使用噬菌体显示选择抗体识别翻译后修改的抗体,独立于序列上下文*

      通过翻译后修饰来控制许多细胞活性,其研究在很大程度上由于其普遍的和非免疫原性而缺乏特异性试剂受到阻碍。虽然对特异性修饰序列的抗体相对容易获得,但是极难获得识别转换后修饰的试剂,而是独立于修改的序列背景。在这项研究中,我们检查了使用磺酪氨酸作为测试用例从大噬菌体抗体文库中选择这种抗体的可能性。磺酸碱是一种翻译后修饰在许多细胞外蛋白质 - 蛋白质相互作用中重要,包括人类免疫缺陷病毒感染。在筛选近8000个所选择的克隆后,我们能够使用两种不同的选择策略隔离单个特定的单链Fv,其中一个不同的选择策略包括用酪氨酸硫酸盐洗脱。该抗体能够在试验肽和许多不同的天然蛋白质中独立地识别磺酰虫蛋白。通过用硫酸酶或与可溶性酪氨酸硫酸盐进行硫酸酶或预孵育,抗体反应性损失抗体反应性,表明其特异性。该抗体的分离是表示噬菌体抗体文库的潜力在转化后修饰的试剂的推导中,尽管所需的广泛筛选表明这种抗体非常罕见。
      通过翻译后修饰(PTM)来调节许多蛋白质活性,
      使用的缩写是:PTM,翻译后修改; TPST,酪氨酸氟烷酯酶; v,变量; VH,重链变量; VL,轻链变量; SCFV,单链Fv; OVA,卵烧; IPTG,异丙基β- d-thiogalactopyranoside; AP,碱性磷酸酶; DMF,二甲基甲酰胺; FMOC, N - (9-芴基)甲氧基羰基; SMCC,琥珀酰亚胺基4- [N-MaleImidoMethyl] -cyclohexane-1-羧酸盐; Ampglu,50μg/ ml氨苄青霉素,3%葡萄糖。
      1使用的缩写是:PTM,翻译后修改; TPST,酪氨酸氟烷酯酶; v,变量; VH,重链变量; VL,轻链变量; SCFV,单链Fv; OVA,卵烧; IPTG,异丙基β- d-thiogalactopyranoside; AP,碱性磷酸酶; DMF,二甲基甲酰胺; FMOC, N - (9-芴基)甲氧基羰基; SMCC,琥珀酰亚胺基4- [N-MaleImidoMethyl] -cyclohexane-1-羧酸盐; Ampglu,50μg/ ml氨苄青霉素,3%葡萄糖。
      已描述的200多个(
      • Krishna R.G.
      • Wold F.
      翻译后的蛋白质改性。
      ),随着酶活性,蛋白质相互作用伙伴,亚细胞定位和有针对性的降解的变化是一些最重要的受监管活动。已经使用了许多不同的方法来研究PTM,其中大部分是依赖于感兴趣的蛋白质的特异性分离,并鉴定影响该特定蛋白质的PTM(
      • maccoss m.j.
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      霰弹枪鉴定蛋白质复合物和透镜组织的蛋白质修饰。
      )或分离含有特异性PTM的蛋白质和随后鉴定分离的蛋白质。有两种基本方法可分离或鉴定含有特异性PTM的所有蛋白质:化学衍生化或特定亲和试剂。前者依靠PTM的特定化学反应性,通常通过添加易识别的标签,例如亚硝基化半胱氨酸的生物素化(
      • jaffrey s.r.
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      • Tempst P.
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      蛋白质S-亚硝基化:神经元一氧化氮的生理信号。
      )或磷酸化的丝氨酸/苏氨酸残基(
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      磷酸化蛋白作为探测磷蛋白酶体的工具的富集分析。
      ),允许它们通过特定的质量偏移来纯化或鉴定。识别PTM的后者特异性亲和试剂包含许多不同的分子类型,包括使用铁或镓的IMac结合含有磷源苷酸的蛋白质(
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      通过固定化金属分离磷蛋白(Fe3+)亲和层析。
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      自动固定化金属亲和力色谱/纳米液相色谱/电喷雾电离质谱平台,用于分析蛋白质磷酸化位点。
      )或磷酸化的苏氨酸或丝氨酸(
      • imam-sghiouar n。
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      金属螯合亲和色谱法在磷蛋白酶研究中的应用。
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      使用新型金属离子亲和树脂和基质辅助激光解吸质谱法,CFTR中丝氨酸753磷酸化的证据。
      );凝胶素,识别糖基化蛋白;和抗体识别酪氨酸修饰的抗体。这些都已用于蛋白质组学研究(
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      质谱分析质谱分析及其在酿酒酵母酿酒酵母中的应用。
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      凝集素亲和捕获,同位素编码标记和质谱法以鉴定N-连接的糖蛋白。
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      酪氨酸氮化蛋白鉴定蛋白质组学方法。
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      • Blagoev B.
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      • 罗氏S.
      • 寄生H.F.
      鉴定一种新型免疫聚氨酯酪氨酸基激活基序分子,STAM2,通过质谱法及其参与生长因子和细胞因子受体信号传导途径。
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      • 布里姆
      • Salomon A.R.
      • Ficarro S.B.
      • Mukherji M.
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      • 彼得斯e.c.
      使用固定化金属亲和色谱法和串联质谱法从人T细胞中培养酪氨酸磷酸化位点的鲁棒磷蛋白酶分析。
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      • Salomon A.R.
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      • 布里姆
      • 布兰特A.
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      • 喇叭d.m.
      • 舒尔茨P.G.
      • 彼得斯e.c.
      用质谱法在人细胞中的酪氨酸磷酸化途径分析。
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      • Aulak K.
      • Miyagi M.
      • 燕L.
      • 西K.
      • Massillon D.
      • Crabb J.
      • Stuehr D.
      蛋白质组学方法鉴定炎症攻击期间体内硝化的蛋白质。
      )。尽管抗体是迄今为止最常见的特异性亲和试剂,但是很少有识别PTMS独立于它们所连接的蛋白质。亚硝基化酪氨酸和磷酸化酪氨酸是蛋白质组学研究中使用的抗体(
      • Aulak K.S.
      • Koeck T.
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      酪氨酸氮化蛋白鉴定蛋白质组学方法。
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      鉴定一种新型免疫聚氨酯酪氨酸基激活基序分子,STAM2,通过质谱法及其参与生长因子和细胞因子受体信号传导途径。
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      使用固定化金属亲和色谱法和串联质谱法从人T细胞中培养酪氨酸磷酸化位点的鲁棒磷蛋白酶分析。
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      用质谱法在人细胞中的酪氨酸磷酸化途径分析。
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      • Crabb J.
      • Stuehr D.
      蛋白质组学方法鉴定炎症攻击期间体内硝化的蛋白质。
      )也已经确定了针对磷源/苏氨酸的抗体(
      • 格罗戈尔米
      • Kristiansen T.Z.
      • Stensballe A.
      • 安德森J.S.
      • Ohara O.
      • Jensen O.N.
      • Pandey A.
      通过富集磷特异性抗体鉴定丝氨酸/苏氨酸 - 磷酸化蛋白的质谱基蛋白质组学方法:鉴定新型蛋白质,Frigg作为蛋白激酶底物。
      ),表明如果可以导出这种试剂的效用存在。然而,据证明通常难以分离识别广泛背景下识别PTM的抗体。部分内容可能反映了公认表位的相对较小的大小,但也许更重要的是,这种PTM的u特异性,特别是在分泌的和膜结合的蛋白上,使它们在完整的免疫系统中的非免疫原性。此外,可以将一些翻译后修饰(例如磷酸酪氨酸)是内在的抗原性,因为修饰的侧链进一步来自肽骨架,例如磷源,或者因为取代的芳族残基通常比改性更抗原更多的抗原性类似于代谢中间体的残基(如丝氨酸和苏氨酸)。
      一种广泛分布的PTM是酪氨酸硫化(
      • Bettelheim F.
      来自纤维蛋白原的肽中的酪氨酸-O-硫酸盐。
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      噻吩甲酰胺磺膦酸酯酶-A对线虫C.秀丽隐杆菌的适当角质苷形成。
      )( 图。1A)。已经发现这是为了使细胞外蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质相互作用与Psgl-1和p-selectin(
      • Pouyani T.
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      PSGL-1对P-选择素的识别由PSG1-1氨基末端的酪氨酸硫酸盐共识控制。
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      PSGL-1的氨基末端的硫酸化肽区段对于P-SELETIN结合至关重要。
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      酪氨酸硫化p-选择蛋白糖蛋白配体-1需要高亲和力与p-选择蛋白的结合。
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      • ertling r.
      • cumming d.a.
      • Veldman G.M.
      • Berndt M.C.
      一种新型眼镜蛇毒液金属蛋白酶,MOCARHAGIN,从P-SELECTIN糖蛋白配体,PSGL-1的成熟N末端切割一个10氨基酸肽,并消除了P-SELITEIN结合。
      ),其中psgl-1的硫酸化酪氨酸残基定位成与p-selectin(
      • Somers W.S.
      • 唐杰。
      • Shaw G.D.
      • Camphausen R.T.
      通过与SLE(X)和PSGL-1结合的P-和E-SELIENIN的结构揭示的白细胞束缚和轧制的分子基础。
      ),用作原型。酪氨酸硫酸化趋化因子受体CCR5,CXCR4和CCR2也依赖于其硫酸盐基团,以增加对趋化因子和人类免疫缺陷病毒的结合亲和力(
      • 法州M.
      • Mirzabekov T.
      • Kolchinsky P.
      • Wyatt R.
      • Cayabyab M.
      • Gerard N.P.
      • 格拉德C.
      • SODROSKI J.
      • 选择
      CCR5氨基末端的酪氨酸硫化促进了HIV-1进入。
      ,
      • 鸬鹚尤。
      • Persuh M.
      • Thompson D.A.
      • 林S.W.
      • Sakmar T.P.
      • 奥尔森W.C.
      • 拖拉机
      CCR5氨基末端域肽含有HIV-1封套糖蛋白GP120的CCR5氨基末端结构域肽的特异性相互作用。
      ,
      • 横幅N.
      • 克雷格斯。
      • 法州M.
      • Sogah D.
      • Santo N.v.
      • 选择
      • SODROSKI J.
      唾液酸化的O-聚糖和NH的硫酸盐2 - CC趋化因子受体5的终域有助于趋化因子的高亲和力结合。
      ,
      • 法州M.
      • Babcock G.J.
      • Vasilieva N.
      • 赖特P.L.
      • Kiprilov E.
      • Mirzabekov T.
      • 选择
      CXCR4氨基末端在基质衍生因子1α关联和HIV-1进入中的翻译后修饰的作用。
      ,
      • Preobrazhensky a.a.
      • 龙龙
      • 卡瓦南T.
      • gavrilin m.a.
      • 杜丽娜I.v.
      • Chakravarty L.
      • Kolattukudy P.E.
      单核细胞趋化蛋白-1受体CCR2B是糖蛋白,其在保守的细胞外N-末端区域中具有酪氨酸硫酸盐。
      )酪氨酸硫酸化互补性测定区域一些人类免疫缺陷病毒中和抗体,其功效随着该PTM的消除而降低(
      • 黄阁
      • Venturi M.
      • Majeed S.
      • 摩尔M.J.
      • Phogat S.
      • 张M.Y.
      • DIMITROV D.S.
      • Hendrickson W.A.
      • 罗宾逊J.
      • SODROSKI J.
      • Wyatt R.
      • 选择
      • 法州M.
      • kwong p.d.
      酪氨酸硫酸盐和VH-基因使用的结构基础,识别GP120上的HIV型团簇结合位点的抗体。
      ,
      • 选择
      • 李W.
      • 赖特P.L.
      • Vasilieva N.
      • Venturi M.
      • 黄阁
      • Grundner C.
      • Dorfman T.
      • Zwick M.B.
      • 王L.
      • 罗森伯格E.S.
      • kwong p.d.
      • 伯顿D.R.
      • 罗宾逊J.E.
      • SODROSKI J.G.
      • 法州M.
      人抗体的酪氨酸硫化有助于识别HIV-1GP120的CCR5结合区域。
      )。通过将硫酸盐从腺苷3-磷酸5-磷磺酸氢磺酸盐转移到要改性多肽酪氨酸的羟基(
      • 李罗..
      • HUTTNER W.B.
      酪氨酸-O-硫酸化蛋白的PC12噬细胞瘤细胞及其酪氨酸氟烷蛋白酶酶的硫化酶。
      )。在MAN,两种酶,酪氨酸蛋白磺基转移酶(TPST)-1和TPST-2,催化该反应,并进行了缺乏每种酶中的转基因小鼠(
      • Borghei A.
      • 欧阳Y.B.
      • Westmuckett A.D.
      • Marcello M.R.
      • Randel C.P.
      • 埃文斯J.P.
      • 摩尔K.L.
      酪氨酸氟烷蛋白砜 - 2的靶向破坏,一种催化翻译后蛋白酪氨酸O-硫化的酶,导致男性不育症。
      ,
      • 欧阳Y.B.
      • 克劳利J.T.
      • 阿斯顿C.E.
      • 摩尔K.L.
      酪氨酸氟烷蛋白酶-1缺陷小鼠的体重减轻和后期后后期胎儿死亡。
      )。缺乏TPST-1导致体重减轻和后期后期胎儿死亡(
      • 欧阳Y.B.
      • 克劳利J.T.
      • 阿斯顿C.E.
      • 摩尔K.L.
      酪氨酸氟烷蛋白酶-1缺陷小鼠的体重减轻和后期后后期胎儿死亡。
      ),而TPST-2缺乏导致男性不孕症(
      • Borghei A.
      • 欧阳Y.B.
      • Westmuckett A.D.
      • Marcello M.R.
      • Randel C.P.
      • 埃文斯J.P.
      • 摩尔K.L.
      酪氨酸氟烷蛋白砜 - 2的靶向破坏,一种催化翻译后蛋白酪氨酸O-硫化的酶,导致男性不育症。
      )。对于酪氨酸硫酸盐的缺乏进行简单的,快速的测定已经阻碍了这种修饰的调查,并且免疫试图衍生鉴定硫酸化酪氨酸的抗体已经不成功
      W. Huttner,个人沟通。
      2W. Huttner,个人沟通。
      虽然已经描述了结合表位包括酪氨酸硫酸酯的抗体(
      • Snapp K.
      • 丁H.
      • 阿特金斯K.
      • WARNKE R.
      • Luscinskas F.
      • 堪萨斯G.
      一种新的p-选择蛋白糖蛋白配体-1单克隆抗体识别人PSGL-1的酪氨酸硫酸酯基序内的表位,并阻止识别P-和L-选择素。
      )。由于许多分泌和膜结合的蛋白质上的酪氨酸硫酸盐存在,这种结果并不令人惊讶地引发免疫系统变得特别容忍改性。
      图缩略图GR1.
      图。1。A,酪氨酸硫酸盐后翻译后修饰的结构。 B,用于选择的两种肽的序列。硫酸化的酪氨酸表明 大胆的 下划线 with the SO3 随附的。 C,每种肽通过羧基 - 末端SH组偶联与卵蛋白,BSA或生物素。 D,侧翼已知酪氨酸硫酸盐改性位点的氨基酸序列 大胆的 下划线,对于本研究中使用的不同蛋白质。
      克服对非免疫原靶的特异性抗体产生的完整免疫系统的局限性的一种方法是使用噬菌体抗体文库而不是免疫。在这种技术中大量(≥109)不同抗体显示在丝状噬菌体表面上,并且在其结合能力的基础上选择特异性粘合剂(用于评论,参见参考文献。
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      • 床单M.D.
      • Amersdorfer P.
      • 芬奔r.
      • SARGENT P.
      • Lindqvist E.
      • Schier R.
      • HEMMINGSEN G.
      • 黄C.
      • Gerhart J.C.
      • 标记J.D.
      高效施工大型非免疫噬菌体抗体库;生产高亲和力人单链抗体的面板对蛋白质抗原。
      )或合成v基因(
      • Nissim A.
      • hoovenboom H.R.
      • Tomlinson i.M.
      • Flynn G.
      • 中间C.
      • 泳道D.
      • 冬季G.
      来自“单罐”噬菌体展示文库的抗体片段作为免疫化学试剂。
      ,
      • Griffiths A.D.
      • 威廉姆斯S.C.
      • 哈特利O.
      • Tomlinson i.M.
      • 水屋P.
      • Crosby W.L.
      • Kontermann R.E.
      • 琼斯P.T.
      • 低下
      • 艾莉森T.J.
      • prospero t.d.
      • hoovenboom H.R.
      • Nissim A.
      • Cox J.P.L.
      • 哈里森J.L.
      • Zaccolo M.
      • Gherardi E.
      • 冬季G.
      直接从大型合成曲目中分离高亲和力人抗体。
      ,
      • de Kruif J.
      • Boel E.
      • Logtenberg T.
      具有设计CDR3区的半合成噬菌体抗体显示文库的人单链Fv抗体片段的选择和应用。
      ,
      • Knappik A.
      • GE L.
      • 霍格格A.
      • 包P.
      • 菲舍尔M.
      • Wellnhofer G.
      • 雪斯A.
      • 狼j.
      • Pluckthun A.
      • virnekas b。
      基于模块化共识框架和与三核苷酸随机化的组合式人组合抗体库(HUCALAL)。
      ),克服了免疫系统的内在偏差。虽然已经选择了噬菌体抗体,其针对大量不同的多肽和化学靶标,包括特异性肽(
      • Pavlik P.
      • Siegel R.W.
      • Marzari R.
      • SBLOTTERTO D.
      • Verzillo V.
      • 柯林斯C.
      • 标记J.D.
      • 布拉德伯里A.
      预测适于选择噬菌体抗体的抗原肽。
      ,
      • Siegel R.W.
      • 艾伦B.
      • Pavlik P.
      • 标记J.D.
      • 布拉德伯里A.
      使用在肽靶标中选择的单链抗体的蛋白质复合物的质谱分析:对功能基因组学的应用。
      ,
      • PersiC L.
      • 喇叭i.r.
      • Rybak S.
      • Cattaneo A.
      • hoovenboom H.R.
      • 布拉德伯里A.
      在57-76 p21ras中和来自噬菌体抗体文库的57-76 p21ras中和表位上选择的单链可变片段识别天然蛋白质。
      ,
      • Griffiths A.D.
      • Malmqvist M.
      • 标记J.D.
      • 再见。
      • Embleton M.J.
      • McCafferty J.
      • Baier M.
      • 霍林K.P.
      • 戈里克B.D.
      • 休斯 - 琼斯N.C.
      • hoovenboom H.R.
      • 冬季G.
      噬菌体展示文库具有高特异性的人抗自抗体。
      ),没有描述这种技术的使用来选择针对翻译后修改的抗体。
      为了确定噬菌体展示是否可用于选择识别PTMS的有用抗体,我们使用了许多不同的选择策略来分离来自噬菌体显示的单链FV(SCFV)片段的大型重组文库中的抗酪氨酸硫酸盐抗体(
      • SBLOTTERTO D.
      • 布拉德伯里A.
      利用单细菌的重组以制备大噬菌体抗体库。
      )。我们在两次或三轮选择后表征了近8000个克隆,并鉴定了在转化为全长IgG时能够在能够保持其识别特异性的多个序列环境中识别酪氨酸硫酸的单个SCFV。

      实验步骤

       抗原的合成 -

      在应用的生物系统431A肽合成仪上合成Pep1和Pep2,使用标准二环己基碳二亚胺(Novabiochem)联轴器为0.1mmol级。 N-Hydroxybenzotraiazole(Novabiochem)。除非另有说明,否则所有用于抗原合成的试剂购自Aldrich。合成从预加载到2-氯酸树脂(Novabiochem)上的Trityl保护的半胱氨酸开始,并使用具有标准侧链保护基团的FMOC保护的氨基酸进行(Novabiochem)。在室温下同时切割肽,并在三氟乙酸中培养3.5小时,用5%硫代乙酸,5%水,2.5%乙二醇和4.5%苯酚孵育。然后将肽在寒冷乙醚中沉淀,并通过反相HPLC纯化。
      Pep1s和Pep2s的合成更复杂,手动进行。将载有0.1mmol保护的半胱氨酸的2-氯苯树脂在二甲基甲酰胺(DMF)中溶胀10分钟并排出。预加载的半胱氨酸具有游离氨基,但所有后续循环都需要去除FMOC组。为了实现这一点,溶胀的树脂在DMF中覆盖20%的哌啶10分钟,排干,再次覆盖在DMF中的20%哌啶,排水,用20mL DMF洗涤两次,然后用20mL二氯甲烷洗涤六次。通过将0.5mmol的P5mmoc保护的氨基酸溶解在1ml的DMF中以1mL为0.45,通过将0.5mmol的氨基酸溶解来制备偶联溶液。 m N-HYDROXYBENZOTRIAZOLE /O-benzotriazole-N, N,N ', N' - 六氟磷酸溶液溶液。加入二异丙基乙胺(150μL),终浓度为7%。然后将偶联溶液加入到树脂中并静置6-12小时。为了避免缺失,硫酸化酪氨酸残基后之后的每种氨基酸都是双偶联的。合成完成后,将肽在2℃下在90%三氟乙酸中同时切割并在90%三氟乙酸中脱保护。然后将肽在寒冷乙醚中沉淀,并通过反相HPLC纯化。
      抗原肽的一部分通过羧基末端半胱氨酸生物素化。 Pep1,Pep2和Pep1s溶解在缓冲液中至800μm,而Pep2s溶解在100μm。向肽加入等摩尔量的EZ-链路聚环氧乙烷 - 碘乙酰基苯(Pierce),并将溶液在室温下在黑暗中保持90分钟。然后将反应储存在-20℃。通过质谱法证实肽的生物素化。
      试剂磺酸 - SMCC(Pierce)用于将抗原肽的一部分与BSA和卵磷蛋白(OVA)的伯胺交联。 BSA和OVA溶解在20米 m Na2 HPO. 4, 30 mm NaCl,pH 7.2,终浓度为8mg / ml。根据制造商的说明,将Sulfo-SMCC溶解在水中,并在35倍过量和20倍过量的OVA中加入BSA。使反应在室温下进行1小时,将未反应的磺基-SMCC在浓缩液中除去,其中10,000分子量截止(Ambion)。 Pep1,Pep1s和Pep2溶解在PBS中,并在3倍过量的改性BSA和OVA中加入,而Pep2s以0.2的含量比例加入。将该肽和蛋白质的混合物在室温下保持12小时,然后冷冻。尽管BSA和OVA的异质糖基化使得难以获得清洁质谱,但是可以看到由抗原肽质量分离的一系列新的较重峰(数据未示出)。

       选择 -

      将免疫管(Nunc)在4℃下涂有抗原过夜,在1mL PBS中为10μg抗原。然后用PBS洗涤免疫管,用2%的PBS封闭,在PBS中封闭,并在37℃下留下1小时。在加入免疫管之外,1ml等分试样的噬菌体显示的SCFV文库(
      • SBLOTTERTO D.
      • 布拉德伯里A.
      利用单细菌的重组以制备大噬菌体抗体库。
      )( 1013 噬菌体/ ml)含有30分钟的30分钟,1nmol Free Pep1或Pep2和3mg BSA或OVA。封闭后,用PBS洗涤抗原涂覆的免疫管3次,并加入封闭的文库等分试样在室温下孵育3小时。然后用PBS中的0.1%吐温20洗涤免疫管,并用PBS两次洗涤两次。在37℃下在1mg / ml胰蛋白酶中孵育30分钟,在1mg / ml胰蛋白酶中洗脱结合的噬菌体。
      为进一步回合的选择,从第一和第二回合选择的洗脱噬菌体进行放大。 10%的洗脱噬菌体用于在中隙阶段感染900μL的DH5αFT,而其余部分被冷冻。细菌已成长为2×YT(16g胰蛋白酶,10g酵母提取物,5g NaCl,调节至pH 7)/15μg/ ml四环素,3%葡萄糖。 (除了在SCFV表达期间,所有细菌生长都发生在3%葡萄糖的存在下。)为了进行感染,将噬菌体和细菌混合在一起并在37℃下保持30分钟,而不会摇动细菌用KM13辅助噬菌体感染(
      • Goletz S.
      • Christensen P.A.
      • Kristensen P.
      • Blohm D.
      • Tomlinson I.
      • 冬季G.
      • karsten u.
      通过噬菌体展示选择大多样性抗型抗体碎片。
      )以相同的方式,并在30℃下以2×YT50μg/ ml氨苄青霉素,50μg/ ml卡那霉素在30℃下生长过夜。用第三轮输出感染的DH5αft在2×YT AMPGLU板上镀。除了代替胰蛋白酶之外,使用酪氨酸硫酸硫化洗脱的选择除了胰蛋白酶之外,10米 m 酪氨酸硫酸酯用于洗脱。

       识别表达SV5标签的输出噬菌体

      使用Q-Bot Colony拾取器(Genetix)挑选来自最终圆的细菌克隆,接种到含有2×Yt Ampglu的384孔板中,并在30℃下在不摇动的情况下生长过夜。生长后,将培养物复制到UV光灭菌的硝酸纤维素片上,然后将其置于新鲜的2×YT Ampglu板上,细菌斑点,并在30℃下孵育过夜。第二天,每张384个菌落作为离散点可见。通过将纸张转移到2×YT AMP的新鲜板,100μm m IPTG并在25℃下孵育3-6小时。诱导后,将硝酸纤维素片置于氯仿的开放容器旁边的湿纸巾上,纸张和氯仿用塑料盒覆盖15分钟。然后将片材在裂解缓冲液中进行16-H孵育(100米m Tris, pH 7.8, 150 mm NaCl, 5 mm MgCl2,1.5%(w / v)bsa,1μg/ ml胰腺DNase I,40μg/ ml溶菌酶)和TNT缓冲液中的两次洗涤(10米m Tris, pH 8, 150 mm NaCl,0.05%(v / v)吐温20)。使用潮湿的组织用于物理去除菌落的所有痕量,并且在TNT缓冲液中洗涤片第三次。洗涤后,将片材浸没在封闭缓冲液(TNT,3%(W / V)BSA)中30分钟,然后转移到含有1:500稀释的封闭缓冲液中的SV5抗体(
      • 汉克T.
      • Szawlowski P.
      • 兰德尔r.e.
      使用标签特异性单克隆抗体和标签连接的抗原构建含有Simian免疫缺陷病毒P27的固体基质 - 抗体 - 抗原复合物。
      )1小时。用0.1%BSA,TNT的TNT洗涤片材10分钟,用0.1%BSA和0.1%NONIDET P40,然后用0.1%BSA TNT。副抗体,山羊α-小鼠与碱性磷酸酶(DAKO)缀合,在阻断缓冲液中稀释1:2000,并与片材孵育2小时,然后洗涤如原发性抗体。用5-溴-4-氯-3'-吲哚基酯开发的片材 p - 用阳性(SV5阳性)菌落鉴定为蓝色的卤素和硝基唑氯化物(Pierce)。

       识别绑定选择的背景组件的SCFV片段 -

      将SV5阳性菌落挑选到填充100μL/孔2×YT AMP / Glu的96孔板中,并在37℃下孵育直至它们达到中间阶段。然后将细菌旋转,并用100μl/孔2×Yt amp / IPTG替换培养基(0.1米m)。在25℃下诱导过夜诱导后,制备SCFV片段的粗分离物。将细胞沉淀,每孔收集80μl培养基,丢弃剩余部分,将细胞重悬于20μl的周质缓冲液(50米中20%蔗糖中m Tris, pH 8, with 1 mm EDTA)。然后将细胞在4℃下孵育15分钟并沉淀,并将10μl上清液加入到80μl先前收集的诱导培养基中。该原油制备含有SCFV释放到生长上清液中以及保留在周质中的SCFV。然后将其用1%鱼明胶在PBS中稀释2倍并在4℃下保持直至使用(小于4小时)。
      这些SCFV准备用于ELISA,以确定SCFV片段是否与免疫管选择的背景组分结合。使用BSA和OVA组合的37℃温育(在总浓度为12μg/ mL的PBS中)涂覆免疫冰板(Nunc)。孵育后,弃去抗原,用200μlPBS洗涤孔。然后将平板封闭1小时,在PBS中具有200μL/孔4.5%的鱼明胶。弃去封闭溶液,用200μLPBS洗涤孔两次,加入100μl粗SCFV溶液。使SCFV片段在室温下孵育90分钟,然后用200μL/孔PBS洗涤两次。加入100μl稀释1:2000的PBS中的SV5,加入1%鱼明胶,在室温下1小时后,除去抗体溶液,用200μL/孔PBS洗涤孔两次。第三抗体,与辣根过氧化物酶(DAKO)缀合的山羊α-小鼠,在PBS中稀释1:4000,用1%鱼明胶,加入100μl。在室温下1小时后,除去抗体溶液,用三个200-μL等分试样的PBS洗涤孔,0.1%吐温20,然后是300μL等分试样的PBS。用3,3,5,5-四甲基苯胺(Pierce)开发板。用于背景结合的ELISA,使用碱性磷酸酶报告者以类似的方式进行。唯一的差异在第三抗体和信号的发育中。对于第三抗体,使用1:2000稀释于具有1%鱼明胶的PBS中与碱性磷酸酶(DAKO)缀合的山羊α-小鼠的稀释率。孵育和洗涤作为辣根过氧化物酶的报告者后,使用信号使用 p - 硝基苯基(Pierce)。

       鉴定结合酪氨酸硫酸盐的SCFV片段 -

      检测与酪氨酸硫酸酯结合的最初的ELISA基本上作为ELISA检测背景结合。唯一的差异是吸附硫酸化抗原而不是选择的背景组分。在鉴定特异性识别硫酸化酪氨酸残基的单个SCF上时,蛋白质如下纯化。

       活性SCV-的表达和部分纯化

      用SCFV转化的XL-1蓝色能量细胞(Stratagene)(在Pdan5(
      • SBLOTTERTO D.
      • 布拉德伯里A.
      利用单细菌的重组以制备大噬菌体抗体库。
      ))在3毫升2×Yt Ampglu中生长过夜。该起始培养物用于接种500ml 2×Yt Ampglu的培养物。在造粒到中腔细胞的生长后,重新悬浮于2×YT放大器,250μm isopropyl α- D- 硫代酰酰亚胺(Invitrogen),并在25℃下孵育过夜。然后将细胞沉淀,并将培养基通过0.22μm过滤器(氧乙烯)过滤,并用10,000分子量截止透析盒(Pierce)透析磷酸盐缓冲盐水。将SCFV储存在4°C。通过Western Blotting SDS-PAGE确认SCFV的存在。

       硫酸酶治疗酪氨酸硫酸化蛋白 -

      下列酪氨酸硫酸化蛋白购自Sigma:IgM(小鼠),纤维蛋白原(大鼠),甲状葡萄球菌素(猪),纤维蛋白原馏分1S(牛),纤维蛋白原馏分IV(牛),血红素(Hirudo Medicinalis.)和vitronectin(人)。人体IGM购自Chemicon International。将蛋白质分为2×0.5mg等分试样并溶解在0.067中 m 乙酸钠在pH5.5处。将1.5mg鲍鱼硫酸淀粉酶(Sigma)加入其中一种管中,将两个样品在37℃下置于37℃过夜。通过将管子放置在冰上30分钟后止止酶反应,然后在PBS中稀释。使用20单位的血红素和5μgvitronectin,相应地减少了硫酸酶量。 SDS-PAGE分析蛋白质以评估降解水平。

       SCFV,SCFV-碱性磷酸酶(AP)和IG Elisas-

      将96孔Maxisorp微孔板(Nunc)涂有4℃的抗原过夜。对于肽,首先用链霉抗生物素蛋白(10μg/ ml)涂覆板,然后用生物素化的PEP1,PEP1S,PEP2,PEP2S或100μL的BSA(10μg/ mL) - 百分比PEP1,PEP1S,PEP2和PEP2S加载。 。对于其他抗原,如果用硫酸酯处理蛋白质,则在PBS或硫酸酶缓冲液中以100μl涂覆在10μg/ ml的蛋白质。在4℃下孵育过夜后,用PBS洗涤板三次,并在PBS或奇迹嵌段(0.3%BSA,0.3%牛奶,0.3%鱼明胶)中封闭100μL4.5%的鱼明胶(Sigma)。在室温下1小时后,将板用PBS洗涤三次,向每个孔中加入100μl部分纯化的SCFV溶液1.5小时。如上用上洗涤板,并将100μL二次抗体小鼠抗SV5加入到每个孔中并留下1小时。用1%鱼明胶在PBS 1:2000中稀释二次抗体。然后将板洗涤,并加入到每个孔中加入100μl与碱性磷酸酶(Sigma)缀合的山羊抗小鼠。将第三抗体在含有1%鱼明胶的PBS中稀释1:2000。 1小时后,用含有0.05%Tween 20(Sigma)的PBS洗涤板3次,然后用PBS洗涤三次。最后加入100μl碱性磷酸酶底物缓冲液(Bio-rad或Pierce)。在发生显着的颜色变化之后,通过在450nm处读数来量化板。
      在AP融合的情况下,在100μl0.1×奇迹块的情况下,每孔加入1μg纯化的SCV-AP,而不是SCFV,并且不加入另外的抗体。除了使用1μg/孔IgG之外,同样地进行IgG ELISA,使用抗人AP在1:2000稀释(Santa Cruz Biotechnology)中检测信号。

       SCFV-AP蛋白的构建和纯化 -

      从噬菌体展示载体中切除SCFV基因,并使用BSSHII和NHEI限制酶克隆到PEP-AP载体中。 PEP-AP载体是PET22B的衍生物,其中编码碱性磷酸酶的基因从PSKAP / S载体中亚克隆(
      • 格里普r.a.
      • van Twisk C.
      • Kerschbaumer r.j.
      • 哈珀K.
      • 托兰斯L.
      • Himmler G.
      • van der狼金。
      • Schots A.
      PSKAP / S:一种表达载体,用于生产单链Fv碱性磷酸酶融合蛋白。
      )进入PET22B,使得SCFV片段可以使用BSSHII和NHEI从PDAN5噬菌体显示文库载体中直接克隆。
      在250ml自动化培养基中生长后纯化SCFV-AP蛋白(
      • 秘书F.W.
      通过高密度振荡培养的自动诱导蛋白质产生。
      )在18℃下40小时。将细菌沉淀重悬于10ml PBS中并使用Emusiflex C5(Avestin Inc.)均化。在20,000×以20,000×离心后 g 20分钟去除细胞碎片,他的6通过在制造商的说明之后使用生物LP系统(BIO-RAD)通过固定金属亲和色谱法纯化-GGG-AP蛋白。

       IgG的构建,表达和纯化 -

      如前所述,从所选的SCFV克隆产生atrsigg(
      • Maccallum r.m.
      • 马丁A.C.
      • 桑顿金。
      抗体 - 抗原相互作用:接触分析和结合位点形貌。
      )。简而言之,VH基因从其SCFV表达噬菌体克隆扩增,用底漆对25stVH5'(GTA CCA ACG CGT GTC CTC CTG C​​TG C​​TG GTG GTG GTG GTG GTG GTG GTG GTG GTG TGA GGA GAC GGT GAC CAG GGT通过PCR,用Mlui和NHEI消化纯化的DNA片段,并将其连接到人IgG1表达载体N5Kg1Val-Lark(来自Mitch Reff博士,Idec Pharmaceuticals,San Diego,CA)和含有正确VH的克隆通过DNA测序鉴定基因。从与引物对25stvk5'(Tac Tcg CaA GCG GTG CAC GAT GTG CAA TTG TGT TGT CAC AGT CTC C)和25stVK3'(TAT ATA CGA Agt Tat Tat Tat Tat Tat Tat Tat Tat Tat Tat Tat Tat Tat Tat GGT CGA CCC CGT ACG TTT GAT ATC CAC TTT C)并克隆到PCR-2.1载体(Invitrogen)中。通过DNA测序鉴定含有正确VK基因的克隆。从PCR-2.1载体与DraiII和BsiWi载体切除VK基因,并将其连接到含有适当的VH基因的Draiii-和Bsiwi消化的N5kg1Val-Lark DNA中。通过DNA测序鉴定含有正确VH和VK基因的克隆,用载体DNA通过电穿孔来转染中国仓鼠卵巢DG44细胞。通过在G418中选择稳定的细胞系,并扩增成1升旋转瓶。收集含有IgG的上清液并在蛋白G柱上纯化(GE Healthcare)。通过天然和减少的SDS-PAGE评估亲和纯化的IgG,并确定最终股票的蛋白质浓度 A280 nm.

       西部分析SCFV-AP和IgG-

      使用4-12%梯度NoVEX丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离抗原,并使用半革电解将电转移到硝酸纤维素上。抗原加载以下量: 大肠杆菌 细胞提取物,30μg;硫酸酶,28μg;三种纤维蛋白质,10μg; C4,0.75μg;和vitronectin,10μg。在分析之前,使用奇迹块溶液堵塞印迹至少30分钟。将200μg或50μg的SCV-AP稀释在10ml 1×奇迹块中,并与转移的印迹孵育1小时。然后用吐温30(两次)的PBS洗涤印迹10分钟,然后用PBS(两次)。在类似洗涤后使用碱性磷酸酶标记的抗人(Santa Cruz Biotechnology)抗体检测结合的IgG。使用5-溴-4-氯-3'-吲哚基酯检测碱性磷酸酶活性 p - 吲哚和硝基唑氯化物(Pierce)。

       酪氨酸硫酸盐竞争ELISA测定 -

      牛纤维蛋白原IV使用EZ-Link磺酰化生物素化N - 羟基琥珀酰亚胺LC-LC生物素化试剂盒(Pierce)。将5μg的生物素化抗原与2mg SCV-AP一起在竞争的化合物(酪氨酸硫酸盐,酪氨酸磷酸盐和酪氨酸)的存在或不存在下孵育1小时,在5米处m。与抗体一起孵育后,使用翠鸟磁性颗粒处理器(热电子)将生物素化抗原与结合的SCV-AP转移到连续的孔中。将10μL链霉抗生物素蛋白涂覆的磁珠(染料)用于每个样品,并孵育10分钟。随后进行3×PBS,随后进行3×PBS,使用磷酸酶底物试剂盒(Pierce)检测洗涤后的AP信号。除了使用5μg抗原和1μg的IgG之外,与IgG的ELISA类似地进行;在第一次洗涤之后,将复合物与1:2000稀释的抗人AP孵育1小时,并在测量之前再次洗涤。报告的405nm处的吸光度表示背景减法后获得的最终值。

      结果

       合成肽抗原 -

      在中央上用硫酸盐组合成两种肽序列 下划线 tyrosine (图。1B)。 Pep1的序列基于PSGL-1的硫化位点,而Pep2是旨在与Pep1不同的合成非天然序列。使用标准化学在施加的生物系统431A肽合成器上容易地完成非硫酸化肽的合成。硫酸化肽更加困难,需要双偶联。尽管使用双偶联,但两种硫酸肽都以低产率制备。通过反相HPLC纯化后,肽抗原偶联至BSA,OVA或Biotin,如图所示 图1C.。首先将肽命名为其载体(BSA或OVA),然后是肽(BSA-1),然后用于酪氨酸硫酸盐改性(BSA-1S)的存在或不存在。

       SCFV选择 -

      如前所述,以前观察到具有相同抗原和同一库的不同选择过程产生不同的SCFV片段(
      • 卢杰。
      • 斯隆S.
      用于克隆噬菌体展示抗体的交替选择策略。
      ,
      • 爱德华兹下午
      • Barash S.C.
      • 主要的S.H.
      • Choi G.H.
      • minter r.
      • Ullrich S.
      • 威廉姆斯E.
      • du fou l.
      • 威尔顿J.
      • Albert v.r.
      • 鲁本三
      • 沃恩·哈杰。
      人抗体曲目的显着灵活性;将超过一千种不同抗体的分离为单个蛋白质,BLY。
      ),采用了14种不同的选择策略(见 表I.)使用上述抗原。通过改变载体(BSA,卵烧蛋白或生物素),肽(肽1或2),以及在不同选择中的洗脱方法(胰蛋白酶或酪氨酸),包括在不同的圆形和包括与与与同一载体连接的非硫酸肽之间封闭剂在选择期间,希望分离识别酪氨酸硫酸酯的抗体,每种选择的共同组分,将被分离。
      T 有能力的 I使用的不同选择策略,表明每轮的抗原和洗脱方法使用
      第1轮第2轮第3轮洗脱
      策略1:严格
      选择1BSA-1SOVA-2S生物素-1胰蛋白酶
      选择2.OVA-1S生物素-2BSA-1S胰蛋白酶
      选择3.生物素-1BSA-2SOVA-1S胰蛋白酶
      策略2:非严格
      选择4.BSA-1SOVA-1S胰蛋白酶
      选择5.OVA-1S生物素-1胰蛋白酶
      选择6.生物素-1BSA-1S胰蛋白酶
      策略3:具体洗脱
      选择7.BSA-1SOVA-1STyrfate.
      选择8.BSA-2SOVA-2STyrfate.
      选择9.OVA-1SBSA-1STyrfate.
      选择10.OVA-2SBSA-2STyrfate.
      策略4:解决方案互动
      选择11.生物素-1生物素-1胰蛋白酶
      选择12.生物素-1生物素-2胰蛋白酶
      选择13.生物素-2生物素-1胰蛋白酶
      选择14.生物素-2生物素-2胰蛋白酶
      首先用上述一种抗原(直接吸附BSA和卵氨酸蛋白缀合物的ImmunoTubes(Nunc);捕获用于生物素缀合物的链霉抗生物素蛋白涂覆的免疫管)。用鱼明胶堵塞后(
      • 刘B.
      • 黄兰
      • sihlbom c.
      • 伯灵名A.
      • 标记J.D.
      通过噬菌体展示探讨蛋白质组的单克隆抗体。
      ), 1013 将显示SCFV片段的噬菌体中加入免疫管中,以含有4.5%鱼明胶和抗原形式的抗原作为阻断剂的溶液中。孵育3小时后,用胰蛋白酶洗脱保留的噬菌体,其从噬菌体中消化SCFV(
      • Goletz S.
      • Christensen P.A.
      • Kristensen P.
      • Blohm D.
      • Tomlinson I.
      • 冬季G.
      • karsten u.
      通过噬菌体展示选择大多样性抗型抗体碎片。
      )或10米m 硫酸酪氨酸。预计胰蛋白酶将通过SCFV释放所有与靶靶向靶的噬菌体(而不是非纯粹),而希望酪氨酸硫酸盐将洗脱硫酸酯硫酸盐特异性噬菌体。除了免疫管选择外,还使用链霉抗生物素蛋白磁珠在溶液中进行选择,以收获与在磁珠上捕获的生物素化肽结合的噬菌体。

       鉴定以酪氨酸硫酸盐依赖性方式结合的SCFV -

      初步检查从严格和非严格的选择中随机选择的288个克隆(策略1和2)显示没有针对酪氨酸硫酸盐的特异性(未示出的数据),许多似乎由截短的克隆组成。当靶抗原以非常低的浓度存在时,我们观察到以前通过截短的克隆统治选择,或者选择不简单。在所描述的选择策略中,唯一的常见目标是酪氨酸硫酸盐,表位相对较小。作为结果截断的克隆,含有暴露的疏水性表面和相对非特异性的结合,可能能够占主导地位。因此,我们决定筛选更多数量的克隆(表二)。挑选了不同选择策略之间的近8000个克隆(汇集了前两种策略的克隆)。然而,而不是立即筛选对(珍贵的)硫酸盐抗原的所有SCFV片段,我们将这些克隆进行了两次初步测试:首先是用SV5肽标签置于框架中,并将这些SCFV碎片是否能够与A结合选择(肽,载体或阻断剂)的背景组分。 SCFV库已在SCFV的羧基末端的SV5标签构建(
      • SBLOTTERTO D.
      • 布拉德伯里A.
      利用单细菌的重组以制备大噬菌体抗体库。
      )。对SV5反应性的筛选确定了那些在检测极限高于检测极限的水平下正确翻译的克隆,表明将表达不良克隆的最小表达水平。虽然我们希望这将丰富全长克隆,但表达框架的内易删除( 例如 VH或VL域)也应该通过这种方法来富集。
      T 有能力的 II克隆筛查综述
      不。挑选SV5阳性背景负面硫酸盐依赖性结合
      噬菌体盟友SCFV ELISA.
      策略1:严格;策略2:非严格3810129585591
      策略3:具体洗脱573243174241
      策略4:解决方案互动3528211718630
      使用免疫载覆方法检测SV5阳性克隆(
      • de wildt r.m.
      • MUNDY C.R.
      • 戈里克B.D.
      • Tomlinson i.M.
      抗体阵列用于抗体 - 抗原相互作用的高通量筛选。
      )。在微量滴定板中过夜生长后,使用Q-Bot拾取机器人将菌落复制到UV光灭菌的硝酸纤维素上。然后将该硝酸纤维素置于细菌侧,到新鲜的琼脂平板上。过夜生长后,通过将硝酸纤维素片移动到含有0.25μm的新鲜琼脂平板上诱导SCFV表达m IPTG。然后裂解菌落,用SV5探测硝酸纤维素(
      • 汉克T.
      • Szawlowski P.
      • 兰德尔r.e.
      使用标签特异性单克隆抗体和标签连接的抗原构建含有Simian免疫缺陷病毒P27的固体基质 - 抗体 - 抗原复合物。
      )和山羊抗小鼠与碱性磷酸酶缀合。根据所用的选择策略,34-60%的克隆对于SV5表达是阳性的。
      然后测试SV5结合阳性的克隆,以便分别与BSA,卵素和鱼明胶,载体和阻断蛋白质的混合物结合。使用该蛋白质混合物作为抗原的ELISA发现,12-34%的SV5阳性克隆可与选择的背景组分结合,并且也被排除在随后的分析之外。
      测试其余2892个SCFV片段的能力,其特异性并独立于序列上下文作为噬菌体抗体。使用BSA-1,BSA-1S,BSA-2和BSA-2S作为抗原进行一系列ELISA,并且31个克隆似乎以硫酸盐依赖性方式结合肽中的一个或另一个(数据未显示) )。将这些31个克隆进一步测试硫酸盐特异性结合,作为可溶性SCFV片段,而不是噬菌体,并且仅鉴定出两种含量以硫酸盐依赖的方式结合PeP1和Pep2s(Fig. 2)。其中一种(SCFV 25)源自策略1/2池,而第二种(SCFV 31)衍生自酪氨酸硫酸盐洗脱。另外,两个克隆(SCFV片段2和9)同样良好地结合了所有四个靶,并且有些似乎识别所有四个靶标,偏好肽(SCFV片段4,23,28和30),然而,其他人对其中一种肽而不是修饰(SCFV片段5,6,8,10,26和29)。肽抗原和载体蛋白之间的接头是所有四种蛋白质之间的唯一常见结构,这可能是识别所有四个靶标的那些克隆的表位。回想起,可以预测该结果,因为文库未被溶解的接头封闭,并且在载体蛋白是载体蛋白的方式中没有在选择之间切换接头。
      图缩略图GR2.
      图2。A,可溶性SCFV ELISA结果,噬菌体ELISA鉴定的22种稳定阳性克隆。 B,具有两个克隆SCFV 25和SCFV 32的确认ELISA,鉴定为以硫酸盐依赖性的方式结合。 BSA-1SBSA-1 代表含有硫酸化和非硫酸化形式的BSA偶联的肽1。
      鉴于依赖于硫酸盐的时尚肽的两个SCFV片段在硫酸化和非硫酸化肽上重新测试(图。2B),并确认了它们的反应性。对两个克隆进行测序并发现相同。

       对自然靶标结合的特征 -

      为了进一步表征该抗体的结合特异性,我们还评估了SCFV识别天然酪氨酸硫酸化蛋白的能力(
      • 摩尔K.L.
      蛋白酪氨酸O-硫酸化的生物学和酶学。
      )通过用三种蛋白质进行蛋白质是酪氨酸硫酸化的elisas:纤维蛋白原(
      • Hirose S.
      • oda k。
      • Ikehara Y.
      大鼠肝细胞原代培养中纤维蛋白原γb链的酪氨酸O-硫化。
      ),甲肾上腺素(
      • 景观
      • nlend m.c.
      • Cauvi D.
      • chabaud o.
      猪甲状腺球蛋白的激素介质酪氨酸5是硫酸化的。
      )和大鼠IgM(
      • baeuerle p.a.
      • HUTTNER W.B.
      酪氨酸硫酸化是特异性特异性蛋白质改性。
      )。这些蛋白质购自商业来源,并没有以其他方式检测磺替蛋白改性。 SCFV认识到所有三种蛋白质,唯一的常见特征是酪氨酸硫酸盐改性。这可以用鲍鱼硫酸淀粉(
      • 赫罗特V.
      分泌硫酸化甲状腺蛋白。
      ,
      • Suiko M.
      • 刘米。
      3Y1分泌纤连蛋白在酪氨酸-O-硫酸酯脱硫时改变3Y1分泌的纤连蛋白的变化。
      ),并且显示该处理显着降低了SCFV ELISA信号(图3A)。然而,硫酸酶治疗之前和之后通过SDS-PAGE对蛋白质的检查表明存在来自硫酸酶的显着涂片的存在和甲状腺蛋白和纤维蛋白原的量(特别是甲状腺蛋白)的量,而大鼠IgM的水平保持相对恒定。大鼠IgM具有抗体的最高信号和用硫酸酶处理后的最大信号还原(图3B.),表明信号还原可能是由于硫化的丧失,而在甲状腺蛋白和纤维蛋白原的情况下,一些信号损失可能也是由于蛋白水解。
      图缩略图GR3.
      图3。A,可溶性SCFV对硫酸化和非硫酸化肽的ELISA反应性,并已知已知硫酸酯。 B,在ELISA中使用的蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳 A,显示硫酸酶治疗的影响。
      由于纯化的SCFV表达不当,产生了两种重组形式的更大稳定性:全长IgG和SCFV-AP融合蛋白(
      • 格里普r.a.
      • van Twisk C.
      • Kerschbaumer r.j.
      • 哈珀K.
      • 托兰斯L.
      • Himmler G.
      • van der狼金。
      • Schots A.
      PSKAP / S:一种表达载体,用于生产单链Fv碱性磷酸酶融合蛋白。
      ,
      • Lindner P.
      • 鲍尔K.
      • Krebber A.
      • Nieba L.
      • 克雷默E.
      • Krebber C.
      • 霍格格A.
      • Klinger B.
      • Modikat R.
      • Pluckthun A.
      用重组抗HIS标签SCFV-磷酸酶或SCFV-噬菌体融合的特异性检测他标记的蛋白质。
      ,
      • Bourin P.
      • 伺服A.
      • 拉伸J.J.
      • Goyffon M.
      • VAUX D.
      • Billiald P.
      用重组单链抗体/碱性磷酸酶缀合物的CD3阳性淋巴细胞的免疫标带。
      ,
      • Muller B.H.
      • Chevrier D.
      • Boulain J.C.
      • 古斯登J.L.
      重组单链FV抗体片段 - 碱性磷酸酶缀合物用于分子杂交的一步免疫。
      ,
      • 汉诗。
      • Karatan E.
      • Scholle M.D.
      • McCafferty J.
      • 凯斯。
      碱性磷酸酶融合的噬菌体显示输出加速筛选。
      )。这些都是二聚体,发现在4°C下几个月稳定。通常,IgG更容易使用并倾向于提供更强烈的信号,而SCFV-AP融合具有不需要二抗的优点。 ELISA与IGG显示,它识别来自水蛭的血红素,三种不同形式的纤维蛋白原(级分1s(牛),纤维蛋白原馏分IV(牛)和纤维蛋白原(大鼠)),以及补体C4(Fig 4A)在硫酸酶处理时,信号丢失。有趣的是,我们注意到为不同蛋白质获得的ELISA信号与硫酸化酪氨酸的数量之间的相关性,分别具有最高的ELISA信号并分别具有三个和两个硫酸化酪氨酸(图。1D)。 SCFV-AP缀合物用于分析与人VITRONECTIN的结合(其无法用IgG测试,因为它具有次级抗人抗体的强不特异性信号)并确认与人IgM的结合(图4B.)。但是,可以从中看到 图4C.除IgM和C4外,硫酸酶治疗后再有显着的蛋白水解。
      图缩略图GR4.
      图4。A,ELISA与全长IgG进行,抗一些硫酸盐蛋白质。 B,用SCFV-AP融合蛋白进行ELISA。 C,硫酸酶治疗前后分析的蛋白质页面。 FB. ,纤维蛋白原; B1S,牛馏分1s; 比夫 ,牛馏分iv。
      为了进一步证明抗体的抗体的特异性硫酸盐修饰,具有基于磁性珠粒的ELISA(翠鸟,热电子Inc.),以了解可溶性酪氨酸硫酸盐可以抑制抗体结合。生物素化的牛纤维蛋白原IV,抗磺酰胺抗体和PBS,5米m 酪氨酸硫酸盐,5米m 酪氨酸磷酸盐,或5米m 将酪氨酸一起温育1小时。在此期间之后,通过添加链霉抗生物素蛋白磁珠,然后洗涤,评估与生物素化纤维蛋白原结合的抗体的量。可以看出 图5A,孵化5米m 酪氨酸硫酸盐将信号降低到背景水平,而酪氨酸磷酸盐和酪氨酸没有任何影响,表明结合的特异性。使用SCFV-AP融合获得了类似的结果(图5B.)和溶菌酶和抗溶菌酶抗体的对照实验表明,信号抑制不是由于由酪氨酸硫酸酯(数据未显示的数据)引起的非特异性抑制作用。通过滴定抑制结合所需的酪氨酸硫酸盐的量进一步研究该抑制。可以看出 图5C.,10米m 酪氨酸硫酸盐观察到几乎完全抑制,而在〜25米处看到半最大抑制m.
      图缩略图GR5.
      图5。A,抑制IgG与酪氨酸硫酸盐孵育时对牛纤维蛋白酶原IV的抑制( Tyrs. )但不是酪氨酸或酪氨酸磷酸盐( Tyrp. )。 B, 和...一样 A 除了使用SCFV-AP融合。 C,通过增加酪氨酸硫酸盐浓度滴定IgG与纤维蛋白原IV的抑制。 ABS. ,吸光度。
      我们还确定抗体是否能够识别Western印迹中的酪氨酸硫酸盐改性。用抗人的IgG进行各种纤维蛋白聚糖和C4的分析,而抗人AP,而使用SCFV-AP缀合物测定vitronectin,因为它与第二抗体产生非常高的背景。通过与Coomassie蓝带的强度不相关的信号强度清楚地识别每种蛋白质,表明可见带差异硫酸化。将这些蛋白质用鲍鱼硫酸淀粉酶处理处理,调节以减少每种蛋白质的蛋白水解(图6A)。可以看出,在硫酸酶治疗后,每种蛋白质的西部信号被废除或显着降低(图6B.)不影响蛋白质本身的完整性。作为 大肠杆菌 不表达任何硫酸化蛋白质,缺乏酶机,通过探测重载,我们测试了抗体的非特异性结合程度 大肠杆菌 提炼。可以看出 lane 1,无论如何都没有获得信号,表明抗体不能与各种阵列反应 大肠杆菌 在正常生长条件下表达的蛋白质。
      图缩略图GR6.
      图6。A,处理不同蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳(车道5., 7, 9, 11 , 和 13)并未治疗(车道1, 4, 6, 8, 10 , 和 12)用鲍鱼硫酸糖酶。 B,相同的蛋白质 A 使用IgG进行蛋白质印迹分析(车道1-11)或SCFV-AP融合(车道12.13 )。 Lane 1, 大肠杆菌 提炼; lane 2,鲍仑硫酸酯; lane 3,标记; 车道4.5,纤维蛋白原1s; 车道6.7,纤维蛋白原IV; 车道8.9,大鼠纤维蛋白原; 车道10.11,人类c4; 车道12.13,Vitronectin。

      讨论

      识别PTMS的抗体独立于它们所染色的蛋白质,已被证明是罕见的。通过使用通用PTM特异性抗体进行免疫沉淀,可以在不同的实验条件下鉴定并监测PTM的所有蛋白质(
      • Aulak K.S.
      • Koeck T.
      • Crabb J.W.
      • Stuehr D.J.
      酪氨酸氮化蛋白鉴定蛋白质组学方法。
      ,
      • Pandey A.
      • Fernandez m.m.
      • 斯丁H.
      • Blagoev B.
      • Nielsen M.M.
      • 罗氏S.
      • 寄生H.F.
      鉴定一种新型免疫聚氨酯酪氨酸基激活基序分子,STAM2,通过质谱法及其参与生长因子和细胞因子受体信号传导途径。
      ,
      • 布里姆
      • Salomon A.R.
      • Ficarro S.B.
      • Mukherji M.
      • Stetller-Gill M.
      • 彼得斯e.c.
      使用固定化金属亲和色谱法和串联质谱法从人T细胞中培养酪氨酸磷酸化位点的鲁棒磷蛋白酶分析。
      ,
      • Salomon A.R.
      • Ficarro S.B.
      • 布里姆
      • 布兰特A.
      • Phung Q.T.
      • Ericson C.
      • Sauer K.
      • 布洛克A.
      • 喇叭d.m.
      • 舒尔茨P.G.
      • 彼得斯e.c.
      用质谱法在人细胞中的酪氨酸磷酸化途径分析。
      ,
      • Aulak K.
      • Miyagi M.
      • 燕L.
      • 西K.
      • Massillon D.
      • Crabb J.
      • Stuehr D.
      蛋白质组学方法鉴定炎症攻击期间体内硝化的蛋白质。
      )。遗憾的是,通过免疫,证明它非常难以孤立这种抗体,反映先天耐受免疫系统具有这种普遍存在的蛋白质修饰。
      噬菌体展示通过提供克服了这种天生的耐受性 体外 选择条件,完整免疫系统的正常限制不再适用。在文库制成的情况下(
      • Nissim A.
      • hoovenboom H.R.
      • Tomlinson i.M.
      • Flynn G.
      • 中间C.
      • 泳道D.
      • 冬季G.
      来自“单罐”噬菌体展示文库的抗体片段作为免疫化学试剂。
      ,
      • Griffiths A.D.
      • 威廉姆斯S.C.
      • 哈特利O.
      • Tomlinson i.M.
      • 水屋P.
      • Crosby W.L.
      • Kontermann R.E.
      • 琼斯P.T.
      • 低下
      • 艾莉森T.J.
      • prospero t.d.
      • hoovenboom H.R.
      • Nissim A.
      • Cox J.P.L.
      • 哈里森J.L.
      • Zaccolo M.
      • Gherardi E.
      • 冬季G.
      直接从大型合成曲目中分离高亲和力人抗体。
      ,
      • de Kruif J.
      • Boel E.
      • Logtenberg T.
      具有设计CDR3区的半合成噬菌体抗体显示文库的人单链Fv抗体片段的选择和应用。
      ,
      • Knappik A.
      • GE L.
      • 霍格格A.
      • 包P.
      • 菲舍尔M.
      • Wellnhofer G.
      • 雪斯A.
      • 狼j.
      • Pluckthun A.
      • virnekas b。
      基于模块化共识框架和与三核苷酸随机化的组合式人组合抗体库(HUCALAL)。
      ,
      • Silacci M.
      • 砖头S.
      • Schirru G.
      • Marlind J.
      • Ettorre A.
      • Merlo A.
      • Viti F.
      • neri D.
      大型合成人抗体噬菌体展示文库的设计,结构和表征。
      ),内源性胚芽线V基因形成多样性的基础,但是至关重要的第三重链高变环是由无随机寡核苷酸产生的,所述无规寡核苷酸从未经过免疫系统进行编辑。结果没有理由为什么他们不应该能够识别自我抗原。在由天然VH和VL基因制成的文库中(
      • 沃恩·哈杰。
      • 威廉姆斯A.J.
      • Pritchard K.
      • 奥斯巴恩J.K.
      • 教皇A.R.
      • expshaw J.C.
      • McCafferty J.
      • hdits r.a.
      • 威尔顿J.
      • 约翰逊K.S.
      具有从大型非免疫噬菌体显示文库中分离的亚纳米摩尔亲和力的人抗体。
      ,
      • 标记J.D.
      • hoovenboom H.R.
      • Bonnert T.P.
      • McCafferty J.
      • Griffiths A.D.
      • 冬季G.
      通过免疫免疫。来自V-基因文库的人抗体显示在噬菌体上。
      ,
      • SBLOTTERTO D.
      • 布拉德伯里A.
      利用单细菌的重组以制备大噬菌体抗体库。
      ,
      • de haard h.j.
      • van neer n。
      • 重生A.
      • HUFTON S.E.
      • rover r.c.
      • HENDEIKX P.
      • 德布劳A.P.
      • arends J.W.
      • hoovenboom H.R.
      一种大型非免疫人Fab片段噬菌体文库,允许快速分离和高亲和力抗体的动力学分析。
      ,
      • 床单M.D.
      • Amersdorfer P.
      • 芬奔r.
      • SARGENT P.
      • Lindqvist E.
      • Schier R.
      • HEMMINGSEN G.
      • 黄C.
      • Gerhart J.C.
      • 标记J.D.
      高效施工大型非免疫噬菌体抗体库;生产高亲和力人单链抗体的面板对蛋白质抗原。
      )但是,尽管重排的V基因受到免疫耐受的影响,但这只发生在原始VH / VL配对的背景下,这提供了特异性,而不是在单个重新排列的V基因本身上。由于这些文库中的抗体由随机VH / VL组合组成,几乎所有这些都是新颖的,形成许多新的特异性,其允许选择针对不同靶标的抗体的抗体,包括自抗原。虽然噬菌体抗体文库已被广泛用于选择针对这种靶标的抗体(
      • 沃恩·哈杰。
      • 威廉姆斯A.J.
      • Pritchard K.
      • 奥斯巴恩J.K.
      • 教皇A.R.
      • expshaw J.C.
      • McCafferty J.
      • hdits r.a.
      • 威尔顿J.
      • 约翰逊K.S.
      具有从大型非免疫噬菌体显示文库中分离的亚纳米摩尔亲和力的人抗体。
      ,
      • 标记J.D.
      • hoovenboom H.R.
      • Bonnert T.P.
      • McCafferty J.
      • Griffiths A.D.
      • 冬季G.
      通过免疫免疫。来自V-基因文库的人抗体显示在噬菌体上。
      ,
      • SBLOTTERTO D.
      • 布拉德伯里A.
      利用单细菌的重组以制备大噬菌体抗体库。
      ,
      • de haard h.j.
      • van neer n。
      • 重生A.
      • HUFTON S.E.
      • rover r.c.
      • HENDEIKX P.
      • 德布劳A.P.
      • arends J.W.
      • hoovenboom H.R.
      一种大型非免疫人Fab片段噬菌体文库,允许快速分离和高亲和力抗体的动力学分析。
      ,
      • 床单M.D.
      • Amersdorfer P.
      • 芬奔r.
      • SARGENT P.
      • Lindqvist E.
      • Schier R.
      • HEMMINGSEN G.
      • 黄C.
      • Gerhart J.C.
      • 标记J.D.
      高效施工大型非免疫噬菌体抗体库;生产高亲和力人单链抗体的面板对蛋白质抗原。
      ,
      • Nissim A.
      • hoovenboom H.R.
      • Tomlinson i.M.
      • Flynn G.
      • 中间C.
      • 泳道D.
      • 冬季G.
      来自“单罐”噬菌体展示文库的抗体片段作为免疫化学试剂。
      ,
      • Griffiths A.D.
      • 威廉姆斯S.C.
      • 哈特利O.
      • Tomlinson i.M.
      • 水屋P.
      • Crosby W.L.
      • Kontermann R.E.
      • 琼斯P.T.
      • 低下
      • 艾莉森T.J.
      • prospero t.d.
      • hoovenboom H.R.
      • Nissim A.
      • Cox J.P.L.
      • 哈里森J.L.
      • Zaccolo M.
      • Gherardi E.
      • 冬季G.
      直接从大型合成曲目中分离高亲和力人抗体。
      ,
      • de Kruif J.
      • Boel E.
      • Logtenberg T.
      具有设计CDR3区的半合成噬菌体抗体显示文库的人单链Fv抗体片段的选择和应用。
      ,
      • Knappik A.
      • GE L.
      • 霍格格A.
      • 包P.
      • 菲舍尔M.
      • Wellnhofer G.
      • 雪斯A.
      • 狼j.
      • Pluckthun A.
      • virnekas b。
      基于模块化共识框架和与三核苷酸随机化的组合式人组合抗体库(HUCALAL)。
      ),令人惊讶的是,没有尝试(或至少发布)以选择针对翻译后修饰的抗体。这里描述的结果表明了可能的解释:而不是筛选96-384个克隆,这几乎总是为大多数靶标产生多种不同的克隆,我们必须在找到具有所需特性的两个相同的克隆之前筛选近8000种不同的克隆。这是这是唯一的克隆,它是使用两个非常不同的选择策略隔离的事实表明它可能是这个非常大的图书馆中这个特异性的唯一一个(
      • SBLOTTERTO D.
      • 布拉德伯里A.
      利用单细菌的重组以制备大噬菌体抗体库。
      )。这表明这种抗体比识别其他靶标更罕见,并且需要广泛的筛选来找到它们。
      对抗体结合位点结构的检查揭示了三个主要的拓扑,腔,凹槽和平坦,结合哈帕特,肽和蛋白质(
      • Almagro J.C.
      鉴定识别不同尺寸抗原的抗体的特异性确定残留物的差异:对抗体曲目的理性设计的影响。
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      • Lara-Ochoa F.
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      免疫球蛋白的抗原结合位点的规范结构曲目表明与免疫识别机制相关的强烈几何限制。
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      • 马丁A.C.
      • 桑顿金。
      抗体 - 抗原相互作用:接触分析和结合位点形貌。
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      • 马丁A.C.
      抗原组合网站的分析:高变环的长度和序列组成与抗原性质之间的相关性。
      ),罕见的抗体显示出替代地形如长的手指状HCDR3凸起(
      • saphire e.o.
      • Parren P.W.
      • Pantophlet R.
      • Zwick M.B.
      • 莫里斯下午
      • rudd下午
      • DWEK R.A.
      • 斯坦菲尔德r.l.
      • 伯顿D.R.
      • 威尔逊I.A.
      中和人IgG的晶体结构对抗HIV-1:用于疫苗设计的模板。
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      • Zwick M.B.
      • Parren P.W.
      • saphire e.o.
      • 教堂S.
      • 王米
      • 斯科特J.K.
      • 道森P.E.
      • 威尔逊I.A.
      • 伯顿D.R.
      识别人免疫缺陷病毒1型GP120所需的宽度中和免疫球蛋白G1 B12的分子特征。
      )。除了多肽修饰外,如泛素化(
      • BUSCH H.
      • goldknopf i.l.
      泛素蛋白缀合物。
      ),大多数PTM都可以被认为是小的哈帕特。然而,与自由的抗振者不同,它们附着于多肽,因此不太可能能够充分地深入地渗透抗体结合位点腔。类似地,它们可能无法被具有平坦或带槽拓扑的抗体识别,而没有识别的药物链的组分。这些严格的结构要求可能解释为什么这种抗体是如此罕见。
      本研究提出了许多不同的证据,以证明该抗体的具体特征,即SCFV,SCFV-AP融合或全长IgG能够识别已知的许多不同的蛋白质是酪氨酸硫酸盐。这些蛋白质没有序列同一性,并且唯一的常见因素是硫酸化酪氨酸残基(图。1D)。虽然用鲍鱼硫酸淀粉处理可以消除结合,但很明显使用的蛋白质(Sigma)被一些蛋白酶活性污染,结果,结合丧失是两种活性的组合。然而,通过仔细滴定,可以减少这种效果(Fig. 6),可以通过维持蛋白质完整性来观察到抗体反应性的丧失。该抗体还能够比未硫化形式更有效地识别两个合成酪氨酸硫酸化肽,并且信号强度似乎取决于所公认的蛋白质的硫化状态。最后和最令人信服地,我们能够抑制抗体与游离酪氨酸硫酸盐的结合,但单独酪氨酸磷酸盐或酪氨酸。该抑制的滴定显示,在1.25米处获得半最大抑制m,表明该抗体也能够在相对低的亲和力下与脂肪酸硫酸无结合。
      虽然我们认为这种方法的应用可能是成功的,但我们期望在类似于所用的文库中的这种抗体的频率同样低,需要类似的广泛筛选用于识别。在此处报告的实验中,使用胰蛋白酶或酪氨酸硫酸盐进行成功洗脱。胰蛋白酶是一种通过蛋白水解去除SCFV的通用方法(
      • Goletz S.
      • Christensen P.A.
      • Kristensen P.
      • Blohm D.
      • Tomlinson I.
      • 冬季G.
      • karsten u.
      通过噬菌体展示选择大多样性抗型抗体碎片。
      )。虽然这种洗脱依赖于显示的SCFV的结合活性,但是不一定是转换后修饰的特定。通过使用高浓度的酪氨酸硫酸盐作为种植体,我们预计洗脱的SCFV片段将特异于改性。在这方面略微醒目的是,酪氨酸硫酸盐的群体(0.17%)的特定SCFV的频率显着高于使用胰蛋白酶(0.026%),反映了用酪氨酸硫酸盐洗脱的事实导致克隆较少。这表明使用高浓度的PTM的可溶性形式可能是最有效的洗脱液,克隆较少,可用于筛选,但呈较高的阳性比例。然而,应该指出的是,由于氨基酸侧链的突出性,如磷酸酪氨酸如磷酸酪氨酸的性质,可以是完整免疫系统和噬菌体抗体文库的背景下的特别抗原性后修饰。如果是这种情况,则选择具有识别替代PTM的类似性质的抗体可能更具挑战性。
      这个图书馆(
      • SBLOTTERTO D.
      • 布拉德伯里A.
      利用单细菌的重组以制备大噬菌体抗体库。
      )基于天然重新排列的人VH和VL基因。而不是使用常规库,可以创建针对识别翻译后修改的特定库独立于其他目标类型(
      • Almagro J.C.
      鉴定识别不同尺寸抗原的抗体的特异性确定残留物的差异:对抗体曲目的理性设计的影响。
      )使用该或其他通用PTM抗体作为支架。在这种情况下,与含酪氨酸硫酸盐的蛋白质复合物中该抗体的结构可以提供有用的信息,包括鉴定参与结合的氨基酸,其突变可以允许选择具有更高亲和力的抗体对于最近用Hapten结合抗体进行的通用修饰或特异性修饰位点(
      • 波尔森H.
      • LANTTO J.
      • 欧姆姆米
      一种重点的抗体文库,用于改善海角识别。
      )。
      虽然对人类基因组的计算分析表明,最多三分之一的蛋白质,进入分泌途径可以是酪氨酸硫酸化(
      • monigatti f.
      • Gasteiger E.
      • Bairoch A.
      • j
      硫化剂:预测蛋白质序列中的酪氨酸硫酸盐位点。
      ),少于70次实验携带酪氨酸硫酸盐(
      • 摩尔K.L.
      蛋白酪氨酸O-硫酸化的生物学和酶学。
      )。这反映了鉴定磺陶蛋白残基的困难,其传统上由酪氨酸的薄层色谱分离进行[35S]从放射性标记蛋白的水解产物硫酸盐(
      • Sako D.
      • Comess K.m.
      • 宝石K.M.
      • Camphausen R.T.
      • cumming d.a.
      • Shaw G.D.
      PSGL-1的氨基末端的硫酸化肽区段对于P-SELETIN结合至关重要。
      )或MS(
      • Onnerfjord P.
      • 希思菲尔德T.F.
      • Heinegard D.
      用质谱法识别鉴定细胞外亮氨酸富含重复蛋白的酪氨酸硫酸盐。
      )硫酸盐基团的存在通常推断而不是经过验证的。这里描述的抗体的分离应大大简化了对这种翻译后修饰的进一步研究,从而更加了解其在不同生理过程中的分布和作用。

      附录-

      我们最近显示抗体的SCFV-AP版本也能够识别肝素辅因子II。
      N.Lappan,未发表的数据。

      致谢

      我们感谢D. Tollefsen博士提供肝素Cofactor II以及K. Moore博士进行有用的建议。

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