot的蛋白质表达 -

      除了蛋白质分析之外,在蛋白质分析中提取的脊髓的上清液和颗粒部分进行蛋白质印迹,除了省略低速离心。每巷加载聚丙烯酰胺梯度(4-20%)SDS凝胶,含有25μg可溶性或颗粒蛋白。将凝胶印迹到PVDF膜中,并在含有0.1%吐温20的Tris缓冲盐水中封闭1%的非脂肪乳溶液,在4℃下过夜。用兔多克隆抗体对Rabgdi(Zymed Laboratories Inc.,1:2000)和Synapsin II(QED Bioscience,1:5000)探测着斑点。在室温下孵育1小时后,洗涤膜,然后用牛抗兔辣根过氧化物酶 - 缀合的第二抗体(1:5000)在室温下孵育1小时。用ECL +试剂(Amersham Biosciences)开发出印迹,并通过放射自显影可视化。

      结果

       全局蛋白质表达分析 -

      为了优化脊髓内细胞蛋白质的覆盖,我们使用基于差分离心的分馏技术。因此,从脊髓提取物中产生两个颗粒和一种可溶性级分。这些分馏并非设计用于保存细胞器,而是破坏它们并释放蛋白质。 表I. 总结从小鼠脊髓的这些级分中蛋白质的回收率。含有G93A-SOD1突变的TG小鼠来自终级动物(120天),而其他小鼠来自野生型SOD1 TG和类似年龄的正常动物。我们始终发现,来自突变体SOD1小鼠的总可提取蛋白质比非转基因或野生型SOD1动物低30-40%。因为电机神经元仅贡献总蛋白质的10-15%,因此可能因来自G93A-SOD1动物的神经元和相关的支持细胞的丧失和/或在所有细胞类型中的混合物中减少了整个蛋白质表达而导致脊髓。
      T有能力的 I蛋白质从小鼠脊髓的可溶性和颗粒部分中回收
      脊髓(mg)可溶性(mg)颗粒状(mg)总计(mg)mg / 100 mg
      G93A-SOD1812.150.72.853.5
      WT SOD110732.55.55.1
      非TG.1245.62.486.5
      这种相对简单的分馏方法允许鉴定来自小鼠脊髓的10倍的蛋白质,而不是在没有先前分级的情况下获得的。多个级分中发现了几种蛋白质,但大多数是在一个池中表示(Fig. 1)。因此,二维肽色谱法提供了表示在脊髓中表达的几组蛋白质的有限轮廓。意识到该方法朝着多种色谱步骤通过质谱步骤鉴定的肽的一些内在偏压,我们将努力重点努力识别使用基因本体数据库挖掘计划代表各种生物过程的蛋白质组的变化。
      图缩略图GR1.
      图。1。小鼠脊髓多维液相色谱 - 质谱法鉴定的蛋白质分布。P1 是第一个颗粒部分, P2 是高速颗粒部分,和 S2 is the supernatant.

       蛋白质表达的信息辅助分析 -

      在我们的分析中,使用多步色谱法覆盖偶联至质谱法在单一实验中限制为小于1000蛋白。尽管最近的一项研究提供了在多重LC-MS实验中鉴定了3000多种蛋白质(
      • yu l.r.
      • Conrads T.P.
      • uo t.
      • Kinoshita Y.
      • 莫里森R.S.
      • 卢卡斯D.A.
      • Chan K.C.
      • Blonder J.
      • isaaq h.j.
      • veenstra t.d.
      皮质神经元蛋白质组的全局分析。
      ),这些分析所需的大量色谱步骤使得这些方案对于多个样本分析不切实际。因此,我们从事耦合到信息学的简化定性数据还原方法,以分析来自转基因和正常小鼠的脊髓的LC-MS衍生的蛋白质谱。我们推断蛋白质组成趋势(上或下)的变化可以通过与代表细胞结构或功能的类别相关的蛋白质组最佳揭示。因此,分析的目标是发现群体中的常见趋势,而不是单个蛋白质的最大变化。在这方面,基于此类标准的蛋白质或基因的分类称为基因本体学(GO)(GO)(
      • 刘易斯S.
      • ashburner m.
      • Reese M.G.
      注释真核生物基因组。
      )和数据库已利用此类分类方案(
      • Zeeberg B.R.
      • 冯W.
      • 王G.
      • 王M.D.
      • fojo a.t.
      • 阳光M.
      • Narasimhan S.
      • 凯恩D.W.
      • 重温W.C.
      • Lababidi S.
      • Bussey K.J.
      • riss J.
      • 巴雷特J.C.
      • Weinstein J.N.
      龙头:基因组和蛋白质组学数据的生物学解释资源。
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      • Camon E.
      • Magrane M.
      • 巴克尔D.
      • 李五。
      • 调光e.
      • Maslen J.
      • Binns D.
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      • Lopez R.
      • APWEILER R.
      基因本体注释(GOA)数据库:使用基因本体分享UNIPROT中的知识。
      )。 GO映射在分析基于微阵列的mRNA表达数据(
      • 田L.
      • 格林伯格S.A.
      • 孔子S.W.
      • Altschuler J.
      • Kohane I.S.
      • 公园P.J.
      发现表达型材研究中的统计学显着的途径。
      )但很少有蛋白质分析研究已经利用了分析(
      • Blonder J.
      • Terunuma A.
      • Conrads T.P.
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      高通量质谱法的人表皮浆膜的蛋白质组学特征。
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      血小板蛋白质组学和基因组学的整合:血小板蛋白质和血小板特异性基因的剖面。
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      • Bennett K.
      • PLOPPER G.E.
      使用基因本体研究人间充质干细胞和人骨盆蛋白表达谱。
      ),这些应用没有其中覆盖转基因动物组织的比较研究。因此,这些研究的次要目的是验证用于比较蛋白质组学和基因组数据的GO映射的使用。
      为了研究Go Mapping的效用,通过将MS强度数据归一化鉴定肽的MS强度数据来制备蛋白质组学识别数据集(参见“实验程序”)。通过从表达野生型和突变体SOD1蛋白的转基因SOD1小鼠的所有阳性鉴定来制备基因列表。查询列表是由基于潜在的肽评分(参见“实验程序”)中包含400-540蛋白的单个转基因小鼠数据集。我们利用基因本体计划,甘草,对相关蛋白质的能力,并确定代表生物过程和功能的蛋白质组(表现出高或低丰度)的变化的潜在意义。因为我们用作基于质谱的蛋白质组学中鉴定的所有蛋白质,所以在一个数据集中缺席的那些也包括在分析中,作为“不变”。戈莫纳使用的方法(Fisher两尾精确测试)评估GO类别变化的潜在意义是适用于少数代表的类别以及许多代表性的类别,因为重要因素是基于改变蛋白的比例(无论如何方向)大于随机机会的预期(
      • Zeeberg B.R.
      • 冯W.
      • 王G.
      • 王M.D.
      • fojo a.t.
      • 阳光M.
      • Narasimhan S.
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      • 重温W.C.
      • Lababidi S.
      • Bussey K.J.
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      • 巴雷特J.C.
      • Weinstein J.N.
      龙头:基因组和蛋白质组学数据的生物学解释资源。
      )。因此,具有低的GO类别 p 值含有富集或耗尽的相关蛋白质组。对于我们使用截止的蛋白质数据 p 值小于0.05;在随机分布中出现了类别中的蛋白质的可能性小于5%的几率。重叠的Go组由类别/子类别表示,该类别/子类别表现出单个TG鼠标数据集中最重要的变化。无论如何,我们没有考虑少于三种蛋白质的任何类别 p 由Gominer计算的价值。这些数据总结在 表II III .
      T有能力的 IIWT SOD1 TG小鼠脊髓蛋白质表达的基因本体学分析
      去ID.全部的在下面超过改变了p(在下面)p(超过)类别
      0005739821410240.79920.0221线粒体
      0005740153360.54990.0593线粒体膜
      0046933133360.47710.0406氢转运ATP合酶
      00150782456110.54200.0023氢离子转运蛋白活性
      00426252465110.34290.0495ATP酶活性,耦合到离子运输
      001507558139220.36960.0096离子转运蛋白活动
      003069529120120.03211.0000GTPase调节剂活动
      T有能力的 IIIGO类别,G93A TG转基因小鼠脊髓具有显着变化
      去ID.全部的在下面超过改变了p(在下面)p(超过)类别
      0005739824010500.02480.7152线粒体
      0005740158080.04451.0000线粒体膜
      0016209112570.84800.0259抗氧化活性
      00060063138110.99840.0405葡萄糖新陈代谢
      0006096271780.99990.0234糖酵解
      0030695252350.99840.5915GTPase调节剂活动
      0009966113580.85570.0356调节信号转导
      000486041340.85400.0061蛋白激酶抑制剂活性
      0004672236280.03830.6995蛋白激酶活性
      000016551340.79620.0114Mapkkk Cascade.
      00429811865110.36000.0409调节凋亡
      000741660331.00000.0253Synaptogenesis.
      0005773101450.99200.0180液泡/溶酶体
      在G93A-SOD1转基因小鼠中,在增强的蛋白激酶,抗氧化蛋白质,液泡蛋白和蛋白激酶抑制剂的增强表示中发现显着改变的蛋白质类别(表III)。在线粒体蛋白质,尤其是膜相关物种中发现了较低的相对表达。在WT SOD1转基因小鼠的数据中观察到相反的趋势(表二)。因此,SOD1 TG动物中的共同链接是线粒体,与G93A脊髓中具有低表示的线粒体,与野生型SOD1 TG小鼠脊髓增强的表示相比。在小鼠脊髓数据分析中标记的其他GO类别(视到潜在的显着)可能与在G93A和WT SOD1小鼠中可能未检测到的蛋白质的变化相关。我们将此发现归因于蛋白质组表达数据中的内在变异性。甚至在使用同位素标记方法的样品的定量分析中据报道了这样的结果(
      • 江X.S.
      • 戴J.
      • 盛Q.H.
      • 张L.
      • 夏Q.c.
      • 吴j.r.
      • 曾R.
      亚细胞蛋白质组学研究的比较蛋白质组学策略:ICAT方法与生物信息学预测相结合,以确定大鼠肝线粒体蛋白和过氧化氢酶线粒体定位的指示。
      )。

       线粒体,氧化应激和新陈代谢 -

      显示在G93A TG小鼠脊髓中的表达变化的线粒体蛋白质 表IV.。与G93A-SOD1和WT SOD1小鼠脊髓共同鉴定有限数量的蛋白质,使得G93A-SOD1小鼠中的其他鉴定的蛋白质被列为高或低平均丰度。发现一些蛋白质的相对比的变化与用G93A-SOD1蛋白转染的电动机神经元细胞系的蛋白质组学研究中发现(
      • Fukada K.
      • 张F.
      • Vien A.
      • Cashman N.R.
      • 朱H.
      家族性肌营养侧面硬化剂细胞系模型的线粒体蛋白质组学分析。
      )。这些研究之间的协议支持我们的蛋白质分析方法。在ATP驱动的运输商类别中检查成员,揭示了一些这些蛋白质是线粒体膜结合的ATP合酶亚基(表IV.)。这些在G93A-SOD1小鼠脊髓中呈代。另一方面,G93A-SOD1小鼠线粒体中升高的抗氧化蛋白(表IV.),过氧化毒素5(PRDX5),通过G93A-SOD1小鼠脊髓中的总增强的抗氧化蛋白水平互补。该GO组包括另一个过氧化嗪(PRDX6),小鼠SOD1和谷胱甘肽 S - 转移酶(马来环酰乙酸酯异构酶)。类似地,在含有酶(葡萄糖代谢)如烯醇化酶,磷酸甘油蛋白酶等的另一个GO类别(葡萄糖代谢)中,类似地富含蛋白质碳水化合物代谢酶的变化。总体而言,这些差异与G93A-SOD1小鼠脊髓中的降低降低,耦合到代谢活性的矛盾增加。
      T有能力的 IV转基因小鼠脊髓中线粒体蛋白质的谱
      瑞士 - PROL加入号码瑞士语法ID蛋白质描述G93A / WT SOD1
      Q99798ACO2张贴水痘1.98(2.38)
      a 括号中的表达比来自参考。
      • Fukada K.
      • 张F.
      • Vien A.
      • Cashman N.R.
      • 朱H.
      家族性肌营养侧面硬化剂细胞系模型的线粒体蛋白质组学分析。
      .
      P05063Aldoc_Mouse.aldolase.2.60(2.48)
      a 括号中的表达比来自参考。
      • Fukada K.
      • 张F.
      • Vien A.
      • Cashman N.R.
      • 朱H.
      家族性肌营养侧面硬化剂细胞系模型的线粒体蛋白质组学分析。
      .
      Q9DCX2ATP5H_Mouse.ATP合成酶D链 lolole.
      Q03265ATPA_Mouse.ATP合成酶α链 lolole.
      P10719ATPB_RAT.ATP合成酶β链0.52(0.43)
      a 括号中的表达比来自参考。
      • Fukada K.
      • 张F.
      • Vien A.
      • Cashman N.R.
      • 朱H.
      家族性肌营养侧面硬化剂细胞系模型的线粒体蛋白质组学分析。
      .
      P12787cox5a_mouse.细胞色素 c oxidase subunit 5a0.07(0.28)
      a 括号中的表达比来自参考。
      • Fukada K.
      • 张F.
      • Vien A.
      • Cashman N.R.
      • 朱H.
      家族性肌营养侧面硬化剂细胞系模型的线粒体蛋白质组学分析。
      .
      P19536cox5b_mouse.细胞色素 c oxidase subunit 5b lolole.
      P43024cx6a1_mouse.细胞色素 c oxidase 6a lolole.
      O08749dldh_mouse.二氢乙烯脱氢酶0.21(0.42)
      a 括号中的表达比来自参考。
      • Fukada K.
      • 张F.
      • Vien A.
      • Cashman N.R.
      • 朱H.
      家族性肌营养侧面硬化剂细胞系模型的线粒体蛋白质组学分析。
      .
      P14408fumh_rat.富马酸氢盐 lolole.
      Q9R0Y5kad1_mouse.腺苷酸激酶1高的
      P99029prdx5_mouse.过氧杂志5.高的
      P45880VDAC2电压依赖的阴离子通道0.09(0.65)
      a 括号中的表达比来自参考。
      • Fukada K.
      • 张F.
      • Vien A.
      • Cashman N.R.
      • 朱H.
      家族性肌营养侧面硬化剂细胞系模型的线粒体蛋白质组学分析。
      .
      a 括号中的表达比来自参考。
      • Fukada K.
      • 张F.
      • Vien A.
      • Cashman N.R.
      • 朱H.
      家族性肌营养侧面硬化剂细胞系模型的线粒体蛋白质组学分析。
      .
      虽然有几个报告表明突变体和WT SOD1都进入线粒体(见上文参考文献),但我们的蛋白质组学结果表明突变体SOD1的存在可能影响内膜(ATPases)和基质的组分。因此,我们使用差动洗涤剂萃取方法将脊髓线粒体分离出来自转基因小鼠(WT和G93A-SOD1)(
      • 基拉Y.
      • Sato E.F.
      • in
      Cu,Zn型超氧化物歧化酶与线粒体和过氧化物酶的关系。
      )然后使用LC-MS鉴定组分蛋白质。如图所示 表V. WT SOD1主要与易于萃取的中性洗涤剂级分相关,所述中性洗涤剂级分代表外膜和内膜空间。另一方面,突变体G93A-SOD1分布在所有级分中,并且包括一部分蛋白质,其仅通过变性洗涤剂十二烷基硫酸钠萃取。在相同的级分中也存在HSP70家族的热休克蛋白。然而,注意,细胞质HSP70和线粒体HSP70在与G93A-SOD1相同的级分中发现,而仅在含有WT SOD1的级分中检测到线粒体HSP70。因此,与先前的报道报告具有G93A-SOD1的细胞质HSP70的定位(
      • 好的 ado-Matsumoto A.
      • 弗里维奇I.
      肌营养的外侧硬化:一个提出的机制。
      ),我们发现两个蛋白质都分布在多个线粒体级分中,包括仅通过苛刻的洗涤剂条件可提取的材料。
      T有能力的 VSOD1和热休克蛋白在脊髓线粒体分数中
      相对表达蛋白质
      Digitonin-Soluble.nonidet p-40-可溶SDS-SOLUBLB.
      WT SOD10.211.59Cu,Zn-超氧化物歧化酶
      0.441.27应激 - 70蛋白,线粒体
      G93A-SOD11.050.930.70Cu,Zn-超氧化物歧化酶
      0.481.030.82热休克同源71-KDA蛋白
      1.030.87应激 - 70蛋白,线粒体

       蛋白激酶调节和凋亡 -

      GO分析蛋白质组学数据表明G93A-SOD1小鼠脊髓具有富集蛋白激酶调节活动的富集(表III)。地图激酶激酶激酶类别包括蛋白激酶映射激酶I(ERK1)和蛋白质磷酸酶2a的调节亚基,如过度呈现,但在表达谱中,全球蛋白质激酶存在众所谓。另一方面,两种GO类别含有与MAP激酶和蛋白激酶C(PKC)信号传导相关的富集的激酶调节蛋白。蛋白激酶调节剂包括指向蛋白激酶C(14-3-3蛋白)和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂1B的那些(P27kip1)。该基团中的一种蛋白质也是与MAP激酶相关的磷酸酶(MAPK8IP1)。虽然不是直接蛋白激酶调节剂,S100β,CA2+ - 和Zn.2+ - 粘合蛋白,抑制PKC P53的磷酸化(
      • 林J.
      • 布莱克米
      • 唐c.
      • Zimmer D.
      • Rustandi r.r.
      • 韦伯D.J.
      • 承运人F.
      抑制S100B钙结合蛋白的P53转录活性。
      )。该磷酸化可防止P53寡聚化和促凋亡功能。 S100β主要由胶质细胞表达,可以是神经元的营养或神经毒性因素(
      • van Eldik L.J.
      • Wainwright M.S.
      Janus面对Glial衍生的S100B:大脑中有益和有害的功能。
      )。低水平的S100β是神经营养的,而较高的水平是神经毒性(
      • van Eldik L.J.
      • Wainwright M.S.
      Janus面对Glial衍生的S100B:大脑中有益和有害的功能。
      )。集体这些数据暗示蛋白激酶效应信号传导的变化涉及脊髓中的非尿细胞中的应力响应。虽然之前的报道表明与G93A-SOD1小鼠脊髓相关的PKC活性增加(
      • 胡锦涛。
      • Chernoff K.
      • Pelech S.
      • Krieger C.
      G93A MSOD中枢神经系统蛋白激酶和蛋白质磷酸酶表达在G93a MSOD过度表达小鼠中。
      ),抑制所选PKC底物的磷酸化的蛋白质的相关增加是当前研究中的新发现之一。在另一种GO类别中也发现了两种这些蛋白质(S100β和14-3-3η),调节细胞凋亡。该类别中的过度/下蛋白质组分为G93A小鼠脊髓细胞凋亡的正面和负调节剂之间。该组中的三种潜在重要的蛋白质包括Nogo(神经突抑制剂),细胞凋亡抑制剂MIAP-2和RIP-KINASE2(RIP2)。在TG小鼠模型(G85R-SOD1)和人ALS后疗组织中,观察到各种同种型的差异表达(G85R-SOD1)(
      • Dupuis L.
      • Gonzalez de Aguilar J.L.
      • di scala f.
      • rene f.
      • De Tapia M.
      • PRADAT P.F.
      • Lacomblez L.
      • Seihlan D.
      • Prinjha R.
      • 沃尔斯芬
      • Meininger V.
      • Loeffler J.P.
      Nogo提供了诊断肌营养侧面硬化的分子标记。
      )。细胞凋亡抑制剂MIAP-2是BIR(Baculoviral IAP重复)家族的成员,其与特异性肿瘤坏死因子受体(TNF-R)复合物结合(
      • rothe m.
      • 平底锅。
      • Henzel W.J.
      • Ayres T.M.
      • Goeddel D.v.
      TNFR2-TRAF信号综合体包含两种与凋亡蛋白的杆状病毒抑制剂相关的新型蛋白质。
      )通过NFκB信号传导诱导抗疗法活动(
      • 王C.Y.
      • 梅奥米。
      • Korneluk r.g.
      • Goeddel D.v.
      • Baldwin Jr.,A.。
      NF-κB抗痘病:TRAF1和TRAF2和C-IAP1和C-IAP2诱导抑制CASPASE-8活化。
      )。最后,RIP-Kinase2参与由NFκB活化介导的炎症途径(
      • 麦卡锡J.V.
      • 倪J.
      • Dixit V.M.
      RIP2是一种新型NF-κB活化和细胞死亡诱导激酶。
      )。与IAP蛋白一样,RIP2被募集到信号传导受体复合物,例如TNF-R1(
      • Li L.
      • bin l.h.
      • 李F.
      • 刘Y.
      • 陈德。
      • 翟Z.
      • 舒H.B.
      TRIP6是多NF-κB激活路径的RIP2相关公共信令分量。
      )。 RIP2的过度表达诱导细胞凋亡或增强症Caspase-8介导的细胞死亡(
      • 麦卡锡J.V.
      • 倪J.
      • Dixit V.M.
      RIP2是一种新型NF-κB活化和细胞死亡诱导激酶。
      )。虽然先前在G93A-SOD1小鼠脊髓中报道了促凋亡蛋白的激活(
      • Sathasivam S.
      • Ince P.G.
      • Shaw P.J.
      肌营养侧面硬化症中的细胞凋亡:证据综述。
      ,
      • 嗯。
      • Tsukita K.
      • Iwasato T.
      • 铃木Y.
      • Tomioka M.
      • Tateno M.
      • 纳戈M.
      • Kawata A.
      • 德州
      • Miura M.
      • MISAWA H.
      • Itohara S.
      • Takahashi R.
      Caspase-9在转基因ALS小鼠模型疾病进展中的关键作用。
      ),我们对蛋白质谱的GO分析表明,在凋亡和抗污染途径中有蛋白质的表达改变。

       膜细胞器和GTPase调节蛋白 -

      从目前的研究获得的蛋白质曲线表明某些溶酶体蛋白质富含G93A-SOD1小鼠脊髓(表III)。这些包括溶酶体蛋白酶(组织蛋白酶D),质子泵送ATP酶(ATP6V1H),抗氧化蛋白过氧化嗪6和低密度脂蛋白受体相关蛋白(LPR2_human)。
      在GTPase调节剂类别下,在WT SOD1和G93A转基因小鼠中检测来自该组的一种蛋白质,rab鸟嘌呤核苷酸解离抑制剂,Rabgdi。为了在G93A-SOD1小鼠脊髓中确认该蛋白质的增强表达,与非转基因小鼠相比,我们对来自G93A-SOD1小鼠的组织的可溶性和颗粒部分的蛋白质印迹进行了蛋白质印迹。显示在 Fig. 2 是这些实验的结果。在120天(麻痹阶段)和60天(假设)和60天(假设)与非致死小鼠相比,G93A-SOD1小鼠脊髓中rabgdi在G93A-SOD1小鼠脊髓中均为急剧增加。为了比较,在相同的样品提取物中,我们发现,与60和120天的非转基因小鼠相比,G93A-SOD1小鼠中的Synapsin II在G93A-SOD1小鼠中。
      图缩略图GR2.
      图2。rabgdi和Synapsin II在小鼠脊髓中的表达。 Supernatant (S)和颗粒(P)由G93A-SOD1制备级分(G93A)和非转录(nontg.)从120天获得的小鼠脊髓(A)和60天(B) 老鼠。将25μg蛋白质加载到SDS-PAGE凝胶的每条泳道中,并如“实验程序”下所述呈印刷至PVDF膜。 rabgdi的抗体(剩下)和Synapsin II(正确的)用于探测印迹。 Rabgdi抗体识别α(Mr 55,000) and β (Mr 46,000)rabgdi同种型。分子量标准的位置显示在 剩下.

       G93A-SOD1和WT脊髓mRNA表达的分析 -

      GO分析是少数“OMIC”分析之一,可以在蛋白质和基因表达数据之间提供有意义的比较。我们使用了两组独立的微阵列数据。一个是我们自己的微阵列分析在70-110天的小鼠脊髓mRNA(表VII.),而另一个来自NCBI Geo数据库10周的小鼠脊髓(表VI.)。在两个数据集中,比较具有年龄匹配的非触发鼠标控制。在微阵列数据集之间,在溶酶体蛋白,离子结合蛋白,脂质传输/代谢和选择的转录因子上的数据中心中的重叠。在 表VI.,阳离子结合蛋白质,膜相关的ATP酶,与应激活化的蛋白激酶活性,第二信使信号和基因转录相关的蛋白质也超越。在 表VII. 微阵列数据在疾病进展的后期阶段显示G93A-SOD1小鼠脊髓的变化,并在GO分析中更加“改变”。这些包括脂质代谢,补体激活,溶酶体活性和离子通道活动。在微阵列数据的GO分析中表示的较数蛋白质(基因)为这些选定类别中的潜在蛋白质变化的检测提供了额外的敏感性。在这些类别中蛋白质和微阵列数据的一致性在ATP驱动的铜传输ATP酶(ATP7A / B),磷脂传输ATP酶(ATP11B / 8A2)和真空ATP酶(ATP6V1)中是值得注意的。类似地,类似溶酶体蛋白如组织蛋白酶蛋白酶,富含蛋白质组学和mRNA表达数据(分别的组织蛋白酶D和A)。地图激酶级联的选定成员的变化也在微阵列数据与蛋白质数据(表III)。另一方面,线粒体蛋白质的差异(表IV.)未在任何一项研究中分析微阵列数据。这表明mRNA和蛋白质表达数据之间的这种崩溃与蛋白质周转的变化有关,可能是由于氧化损伤或mRNA翻译的调节。
      T有能力的 VIG93A-SOD1小鼠脊髓基因表达的分析(70天)
      去ID.全部的改变了p value类别
      43169980280.0239阳离子装订
      431671157330.0148离子装订
      55073130.0217铜离子结合
      46914569180.0279过渡金属离子结合
      165635150.003转录活化剂活性
      199326940.0448第二个信使介导的信令
      7155388170.0014细胞粘附
      71541938490.0262细胞交流
      42981194110.0373调节凋亡
      71263740.0055十分病
      513273740.0055M阶段的减数分裂细胞周期
      4709320.0011映射激酶激酶激酶活性
      7257720.0179激活JNK.
      a JNK,C-Jun NH2 - 寿命激酶。
      72542730.0489JNK Cascade.
      55152145920.0003蛋白质结合
      42626105100.0014ATP酶活性,加上物质的运输
      426257160.0217ATP酶活性,耦合到离子运输
      8900420.0054氢:交换钾的ATP酶活性
      a JNK,C-Jun NH2 - 寿命激酶。
      T有能力的 VIIG93A-SOD1小鼠脊髓基因表达的分析(70-110天)
      去ID.全部的改变了p value类别
      161262220.0492甾醇生物合成
      44255326110.0176细胞脂质代谢
      82071720.0305C21 类固醇激素新陈代谢
      66952020.0413胆固醇生物合成
      6693920.0088前列腺新陈代谢
      66902320.0533icOsanoid新陈代谢
      6687310.048糖磷脂代谢
      663112150.0475脂肪酸新陈代谢
      6629393140.005脂质代谢
      46513310.048神经酰胺生物合成
      9247310.048糖脂生物合成
      69582050.0001补充激活,古典途径
      6957910.0001补充激活
      32393110.00001Lytic液泡
      576493110.00001溶酶体
      6882620.0038锌离子稳态
      469834540.006蛋白质二聚化活动
      199012220.0492蛋白质激酶结合
      199002220.0492激酶绑定
      428033440.0022蛋白质同源化活性
      428024840.0076蛋白质自绑定
      19865920.0088免疫球蛋白结合
      55201820.034胰岛素样生长因子结合
      55168850.0143钙调蛋白结合
      55152227470.0306蛋白质结合
      486610650.0293内肽酶抑制剂活性
      48601820.034蛋白激酶抑制剂活性
      5095320.0008磷脂酶A.2 inhibitor activity
      19834420.0015磷脂酶抑制剂活性
      4859153100.0002酶抑制剂活性
      192121920.0376激酶抑制剂活性
      52678340.0463钾沟道活动
      52495640.0129电压门控钾沟道活动
      521624390.0179离子沟道活动
      15268271110.0048α型沟道活动
      15267282110.0064频道或孔隙类运输机活动

      讨论

      蛋白质组学注定要成为对人类神经变性疾病的原因和治愈等人类神经变性疾病,如阿尔茨海默病,帕金森病和ALS的不可或缺的一部分。在当前的工作中,我们已经表明,在转基因小鼠模型中,突变体SOD1基因的表达导致脊髓提取物中检测到的蛋白质曲线的不同变化。这些包括在细胞信号传导和溶酶体功能中参与的线粒体蛋白和蛋白质中的改变。通过使用基于信息学的方法,促进了这些差异的阐明。 GO分析所需的表达比的趋平使得当前研究中获得的半定量数据非常有用,这对于比较方法非常有用。因此,该策略减轻了基于质谱的蛋白质组学的局限性的一个,因为比较基于使用蛋白质组而不是单个蛋白质的特定差异的去分析。
      线粒体蛋白质分布的大多数具体差异与G93A-SOD1小鼠脊髓中观察到的线粒体酶活性的变化一致(
      • j
      • 希金斯下午
      • 徐Z.
      线粒体电子传递链复合功能障碍在肌营养侧面硬化的转基因小鼠模型中。
      ,
      • Mattiazzi M.
      • d'aurelio m.
      • Gajewski C.D.
      • Martushova K.
      • Kiaei M.
      • BEAL M.F.
      • Manfredi G.
      突变的人SOD1导致转基因小鼠线粒体中的氧化磷酸化功能障碍。
      )和人类als(
      • Borthwick上午
      • 约翰逊M.A.
      • Ince P.G.
      • Shaw P.J.
      • turnbull d.m.
      肌营养侧面硬化的线粒体酶活性:对线粒体在神经细胞死亡中的作用的影响。
      )。例如,在SOD1转基因小鼠的脊髓脊髓的其他研究中检测到增加的mRNA水平(
      • 奥尔森M.K.
      • roberds s.l.
      • Ellerbrock B.R.
      • Fleck T.J.
      • McKinley D.K.
      • Gurney M.E.
      SOD1-G93A转基因小鼠脊髓转录分析揭示的疾病机制。
      )在选定的人ALS脊髓组织中(
      • 马拉西娜A.
      • kaushik n。
      • de belleroche J.
      用网格cDNA阵列检测到肌萎缩侧颅骨脊髓中14种基因的差异表达。
      )与我们发现含量增加的过氧恶毒素水平。在NSC34细胞系中差异表达的蛋白质重叠(
      • Fukada K.
      • 张F.
      • Vien A.
      • Cashman N.R.
      • 朱H.
      家族性肌营养侧面硬化剂细胞系模型的线粒体蛋白质组学分析。
      )表达突变体SOD1与我们的研究中的小鼠脊髓相比表明在所选线粒体蛋白的方向(上/下)(表IV.)并且突变体SOD1蛋白的过表达与改变的线粒体组合物相关。 G93A-SOD1和HSP70蛋白质与含有ATP生物合成络合物的线粒体级分的缔合蛋白的关联表明,突变体SOD1的“功能增益”部分是靶向特异性线粒体蛋白。因为转基因小鼠中的疾病发病后来在表达较低水平的G93A-SOD1(
      • 邓H.X.
      • Siddique T.
      转基因小鼠模型和人类神经变性障碍。
      ),可以将突变体SOD1的积累作为疾病进展的促进剂被视为促进剂。
      几种蛋白激酶活性的上调,如蛋白激酶C(
      • 胡锦涛。
      • 张H.
      • Wagey R.
      • Krieger C.
      • Pelech S.L.
      肌萎缩侧面硬化脊髓中蛋白激酶和蛋白质磷酸酶表达。
      )报道(重应激激酶p38)(
      • Tortarolo M.
      • Veglianese P.
      • Calvaresi N.
      • Botturi A.
      • 罗西C.
      • Giorgini A.
      • Migheli A.
      • Bendotti C.
      家族肌萎缩侧硬化症小鼠模型中P38丝裂型活化蛋白激酶的持续激活与疾病进展相关。
      )在SOD1突变小鼠的脊髓中。我们的结果证实了这些发现,并延伸了蛋白激酶介导的信号传导的改变,包括蛋白激酶抑制蛋白的变化和地图激酶家族中的选定应力激活蛋白激酶。
      为了将GO结果放入更大的背景下,我们调查了含有来自小鼠脊髓的最大数量的改变基因的Go类别的映射。该类别,细胞通信,在微阵列数据中具有近2000个基因>G93A-SOD1蛋白质组学数据中的180个蛋白质。 GO分析微阵列和蛋白质组学数据给出了类似的地图。 Fig. 3 描绘小区通信树和从蛋白质组学数据映射的几个分支。 红色方块 在每个节点处表示富含改变基因的GO类别。主要群包括细胞粘附,信号转导和细胞 - 细胞信号传导。在蛋白质组学和微阵列数据集中的一致发现是,在细胞 - 细胞信号传导分支中,神经递质分泌基团的改变蛋白/基因的收敛性(Fig. 3 )。
      图缩略图GR3.
      图3。GO类别中蛋白质表达变化的映射。绿线 说明了用于信号转导和G蛋白调节的连接途径。蛋白质表达和mRNA表达的富集类别包括细胞 - 细胞通信,细胞粘附,神经递质分泌和信号转导类别如图所示 实心箭头。在这一点 剩下 是一个单独的标题,显示仅在蛋白质表达数据的GO分析中发现的独特富集类别。这些包括线粒体ATP酶(ATP生物合成)和三羧酸循环中的酶。
      例如,我们发现在末期(120天)和假设小鼠(60天)的G93A-SOD1小鼠脊髓中,Sysapapin II水平低至(60天)(Fig. 2)。 Synapsin II是一种突触囊泡相关蛋白,其用于直接靶向和分期的神经递质,其携带神经递质,例如谷氨酸,γ-氨基丁酸和乙酰胆碱(
      • Rosahl T.W.
      • Spillane D.
      • Missler M.
      • 赫兹J.
      • Selig D.K.
      • Wolff J.R.
      • 锤子r.e.
      • Malenka R.C.
      • SUDHOF T.C.
      突触囊泡监管中Synapsins I和II的基本功能。
      )。两组微阵列数据表现出CA所必需的Synaptagmins(Syt1和Syt4)的表达减少2+ - 依赖突触囊泡融合(
      • koh t.w.
      • 贝伦H.J.
      Synaptotagmin I,CA2+ 用于神经递质释放的传感器。
      ,
      • SUDHOF T.C.
      Synaptotagmins:为什么这么多?
      )。从文献中,改变突触囊泡蛋白的唯一其他指示来自来自ALS受试者的前角的后胚胎免疫化学分析(
      • Ikemoto A.
      • Nakamura S.
      • Akiguchi I.
      • Hirano A.
      肌萎缩横向硬化的突触囊泡蛋白与突触蛋白膜蛋白蛋白蛋白的差异表达。
      )。在该研究中,与对照相比,在ALS组织中观察到Synapsin和Sypaptophysin的免疫反应性的改变分布(
      • Ikemoto A.
      • Nakamura S.
      • Akiguchi I.
      • Hirano A.
      肌萎缩横向硬化的突触囊泡蛋白与突触蛋白膜蛋白蛋白蛋白的差异表达。
      )。这些数据表明,突触囊泡相关蛋白的缺陷可以是直接影响神经递质的分泌的运动神经元功能障碍的早期指标之一。
      互联蛋白酶地图显示了SOD1对其他细胞过程潜在影响的另一个表示(Fig. 4)。该地图上的大多数分支节点代表SOD1对泛素连接酶的直接或相互作用作用(
      • Niwa J.
      • Ishigaki S.
      • Hishikawa N.
      • Yamamoto M.
      • 多宇M.
      • 村田村
      • Tanaka K.
      • Taniguchi N.
      • Sobue G.
      Dorfin Ubiquitylates突变体SOD1并防止突变体SOD1介导的神经毒性。
      ),钙磷素的氧化抑制(
      • Volkel H.
      • Scholz M.
      • 链接J.
      • Selzle M.
      • Werner P.
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      图缩略图GR4.
      图4。Cu,Zn-超氧化物歧化酶的蛋白酶型图。 表明初级相互作用(SOD1的直接和间接点(铜伴侣,P53,睫状体神经营养因子(CNTF.), 等等。)。注意,许多这些相互作用只涉及突变体SOD1而不是WT SOD1。从主要点延伸的分支显示出与这些物种直接或间接相互作用的其他基因。来自当前研究结果的突变体SOD1的新节点以受影响的细胞系统(如神经递质调节和线粒体ATP)的名称显示(来自) )。
      总之,使用更高水平的基因本体分析的蛋白质组学和基因组数据的整合允许划定ALS的小鼠模型中的常见和独特的疾病途径及其与人类疾病的相关性。

      致谢

      我们感谢Eric G. Bremer博士(儿童纪念教育和研究所,芝加哥,IL)用于使用微阵列芯片处理和扫描仪器。

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