鉴定与之相关的蛋白表达签名 幽门螺杆菌 使用重组彩易福彩微阵列感染和胃腺癌*

      基于彩易福彩微阵列的技术是蛋白质组学,目标发现和差异分析的强大新兴工具。在这里,我们报告了重组彩易福彩片段已被用于构建大规模彩易福彩微阵列的第一研究,该研究由127种不同彩易福彩与主要免疫调节抗原组成。阵列基于单一框架重组彩易福彩片段(SINFAB),该彩易福彩片段(SINFABS)设计用于高芯片稳定性和功能,并且用于分析恶性和正常胃组织样本幽门螺杆菌 - 积极和阴性患者。我们的结果表明,可以从这些复杂的组织蛋白质组中鉴定出不同的肿瘤以及感染相关的蛋白质表达签名,以及在这些疾病中未发现的IL-9,IL-11和MCP-4如IL-9,IL-11和MCP-4等生物标志物。在更长的角度下,这项研究可能会改善对此的理解H. Pylori. - 诱导胃癌并导致改进诊断的发展。
      基于彩易福彩微阵列的技术是癌蛋白领域的有希望的工具,其中最重要的应用是比较恶性肿瘤的蛋白质组表达签名 相对 正常样本(用于审查,请参阅参考文献。
      • Wingren C.
      • Borrebaeck C.A.
      使用彩易福彩微阵列的高通量蛋白质组学。
      • Borrebaeck C.
      基于彩易福彩微阵列的癌蛋白。
      )。这种方法有可能识别疾病相关的生物标志物,这可能能够开发改进的诊断以及鉴定新的药物目标(
      • Wingren C.
      • Borrebaeck C.A.
      使用彩易福彩微阵列的高通量蛋白质组学。
      ,
      • Haab B.B.
      癌症研究中的彩易福彩阵列。
      )。还可以进一步了解各种癌症等疾病进展的分子方面,例如胃腺癌(用于审查,参见参考文献。
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      胃癌:流行病学,病理和治疗。
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      胃腺癌通常与之相关 幽门螺杆菌 感染和1-2%的受感染的个体随后发展胃癌(
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      幽门螺杆菌 and gastrointestinal tract adenocarcinomas.
      )。免疫应对 H. Pylori. 导致对不同细胞因子,趋化因子和其他免疫调节分子的调节,是肿瘤进展最重要的辅因子之一(
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      胃癌的分子生物学:幽门螺杆菌感染和胃腺癌:负责改变生长信号传导的细菌和宿主因子。
      )。因此,为了研究与胃腺癌的起始和进展相关的免疫应答的组分需要分析大量不同的分子,通常仅使用小型组织样品。基于胃组织相关免疫调节蛋白的基于彩易福彩微阵列的分析提供了解决这些基本问题的潜在方法,并检测疾病相关的蛋白质签名和生物标志物(
      • Wingren C.
      • Borrebaeck C.A.
      使用彩易福彩微阵列的高通量蛋白质组学。
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      基于彩易福彩微阵列的癌蛋白。
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      癌症研究中的彩易福彩阵列。
      )。
      彩易福彩微阵列,由MacBeath和Schreiber开创(
      • Macbeath G.
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      将蛋白质作为微阵列进行高通量函数测定。
      )和哈巴 。(
      • Haab B.B.
      • 邓汉米。
      • 棕色p.o.
      蛋白质微阵列,用于在复合溶液中的高度平行检测和定量特定蛋白质和彩易福彩。
      ),已成为检测蛋白质和肽的敏感和高通量方法(
      • Wingren C.
      • Borrebaeck C.A.
      使用彩易福彩微阵列的高通量蛋白质组学。
      ,
      • Haab B.B.
      癌症研究中的彩易福彩阵列。
      )。利用这种技术癌症研究的前景迅速实现了(
      • Sreekumar A.
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      • 格式化。
      • 禁区。
      • Ghosh D.
      • 劳伦斯泰斯。
      • Chinnaiyan上午
      使用蛋白质微阵列的癌细胞分析:发现新型辐射调节蛋白质。
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      • knezevic V.
      • leethanakul c.
      • Bichsel V.E.
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      彩易福彩阵列癌细胞蛋白质组学分析。
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      • Mulligan S.P.
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      使用分化彩易福彩微阵列的白血病免疫蛋白酶型。
      )和彩易福彩微阵列最近已被用于分析来自组织和血清的较大临床样本(
      • 米勒J.C.
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      人前列腺癌血清的彩易福彩微阵列分析:彩易福彩筛选和潜在生物标志物的鉴定。
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      使用高通量蛋白阵列在正常和恶性乳房组织中差异表达蛋白质的分析。
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      优化彩易福彩微阵列的归一化和血清蛋白质分析的应用。
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      • Haab B.B.
      彩易福彩微阵列分析显示出与胰腺癌相关的个体和组合的血清蛋白。
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      • Mulligan S.P.
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      用彩易福彩微阵列鉴定白血病表面抗原的曲目。
      )。虽然这些研究中使用的平台已经有用,但内容, IE。 商业现成单克隆和多克隆彩易福彩,赋予若干限制(
      • Wingren C.
      • 在 gvarsson J.
      • Lindstedt M.
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      重组彩易福彩微阵列 - 一种可行的选择?
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      彩易福彩微阵列:承诺和问题。
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      • Macbeath G.
      蛋白质微阵列和蛋白质组学。
      )。首先,不同的单克隆彩易福彩衍生自不同的种系基因,因此具有不同的框架。因此,它们的片上性能将显示不可接受的变化(
      • Steinhauer C.
      • Wingren C.
      • HART A.C.
      • Borrebaeck C.A.
      单帧重组彩易福彩彩易福彩片段设计用于蛋白质芯片应用。
      ),导致每种新的个体彩易福彩的繁琐验证。其次,缩放阵列需要生产成千上万的单克隆彩易福彩,这既耗时且昂贵。为了克服这些限制,我们通过分子设计开发了彩易福彩片段。这些微阵列适应单帧彩易福彩片段(SINFAB)
      使用的缩写是:Sinfab,单帧重组彩易福彩片段; SCFV,单链可变片段; GA,胃腺癌;生命值, H. Pylori.; n,正常; SAM,微阵列分析的意义; PCA,主成分分析; Th,辅助T细胞; C,语料库; CT,霍乱毒素。
      1使用的缩写是:Sinfab,单帧重组彩易福彩片段; SCFV,单链可变片段; GA,胃腺癌;生命值, H. Pylori.; n,正常; SAM,微阵列分析的意义; PCA,主成分分析; Th,辅助T细胞; C,语料库; CT,霍乱毒素。
      是从噬菌体显示库获得的单链可变片段(SCFV)(
      • Söderlinde.
      • Strandberg L.
      • 杰霍尔P.
      • Kobayashi N.
      • Alexeiva V.
      • Åberg上午
      • 尼尔森A.
      • jansson b.
      • 欧姆姆米
      • Wingren C.
      • Danielsson L.
      • Carlsson R.
      • Borrebaeck C.A.K.
      重组种系衍生的CDR序列,用于创造不同的单框架彩易福彩库。
      ),所有单独的SCV都是一个稳定的框架(VH3-23 / VL1-47)内置(
      • Söderlinde.
      • Strandberg L.
      • 杰霍尔P.
      • Kobayashi N.
      • Alexeiva V.
      • Åberg上午
      • 尼尔森A.
      • jansson b.
      • 欧姆姆米
      • Wingren C.
      • Danielsson L.
      • Carlsson R.
      • Borrebaeck C.A.K.
      重组种系衍生的CDR序列,用于创造不同的单框架彩易福彩库。
      )。这些SINFABS已被用于开发彩易福彩微阵列平台(
      • Wingren C.
      • 在 gvarsson J.
      • Lindstedt M.
      • Borrebaeck C.A.
      重组彩易福彩微阵列 - 一种可行的选择?
      ,
      • Wingren C.
      • Steinhauer C.
      • 在 gvarsson J.
      • 波尔森E.
      • Larsson K.
      • Borrebaeck C.A.
      基于亲和标记的单链Fv彩易福彩的微阵列:复合蛋白质组中分析物的敏感性检测。
      ,
      • 在 gvarsson J.
      • Lindstedt M.
      • Borrebaeck C.A.
      • Wingren C.
      复合蛋白质谱的一步分馏能够使用基于彩易福彩的微阵列检测低丰富的分析物。
      )适用于复合蛋白质组的敏感分析,例如血清和组织提取物。
      C. Wingren,J.Ingvarsson,L. dexlin,D. Zul,C. A. K. Borrebaeck,准备稿。
      2C. Wingren,J.Ingvarsson,L. dexlin,D. Zul,C. A. K. Borrebaeck,准备稿。
      J. Ingvarsson,A. Larsson,A.Sjöholm,L.Truedsson,C. A. K.Borrebaeck,以及编写的稿件。
      3J. Ingvarsson,A. Larsson,A.Sjöholm,L.Truedsson,C. A. K.Borrebaeck,以及编写的稿件。
      在这项研究中,我们已经使用127种不同Sinfab探针构建了阵列,针对低和高丰富的蛋白质,例如细胞因子,趋化因子和补体因子。蛋白质从三种不同的组织类型中提取物如 H. Pylori. - 肌瘤腺癌, H. Pylori. - 呈正常胃膜上皮,和 H. Pylori. - 已经分析了常规胃膜上皮。该研究的目的是验证癌蛋白组中的平台,并证明可以鉴定与肿瘤和感染相关的特定蛋白质签名。

      实验步骤

       患者试样和蛋白质从组织样品中提取 -

      在研究中,共有来自20名患者(中位数75岁,55-87名,7名女性,13名男子)的35个样本被纳入苏达堡,瑞典·瑞典。患者要么患有非贲门胃腺癌(GA)(15名患者)或胰腺腺癌(5例)。该研究由哥德堡大学的道德审查委员会批准,并在参与前从每个志愿者获得知情同意。患者没有一个患者在胃切除之前经过放射治疗或化疗。
      H. Pylori. - 在手术期间获得阳性胃腺癌样品(GA / HP +),以及 H. Pylori. - 从肿瘤至少5厘米的无肿瘤组织中获得阳性正常胃组织样品(N / HP +),而所有 H. Pylori. - 从胰腺癌患者中获得了常规胃组织样本(n / hp-)。正常的胃组织来自两者 H. Pylori. - 呈现 H. Pylori. - 中低保留了它们的正常建筑,并没有显示肿瘤细胞的迹象。来自同一患者的Antrum和Corpus的无肿瘤粘膜是在5的中获得的 H. Pylori. - 正常样本和6个,共15个 H. Pylori. - 呈正常的正常样品。然而,我们发现在antrum和语料库群之间的表达抗原(数据未显示)中没有发现统计学上显着的差异。从组织样品,尺寸为〜10-20mm的活组织检查2 切割并在-70℃下储存以进行后续蛋白质提取。通过在含有2%皂苷,100μg/ ml大豆胰蛋白酶抑制剂(Sigma Chemical Co.),350μg/ mL苯基甲基磺酰基 - 氟化物(Sigma Chemical Co.)和0.1%牛血清白蛋白的PBS中从活组织检查中从活组织检查中提取蛋白质。在4℃过夜。然后将样品离心(13000× g 5分钟),将上清液在-70℃下储存,直至如下所述标记的生物素。

       诊断幽门螺杆菌感染 -

      H. Pylori. 通过细菌培养物和血清学分析患者的感染状态。使用内部ELISA方法进行血清学分析,检测IgG或IgA彩易福彩对粗膜的制剂 H. Pylori. 如前所述(
      • Mattsson A.
      • 罐头A.
      • 哈姆雷特A.
      • lonroth h.
      • 博林I.
      • Svennerholm上午
      血清中的特异性彩易福彩和症状和无症状的幽门螺杆菌感染受试者的胃吸出。
      )以及商业ELISA试剂盒(EIA-G III; OIO-G III; ORION诊断)。患者被认为是 H. Pylori. - 如果它们在培养和/或至少2个血清学测试中存在阳性,并且认为是 H. Pylori. - 如果它们在培养和所有三种血清学测试中是阴性的。

       从组织提取物中标记蛋白质样品 -

      将提取的蛋白质样品在Zeba脱盐旋转柱(PIRCE)上脱盐,并在PBS中洗脱。使用Micro BCA TM蛋白质测定试剂盒(PIRCE)测定蛋白质浓度,并且每个样品在PBS中稀释至0.5mg蛋白质/ mL。为了归一化目的,将霍乱毒素亚单位B(Sigma Chemical Co.)以终浓度的280 n加入所有样品中m。接下来,样品是生物素化的 N通过加入 - 羟基硫磺基琥珀酰亚胺 - 生物素(Pierce) N-Hydroxysulfosuc氨基酰亚胺 - 生物素到终浓度为0.6米m 在冰上为2小时,每20分钟仔细涡旋。通过在4℃下通过广泛的透析除去未反应的生物素,然后将样品等分并在-80℃下储存。

       彩易福彩微阵列的制造和加工 -

      127种选自N编码器库的不同彩易福彩(
      • Söderlinde.
      • Strandberg L.
      • 杰霍尔P.
      • Kobayashi N.
      • Alexeiva V.
      • Åberg上午
      • 尼尔森A.
      • jansson b.
      • 欧姆姆米
      • Wingren C.
      • Danielsson L.
      • Carlsson R.
      • Borrebaeck C.A.K.
      重组种系衍生的CDR序列,用于创造不同的单框架彩易福彩库。
      )由Bioinvent International AB(瑞典隆德)善意提供。简而言之,生产SCFV彩易福彩 大肠杆菌 并通过亲和层析镍 - 氮酰基乙酸基质(Qiagen,Hilden,德国)纯化。用250米洗脱结合的分子m 咪唑,对PBS的广泛透析,浓缩(平均浓度277μg/ ml),并在4℃下储存直至使用。通过10%SDS-PAGE(Invitrogen)证实了SCFV彩易福彩的完整性和纯度。
      对于彩易福彩微阵列的生产,我们使用先前优化的设置。
      C. Wingren,J.Ingvarsson,L. dexlin,D. Zul,C. A. K. Borrebaeck,准备稿。
      J. Ingvarsson,A. Larsson,A.Sjöholm,L.Truedsson,C. A. K.Borrebaeck,以及编写的稿件。
      简而言之,使用非接触式Biochip Arrayer1(PerkinElmer Life Sciences,Inc.)发现了每次SCFV的1至30毫兆摩尔(7个FMOL平均值)。通过斑点2滴(333pL /滴)排列SCFV,该液滴在每个位置在黑色聚合物Maxisorp微阵列载玻片上(Nunc,Roskilde,丹麦)。为了在随后的定量期间协助栅格的对准,每个第十行发现含有Cy5-缀合的链霉葡萄酒(2μg/ ml)的花朵。为了促进芯片对屑归一化,在每个阵列上发现稀释系列(23-370μg/ ml)抗霍乱毒素彩易福彩(CT17)。在室温下,阵列用5%(w / v)含有5%(w / v)脂肪奶粉(Semper ab,sundbyberg,瑞典)。所有孵育在室温下在湿度室中进行。用0.05%Tween-20在PBS(PBS-T)中洗涤阵列,并用250μl的生物素化样品(0.1mg / ml)孵育1%(w / v)脂肪奶粉和1%在PBS(样品缓冲液)中吐温1小时。接下来,用PBS-T洗涤阵列四次,并用1μg/ ml Alexa Fluor 647-缀合的链霉蛋白在样品缓冲液中孵育1小时。最后,用PBS-T洗涤阵列,在氮气流下干燥,并使用四种不同的扫描仪设置使用共聚焦ScanArray Express微阵列扫描仪(PerkinElmer Life Sciences)扫描。 ScanArray Express软件V2.0(PerkinElmer Life Sciences)用于定量每个点的强度,并弥补背景。自动排除两个最高和两个最低复制,每个数据点代表剩余四重复的平均值。

       数据分析-

      背景技术从每个样本的不同扫描仪设置的校正数据被缩放到一个特定设置,并且仅使用来自不饱和点的数据进行进一步分析。通过将信号数据乘以来自每个样本的信号数据来执行数据集的芯片归一化的芯片(i)到一个因素nI,它计算出来 n = S(CT17) /μ. (CT17) 。 S. (CT17) 是来自CT17的信号强度(稀释系列在稀释系列的线性范围内),每个样品(I)和μCT17 来自所有样品的CT17的平均信号强度。
      然后计算LOG2值,使用微阵列分析(SAM)的意义来确定样品类之间的差异(
      • Tusher V.G.
      • Tibshirani R.
      • 楚G.
      微阵列施加到电离辐射响应的显着性分析。
      )。列出了使用Wilcoxon两类未配对测试在样品之间产生显着不同信号强度的彩易福彩,从而进行了两类未配对测试(见 表I. III )并用于样本类的集群分析。在样品类别(I)GA / HP +之间差异表达的抗原 相对 以0%的错误发现率和0.811,(ii)n / hp +的δ值过滤滤波 相对 N / HP-以0%的错误发现率和0.505的DELTA值滤波,和(iii)GA / HP + 相对 使用SAM方法以3.5%和Δ值为0.546的错误发现率滤波N / HP +。将基于SAM的方法与基于方差的方法进行比较,这产生了类似的结果。此外,为代表性数据集生成的正常概率绘图表明它们通常是正常分布的(数据未显示)。主要成分分析(PCA)使用Spotfire软件(8.0版,Spotfire AB)进行。在分层聚类分析之前,通过抗原在分层聚类分析之前通过抗原进行Z分数,这是使用使用Spotfire 8软件的算术平均值的未加权对组方法进行的。
      T 有能力的 I与H.幽门阳性肿瘤组织相关的蛋白质签名
      缩写 名称 功能
      C1q补体系统的组件1Q补充因素
      FB. 补体系统的因子B
      C5补体系统的组件5
      MCP-1单核细胞趋化蛋白1
      MCP-3单核细胞趋化蛋白3
      MCP-4单核细胞趋化蛋白4趋化因素
      Eotaxin.CC-趋化因子
      咆哮在激活后调节,表达正常的T细胞,并且可能是分泌的
      IL-8白细胞介素8.
      IL-4白细胞介素4.
      IL-13白细胞介素13.th2-细胞因子
      IL-5白细胞介素5.
      IL-6白细胞介素6.
      INF-γ.干扰素γ
      IL-2白细胞介素2.th1-cytokine.
      IL-12白细胞介素12.
      TNF-β.肿瘤坏死因子β
      TGF-β. 转化生长因子βTreg细胞因子
      IL-10白细胞介素10.
      IL-11白细胞介素11.
      GM-CSF.粒细胞单核细胞菌落刺激因子
      TNF-α.肿瘤坏死因子α
      IL-1ra白细胞介素1 ra.
      IL-1α白细胞介素1α细胞因子
      IL-1β白细胞介素1β.
      IL-9白细胞介素9.
      IL-16白细胞介素16.
      IL-18白细胞介素18.
      血管素血管生成
      TM peptide.来自跨膜蛋白的肽未知

      结果和讨论

      在这里,我们报告了重组,微阵列适应彩易福彩片段的第一研究已经用于构建大规模彩易福彩微阵列以分析临床组织样品。该彩易福彩微阵列技术平台
      C. Wingren,J.Ingvarsson,L. dexlin,D. Zul,C. A. K. Borrebaeck,准备稿。
      J. Ingvarsson,A. Larsson,A.Sjöholm,L.Truedsson,C. A. K.Borrebaeck,以及编写的稿件。
      具有几种独特的特征,因为它基于分子设计的重组彩易福彩片段,在结构特征,片上稳定性,功能和灵敏度方面产生高符合性(
      • Wingren C.
      • 在 gvarsson J.
      • Lindstedt M.
      • Borrebaeck C.A.
      重组彩易福彩微阵列 - 一种可行的选择?
      ,
      • Steinhauer C.
      • Wingren C.
      • HART A.C.
      • Borrebaeck C.A.
      单帧重组彩易福彩彩易福彩片段设计用于蛋白质芯片应用。
      ,
      • Wingren C.
      • Steinhauer C.
      • 在 gvarsson J.
      • 波尔森E.
      • Larsson K.
      • Borrebaeck C.A.
      基于亲和标记的单链Fv彩易福彩的微阵列:复合蛋白质组中分析物的敏感性检测。
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      • 在 gvarsson J.
      • Lindstedt M.
      • Borrebaeck C.A.
      • Wingren C.
      复合蛋白质谱的一步分馏能够使用基于彩易福彩的微阵列检测低丰富的分析物。
      )。含有127种不同的重组彩易福彩片段的彩易福彩微阵列,针对60种不同的抗原,例如细胞因子,补体因子和其他免疫相关蛋白质,用于分析来自的35个恶性和正常的胃组织样本 H. Pylori. - 积极和阴性患者。使用一至四种不同的Sinfab克隆来靶向每种抗原,从而避免对单一抗原表位的依赖性,从而最大限度地减少标签诱导的伪影的风险。

       验证微阵列平台 -

      代表性微阵列的图像(Fig. 1)展示了与该平台获得的均匀点形态以及低背景。扫描图像的分析表明,阵列内的复制点的相关性高,显示平均相关系数>0.99 (图2A)。此外,通过计算平均相关系数和平均方差系数来分析重复实验的再现性。基于样本的平均相关系数,基于样本运行2-3周,为0.94(图。2B),平均方差的平均方差为18%,与其他方法相比(
      • Hamelinck D.
      • 周H.
      • Li L.
      • verweij c.
      • Dillon D.
      • 冯Z.
      • 哥斯达j.
      • Haab B.B.
      优化彩易福彩微阵列的归一化和血清蛋白质分析的应用。
      ,
      • Orchekowski R.
      • Hamelinck D.
      • Li L.
      • 格里瓦E.
      • Vanbrocklin M.
      • Marrero J.A.
      • vande woude g.f.
      • 冯Z.
      • 品牌R.
      • Haab B.B.
      彩易福彩微阵列分析显示出与胰腺癌相关的个体和组合的血清蛋白。
      ),证明平台对复杂临床蛋白质孔的处理分析。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1来自胃组织样品的微阵列图像通过重组彩易福彩微阵列分析,含有127种不同SINFAB的8重复。 倍率显示霍乱毒素亚基B特异的抗霍乱毒素彩易福彩(CT17)的稀释系列,其加入样品中并用于芯片对芯片标准化。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2彩易福彩微阵列分析的再现性。A,阵列内复制点的再现性(相关系数> 0.99). B,基于样品的芯片对芯片相关性,相隔2-3周(平均相关系数为0.94)。
      归一化程序对于正确的数据解释至关重要(
      • Hamelinck D.
      • 周H.
      • Li L.
      • verweij c.
      • Dillon D.
      • 冯Z.
      • 哥斯达j.
      • Haab B.B.
      优化彩易福彩微阵列的归一化和血清蛋白质分析的应用。
      ),我们已经调查了两种不同的策略
      J. Ingvarsson,A. Larsson,A.Sjöholm,L.Truedsson,C. A. K.Borrebaeck,以及编写的稿件。
      并得出结论,使用穗蛋白质(霍乱毒素,亚基B)的芯片对屑归一化进行效果非常好。
      J. Ingvarsson,A. Larsson,A.Sjöholm,L.Truedsson,C. A. K.Borrebaeck,以及编写的稿件。
      Fig. 1,倍率显示用于检测掺入霍乱毒素的Sinfab克隆(CT17)的稀释系列。此外,大多数Sinfab克隆对抗不同抗原的不同表位, 例如 IL-13在 Fig. 3,显示了一个非常相似的整体模式。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3基于Ga / Hp +和n / hp-的比较,基于43彩易福彩的43个彩易福彩的组合感染和肿瘤签名的双向等级分析。 GA/Hp+ ( 红色的 )表示来自阳性患者的肿瘤组织 H. Pylori.,而n / hp-( 蓝色的 )代表来自胃部的正常胃组织 H. Pylori. - 患者。首都 A 或者 C 表明样品是从antrum获得的(A)或语料库(C)来自患者。这 数字 表示个体患者。 红色的 表明上调, 绿色 代表下调,和 黑色的 indicates no change.

       鉴定幽门螺杆菌感染和胃腺癌相关的蛋白质表达签名 -

      接下来,我们使用SAM方法确定疾病相关的蛋白质签名(
      • Tusher V.G.
      • Tibshirani R.
      • 楚G.
      微阵列施加到电离辐射响应的显着性分析。
      )。首先,通过比较胃肠腺癌组织的表达谱来确定组合的感染和肿瘤签名 H. Pylori.-阳性(GA / HP +)样品,来自无肿瘤正常胃组织 H. Pylori. - 中断(N / HP-)样本。该分析导致30个由43种不同彩易福彩克隆检测到的显着差异表达的抗原( 表I.)。其次,仅通过比较确定仅与感染相关的签名 H. Pylori. - 不含肿瘤的正常组织(N / HP +)样品,具有N / HP样品(表二),导致14种显着表达17种不同彩易福彩克隆的抗原。最后,通过将GA / HP +样品与N / HP +样品进行比较,确定与肿瘤仅相关的签名,得到29显着差异表达蛋白质(表III)由35种不同的彩易福彩克隆识别。
      T 有能力的 II与H.幽门螺杆菌感染相关的蛋白质签名
      缩写 名称 功能
      C1s补体系统的组件1S补充因素
      Eotaxin.CC-趋化因子趋化因素
      IL-13白细胞介素13.
      IL-5白细胞介素5.th2-细胞因子
      IL-6白细胞介素6.
      INF-γ.干扰素γth1-cytokine.
      IL-2白细胞介素2.
      TGF-β. 转化生长因子βtreg-cytotokine.
      IL-10白细胞介素10.
      IL-11白细胞介素11.
      GM-CSF.粒细胞单核细胞菌落刺激因子
      IL-1ra白细胞介素1受体拮抗剂细胞因子
      IL-1β白细胞介素1β.
      IL-9白细胞介素9.
      T 有能力的 III与胃腺癌肿瘤相关的蛋白质签名
      缩写 名称 功能
      C1q补体系统的组件1Q补充因素
      ei. 弹性蛋白酶抑制剂
      FB. 补体系统的因子B
      C3补体系统的组件3
      C5补体系统的组件5
      MCP-1单核细胞趋化蛋白1趋化因素
      MCP-3单核细胞趋化蛋白3
      MCP-4单核细胞趋化蛋白4
      Eotaxin.CC-趋化因子
      咆哮在激活后调节,表达正常的T细胞,并且可能是分泌的
      IL-8白细胞介素8.
      IL-4白细胞介素4.th2-细胞因子
      IL-12白细胞介素12.th1-cytokine.
      IL-10白细胞介素10.treg-cytotokine.
      IL-1α白细胞介素1α细胞因子
      IL-7白细胞介素7.
      IL-11白细胞介素11.
      GM-CSF.(粒细胞单核细胞) - 思考刺激因子
      TNF-α.肿瘤坏死因子α
      IL-16白细胞介素16.
      CD40CD40受体细胞表面受体
      TM peptide.来自跨膜蛋白的肽未知
      JAK3Janus激酶3.激酶
      BTK. Bruton Tyrosine激酶
      血管素血管生成
      VEGF. 血管内皮生长因子
      Sainyl Le X.CD15s粘附
      Α 10整合α10
      瘦素肽激素
      通过双向等级聚类分析进一步评估蛋白质表达签名(Fig. 3, Fig. 4, Fig. 5)。肿瘤和感染蛋白表达签名分析(GA / HP +样品 相对 N/Hp− samples) (Fig. 3)揭示了两个良好的分离簇,展示了高灵敏度(100%)和特异性(88%)。接下来,通过将N / HP +样品与N / HP样本进行比较,通过将N / HP +样本进行比较,产生两个良好定义的分层簇(Fig. 4),显示95%的灵敏度和88%的特异性。最后,仅与肿瘤相关联的蛋白质签名(GA / HP +样品 相对 检查N / HP +样品),导致高灵敏度(100%),但特异性较低(52%)(Fig. 5),与感染签名相比,导致更伪的阳性。这种观察可能会通过正常组织样本来解释这一观察结果 H. Pylori. - 从原发性肿瘤的无肿瘤组织获得阳性(N / HP +)基团。胃肿瘤可能对影响周围胃组织的免疫反应产生全球影响,或者正常样品受到所谓的“场效应”的影响,这是指与癌症相关的非恶性组织的变化(
      • Srivastava S.
      • Verma M.
      • Henson D.E.
      用于早期检测结肠癌的生物标志物。
      )。这种解释得到了从相同的患者材料获得的非常近期的数据支持,这表明T细胞活性和彩易福彩水平均在肿瘤区域以及无肿瘤粘膜中改变 H. Pylori. - 与...相比,患有胃癌患者 H. Pylori. - 染的无症状的个体。
      M. Quiding-Järbrink,K.Nearsson,A. Lundgren,M. Hansson,C. Johansson,M. Hermansson,E. Johnsson和A.-M。 Svennerholm,提交出版物。
      S. Lundin,K.恩纳森,A. Lundgren,E.Johnsson,M.Quiding-Järbrink,以及A.-M。 Svennerholm,提交出版物。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4基于17个彩易福彩的感染签名的双向分层簇分析,从N / HP +的比较提供了明显不同的信号 相对 N/Hp−. N/Hp+ ( 绿色 )代表来自患者的正常组织 H. Pylori.,而n / hp-( 蓝色的 )代表来自胃部的正常胃组织 H. Pylori. - 患者。首都 A 或者 C 表明样品是从antrum获得的(A)或语料库(C)来自患者。这 数字 表示个体患者。 红色的 表明上调, 绿色 代表下调,和 黑色的 indicates no change.
      图缩略图GR5.
      Fig. 5基于35彩易福彩的肿瘤签名对肿瘤签名的双向等级分析,从GA / HP +的比较提供了明显不同的信号 相对 N/Hp+. GA/Hp+ ( 红色的 )表示来自阳性患者的肿瘤组织 H. Pylori.,而n / hp +( 绿色 )代表来自胃部的正常胃组织 H. Pylori. - 阳性患者。首都 A 或者 C 表明样品是从antrum获得的(A)或语料库(C)来自患者。这 数字 表示个体患者。 红色的 表明上调, 绿色 代表下调,和 黑色的 indicates no change.
      为了进一步分析蛋白质感染签名并检查样本类之间的差异,PCA用于生成数据的二维视图(Fig. 6)。情节6.A 和 6B 表明,组合的感染和肿瘤签名以及感染签名课程都很好地分开,除了一个偏远的n / hp +样品(图6B.)。此外,肿瘤相关签名的PCA表示比较GA / HP +样品 相对 N / HP +样品表明,这些样本类也可以分离,虽然具有较低的特异性(图6C.)。这些数据进一步支持了分层集群分析的结论(图。 4.5 )。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6来自逻辑变换的归一化数据的前两个主成分使用SAM过滤的抗原。A,来自GA / HP +组的样品(黑点)和n / hp-group(红点 )。 B,来自n / hp +组的样本(蓝圆点)和n / hp-group(红点 )。 C,来自n / hp +组的样本(蓝圆点)和n / hp-group(红点)。不同PCA中的两个第一个主成分占88%(A),87%(B)和80%(C)总方差分别。

       蛋白质签名中的抗原分析 -

      在感染签名中有几种细胞因子显着上调,包括典型的TH2细胞因子,如IL-5,IL-6和IL-13,以及包括IFN-γ和IL-2的TH1细胞因子(表二)。此外,与调节性T细胞相关的IL-10和TGF-β也上调(表二)。这证实了以前的研究表明调节性T细胞的频率增加 H. Pylori. - 胃粘膜(
      • Lundgren A.
      • Stromberg E.
      • Sjoling A.
      • Lindholm C.
      • enarsson k。
      • edebo A.
      • 约翰逊E.
      • SURI-PAYER E.
      • Larsson P.
      • 鲁德廷A.
      • Svennerholm上午
      • 德伦丁B.S.
      在幽门螺杆菌感染患者中表达CD4 + CD25高调节性T细胞的粘膜FOXP3。
      )反映胃组织中免疫应答的复杂平衡,这已经建议落在完全偏振的Th1或Th2型材之间(
      • STOCOOV C.
      • Saffari R.
      • CAI X.
      • Hasyagar C.
      • 霍顿J.
      胃癌的分子生物学:幽门螺杆菌感染和胃腺癌:负责改变生长信号传导的细菌和宿主因子。
      )。事实上,TH1,TH2和调节性T细胞细胞因子已经先前被证明与之相关 H. Pylori. infection (
      • Lindholm C.
      • quiding-warbink m.
      • lonroth h.
      • 哈姆雷特A.
      • Svennerholm上午
      幽门螺杆菌受试者的局部细胞因子反应。
      ,
      • 腰部K.
      • Wyatt J.I.
      • Heatley R.v.
      白细胞介素-10的胃粘膜分泌:与组织病理学,幽门螺杆菌状态的关系,幽门螺杆菌状态和肿瘤坏死因子-α分泌。
      )。特别地,已经提出抑制Th1细胞因子的IL-10负责感染的持续性(
      • 腰部K.
      • Bromelow K.
      • Wyatt J.I.
      • Heatley R.v.
      白细胞介素10在幽门螺杆菌相关胃炎中:免疫组织化学定位和对细胞因子分泌的体外影响。
      )。另外,粒细胞 - 单核细胞 - 菌落刺激因子和IL-1β以及趋化因子eotaxin(表二)也被发现,确认先前的观察 H. Pylori. infection (
      • Lindholm C.
      • quiding-warbink m.
      • lonroth h.
      • 哈姆雷特A.
      • Svennerholm上午
      幽门螺杆菌受试者的局部细胞因子反应。
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      • Beales I.L.
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      通过幽门螺杆菌,IL-1Beta和TNF-α在人胃上皮细胞中刺激IL-8产生需要酪氨酸激酶活性,但不是蛋白激酶C.
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      • ohtsuru A.
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      • Takeshima F.
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      • Kodama T.
      • Sawai N.
      • Tanahashi T.
      • 克什米马克。
      • imanishi J.
      在幽门螺杆菌感染的胃粘膜中的趋化因子。
      )。
      在肿瘤相关蛋白质签名中,典型的Th2细胞因子IL-4被上调(表III),这可能表明肿瘤进展与免疫应答的局部Th2偏差有关(
      • 仁Z.
      • 庞G.
      • Clancy R.
      • Li L.C.
      • 李C.S.
      • Batey R.
      • Borody T.
      • 达克利M.
      胃癌胃T细胞应答的转变。
      )。此外,与N / HP +样品和N / HP样品相比,肿瘤组织的细胞因子谱与IL-10水平增加有关。有趣的是,最近也观察到增加IL-10生产 H. Pylori.与无症状相比,胃癌患者的T细胞的培养物培养 H. Pylori. - 摄取的个体。
      S. Lundin,K.恩纳森,A. Lundgren,E.Johnsson,M.Quiding-Järbrink,以及A.-M。 Svennerholm,提交出版物。
      因为IL-10与免疫抑制相关,所以Th2偏斜和IL-10产生的组合可能促进肿瘤进展。此外,TH1细胞因子IL-12也上调(表III),再次证明胃中免疫应答的复杂平衡(
      • STOCOOV C.
      • Saffari R.
      • CAI X.
      • Hasyagar C.
      • 霍顿J.
      胃癌的分子生物学:幽门螺杆菌感染和胃腺癌:负责改变生长信号传导的细菌和宿主因子。
      )。与感染签名相比,C1S是唯一的上调补体因子,几个补体因子,例如C1Q,C3,C5,因子B,(FB)和酯酶抑制剂(EI)( 表III)在肿瘤相关签名中上调。由于TNFα诱导的结果,肿瘤细胞可能由肿瘤细胞产生这些补充因子,如最近显示C3和胃癌衍生细胞系上的因子B(
      • Kitano E.
      • Kitamura H.
      胃癌衍生细胞系对因子D的合成。
      )。注意,额外的趋化因子,如MCP-1,MCP-3和IL-8(表III)上调,可以反映肿瘤中更严重的炎症状态和增加的组织血管化(
      • Yamaoka Y.
      • Kodama T.
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      • Tanaka K.
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      单核细胞化学蛋白-1胃癌患者循环水平的谱。
      )。后一种建议进一步支持血管内皮生长因子和血管素的上调(表III)介导血管生成,并已被显示出用癌症表达(
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      表皮生长因子受体的反膜激活参与瘦素诱导的Janus-活化激酶2和人胃癌细胞中细胞外信号调节激酶1/2的活化。
      ),也发现在肿瘤相关的蛋白表达谱上上调(表III )。
      总体而言,感染签名的蛋白质和肿瘤签名显示出不同的差异,尽管常见的特征也很明显。 Venn图表 Fig. 7 概述感染和肿瘤签名以及合并的签名。除了在合并的签名中也发现了感染签名中的一种蛋白质。肿瘤签名中的几种蛋白质也被发现在组合标志内,尽管检测到10个唯一调节的抗原。感染与肿瘤相关签名之间存在相对较小的重叠,这对于诊断应用是重要的。事实上,不同签名中的几种蛋白质具有潜力用作生物标志物和开发新的诊断方法 H. Pylori. 感染和胃腺癌,虽然需要进一步研究来验证我们的研究结果。此外,一些与感染签名相关的蛋白质,如IL-9和IL-11以及肿瘤签名, 例如 MCP-4在炎症期间起在白细胞积累中发挥作用,之前没有与之相关 H. Pylori. 感染或胃肠癌,并进一步调查这些发现可能会提高对这些疾病的理解。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7venn图显示在不同比较中差异表达抗原的分布。 与N / HP样品相比(I)GA / HP +样品中差异表达的抗原(顶圈),在(ii)n / hp +样品中与n / hp样品相比(右圈),和(III)GA / HP +样品与N / HP +样品相比(左圈 )。

      结论

      在该研究中,我们已经证明了基于重组,微阵列适应的彩易福彩片段的彩易福彩微阵列的第一实例,用于分析复杂癌症蛋白质组中的蛋白质表达鉴定。结果表明,我们可以识别与两者相关的蛋白表达签名 H. Pylori. 感染或胃腺癌,从而使我们与癌症相关的签名相比将一般疾病签名区分。

      致谢

      奥尔森奥尔森和卡琳恩森的技术援助非常感谢。康乐博士,萨哈格卡省大学医院外科博士伊利克约翰逊博士提供临床样本。

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