肽结合域的结合性能表征的高效率策略* s

  • 伊利松
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    中国医学科学院基础医学研究所医学科学研究中心蛋白质组学研究中心,中国医学科学研究所/北京工会医学院,100005
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  • 萧轩高
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    中国医学科学院基础医学研究所医学科学研究中心蛋白质组学研究中心,中国医学科学研究所/北京工会医学院,100005
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  • 瑞田
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    中国医学科学院基础医学研究所医学科学研究中心蛋白质组学研究中心,中国医学科学研究所/北京工会医学院,100005
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  • Sucan Ma.
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    中国医学科学院基础医学研究所医学科学研究中心蛋白质组学研究中心,中国医学科学研究所/北京工会医学院,100005
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  • Huanging Huang.
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    中国医学科学院基础医学研究所医学科学研究中心蛋白质组学研究中心,中国医学科学研究所/北京工会医学院,100005
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  • 嘉艳郭
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    中国医学科学院基础医学研究所医学科学研究中心蛋白质组学研究中心,中国医学科学研究所/北京工会医学院,100005
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  • yingna li.
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    中国医学科学院基础医学研究所医学科学研究中心蛋白质组学研究中心,中国医学科学研究所/北京工会医学院,100005
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  • 凌张
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    中国医学科学院基础医学研究所医学科学研究中心蛋白质组学研究中心,中国医学科学研究所/北京工会医学院,100005
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  • youhe gao.
    一致
    应解决对应的通信:Inst。中国医学科学院基础医学科学/北京工会医学院,5号董丹寺,100005北京。电话:86-10-6529-6407;传真:86-10-6521-2284;
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    中国医学科学院基础医学研究所医学科学研究中心蛋白质组学研究中心,中国医学科学研究所/北京工会医学院,100005
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  • 作者脚注
    *本工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会拨款30270657,30230150和3037030。本文的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
    是本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)含有补充材料。
    ‡ 这些作者同等贡献这项工作。
      大部分蛋白质 - 蛋白质相互作用由肽结合结构域的家族介导。这些域中的每个域的综合表征对于了解域水平的蛋白质相互作用的机制和网络至关重要。但是,现有方法都是基于每个域的大规模筛查,这些域是效率低效的,以处理主要域家庭中的数百个成员。我们使用酵母双杂交配合阵列基于高通量验证筛选专用候选配体文库的高通量验证筛选的肽结合结构域的高效结合结构表来进行系统策略。其出色的特点是,与传统筛查相比,整体效率显着提高,并且它将更高的系统周期。 PDZ域名家庭首先用于测试策略。五个PDZ结构域迅速表现出来。与其他方法相比,确定了更广泛的结合性质,包括新颖的识别特异性,为常规PDZ分类的主要修订提供了基础。发现了几种新的相互作用,用作进一步的功能调查的重要线索。该策略可以很容易地扩展到各种肽结合结构域作为蛋白质组学规模中域结合性的综合分析。
      大量比例的蛋白质 - 蛋白质相互作用由蛋白质相互作用域的家族介导,所述蛋白质相互作用域的介导,所述蛋白质相互作用域在其结合伴侣中识别短肽基序,例如PDZ,SH3,WW,GYF等(
      • Pawson T.
      • 纳什P.
      通过蛋白质相互作用域组装细胞调节系统。
      )。这些肽结合结构域涉及各种功能,例如亚细胞定位,酶活性,调节蛋白的底物特异性,以及多律蛋白复合物的组装(
      • Gmeiner W.H.
      • 霍丽塔D.A.
      SH3结构域结构与动力学对蛋白质调节和药物设计的影响。
      ,
      • Kofler M.
      • Motzny K.
      • 弗鲁德·
      GYF域蛋白质组学揭示了已知和新型靶蛋白的相互作用位点。
      )。综合研究每种肽结合域家族的结合性质对于了解域水平的蛋白质相互作用的机制和网络至关重要(
      • 邓硕
      • Mehta S.
      • 太阳F.
      • 陈T.
      推断从蛋白质 - 蛋白质相互作用的结构域域相互作用。
      ,
      • Landgraf C.
      • Panni S.
      • MonteCchi-Palazzi L.
      • Castagnoli L.
      • Schneider-mergener J.
      • Volkmer-engert R.
      • Cesareni G.
      蛋白质组肽扫描蛋白质相互作用网络。
      )。
      几种强大的方法,包括取向肽库,点合成,噬菌体展示和酵母双杂交(Y2H)
      使用的缩写是:Y2H,酵母双杂交;广告,激活域; BD,绑定域; HPRD,人蛋白参考数据库; ONPG, o - 硝基苯β-d - 甲酰基吡喃糖苷; RPY2H,随机肽库的酵母双杂交筛选;斑点合成,纤维素膜对肽的合成; SD,合成葡萄糖; nr,非冗余; MAPK,丝裂剂激活蛋白激酶; SH,SRC同源性。
      1使用的缩写是:Y2H,酵母双杂交;广告,激活域; BD,绑定域; HPRD,人蛋白参考数据库; ONPG, o - 硝基苯β-d - 甲酰基吡喃糖苷; RPY2H,随机肽库的酵母双杂交筛选;斑点合成,纤维素膜对肽的合成; SD,合成葡萄糖; nr,非冗余; MAPK,丝裂剂激活蛋白激酶; SH,SRC同源性。
      方法已成功用于表征个体域家族的肽识别特异性。导向的肽库方法是初步涉及域共有结合序列的调查(
      • Marengere L.E.
      • 松阳Z.
      • GISH G.D.
      • Schaller M.D.
      • 帕森斯J.T.
      • 斯特恩M.J.
      • 坎特利L.C.
      • Pawson T.
      SH2域特异性和活性由单个残基改性。
      ,
      • 松阳Z.
      • 扇动A.S.
      • 傅C.
      • 徐J.
      • 马法蒂亚三
      • chishti a.h.
      • 克朗佩顿A.
      • Chan A.C.
      • 安德森金。
      • 坎特利L.C.
      独特的PDZ结构域对独特的羧基末端图识别。
      )。将目的领域固定并用可溶性取向肽孵育,并且吸附的肽被测序为混合物以以统计方式解作着共有共分基序。该方法是强大的,用于揭示在给定位置的某些氨基酸的域的偏好;然而,它既不确定是否禁止在特定位置禁止某些残留物也不禁止结合肽的实际序列(
      • Marengere L.E.
      • 松阳Z.
      • GISH G.D.
      • Schaller M.D.
      • 帕森斯J.T.
      • 斯特恩M.J.
      • 坎特利L.C.
      • Pawson T.
      SH2域特异性和活性由单个残基改性。
      ,
      • 松阳Z.
      • 扇动A.S.
      • 傅C.
      • 徐J.
      • 马法蒂亚三
      • chishti a.h.
      • 克朗佩顿A.
      • Chan A.C.
      • 安德森金。
      • 坎特利L.C.
      独特的PDZ结构域对独特的羧基末端图识别。
      )。作为一种替代策略,导向的肽阵列库集成了面向肽库和阵列技术(
      • Rodriguez M.
      • 李斯。
      • 哈珀J.W.
      • 松阳Z.
      一种取向肽阵列库(蛋白石)策略,用于研究蛋白质 - 蛋白质相互作用。
      )。在固体载体上合成了数百个单独的池,它们由取向的肽文库组成,并且每个位置的优选氨基酸直接从阵列的情况下读取而没有蛋白质测序。该方法的缺点是在游泳池中分析结合肽,使得不可能获得实际肽的实际序列和定量比较定义的肽的亲和力。斑点合成基于纤维素膜的化学合成,以及这些肽与感兴趣区域的与这些肽的结合的独立试验(
      • 弗兰克拉
      现场合成技术。膜上的合成肽阵列支撑原理和应用。
      )。在这种方法中,可以直接获得实际结合序列,但是由于合成序列取决于依赖性,因此不会检测到意外的序列 先验 信息,并且吞吐量受肽数量的限制,这些肽可以在逼真的尺寸合理尺寸的膜上合成(~104 peptides) (
      • Boisguerin P.
      • 林根罗
      • AY B.
      • Radziwill G.
      • Moelling K.
      • 董兰
      • Volkmer-engert R.
      用游离C Termini合成纤维素膜结合肽的改进方法可用于PDZ结构域结合研究。
      ,
      • Weiser A.A.
      • 或 - 桂米
      • Tapia V.
      • 莱希森林A.
      • Schuchhardt J.
      • frommel C.
      • Volkmer-engert R.
      斑点合成:阵列基于肽结合亲和力的可靠性。
      )。噬菌体显示是一种高吞吐量方法,其中包括10个库9–1010 可以显示和筛选随机肽(
      • Landgraf C.
      • Panni S.
      • MonteCchi-Palazzi L.
      • Castagnoli L.
      • Schneider-mergener J.
      • Volkmer-engert R.
      • Cesareni G.
      蛋白质组肽扫描蛋白质相互作用网络。
      ,
      • 斯科特J.K.
      • 史密斯G.P.
      搜索具有表位库的肽配体。
      )。高亲和力配体可以比低亲和力更有效地识别(
      • vaccaro p.
      • 布兰特迪B.
      • MonteCchi-Palazzi L.
      • 菲利普斯。
      • Helmer Citterich M.
      • Cesareni G.
      • 牙齿L.
      inadl的多个PDZ结构域的不同结合特异性,一种具有同源性的人蛋白 果蝇黑胶基.
      )。所有上述方法都是 体外 并且需要纯化的蛋白质以及人工条件以温育和洗脱。作为A. 体内 方法,Y2H测定以高吞吐量的方式广泛使用,以找到感兴趣的域的配体(
      • NA. kayama M.
      • Kikuno R.
      • Ohara O.
      蛋白质 - 蛋白质 - 在大蛋白质之间的相互作用:使用由长CDNA组成的功能分类文库的双杂化筛选。
      ,
      • 有害J.F.
      • Venkatesan K.
      • 郝T.
      • Hirozane-Kishikawa T.
      • Dricot A.
      • 李恩
      • Berriz G.F.
      • 吉布斯F.D.
      • 德莱兹M.
      • Ayivi-Guedehoussou N.
      • Klitgord N.
      • 西蒙C.
      • Boxem M.
      • Milstein S.
      • 罗森伯格J.
      • 戈德伯格D.S.
      • 张L.V.
      • Wong S.L.
      • 富兰克林G.
      • 李S.
      • 阿尔巴拉J.s.
      • LIM J.
      • Fraughton C.
      • 骆驼类E.
      • Cevik S.
      • Bex C.
      • Lamesch P.
      • Sikorski R.S.
      • Vandenhaute J.
      • Zoghbi H.Y.
      • Smolyar A.
      • 博萨克斯。
      • Semerra R.
      • Doucette-STAMM L.
      • Cusick M.E.
      • 山D.E.
      • 罗斯f.p.
      • vidal m.
      朝向人蛋白蛋白质相互作用网络的蛋白质组织级映射。
      ,
      • Stelzl U.
      • 蠕虫U.
      • Lalowski M.
      • Haenig C.
      • Brembeck F.H.
      • Goehler H.
      • Stroedicke M.
      • Zenkner M.
      • Schoenherr A.
      • Koeppen S.
      • TIMM J.
      • Mintzlaff S.
      • 亚伯拉罕C.
      • 博克恩。
      • Kietzmann S.
      • Goedde A.
      • Toksoz E.
      • 脱胶A.
      • Krobitsch S.
      • Korn B.
      • Birchmeier W.
      • Lehrach H.
      • Wanker E.E.
      人蛋白 - 蛋白质相互作用网络:用于注释蛋白质组的资源。
      )。优点是可以避免亲和力竞争,可以捕获瞬态相互作用,并且可以隔离实际结合序列(
      • NA. kayama M.
      • Kikuno R.
      • Ohara O.
      蛋白质 - 蛋白质 - 在大蛋白质之间的相互作用:使用由长CDNA组成的功能分类文库的双杂化筛选。
      ,
      • 有害J.F.
      • Venkatesan K.
      • 郝T.
      • Hirozane-Kishikawa T.
      • Dricot A.
      • 李恩
      • Berriz G.F.
      • 吉布斯F.D.
      • 德莱兹M.
      • Ayivi-Guedehoussou N.
      • Klitgord N.
      • 西蒙C.
      • Boxem M.
      • Milstein S.
      • 罗森伯格J.
      • 戈德伯格D.S.
      • 张L.V.
      • Wong S.L.
      • 富兰克林G.
      • 李S.
      • 阿尔巴拉J.s.
      • LIM J.
      • Fraughton C.
      • 骆驼类E.
      • Cevik S.
      • Bex C.
      • Lamesch P.
      • Sikorski R.S.
      • Vandenhaute J.
      • Zoghbi H.Y.
      • Smolyar A.
      • 博萨克斯。
      • Semerra R.
      • Doucette-STAMM L.
      • Cusick M.E.
      • 山D.E.
      • 罗斯f.p.
      • vidal m.
      朝向人蛋白蛋白质相互作用网络的蛋白质组织级映射。
      ,
      • Stelzl U.
      • 蠕虫U.
      • Lalowski M.
      • Haenig C.
      • Brembeck F.H.
      • Goehler H.
      • Stroedicke M.
      • Zenkner M.
      • Schoenherr A.
      • Koeppen S.
      • TIMM J.
      • Mintzlaff S.
      • 亚伯拉罕C.
      • 博克恩。
      • Kietzmann S.
      • Goedde A.
      • Toksoz E.
      • 脱胶A.
      • Krobitsch S.
      • Korn B.
      • Birchmeier W.
      • Lehrach H.
      • Wanker E.E.
      人蛋白 - 蛋白质相互作用网络:用于注释蛋白质组的资源。
      )。然而,传统上CDNA文库在Y2H测定中被筛选,结果低丰度配体容易被高丰度配体淹没(
      • Titz B.
      • Schlesner M.
      • Uetz P.
      我们从高吞吐量蛋白质交互数据中学到什么?
      )。为了综合分析某个域的结合特性,必须重复筛选多个库。或者,随机肽库允许在一轮筛选中鉴定特定的肽以推导在一轮筛选中的共有结合序列(
      • 杨米
      • 吴Z.
      • 领域S.
      用酵母双杂交系统分析蛋白质肽相互作用。
      )。
      然而,这些方法都基于每个诱饵领域的大规模筛查,这些诱饵域具有相对劳动密集型和耗时的耗时。人类蛋白质组中的每一个主要领域家庭(Smart.embl-heidelberg.de/)预测了数百个域,使得为域家族的每个成员做出大量大规模筛选。来自由高度多元化候选配体组成的特殊文库的优选配体的直接验证可以显着提高整体效率。在大多数域家庭中,一个域可以绑定许多配体(
      • Pawson T.
      • 纳什P.
      通过蛋白质相互作用域组装细胞调节系统。
      )并且可以通过多个域识别一个配体(
      • lim i.a.
      • 大厅D.D.
      • 地狱J.W.
      PSD-95和Synapse相关蛋白质102的第一和第二PDZ结构域的选择性和滥交。
      ,
      • Rousset R.
      • 法尔德斯。
      • Desbois C.
      • BANTIGNIES F.
      • jalinot p.
      HTLV-1税癌蛋白的C-末端介导与细胞蛋白的PDZ结构域的相互作用。
      )。在给定的域系列中,由一些域成员选择的配体更可能与不相关的随机序列结合其他成员。为了更有效地表征肽结合结构域的结合特性,在这里,我们在使用酵母双混合配合阵列的基础上基于高通量验证筛选的专业候选配体文库的系统策略。该文库主要通过收集从所选结构域家族的代表性成员的随机肽文库(RPY2HS)的酵母双杂交筛分分离的配体克隆。
      我们首先专注于一种特定类型的肽结合域,PDZ(以后命名 PSD-95 / SAP90, Dlg,and. ZO-1)域,并用它作为解释和评估策略的示例。 PDZ结构域是最丰富的蛋白质相互作用模块之一,并且参与各种重要的细胞功能,例如蛋白质细胞内的细胞,神经递质转运蛋白的调节,以及多滴素复合物的形成(
      • 果仁果冻F.
      • oleksy A.
      • Smietana K.
      • Otlewski J.
      PDZ. 领域 - 小区信令中的常见球员。
      ,
      • Schlieker C.
      • MOGK A.
      • Bukau B.
      用于蜂窝应激响应的PDZ开关。
      )。通常,PDZ结构域专门用于结合其靶蛋白的极端羧基末端(
      • 松阳Z.
      • 扇动A.S.
      • 傅C.
      • 徐J.
      • 马法蒂亚三
      • chishti a.h.
      • 克朗佩顿A.
      • Chan A.C.
      • 安德森金。
      • 坎特利L.C.
      独特的PDZ结构域对独特的羧基末端图识别。
      ,
      • 金E.
      • 盛M.
      突触的PDZ结构域蛋白。
      )。基于最后四个残留物,PDZ结合基序已经分组成于四个类:I类, - (S / T)Xφ*; II类,-ΦXΦ*; III类, - (D / E / K / R)Xφ*;和第四级, - Xψ(d / e)*在哪里 X 是任何氨基酸,φ是疏水残余物,ψ是芳族残基,并且*表示肽序列的止核密码子(
      • 果仁果冻F.
      • oleksy A.
      • Smietana K.
      • Otlewski J.
      PDZ. 领域 - 小区信令中的常见球员。
      )。一些PDZ域可以通过其他交互模式创建进一步的功能多样性,例如PDZ-PDZ域的二聚体(
      • 我是y.j.
      • 李约翰。
      • 公园S.H.
      • 公园S.J.
      • rho s.h.
      • 康G.B.
      • 金E.
      • Eom S.H.
      Shank PDZ-LigAnd复合物的晶体结构揭示了I类PDZ相互作用和新型PDZ-PDZ二聚化。
      ,
      • 纽尔里C.
      • 格兰特S.G.
      • Borg J.P.
      PDZ. 域蛋白:即插即用!
      )和识别内部序列(
      • Penkert r.r.
      • Divittorio H.M.
      • Prehoda K.E.
      通过PDZ结构域可塑性在PAR-6-PALS1复合物中进行内部识别。
      ,
      • 黄H.C.
      • Bourdelas A.
      • Krauss A.
      • 李H.J.
      • 邵y
      • 吴D.
      • Mlodzik M.
      • shi d.l.
      • 郑杰。
      PDZ. 结构域的直接结合在Frizzled的C末端区域中缠绕在保守的内序列中。
      )。

      材料和方法

       诱饵质粒的制备 -

      酵母双杂交诱饵质粒,人ZO-1 PDZ1-PMBA(瑞士 - PROL登录号 Q07157,氨基酸1-105)和PDZ3-PMBA(Swiss-Prel登录号 Q07157,氨基酸401-500)质粒,由Ben Giepmans博士(荷兰癌症学院)友好提供。 ERBIN PDZ域的cDNA(瑞士 - PROL登录号 Q96RT1,通过PCR与Sense Primer5'-GaattcggcatgaactggcaaAcaAG-3'和反义引物5'-GaattctgagGaAacttcGTAC-3'通过PCR扩增氨基酸1273-1371)。来自人T细胞cDNA文库。用EcoRI消化了PCR产物,并克隆到携带的Gal4 BD载体的EcoRI位点,携带 Trp1 作为选择标记。 HTRA2 PDZ域的cDNA(瑞士 - PROL登录号 O43464,氨基酸343-454)通过PCR从人骨髓cDNA文库中获得有义底漆5'-CGCGGATCATCGTGGGGAAAAGAAGATT-3'和反义底漆5'-GGCGGATCAGGGGTCACATATAAGGTCAG-3'。用BamHI消化PCR产物并将其连接到佩尔桥的BamHI位点。 LNX1 PDZ2结构域的cDNA(瑞士 - PROL登录号 Q8TBB1,通过PCR用Sense Primer 5'-CcggaattCgatgtgcctacagacccccGagat-3'和反义引物5'-CGCGGATCCG-3'用Image 5164034克隆(Invitrogen)作为模板来扩增氨基酸371-473。用EcoRI和BamHI消化PCR产物并克隆到Gal 4 BD载体中,PAS2-1携带 Trp1 作为选择标记。通过DNA测序确认所有构建的诱饵质粒。

       Y2H随机肽库的构建与表征 -

      通过基于我们先前描述的方法的改进方法构建高分集随机肽库(
      • 黄鹤
      • 高雅。
      使用基因组DNA产生任意肽文库的方法。
      )。我们选择PGADT7,携带选择标记 Leu2,作为Gal4广告矢量。我们修改了它的阅读框架如下。 1)修饰BamHI位点的阅读框。通过EcoRI消化质粒pGAdt7,并且由5'-末端的四个突出的核苷酸由T4 DNA聚合酶组成或由Munc Bean核酸酶切割,然后通过T4 DNA连接酶连接两个钝端。两个新的GAL4 AD载体,PGADT7(+ B),其中BAMHI位点的读数框架移位一个核苷酸倒退和PGADT7(-B),其中BAMHI位点的读数框架向前移动,得到一个核苷酸。 2)修改了EcoRI的阅读框。合成寡核苷酸5'-aattaAgcttggg-3'和5'-aattaAgctg-3'和每个反义链。通过退火寡核苷酸及其各自的反义链的双链DNA片段,然后单独地亚克隆到PGADT7的EcoRI位点。另外两个新的Gal4 Ad载体PGADT7(+ e),其中EcoRI位点的读数框架移位了一个核苷酸倒退和PGAdt7(-e),其中EcoRI位点中的读数框架被向前移位一个核苷酸。
      通过TSP509I消化人类基因组DNA过夜,在65℃下消化过夜,分别将片段克隆到PGAdT7(+ E)和PGAdT7(-E)的EcoRI位点。将人基因组DNA在37℃下通过DPNII消化5小时,分别将片段克隆到PGAdt7(+ B)和PGAdT7(-B)的BamHI位点。与烟草基因组DNA相同的方法,其额外克隆到原始的PGADT7载体中。将构建的文库质粒转化为 大肠杆菌 DH10B和转化克隆的数量在扩增之前估计。最后我们获得了10个图书馆(补充表1)。对于文库的表征,从每个文库中随机选择几个单个克隆,通过PCR和限制酶消化分析插入的片段。通过合并所有10个文库获得最终的随机肽文库。

       Y2H筛选随机肽库 -

      使用乙酸锂方案将GAL4 BD-PDZ融合诱饵质粒转化到酵母菌菌株CG1945中。转化体在SD / -TRP平板上生长,并在SD / -HIS-TRP板上进行分析,用于自激活估计。选择随后的筛选选择没有背景生长或具有背景生长但是可以被3-氨基-1,2,4-三唑抑制的转化体进行抑制,并且对LacZ测定的阴性也是阴性的。在匹配制造者双混合系统协议(CLONTECH)之后筛选随机肽库。近似10.7 TRP + Leu + 在初级筛选中用SD / -HIS / -LEU / -TRP培养基选择转化体,然后通过改进的LACZ测定在第二筛选中进行测试。抢救后,分离潜在的阳性质粒并重新变成含有相应的诱饵质粒的酵母菌菌株CG1945。仅选定所有报告分析和至少两个独立测试的阳性阳性的克隆用于特异性相互作用并测序。

       半定位结合测定 -

      使用液体培养β-半乳糖苷酶测定法测定阳性克隆和相应的PDZ诱饵之间的相互作用的半定位结合亲和力作为β-半乳糖苷酶测定 o - 硝基苯β-d - 甲酰基吡喃糖苷(ONPG)作为底物。测定方案和β-半乳糖苷酶单位的计算基于来自Clontech的“Matchmaker随机肽库用户手册”。简言之,在适当的选择培养基中的酵母培养过夜,并 A600 被记录。将500μl培养物中的细胞重悬于100μlZ缓冲液中并在液氮中冷冻。然后加入700μLZ缓冲液加0.27%β-巯基乙醇和160μLONPG(Z缓冲液中4mg / ml)。通过加入0.4ml 1终止反应1 m Na2 CO. 3 直到发育黄色。孵化时间和 A420 被记录了。结果表示为米勒单元:β-半乳糖苷酶单位= 1000× A420 /( A600× T (孵化时间在min)× V (M1中的细胞培养量))。为了减少可变性,测定三种单独的转化体,各项一式三份。值表示平均值±S.D. β-半乳糖苷酶单位。结果分析了SPSS11.0的统计软件。

        PDZ. 配体图书馆的构建和高通量酵母交配阵列 -

      通过单独引入从RPY2HS分离的所有非冗余阳性质粒,所有GAL4 AD-PDZ融合质粒和其他质粒(如“讨论”)中的所有非冗余阳性质粒单独引入酵母菌株Y187(如下所述)构建PDZ配体文库。α)。将库酵母克隆储存在-80℃。感兴趣的PDZ诱饵被引入酵母菌株CG1945(一种)。用于相互作用交配阵列,图书馆的10μL液体培养物 将α酵母菌株合并在96孔板中,生长,与诱饵60μL液体培养物混合 酵母菌株。将配合混合物转移到酵母蛋白葡萄糖琼脂平板上,并在30℃下温育32小时。配合后,用SD / -LEU / -TRP选择性琼脂培养物从平板挑选到96孔板上,用SD / -HIS / -LEU /用SD / -LEU / -TRP选择性琼脂培养基转移到96孔板上。 TRP选择性琼脂培养基随后检查阳性相互作用。在30℃温育3-7天后,选择用于进一步LacZ测定的克隆阳性生长阳性。

       分析候选配体的共有结合序列和预测 -

      对于每种PDZ,从阳性克隆的序列比对中推导出共有结合序列和对阳性和阴性序列的比较分析。尾随软件(
      • 黄苗。
      • 张L.
      • 崔Q.H.
      • 江塔兹。
      • 马斯科。
      • 高雅..
      一个Java程序,通过尾部找到PDZ域的潜在配体。
      )用于搜索瑞士 - Prot数据库或NR人类数据库以检索羧基末端与共有粘合序列相匹配的潜在配体蛋白。通过使用BioWorks 3.1 SR1(Thermo Finnigan,San Jose,CA)从NR数据库中的单蛋白组成,在他们的描述中由关键词“人体”的蛋白质组成。使用亚细胞定位和已知功能的生物学信息手动选择最有前途的候选配体蛋白。

       确认候选PDZ相互作用 -

      首先构建表达ZO-1 PDZ1候选配体的羧基末端10氨基酸残基的Gal4 Ad质粒。在一个实例中,对于克劳德蛋白-17的构建,合成了寡核苷酸5'-aattcatgtagtctctaAg-3'和5'-gatccttagacatactggtggaggttacttaagcatg-3'。通过T4多核苷酸激酶磷酸化两种片段并在室温下退火。将所得双链DNA的片段克隆到GAL4 AD载体PGADT7的ECORI / BamHI位点,然后进行DNA测序。将每个构建的质粒与ZO-1PDZ1诱饵质粒分别分别用ZO-1PDZ1诱饵质粒转化为酵母菌菌株CG1945。如上所述在酵母双杂交筛选中选择阳性相互作用。使用厄卜林PDZ,HTRA2PDZ和LNX1 PDZ2的候选配体使用相同的程序。 ZO-1 PDZ3的方法略有不同:克隆了编码每个候选配体的羧基末端16氨基酸残基的寡核苷酸。

       分析新型蛋白质 - 蛋白质相互作用 -

      从人蛋白质参考数据库(HPRD)获得人蛋白蛋白质相互作用参考数据集(www.hprd.org.,905年9月13日)。最短的路径长度与TOPNET进行(
      • yu h.
      • 朱克。
      • Greenbaum D.
      • 卡罗J.
      • Gerstein M.
      TOPNET:用于比较生物亚网络的工具,将蛋白质特性与拓扑统计相关。
      )。使用Osprey网络可视化系统可视化网络(参考手册,版本1.2.0)(
      • Breitkreutz B.J.
      • 斯塔克C.
      • 泰尔斯米
      osprey:网络可视化系统。
      )。

      结果

        PDZ. 域系列结合特征的高效率策略

      新开发的策略涉及以下七个步骤,如图所示 图。1A。步骤1是RPY2H。具有代表性PDZ结构域的单个RPY2HS作为诱饵进行分离一系列阳性PDZ结合克隆(a)。步骤2是配体库的结构。主要通过收集来自所有RPY2HS和所有PDZ域克隆(PDZ域克隆)分离的所有PDZ结合克隆构建了专用的PDZ配体图书馆。 b)除了添加已知的或潜在的PDZ结合克隆,例如PDZ配体蛋白的cDNA克隆和潜在的PDZ结合肽的合成克隆(l)。步骤3是验证筛选。通过使用高吞吐量Y2H交配阵列通过验证PDZ配体库的验证筛选PDZ域(c)。直接从阵列中读取正面和阴性结合序列(d)。第4步是 补充rpy2h.。某些没有与配体库中与足够数量的配体相互作用的PDZ结构域用作诱饵 德诺维 以传统方式rpy2hs。将所选克隆加入到PDZ配体文库中,以增加其随后对具有相似偏好的PDZ结构域的分量。步骤5是结合特性的表征。每种PDZ的精确结合性质的特征在于,通过从RPY2H和/或验证筛选中分离的阳性和阴性序列的比较分析(fg)。步骤6是候选配体蛋白的预测。蛋白质数据库搜索预测候选配体蛋白,其共有结合序列,然后用生物学信息进行手动过滤,例如亚细胞定位和已知功能(h)。步骤7是潜在的相互作用的确认。表达预测候选PDZ配体蛋白的羧基末端的克隆通过合成寡核苷酸和用相应的PDZ诱饵在一对一的Y 2 H测定中与相应的PDZ诱饵进行单独构建以确认相互作用(ik)。然后将合成的克隆加入到PDZ配体文库中(j )。
      图缩略图GR1A.
      图。1。肽结合结构域的结合特征高效率策略。A,策略的方案,重点在PDZ域作为一个例子。 a,具有代表性PDZ结构域的RPY2HS分离阳性PDZ结合克隆。 b,候选配体库的构建主要是通过收集来自RPY2HS和所有PDZ域克隆分离的所有PDZ结合克隆。 c用高通量酵母双杂交配合阵列研究PDZ配体文库的验证筛选PDZ结构域。 d,通过直接从阵列读取鉴定正面和阴性结合序列。 e, 。对于某些PDZ结构域,如果出现足够的正序列被隔离用于表征结合特性,则使用RPY2H来选择阳性克隆。将这些克隆添加到PDZ配体库中,以增加其随后对具有相似偏好的PDZ结构域的分量。 f,鉴定共有结合序列。 g,对阳性序列和阴性序列的比较分析表征结合特性。 h,用蛋白质数据库进行候选配体预测蛋白质数据库与共识结合序列进行,然后用诸如亚细胞定位和已知功能的生物学信息进行手动过滤。 i,确认候选人互动。表达预测候选PDZ配体的羧基末端的质粒通过合成寡核苷酸和用相应的PDZ诱饵在一对一的Y 2 H测定中分别构建,以确认相互作用。 j,合成的克隆加入到PDZ配体文库中以扩大其多样性。 k,发现新型PDZ配体。 l通过添加已知或潜在的PDZ配体,补充PDZ配体库。 n pdz. ,新的PDZ域; syn ,PDZ配体的合成克隆; cDNA ,pdz配体的cDNA克隆。 B,PDZ配体图书馆的班级分布。 内戒指,通过通过ZO-1PDZ1,ZO-1PDZ3,ERBIN PDZ和GAIP C末端相互作用蛋白PDZ收集从RPY2HS分离的所有阳性PDZ结合克隆产生的初始PDZ配体库中的配体。该库总共包含128个非冗余线性PDZ配体。分别有72级(56.25%),35(27.34%),6(4.70%),1(4.70%),1级,II类,III类,IV类和其他配体分别为14(10.90%) 。 外圈,扩增的PDZ配体文库中的配体通过添加用于确认,已知的PDZ配体的CDNA克隆的CDNA克隆以及潜在的PDZ配体的其他构建的克隆的克隆扩增。达到此稿件的提交,该库总共包含242个非冗余线性PDZ配体。分别有124例(51.24%),71(29.34%),17级(7.02%),2(7.02%),2级,II类,III类,IV类和其他配体的28(11.57%) 。四类配体被指定:I类, - (S / T)Xφ*; II类,-ΦXΦ*; III类, - (D / E / K / R)Xφ*;和第四级, - Xψ(d / e)*在哪里 X 是任何氨基酸,φ是疏水性残余物,并且ψ是芳族残基。其他未分类的配体更喜欢羧基末端碱性氨基酸溶胶和极性氨基酸ASN,Ser和Cys。 C,PDZ配体图书馆的长度分布。 白色酒吧,初始PDZ配体图书馆中的配体。 黑条,扩增配体图书馆中的配体。线性库配体的长度主要是六至20个氨基酸残基,超过四个残基用于典型的PDZ结构域识别。 AA. , 氨基酸。
      图缩略图GR1B.
      图。1。肽结合结构域的结合特征高效率策略。A,策略的方案,重点在PDZ域作为一个例子。 a,具有代表性PDZ结构域的RPY2HS分离阳性PDZ结合克隆。 b,候选配体库的构建主要是通过收集来自RPY2HS和所有PDZ域克隆分离的所有PDZ结合克隆。 c用高通量酵母双杂交配合阵列研究PDZ配体文库的验证筛选PDZ结构域。 d,通过直接从阵列读取鉴定正面和阴性结合序列。 e, 。对于某些PDZ结构域,如果出现足够的正序列被隔离用于表征结合特性,则使用RPY2H来选择阳性克隆。将这些克隆添加到PDZ配体库中,以增加其随后对具有相似偏好的PDZ结构域的分量。 f,鉴定共有结合序列。 g,对阳性序列和阴性序列的比较分析表征结合特性。 h,用蛋白质数据库进行候选配体预测蛋白质数据库与共识结合序列进行,然后用诸如亚细胞定位和已知功能的生物学信息进行手动过滤。 i,确认候选人互动。表达预测候选PDZ配体的羧基末端的质粒通过合成寡核苷酸和用相应的PDZ诱饵在一对一的Y 2 H测定中分别构建,以确认相互作用。 j,合成的克隆加入到PDZ配体文库中以扩大其多样性。 k,发现新型PDZ配体。 l通过添加已知或潜在的PDZ配体,补充PDZ配体库。 n pdz. ,新的PDZ域; syn ,PDZ配体的合成克隆; cDNA ,pdz配体的cDNA克隆。 B,PDZ配体图书馆的班级分布。 内戒指,通过通过ZO-1PDZ1,ZO-1PDZ3,ERBIN PDZ和GAIP C末端相互作用蛋白PDZ收集从RPY2HS分离的所有阳性PDZ结合克隆产生的初始PDZ配体库中的配体。该库总共包含128个非冗余线性PDZ配体。分别有72级(56.25%),35(27.34%),6(4.70%),1(4.70%),1级,II类,III类,IV类和其他配体分别为14(10.90%) 。 外圈,扩增的PDZ配体文库中的配体通过添加用于确认,已知的PDZ配体的CDNA克隆的CDNA克隆以及潜在的PDZ配体的其他构建的克隆的克隆扩增。达到此稿件的提交,该库总共包含242个非冗余线性PDZ配体。分别有124例(51.24%),71(29.34%),17级(7.02%),2(7.02%),2级,II类,III类,IV类和其他配体的28(11.57%) 。四类配体被指定:I类, - (S / T)Xφ*; II类,-ΦXΦ*; III类, - (D / E / K / R)Xφ*;和第四级, - Xψ(d / e)*在哪里 X 是任何氨基酸,φ是疏水性残余物,并且ψ是芳族残基。其他未分类的配体更喜欢羧基末端碱性氨基酸溶胶和极性氨基酸ASN,Ser和Cys。 C,PDZ配体图书馆的长度分布。 白色酒吧,初始PDZ配体图书馆中的配体。 黑条,扩增配体图书馆中的配体。线性库配体的长度主要是六至20个氨基酸残基,超过四个残基用于典型的PDZ结构域识别。 AA. , 氨基酸。
      这种策略与若干特征中的其他方法有所不同。首先,通过验证筛选而不是传统筛选,总体效率显着改善。随着候选配体图书馆扩展,可以进一步改善。其次,我们可以通过酵母双混合交配阵列方法实现高吞吐量。可以并行测试多个诱饵域,并且可以同时在阵列上屏蔽数千个候选配体。第三,因为图书馆由已知序列的配体组成,所以可以直接从阵列直接读取阵列的实际正和阴性结合序列,这两者对于精确地限定结合性质。第四,PDZ结构域的克隆也包括在PDZ配体库中,同时能够研究PDZ-PDZ结构域相互作用。第五,最终将最终鉴定具有最高亲和力的配体和能够结合一个特定靶PDZ结构域但不具有其它靶PDZ结构域的高度特异性配体。这些配体可以为合成模拟物提供用作研究工具或治疗剂的基础(
      • 杨米
      • 吴Z.
      • 领域S.
      用酵母双杂交系统分析蛋白质肽相互作用。
      ,
      • dev k.k.
      制备蛋白质相互作用可药剂:靶向PDZ结构域。
      )。

       利用新开发的策略调查PDZ域

       用代表性PDZ结构域的RPY2HS构建PDZ配体图书馆 -

      我们首先单独构建10种随机肽文库(补充表1)通过用不同的读数框架将消化的基因组DNA片段亚克塞到酵母双杂交AD载体中(
      • 黄鹤
      • 高雅。
      使用基因组DNA产生任意肽文库的方法。
      )。因为PDZ结构域通常识别其靶标的极端羧基末端的四个残基,1.6×105 (204)对于研究其识别特异性,必须是独立的随机克隆。每个库都包含大约1×107 转化的克隆并且足以表达羧基 - 末端随机四个残基的所有可能性。考虑到超过四个残留物可能涉及PDZ识别,我们通过将10个库汇集在一起​​而产生更大的随机肽库。最终图书馆包含1.5×108 转化的克隆并且足以覆盖羧基 - 末端随机六个氨基酸的所有可能性(6.4×107, 206 )。
      我们选择了三个人类PDZ域,PDZ1和ZO-1的PDZ3域(Swiss-Prot登录号 Q07157)和埃尔滨的PDZ领域(瑞士 - PROL登录号 Q96RT1),使用Y2H方法单独筛选最终随机肽库。 ZO-1PDZ1和PDZ3的特异性尚未以大规模的筛选表征,如有限数量的已知靶蛋白所示,ZO-1 PDZ1结合符合A类(
      • Huber T.B.
      • 施密特M.
      • Gerke P.
      • 桑勒B.
      • Zahn A.
      • 哈特堡B.
      • 塞府
      • 沃尔兹G.
      • ZHZING T.
      尼弗家族成员的羧基末端与PDZ结构域蛋白Zonula occludens-1结合。
      ,
      • 歌曲X.
      • 赵玉。
      • NARCISSE L.
      • 达菲H.
      • 克拉克斯y.
      • 李斯。
      • Brosnan C.F.
      规范瞬态受体电位通道4(TRPC4)与培养的人胎儿星形胶质细胞中的支架蛋白ZO-1共定。
      ),II级(
      • ITOH M.
      • Furuse M.
      • 森塔克。
      • kubota k。
      • 埼肉M.
      • Tsukita S.
      用Claudins的CoOH末端直接结合三个紧密相关的磁带,ZO-1,ZO-2和ZO-3。
      ,
      • 李X.
      • 奥尔森C.
      • 卢S.
      • nagy J.I.
      Connexin36与Zonula occludens-1在HeLa细胞,βTC-3细胞,胰腺和肾上腺中的关联。
      )和III类(
      • ITOH M.
      • Furuse M.
      • 森塔克。
      • kubota k。
      • 埼肉M.
      • Tsukita S.
      用Claudins的CoOH末端直接结合三个紧密相关的磁带,ZO-1,ZO-2和ZO-3。
      )基序,PDZ3结合符合II类主题的配体(
      • ITOH M.
      • Furuse M.
      • 森塔克。
      • kubota k。
      • 埼肉M.
      • Tsukita S.
      用Claudins的CoOH末端直接结合三个紧密相关的磁带,ZO-1,ZO-2和ZO-3。
      )。通过噬菌体展示实验确定的Erbin PDZ结构域,结合属于I类主题的肽(
      • Laura R.P.
      • 威特A.S.
      • 持有H.A.
      • Gerstner R.
      • Deshayes K.
      • koehler m.f.
      • Kosik K.S.
      • 西德湖S.
      • Lasky L.A.
      erbi.结构域与δ-catenin和arvcf的羧基末端的高亲和力和特异性结合。
      )。我们推断这三个PDZ结构域选择的结合序列可以涵盖PDZ主题的主要类别。
      从RPY2HS,我们分别隔离42,37和35个非冗余的阳性粘结克隆,分别用于ZO-1 PDZ1,ZO-1 PDZ3和Erbin PDZ(补充表2-4)。所有特定的克隆对于报告基因都是阳性的 HIS3 Lacz. 并通过相应的诱饵进行候选质粒的三个独立的COTRANSFORMATION实验证实。
      接下来,我们通过收集从RPY2HS分离的所有正PDZ结合克隆以及我们实验室中的所有PDZ域克隆来生成初始PDZ配体库。该库由143个非冗余克隆组成(补充表12.)。为了检查图书馆中的线性配体是否代表潜在的PDZ结合序列,分析了类别和长度分布(图1,B和C.)。除了所有四种传统配体之外,尤其包括一些未分类的具有Cys或亲水性氨基酸残基的甲基末端的氨基酸残基,使得能够发现非典型PDZ主题。详细地,图书馆中的I类,II类,III类,III类,IV类和未分类配体的数量为72(56.25%),35(27.34%),6(4.70%),1(0.80%)和14(10.90%)分别。据报道,大多数PDZ主题是I类和II级,第三级和第四级是少数民族(
      • 松阳Z.
      • 扇动A.S.
      • 傅C.
      • 徐J.
      • 马法蒂亚三
      • chishti a.h.
      • 克朗佩顿A.
      • Chan A.C.
      • 安德森金。
      • 坎特利L.C.
      独特的PDZ结构域对独特的羧基末端图识别。
      ,
      • 果仁果冻F.
      • oleksy A.
      • Smietana K.
      • Otlewski J.
      PDZ. 领域 - 小区信令中的常见球员。
      )。在图书馆中这些传统类配体的分布与PDZ结构域的一般偏好一致。文库中的线性配体的长度在6-20的范围内,大多数六至91个氨基酸残基不同,比典型PDZ识别所需的四个残基长。两种分析表明,该PDZ配体库适合于验证筛查。

       使用Y2H交配阵列的PDZ配体库的高吞吐量验证筛选 -

      我们使用Y2H交配阵列方法用于验证PDZ配体文库的验证筛选,其中每个诱饵PDZ与96孔格式的每个候选配体配合。首先通过选择性培养基上的菌落生长鉴定阳性相互作用,然后在LacZ测定中的蓝色污渍外观。从配合阵列可以直接读取阳性和阴性结合序列而不重新排列。
      为了评估验证筛选方法,首先选择研究HTRA2 PDZ,其将II类基序结合,如取向的肽库确定(
      • 马丁斯L.M.
      • 土耳其人B.E.
      • Cowling V.
      • 博格A.
      • jarrell e.t.
      • 坎特利L.C.
      • 向下J.
      结合特异性和调节丝氨酸蛋白酶和HTRA2 / OMI的PDZ结构域。
      )。结果,快速鉴定了38个阳性结合序列(补充表5.)。我们还使用了通过RPY2H分析的ZO-1 PDZ1,ZO-1 PDZ3和ERBIN PDZ进行验证筛选。除了在rpy2h中发现的六个,零和三个新的阳性序列分别都被发现(补充表2-4)。同时鉴定所有四个PDZ结构域的阴性序列(补充表2-4)。显着的一些阴性序列与正面相似。例如,在RPY2H中被ZO-1 PDZ1选择了-ETWV *,而-dtwv *被配合阵列被识别为否定。这种轻微的差异可以呈现有意义的信息来区分结合和非粘连序列,表明负序列对于精确地表征PDZ结合性质的阳性序列是重要的。
      从验证筛选中获得ZO-1 PDZ1,ZO-1 PDZ3和Erbin PDZ的新结果,包括阴性和新的阳性序列。它们对RPY2H结果有用的补充。随着PDZ配体图书馆扩展,可以将每个研究的PDZ用于验证筛查的新循环,以便更全面地表征结合特性。

       分析候选配体蛋白的共分结合序列和预测 -

      我们对每个PDZ对齐正序列。结果表明位于羧基末端三至五个氨基酸残基的强有力的共识(补充表2-5,阴影)。此外,我们对阳性和阴性序列进行了相比分析,以推导更精确的共有结合序列(表I. )。
      T 有能力的 I PDZ. 结构域的预测候选配体
      PDZ. 共识序列 候选配体
      瑞士 - PROL加入号码羧基末端蛋白质描述结果
      ZO-1 PDZ1(s / t)ψ(v / i / l / c)
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      Q15760snppntfv.可能的G蛋白偶联受体GPR19×
      P56750sktstsyv.Claudin-17.
      P32745STMRISYL.生长抑素受体类型3
      O60229gdpfstyv.亨廷汀相关蛋白质相互作用蛋白
      Q9GZW8KSSSRSWI.膜跨越4个域亚家族成员7×
      Q9ULI0vhmfetfl.假设蛋白质Kiaa1240×
      Q86W26Etpkntyi. NA. cht-,LRR-和含PYD的蛋白质10
      Q92823-1vnamnsfv.神经元细胞粘附分子×
      (d / e)yv
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      O95832pssgkdyv.Claudin-1
      O15551gydrkdyv.Claudin-3
      O95471Snsskeyv.Claudin-7.
      Q8N6F1SaaaReyv.Claudin-19.×
      (S / T)(k / r / h)(v / i / l)
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      P19320Veaqkskv.血管细胞粘附蛋白1×
      Q9UBN4edyvttrl短暂的瞬态受体电位通道4
      Q96J84qqrmqthv.奈夫1(像Irre样蛋白1的亲属)
      ZO-1 PDZ3(L / W) XX. (v / i / l / m / f / g / p / d / e)ψ(v / i / l /ψ)
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      Q14232Deliklyl.翻译启动因子EIF-2Bα亚基×
      Q99502哈利莱泛眼睛缺席同源物1×
      Q99504Qaleldfl.眼睛不存在同源物3×
      P17181eelqqdfv.干扰素-α/β受体α链×
      Q8NH51nnlcnifv.嗅觉受体8K3×
      Q96AC1YKLTSGWV.Pleckstrin同源域域的家庭C成员1; MIG-2
      Q92599Atwregfl.静止8.×
      O43815达拉克夫夫striatin.×
      O14798IVLLIVFV肿瘤坏死因子受体超家族成员10C×
      Q9Y5U5grlgdlwv.肿瘤坏死因子受体超家族成员18
      Q86Y07vflalffl.丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶VRK2×
      Q9H1J5rvwfgyi.wnt-8a蛋白×
      erbi.(d / e / q)(s / t)(w / f)(v / l)
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      Q8NHY3ppeeeswv.GAS2相关蛋白质同种型β
      P09619AEAEDSFL.PDGF-R-β×
      O00141APPTDSFL.丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶SGK1×
      O00192PQPVDSWV.在Velocardiofacial综合征中删除Armadillo重复蛋白
      Q9UQB3Paspdswv.Cateninδ-2
      Q99569-2pgspdswv.P0071(Plakophilin-4)
      (d / e / q)(s / t)(d / e)v
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      O60242EGDFQTEV.脑特异性血管生成抑制剂3×
      Q13224lssiesdv.NR2B×
      O15399FSSLESEV.NR2D×
      P15385Akavetdv.钾通道Kv1.4×
      P27228ptretev.VE6_HPV35 E6蛋白×
      P03409khfretev.Tax_htlv-1
      Q96KB5vealetdv. PDZ. 结合激酶
      Q99434rlrvetdv.Arhgef16蛋白质×
      (d / e)(v / l)wv
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      Q9Y5U5grlgdlwv.肿瘤坏死因子受体超家族成员18×
      HTRA2 PDZ.(S / T)ψ(v / l)
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      Q8TBB1vswpgtfl.lnx1蛋白质×
      P46937Kesfltwl.是相关的蛋白质
      (s / t)(d / e)ψ(v / i / l)
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      P49815vedftefv.丁香
      Q8N2R7rarksewv.Connexin40.1.
      Q9Y4Z2slafsdfl.神经原因3.×
      (S / T)(v / I / f / g)(w / f)(v / l)
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      Q12906-5tagytgfv.白细胞介素增强剂结合因子3同种型C.
      P43234dsvssifv.Compeopsin O.
      t(h / r)v
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      Q99952ppaewtrv.蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶,非受体18型
      yc.
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      P15498Eedyseyc.VAV PROTO-oncogene×
      φY(v / i / l)
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      P35961cggeffyv.包膜糖蛋白(艾滋病毒)
      Q95835KNRDLVYV疣蛋白激酶
      P49768Lafhqfyi.Presenilin-1(PS1)
      lnx1 pdz2 (英石) XC
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      Q06418gllphssc.酪氨酸蛋白激酶受体Tyro3
      Q99966Tadfpssc.CBP / P300相互作用的反式激活器1
      Q9P2M7snlqtssc.春林
      P43119Asvacslc.前列环素受体
      Q9Y345dlelgtqc.钠和氯化钠依赖性甘氨酸转运蛋白2
      P57058ADGVKTQC激素上调的Neu肿瘤相关激酶
      P48546srelesyc.胃抑制性多肽受体
      DSWV.
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      O00192PQPVDSWV.在Velocardiofacial综合征中删除Armadillo重复蛋白
      Q9UQB3Paspdswv.Cateninδ-2
      Q99569-2pgspdswv.P0071(Plakophilin-4)
      (s / t / e)(w / y / f)v
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      a 直接从膨胀的PDZ配体文库的验证筛查中鉴定的配体蛋白。
      P56750sktstsyv.Claudin-17.
      O60229gdpfstyv.亨廷汀相关蛋白质相互作用蛋白
      Q8NHY3ppeeeswv.GAS2相关蛋白质同种型β
      P49815vedftefv.丁香
      Q8N2R7rarksewv.Connexin40.1.
      (g / i / l)(w / f)v
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      a 直接从膨胀的PDZ配体文库的验证筛查中鉴定的配体蛋白。
      Q12906-5tagytgfv.白细胞介素增强剂结合因子3同种型C.
      P43234dsvssifv.Compeopsin O.
      Q9Y5U5grlgdlwv.肿瘤坏死因子受体超家族成员18
      (v / f)(f / y)(v / i / l)
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      a 直接从膨胀的PDZ配体文库的验证筛查中鉴定的配体蛋白。
      Q86Y07vflalffl.丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶VRK2
      Q9H1J5rvwfgyi.wnt-8a蛋白
      O43815达拉克夫夫striatin.
      等(d / e)v
      这项工作是由国家基础研究计划补助金的支持,2004CB520804和国家自然科学基金会补助金30270657,30230150和3037030。本条的出版费用部分地支付页面费用。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      a 直接从膨胀的PDZ配体文库的验证筛查中鉴定的配体蛋白。
      P15385Akavetdv.钾通道Kv1.4
      Q99434rlrvetdv.Arhgef16蛋白质
      P03409khfretev.Tax_htlv-1
      a 直接从膨胀的PDZ配体文库的验证筛查中鉴定的配体蛋白。
      接下来,我们通过共有结合序列搜索瑞士 - prot或/和NR人体数据库,以预测人蛋白质组中的所有潜在配体。对于所研究的每种PDZ,预计许多天然蛋白是其配体,包括以前鉴定的结合伴侣,例如P0071,δ-连环蛋白和武器重复蛋白,删除Erbin PDZ的Velo-Cardio-Facial综合征(
      • Laura R.P.
      • 威特A.S.
      • 持有H.A.
      • Gerstner R.
      • Deshayes K.
      • koehler m.f.
      • Kosik K.S.
      • 西德湖S.
      • Lasky L.A.
      erbi.结构域与δ-catenin和arvcf的羧基末端的高亲和力和特异性结合。
      ,
      • Izawa I.
      • Nishizawa M.
      • Tomono Y.
      • Ohtakara K.
      • Takahashi T.
      • Inagaki M.
      Erbin与p0071,犰狳蛋白质,在上皮细胞的细胞 - 细胞结合中缔合。
      )以及新颖的(补充表7-10)。然后我们使用诸如亚细胞定位和已知功能的生物学信息来选择最有前途的候选配体(表I. )。

       确认候选PDZ相互作用 -

      我们使用一对一的Y2H测定来确认潜在的相互作用。将最有前景候选配体蛋白质的羧基末端克隆并用相应的PDZ诱饵克隆到酵母细胞中。如图所示 表I.,对每个PDZ的感兴趣确认了几种新型配体蛋白质。然后我们将此处构建的所有克隆添加到PDZ配体库中以扩大其多样性。

       一种新的循环:通过验证筛选扩展PDZ配体图书馆的LNX1 PDZ2研究 -

      通过添加构建的本地蛋白质的合成克隆,扩增初始PDZ配体文库。通过验证筛选扩展库,我们迅速研究了另一个PDZ域,LNX1 PDZ2。尚未澄清其结合特性,据报道,它只结合一种I类配体蛋白(
      • Sollerbant K.
      • Raschperger E.
      • Mirza M.
      • engstrom U.
      • 菲利普森L.
      • ljungdahl p.o.
      • Pettersson R.F.
      Coxsackeivirus和腺病毒受体(轿厢)与含PDZ结构域的蛋白质配体的NumB蛋白-X(LNX)形成复合物。
      )。在这里,我们确定了83个阳性克隆(补充表6.),包括14个天然蛋白质克隆( 表I.)。天然蛋白质克隆的直接分离大大提高了发现新型配体蛋白的效率。因此,我们推导了共识结合序列(表I.),预测潜在的原生配体(补充表11.),并确认了战略过程之后最有前途的相互作用。最后,我们确认了从蛋白质数据库搜索中选择的10种新型配体蛋白质(表I. )。

        PDZ. 结构域的结合特性的表征 -

      对于每个兴趣的PDZ,从PDZ配体图书馆的RPY2HS和/或验证筛查成功鉴定了一系列阳性和阴性序列(补充表2-6)。计算在阳性序列的位置处的每个氨基酸型的发生(图2,A,B和C.)。使用半定位结合测定(ONPG)来评估阳性相互作用的相对结合亲和力(补充图1,a和b )。
      图缩略图Gr2a.
      图2。 PDZ. 域的绑定属性。 用ZO-1 PDZ1与RPY2HS分离阳性克隆(A),ZO-1 PDZ3(B)和Erbin PDZ(C), 分别。阳性配体的序列在羧基末端对齐。统计分析每个位置的每个氨基酸的发生。从羧基末端(位置0)编号位置。这 桌子 总结每个选定氨基酸在给定位置的百分比。
      图缩略图GR2B.
      图2。 PDZ. 域的绑定属性。 用ZO-1 PDZ1与RPY2HS分离阳性克隆(A),ZO-1 PDZ3(B)和Erbin PDZ(C), 分别。阳性配体的序列在羧基末端对齐。统计分析每个位置的每个氨基酸的发生。从羧基末端(位置0)编号位置。这 桌子 总结每个选定氨基酸在给定位置的百分比。
      ZO-1 PDZ1和ERBIN PDZ的结合性质是相似的。 PDZ结构域两者均显示出在极端羧基末端(P°)的疏水性氨基酸的主要偏好,尤其是厄尔宾和缬氨酸(38.1%),Leu(38.1%)或Ile(14.3%)的val(94.7%),用于Zo- 1 pdz1;虽然PDZ1也选择了Rarer Cys和Thr。在P.−1,芳族氨基酸绝大多数优选,尤其是Erbin PDZ的TRP(68.4%);然而,Erbin PDZ也耐受较少的ASP和Glu,PDZ1耐受较少的Arg。在P.−2,Ser(PDZ1的23.8%;埃尔滨23.7%)和Thr(PDZ1的69.4%;厄尔宾55.3%)是主要的选择,而酸性和疏水残留如Glu,Val,ILE和ALA也被观察到程度较小。在P.−3,对于Erbin Glu(60.5%)和ASP(18.4%)大多选择,而PDZ1发现了更具可变的共识,但不能耐受ASP(衍生自负序列)。在P.−4,对于Erbin PDZ,当最后四个残基相同时,疏水性氨基酸比其他氨基酸更高的亲和力(补充图1B);对于PDZ1,在四个羧基末端残基之外没有观察到特异性。
      ZO-1 PDZ3显示出与ZO-1 PDZ1和ERBIN PDZ完全不同的独特性质。在P°,疏水性氨基酸,缬氨酸(29.7%),Leu(27%),ILE(13.5%)和PHE(13.5%)以及罕见的芳族氨基酸,TYR和TRP,以及亲水性氨基酸,液体,ASP和GLN。在P. −1,芳族氨基酸是主要的偏好,特别是pHE(48.6%)和TRP(43.2%)。在P.−2,在阳性序列中没有观察到显性偏好,尽管在亲水性残留物上有轻微的疏水残留物;然而,阴性序列显示出SER和THR的明显不耐受性。值得注意的是PDZ3显示P在P处的疏水性氨基酸残基的特异性偏好−5,特别是Leu(56.8%),这是一个未报告的PDZ结合性。
      除了报告的II类序列之外,HTRA2 PDZ认识到I类和III类序列(
      • 马丁斯L.M.
      • 土耳其人B.E.
      • Cowling V.
      • 博格A.
      • jarrell e.t.
      • 坎特利L.C.
      • 向下J.
      结合特异性和调节丝氨酸蛋白酶和HTRA2 / OMI的PDZ结构域。
      )。三种共识结合序列, - X(s / t)ψφ*, - Xφίφ*,和 - X(d / e)ψφ*(在哪里 X 表示除了如下所述的条件以外的任何氨基酸。与传统的PDZ识别特异性相比,HTRA2 PDZ在P处表现出限制变异性−3,即p−3 根据最后三个残基的组成选择残余物。 glu.−3 仅存在于-e(t / v)(w / f)v *的序列中。 (英石)−3 当疏水或酸性残基在p时被压倒性地优选−2。选择疏水残留物用 - (S / T)Hφ*的共识,碱性或大的疏水性残留物是必需的 - (S / T)Yφ*。
      在P°的LNX1 PDZ2下观察到独特的结合特性,其中两种不同种类的残基,val和Cys主要是主要的优选。当P°存在Cys时,可以定义共有序列 - (S / T)XC*。虽然VAR在P°,芳香氨基酸,TRP和PHE,是P的压倒性偏好−1,在p处没有观察到任何特异性−2;可以推导出共识序列 - X(w / f)v *。这表明PDZ结构域的传统分类不适用于描述LNX1 PDZ2的结合基序。另外,当PR THR存在于P时−2,共有序列是 - (E / S / T)TYV *, - (S / I / F /)TYI *和-ET(d / e)v *。

       分析新的蛋白质 - 蛋白质相互作用 -

      我们鉴定了50个相互作用,包括40个新的相互作用和10个已知的相互作用,在五个PDZ结构域和38个配体蛋白之间(表I.Fig. 3)。作为细胞功能通过稳定或瞬时关联的蛋白质组进行(
      • Stelzl U.
      • 蠕虫U.
      • Lalowski M.
      • Haenig C.
      • Brembeck F.H.
      • Goehler H.
      • Stroedicke M.
      • Zenkner M.
      • Schoenherr A.
      • Koeppen S.
      • TIMM J.
      • Mintzlaff S.
      • 亚伯拉罕C.
      • 博克恩。
      • Kietzmann S.
      • Goedde A.
      • Toksoz E.
      • 脱胶A.
      • Krobitsch S.
      • Korn B.
      • Birchmeier W.
      • Lehrach H.
      • Wanker E.E.
      人蛋白 - 蛋白质相互作用网络:用于注释蛋白质组的资源。
      ),我们推理蛋白质相互作用网络内更接近的蛋白质对(
      • Barabasi A.L.
      • oltvai z.n.
      网络生物学:了解细胞的功能组织。
      ,
      • Milo R.
      • 沉ORR S.
      • Itzkovitz S.
      • 克什坦N.
      • Chklovskii D.
      • Alon U.
      网络图案:复杂网络简单构建块。
      )的生物相关性比其他更高。因此,我们计算了每个交互的两种蛋白质之间的最短路径长度(
      • yu h.
      • 朱克。
      • Greenbaum D.
      • 卡罗J.
      • Gerstein M.
      TOPNET:用于比较生物亚网络的工具,将蛋白质特性与拓扑统计相关。
      )可以在HPRD中找到,以评估新的相互作用的置信度。可以联系40个新型相互作用对中的22个(补充表13.补充图2)。 21对形式的链接在三到六个范围内。最长的路径长度是仅在一个蛋白质对之间的八个环节。平均最短路径长度为4.82,这意味着新型相互作用的两种蛋白质是高度聚类的(
      • Stelzl U.
      • 蠕虫U.
      • Lalowski M.
      • Haenig C.
      • Brembeck F.H.
      • Goehler H.
      • Stroedicke M.
      • Zenkner M.
      • Schoenherr A.
      • Koeppen S.
      • TIMM J.
      • Mintzlaff S.
      • 亚伯拉罕C.
      • 博克恩。
      • Kietzmann S.
      • Goedde A.
      • Toksoz E.
      • 脱胶A.
      • Krobitsch S.
      • Korn B.
      • Birchmeier W.
      • Lehrach H.
      • Wanker E.E.
      人蛋白 - 蛋白质相互作用网络:用于注释蛋白质组的资源。
      ,
      • Strogatz S.H.
      探索复杂网络。
      ),增加彼此直接相互作用的可能性。
      图缩略图GR3.
      图3。受到目的PDZ结构域介导的蛋白质相互作用图。 显示包括感兴趣的五个PDZ结构域的蛋白质相互作用图和在该工作中鉴定的所有50个相互作用,包括40个新的相互作用和10个已知的相互作用。 彩色小点 根据HPRD注释代表不同的生物过程。 黑线 代表新的互动。 红线 代表在这项工作中重新确认的已知互动。这 小地图左下方 表示由蛋白质对新型相互作用之间的最短路径长度(LNX1和Cingulin之间的最短路径长度界定的子网的一个例子;看 。最短路径长度被定义为从一个节点到另一个节点所需的最小边缘数量;这给出了衡量网络内连接在网络内的密切相关的措施。
      本研究中鉴定的一些新的相互作用可能会揭示有关进一步的功能调查的重要线索。作为一个例子,我们发现Erbin PDZ之间的新相互作用,其介导其靶蛋白如ErbB2(
      • Borg J.P.
      • Marchetto S.
      • 勒·艾滋病吧
      • Ollendorff V.
      • 墨林邦
      • 锡达赫
      • 四分之一E.
      • 阿德莱德J.
      • MARGOLIS B.
      • Birnbaum D.
      Erbin:一种与哺乳动物ERBB2 / HER2受体相互作用的基底外侧PDZ蛋白。
      )和PDZ结构域结合激酶,通过与人光盘的相互作用招募到MAPK14,并激活MAPK14信令(
      • Dougherty J.D.
      • 加西亚A.D.
      • NA. kano I.
      • Livingstone M.
      • 诺里斯B.
      • Polakiewicz R.
      • 魏克勒省了
      • sofroniew m.v.
      • Kornblum H.I.
      • Geschwind D.H.
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      PDZ. 结合激酶的表征,丝分裂激酶。
      )。我们推测Erbin对于PDZ结构域结合激酶的亚细胞定位和功能可能是至关重要的,并且在MAPK信号转导通路中起角色。另一个例子是发现LNX1的PDZ2的几种新型相互作用,首先描述了含PDZ结构域的成员的E3泛素连接酶系列(
      • 聂杰。
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      • 面部米
      • DHO S.E.
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      LNX用作环型E3泛素连接酶,其靶向细胞命运决定簇Numb,用于泛素依赖性降解。
      ),其可以提供重要的线索以进一步阐明LNX1在蛋白质泛素改性调节中的作用。

      讨论

      我们开发了一种系统策略,用于基于高通量验证筛选专用PDZ配体图书馆的PDZ结构域的结合特性。该集成系统的关键是PDZ配体库。除了收集从RPY2HS分离的结合克隆并预测用于确认的预测的配体克隆,还可以通过添加其他已知或电位PDZ配体的其他克隆进一步扩增文库。达到本手稿的提交,我们的PDZ配体图书馆已扩展到总共257个非冗余PDZ配体(补充表12.)。分析了图书馆中线性配体的两类和长度分布(图1,B和C.)。目前的库由四种配体组成,包括PDZ结合肽,天然蛋白质,全长天然PDZ配体蛋白和PDZ结构域的羧基末端。前三种适用于研究PDZ的羧基末端结合特性,最后一种能够研究PDZ结构域的二聚化。文库中的天然蛋白能够从一轮验证筛选中直接发现新型PDZ配体蛋白。然而,到目前为止,内部PDZ结合序列不涉及。
      策略的高效率是通过以下特征来计算的。 1)它是节省的。一个月至少需要一个月的传统Y2H筛选,而只有1周足以进行一个验证筛选。 2)它是省力的。传统筛查的当前程序是乏味的,包括大规模文库转化,候选质粒分离,阳性克隆的分离,而阳性克隆的序列,而验证筛查只需要一个交配测定的步骤。因此,可以实现高吞吐量。 3)存在高成功的预测率。通过考虑负结合序列,可以推导出更精确的共有结合序列,从而提高预测的成功。以HTRA2 PDZ为例,对所有阳性和阴性序列的比较分析揭示了P的独特偏好−3。结果,确认了10种预测候选配体蛋白中的七种。
      我们的结果的信心可以在几个方面有理由。首先,在每个PDZ感兴趣的碱序列的羧基末端存在清晰的共有结合序列。其次,在我们的系统中重新储存了20个报告的PDZ配体蛋白质中的10个(50%);这远高于当前数据集之间的预期重叠率(
      • 有害J.F.
      • Venkatesan K.
      • 郝T.
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      )。第三,这里鉴定的每种蛋白质对32个相互作用可以映射到从HPRD参考数据提取的小型蛋白质相互作用网络中,表明两个结合伙伴是生物相关的(
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      )。在HPRD网络中找不到剩余18个交互的链接可能是因为当前的HPRD交互数据远未完成。
      本研究表征了五个PDZ结构域的结合特性。重构先前通过大规模方​​法确定的所有识别特异性,但也发现了一些新的结合特性。先前已经通过噬菌体显示的无规肽库进行了厄尔宾PDZ的特异性,并鉴定了羧基 - 末端 - (D / E)(S / T)WV *结合基质(
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      )。在这项研究中,我们确定了更多样化的共识结合序列,并观察到了可以在P处选择ASP和Glu的新颖现象−1 除了TRP。 HTRA2 PDZ的优选结合序列已先前通过取向的肽文库方法确定,并且II类基序已经被鉴定为最优选的(
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      )。我们发现HTRA2 PDZ也允许I类和III类配体。所表征的更广泛的结合特性可能归因于有效地避免我们的系统中的亲和竞争和丰富抑制。 ZO-1 PDZ1和PDZ3之前未通过大规模筛选研究。几种蛋白质,包括Claudins(
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      )。然而,即使在PDZ3和堵塞羧基末端之间的一对一Y2H测定中,我们的系统中未确认相互作用。原因尚不清楚。显着地,报道的配体蛋白未能识别与共有结合序列不一致的携带羧基末端。对于LNX1 PDZ2,目前的研究是首先全面描述该结构域的结合特性。结果为LNX1蛋白的功能表征铺平了方法。
      迄今为止,PDZ域通常基于绑定主题(
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      )。然而,在区分所有PDZ域中,这种简单的分类可能无法足够。例如,ZO-1 PDZ3在P处表现出独特的特定选择−5 在疏水性氨基酸,特别是Leu,主要是优选的;然而P.−5 不被认为是为了促进PDZ认可特异性。芳族氨基酸TRP,PHE和TYR的主要偏好−1 对于所观察到的所有五个PDZ域,而先前p−1 被认为是保守的,并且仅仅对PDZ结合特异性进行了较小的重要性(
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      )。在P°,除了典型的疏水氨基酸之外,通过LNX1 PDZ2显着选择Cys,而其他极性或亲水残留物如Lys,Asn和Thr也被不同的PDZ结构域选择。此外,所有感兴趣的PDZ结构域均多于一种常规类别的配体以及未分类的PDZ配体。报告了增加新型的新型PDZ-配体相互作用(
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      致谢

      我们感谢Ben Giepmans博士,为ZO-1 PDZ诱饵质粒和Weizhi Chen博士提供批判性阅读。

      补充材料

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