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通过改变细胞外基质(ECM)组成和损害基质囊泡(MV)生产来抑制成骨细胞矿化容量*

      在骨形成期间,成骨细胞通过涉及高度专业化的基质囊泡(MV)的生产和分泌的方法沉积矿化的细胞外基质(ECM)。 Activin A,转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员通过不明确的机制显示在人骨形成模型中具有抑制作用。我们调查了Activin A引发的这些机制体外人间充质干细胞(HMSC)的成骨分化。抑制ECM矿化的抑制作用碱性磷酸酶(ALP)的强烈下降
      使用的缩写是:
      alp.
      碱性磷酸酶
      BCA.
      双子素素酸
      大卫
      注释,可视化和集成发现数据库
      德克斯
      地塞米松
      DMEM / F12-Flex
      Dulbecco的改良鹰介质:营养混合物F-12
      ECM.
      细胞外基质
      FBS.
      胎牛血清
      FDR.
      假发现率
      基因本体论
      HMSC.
      人间充质干细胞
      IPI.
      国际蛋白质指数
      m
      矩阵囊泡
      PBS.
      磷酸盐缓冲溶液
      PI.
      无机磷酸盐
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      TGF-β.
      转化生长因子-β。
      )
      1使用的缩写是:alp.
      碱性磷酸酶
      BCA.
      双子素素酸
      大卫
      注释,可视化和集成发现数据库
      德克斯
      地塞米松
      DMEM / F12-Flex
      Dulbecco的改良鹰介质:营养混合物F-12
      ECM.
      细胞外基质
      FBS.
      胎牛血清
      FDR.
      假发现率
      基因本体论
      HMSC.
      人间充质干细胞
      IPI.
      国际蛋白质指数
      m
      矩阵囊泡
      PBS.
      磷酸盐缓冲溶液
      PI.
      无机磷酸盐
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      TGF-β.
      转化生长因子-β。
      细胞外隔室,ECM和基质囊泡中的活性。基于硅酸基的定量蛋白质组学在激活素A ECM中公开了复杂的蛋白质组成改变,包括改变胶原乳糖,骨胶和几种细胞骨架结合蛋白的表达。此外,在活性素中,骨质细胞基质囊泡产生缺乏含有极低的膜蛋白的表达。 ECM增强人间充质干细胞骨质发生和矿化。当对在Activin A治疗的ECM上培养人间充质干细胞时,这种成骨增强显着降低。这些研究结果表明,Activin A针对成骨细胞分化的ECM成熟阶段最终导致矿化的抑制作用。由Actiacin A调节的ECM蛋白不仅是骨矿化的决定因素,而且具有与骨组织再生相关的骨诱导性质。
      骨组织的质量由合成代谢骨细胞,成骨细胞和其分解代谢对应物,破骨细胞的平衡作用决定。这种骨重塑过程发生在整个寿命中,并且可以受到各种分子的影响,最终对骨骼的质量产生影响(
      • Canalis E.
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      生长因子与骨重塑的调节。
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      骨髓,细胞因子和骨质重塑。骨质疏松症病理生理学的新兴见解。
      )。活生素和抑制素是TGF-β超家族的成员,其在其经典的已知靶组织中具有主要的拮抗作用,例如在垂体中的牛腺苷酸产物中的细胞及其在繁殖中的作用(
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      猪卵泡液中抑制抑制蛋白活性的分离和部分表征。
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      猪卵巢卵泡液中FSH释放蛋白的纯化与表征。
      )。与其他TGF-β构件一样,活力通过在细胞表面的I和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合来引发生物反应。在配体结合时,通过磷酸化的Smad蛋白络合物进一步在细胞质中进一步转导信令,该蛋白质复合物一次在细胞核中调节基因表达。该信号通路是高度复杂的,因为在与多个丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合的不同配体(Activins,BMPS,TGF-β)之间的串扰是高度复杂的。已知使用II型受体ACVR2A或ACVR2B和IS受体ACVRIB(与BMPS共享)的II型受体ACVR2和3蛋白(用TGF-β共用)来发信号素。抑制素通过竞争性结合在甲板存在下对激活素受体的竞争结合发挥其抑制作用。该信号调节来自细胞增殖的各种生物活性,与肿瘤发育和内分泌信号分化(
      • 陈Y.G.
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      活生素和内分泌和其他肿瘤中的抑制素。
      )在许多细胞谱系中,如造血(
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      重组人体活动素和抑制素的人类多电像和红细胞造血祖细胞增殖的选择性和间接调节。
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      Actiacin和抑制蛋白对I型和II型激活素受体和人红细分化的拮抗作用对依赖于依赖性的依赖性异常。
      )和单核细胞/巨噬细胞(
      • 八谷kurten d。
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      抑制蛋白抑制和激活素刺激鼠骨髓培养物中的骨纤维发生和骨细胞发生。
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      诱导活性素/ EDF对人幼咯细胞系HL-60分化的诱导。
      )。还描述了这些生殖激素的几种后果,特别是激活素A,尤其是骨代谢。 Actiacin A存在于骨组织中(
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      活素A-Follistatin系统:人体细胞外基质矿化有效调节剂。
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      牛骨激活素增强骨形态发生蛋白诱导的异位骨形成。
      )影响破骨细胞和成骨细胞。同时具有一致的促骨细胞源性效果(
      • 八谷kurten d。
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      Actiacin A是骨壳诱导的必需辅助因子。
      ),激活素对成骨细胞分化的影响更有争议(见(
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      其他生殖激素,诱导素和抑制素对骨细胞发生和骨细胞发生的调节。
      )审查)若干报告支持活性素A对成骨细胞分化和矿化的刺激作用 体外体内 (
      • 八谷kurten d。
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      激活素 - 来自胎儿大鼠间骨的富含骨细胞富集的培养物的结合和生化作用。
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      Actin增加卵巢切除大鼠腰椎的骨质量和机械强度。
      )。另一方面,使用大鼠和人骨形成模型的两个不同的研究表明,Activin A治疗对骨质发生具有相干抑制作用,导致矿化容量显着降低(
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      活性素-A对胎儿大鼠颅骨细胞培养过程中的成骨细胞分化的抑制作用。
      )。活素A对骨毛细胞发生的相反效果可以简单地反映物种差异,然而,它也可以通过使用过的细胞模型的异质性或成骨细胞分化的阶段驱动(
      • 尼克什。
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      其他生殖激素,诱导素和抑制素对骨细胞发生和骨细胞发生的调节。
      )。然而,其他因素也支持Activin A在骨形成中的负面作用 体内 小鼠和灵长类动物的研究,其中激活素信号传导的阻断导致骨质量增加(
      • 佩斯尔尔R.S.
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      可溶性活动素IIA受体诱导骨形成并提高骨骼完整性。
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      可溶性活素受体型IIA融合蛋白(ACE-011)通过在Cynomolgus猴中的双重合成反应作用增加骨量。
      )。此外,转基因小鼠过表达人抑制蛋白A显示出增加的骨形成(
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      抑制蛋白A是骨质量和强度的内分泌刺激器。
      )。
      细胞外隔室对于骨骼至关重要,因为它决定了大多数骨质质量特性(
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      胶原蛋白肽模型的折叠,疾病误区。
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      • CIDADE G.A.
      • 莫尔斯D.E.
      • 坚定的G.D.
      • Hansma P.K.
      有机基质降解对小梁骨微观骨折行为的影响。
      ),包括其强度,稳定性和完整性。有趣的是,成熟的细胞外基质(ECM)的特征在于,即使在没有进一步的成骨细胞活性的情况下也能够矿化的能力(
      • Eijken M.
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      活素A-Follistatin系统:人体细胞外基质矿化有效调节剂。
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      基质矿化在MC3T3-E1细胞培养物中由β-甘油磷酸磷酸脉冲引发。
      )。这种生物蛋白化过程复杂,不完全阐明,但它被认为是在MVS内开始(
      • 安德森H.C.
      • Reynolds J.J.
      焦磷酸盐刺激钙吸收成培养胚胎骨骼。基质囊泡的细结构及其在钙化中的作用。
      )。骨质化组织中骨骼和其他细胞的成骨细胞,如软骨(
      • 安德森H.C.
      与骨骺软骨基质中钙化相关的囊泡。
      ),肌腱(
      • Arsenault A.L.
      • 弗兰克州B.W.
      • Otensmeyer F.P.
      矿化的矢量序列在土耳其腿部肌腱中由电子显微镜成像确定。
      ),牙齿(
      • 伯纳德G.W.
      牙本质和牙釉质初始钙化的超微结构观察。
      )和钙化血管系统(
      • Tanimura A.
      • McGregor D.H.
      • 安德森H.C.
      动脉粥样硬化钙化中的基质囊泡。
      )从它们的等离子体膜中产生并释放这些囊泡,直径在50至200nm之间。它在这些膜封闭的颗粒内部,在渗透囊泡膜之前形成并生长矿物的第一晶体,并且矿物结晶进入ECM(
      • 安德森H.C.
      • 加里米拉R.
      • 标签S.E.
      基质囊泡在生长板开发和生物矿化中的作用。
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      • Masuhara K.
      • Takaoka K.
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      • 安德森H.C.
      人胎骨骨盆中碱性磷酸酶的免疫悬垂性和胎儿骨质囊泡。
      )。在这种情况下,可以动员钙和无机磷酸盐(PI)的蛋白质,骨中存在的羟基磷灰石晶体的骨架至关重要。 P.i 在MVS中发现的供体蛋白包括碱性磷酸酶(ALP)和无机焦磷酸酶(
      • 阿里S.Y.
      • Sajdera S.W.
      • 安德森H.C.
      骨骺软骨钙化矩阵囊泡的分离与表征。
      )虽然膜蛋白的膜蛋白族假定为钙流入囊泡至关重要(
      • 陈n.x.
      • 奥尼尔K.D.
      • 陈X.
      • MOE S.M.
      腔内介导的血管平滑肌细胞中的基质囊泡钙化。
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      • 吴l.n.
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      鉴别磷脂依赖性钙结合蛋白作为基质囊泡的成分。
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      • golub e.e.
      • 纳,
      annexins和类型II和X胶原在基质囊泡介导的生长钢板软骨中的作用的作用。
      )。
      在该研究中,我们研究了活性素A对人间充质干细胞(HMSC)衍生的成骨细胞分化和矿化的抑制作用。我们以前表明,在人骨甲培养培养中,A激活素影响许多ECM基因改变ECM成熟的表达(
      • Eijken M.
      • Swagemakers S.
      • Koedam M.
      • Steenbergen C.
      • derkx p.
      • Uitterlinden A.G.
      • van der spek p.j.
      • visser j.a.
      • 德继辉
      • Pols H.A.
      • van leeuwen J.P.
      活素A-Follistatin系统:人体细胞外基质矿化有效调节剂。
      )。因此,我们将我们的分析对细胞外环境变化,即ECM和基质囊泡(MV)。使用包括氧化硅代谢标记和质谱法的最先进的定量蛋白质组学工具来完成这些隔室的表征。此外,还确定了ECM组合物对成骨细胞分化的重要性。

      实验步骤

       细胞培养

      如前所述,来自两种不同供体的人骨髓源性间充质干细胞(HMSC; PT-2501,LONZA,LONZA,LONZA,MD),如前所述培养(
      • Eijken M.
      • Swagemakers S.
      • Koedam M.
      • Steenbergen C.
      • derkx p.
      • Uitterlinden A.G.
      • van der spek p.j.
      • visser j.a.
      • 德继辉
      • Pols H.A.
      • van leeuwen J.P.
      活素A-Follistatin系统:人体细胞外基质矿化有效调节剂。
      )在12孔中(3.8厘米2)板块(Greiner Bio-One,Frickenhausen,德国),75或175厘米2 烧瓶(Greiner Bio-One)。 HMSC培养基新鲜补充100 nm 地塞米松(Dex,Sigma)和10米m β-甘油磷酸盐(Sigma,St.LOUIS,MO)用于骨质发生(载体)条件。活力含有25ng / ml Activin A的额外补充剂(R.&D Systems,Minneapolis,Mn)。对于定量质谱分析,在氧化硅酸介质存在下类似地培养HMSC:Aginine-无赖氨酸的Dulbecco的改性鹰培养基(DMEM)/ F12-Flex补充有10%透析的胎牛血清(FBS),4米 M L.-glutamine,青霉素 - 链霉素,4.5克/升葡萄糖,20米m HEPES (Sigma), 1.8 mm CaCl2.2H2O(Sigma),pH 7.5。在两个光培养基中膨胀细胞,补充正常 l-Lysine HCl(12C6,14N2而且)和 l-Arginine(12C6,14N4-Arg)和含有相同氨基酸的沉重同位素的重度培养基(13C6,14N2而且 13C6,15N4-ARG)。完全掺入氨基酸同位素在硅胶培养基中的细胞培养的3周内发生(补充图。S1)。载体和活动素在轻的同位素培养基中培养处理过的细胞,往现允许从生物变异的伪影和污染物的最佳分化(
      • 王玉..
      • 马Z.
      • quinn d.f.
      • 傅e.w.
      对比较蛋白质组学的反向15N-代谢标记/质谱和蛋白质标志物/靶标的快速鉴定。
      )。除非另有说明,否则所有氧化铝试剂均购自Invitrogen(Carlsbad,CA)。

       细胞培养物的缺乏

      如前所述进行细胞活性化(
      • Eijken M.
      • Swagemakers S.
      • Koedam M.
      • Steenbergen C.
      • derkx p.
      • Uitterlinden A.G.
      • van der spek p.j.
      • visser j.a.
      • 德继辉
      • Pols H.A.
      • van leeuwen J.P.
      活素A-Follistatin系统:人体细胞外基质矿化有效调节剂。
      )使用在12孔板中培养的细胞。简而言之,在PBS(Invitrogen,Carlsbad,Ca)中在PBS(Invitrogen,Carlsbad,Ca)中洗涤两次之前,在-20℃下冷冻至少24小时。在矿化开始之前的阶段是在培养中检测显着矿物沉积之前的时间,根据HMSC供体在第10天和第12天或第15天和第17天之间发生。接下来,在载体(载体ECM)或激活素期间合成的含有细胞2D ECM的生长化培养物在骨质发生培养基中孵育(+培养基)。在另一组实验中,在骨质发生培养基(+ HMSC)中,将生长化培养物与新鲜接种的未分化的HMSC一起温育,而不进一步加入活素A.并行地作为这些实验的对照,在标准塑料板上接种骨质发生培养基中的HMSC (塑料)。所有实验均进行进一步直至矿化。在培养物结束时,我们进行了矿化测定。

       碱性磷酸酶活性,蛋白质和矿化测定

      如前所述测定细胞提取物或分离的MV中的ALP活性和钙含量(
      • Eijken M.
      • Koedam M.
      • van driel M.
      • 布鲁曼C.J.
      • Pols H.A.
      • van leeuwen J.P.
      糖皮质激素对适当的人骨化合物分化和基质矿化的基本作用。
      )。简而言之,通过测定从普硝基苯基磷酸磷酸磷酸氯丙苯酚(20μm)来测定AlP活性m 二乙醇胺缓冲液补充有1米m MgCl2 在pH9.8)在细胞裂解物中,分别在37℃下裂解10和70分钟。在405nm测量吸附。对于钙测量,将细胞裂解物在0.24中孵育过夜 m HCl在4°C。根据制造商的说明,用钙测定试剂盒(Sigma)用钙分析试剂盒(Sigma)进行比例测定钙含量。对于矿化染色,用70%乙醇在冰上固定细胞培养物60分钟。固定后,用PBS洗涤细胞两次,用茜素红溶液染色10分钟(使用0.5%氢氧化铵滴定滴定水中的饱和茜素红色,滴定至pH4.2)。对于蛋白质浓度测量,使用BCA套件(Pierce Biotechnology,Rockford,IL,USA)按照制造商的说明使用。

       细胞外基质隔离

      ECM.隔离方法适应(
      • 萧Z.
      • Camalier C.E.
      • Nagashima K.
      • Chan K.C.
      • 卢卡斯D.A.
      • de la cruz m.j.
      • Gignac M.
      • 洛克特S.
      • isaaq h.j.
      • veenstra t.d.
      • Conrads T.P.
      • Beck Jr.,G.R.
      矿化成骨细胞中细胞外基质囊泡蛋白蛋白蛋白的分析。
      )。为了从ECM中提取蛋白质,载体和Activin将处理的HMSC在175厘米中培养2 烧瓶。除去培养基后,将细胞在PBS中洗涤三次,并在37℃下在胶原酶/分散酶(1mg / ml; roche,mannheim,德国)中温育90分钟。以500×离心后 g 为了去除细胞10分钟,获得含有ECM蛋白质提取物的上清液并在-80℃下储存直至分析。

       矩阵囊泡隔离

      将MV与75或175厘米的介质隔离2 如前所述,分别用于随后的FAC或蛋白质组学分析的培养烧瓶(
      • 约翰逊K.
      • MOFFA A.
      • 陈Y.
      • Pritzker K.
      • 高神J.
      • Terkeltaub R.
      基质囊泡血浆细胞膜糖蛋白-1调节鼠骨细胞MC3T3细胞的矿化。
      )。简而言之,首先将培养基以20,000×离心离心 g 在4℃下30分钟,以除去细胞碎片。收集上清液并进一步以100,000×离心 g 在4°C下60分钟。丢弃上清液后,将含有MV的沉淀溶于PBS中。所有超速离心步骤都在超速纤维上进行 l-70(Beckmann Coulter)。

       定量质谱分析

      对于ECM和MVS分离的ECM和MV,将来自氧沙拉培养物的蛋白质提取物在1:1的比例的1:1的比例中混合。组合光:用一体化的二维SDS-PAGE(NUPAGE 4-12%BIS-TRIS,Invitrogen)分解重样的样品。用Coomassie染色(生物安全Coomassie,Bio-rad,Hercules,CA)可视化蛋白质带。使用自动凝胶切片器将SDS-PAGE凝胶泳道切成2毫米切片,并用二硫噻唑醇对凝胶减少进行凝胶,与碘乙胺(Promega,测序等级)的烷基化,基本上如威尔 等等。 (
      • 威尔m。
      • 舍甫琴科A.
      • Houthaeve T.
      • 布雷特S.
      • Schveigerer L.
      • Fotsis T.
      纳米电喷雾质谱法由聚丙烯酰胺凝胶蛋白质的毫微微骨序列。
      )。在1100系列毛细管LC系统(Agilent Technologies)上进行纳米射线LC-MS / MS,耦合到以正模式运行的LTQ-Orbitrap XL质谱仪(Thermo),并配备有纳米Pray源。肽混合物被捕获在Reprosil C18反相柱(Maisch GmbH博士;柱尺寸1.5cm×100μm,内部包装),流速为8μl/ min。使用从0至80%B的线性梯度(a = 0.1%甲酸,在ReposiL C18反相柱(MAISCH GmbH;柱尺寸15cm×50μm)上进行肽分离。 (v / v)乙腈,0.1%甲酸)在120分钟内,并且使用分离器以200nl / min的恒定流速。将柱洗脱液直接喷涂到质谱仪的ESI源中。在连续模式下获得质谱;在数据依赖性模式下进行肽的碎片化。通过使用吉祥物搜索算法或MaxQuant套件来执行数据分析。对于吉祥物搜索,使用吉祥物蒸馏器软件(2.2版;矩阵谱)从原始数据文件自动创建峰值列表。吉祥物搜索算法(版本2.2,矩阵谱)用于搜索国际蛋白质指数(IPI)数据库(IPI人类发布06/11/2009,版本3.66)。肽耐受通常设定为10ppm,并且将片段离子耐受性至0.8Da。允许胰蛋白酶的最大2个错过的乳化裂解,并分别设定氨基甲酰化的半胱氨酸和氧化甲硫氨酸作为固定和可变的修饰。阳性蛋白质击中的吉祥物截止值被设定为65.手动检查含有吉祥物MS / MS光谱以下35分的吉祥物评分,并被解释为有效的识别或丢弃。为了定量分析,使用来自MaxQuant软件套件的质谱原始数据(1.1.1.25版)(
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      和romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      )。需要蛋白质和肽的错误发现率(FDR)0.01,以及六个氨基酸的最小肽长度。通过最大的最大重新校准算法改善了前体离子的质量精度。 Andromeda搜索引擎用于针对与所有序列的反转版本连接的IPI人类数据库中搜索MS / MS光谱。最多允许两个错过的乳沟。片段质量耐受设定为0.6Da。将酶特异性设定为胰蛋白酶。进一步的修饰是半胱氨酸氨基甲酰甲基化(固定)以及蛋白质N-末端乙酰化,甲硫氨酸氧化和赖氨酸泛素(可变)。仅考虑用至少两种肽和两种定量事件鉴定的蛋白质进行分析。 MaxQuant自动定量氧化硅酸肽和蛋白质。计算硅酸蛋白比例作为分配给蛋白质的所有肽比的中值。此外,需要低于或等于0.1的每个MS / MS谱的后误差概率。在两种蛋白质的鉴定肽相同或一个蛋白质的肽包括另一种蛋白质的所有肽的情况下,这些蛋白质通过Maxquant组合并报告为一种蛋白质组。在统计分析之前,已知的污染物(角蛋白和来自牛血清的丰富蛋白)和反向击中(
      • Cox J.
      • matic i.
      • Hiler M.
      • Nagaraj N.
      • Selbach M.
      • 奥尔森J.V.
      基于Silac的定量蛋白质组学的MaxQuant计算平台的实用指南。
      )。

       流式细胞术分析和Western印迹

      通过如别处所述的流式细胞仪测定细胞分泌的MV和ALP + MV的数量(
      • Woeckel V.J.
      • alves r.d.
      • Swagemakers S.M.
      • Eijken M.
      • 千叶H.
      • van der eerden b.c.
      • van leeuwen J.P.
      1Alpha,25-(OH)2D3作用于成骨细胞分化的早期阶段,通过加速生产成熟基质囊泡来增强矿化。
      )。简而言之,将12.5μl新鲜的MV在黑暗中孵育20分钟,用12.5μLELF-97染色溶液(0.2 m ELF-97(Invitrogen)在1.1中 m 醋酸,0.011 m NaNO2,ph 8.0)。 ELF-97是磷酸酶底物,在pH8检测碱性磷酸酶。作为阴性对照,通过PBS(未染色的MV)替代ELF-97染色溶液,并通过如MV分离所描述的,由PBS或培养基取代MV。使用未染色的MV样本设置对ALP +群体的栅栏。对于这些混合物中的每一个,加入125μLPBS。在Becton Dickinson Facs-Canto(BD Bioscience)中测量囊泡,用于沿直角,侧散射(SSC)测量粒度和ELF-97荧光信号,AMCYAN-A通道(488nm)的光衍射。对于蛋白质印迹试验实验,从载体的调节介质中分离的MVS和活性素处理处理过的培养物,用SDS-PAGE分离,并转移到硝酸纤维素膜(杂合,Amersham Biosciences,Buckinghamshire,U.K.)上。作为从普通介质中分离的阴性对照囊泡。在TBS / 0.1%Tween-20中具有5%BSA的非特异性信号后,将膜与针蛋白A2的抗体(1:1000,兔子与ANXA2,ABCAM,ABCAM,AB41803)一起温育。用次抗体探测膜,与IRDYE 800CW(1:5000,LI-COR,猫)缀合的山羊抗津巴犬山羊抗津巴菌。根据制造商的说明(Odyssey Lincoln,Ne),使用Li-Cor红外成像系统可视化免疫反应带。

       基因本体学分析

      使用David Bioinformatics Resources 6.7获得基因本体(GO)分析(
      • 丹尼斯Jr.,G.
      • 谢尔曼B.T.
      • Hosack D.A.
      • 杨杰。
      • 高W.
      • 车道H.C.
      • LEMPICKI R.A.
      David:用于注释,可视化和集成发现的数据库。
      ,
      • Hosack D.A.
      • 丹尼斯Jr.,G.
      • 谢尔曼B.T.
      • 车道H.C.
      • LEMPICKI R.A.
      易于识别基因名单中的生物主题。
      )。只有显着的(p <0.05)与整个基因组背景(David默认)相比,富集的术语被选中。

       统计分析

      所有实验均重复至少三次。值是平均值±S.D.使用学生计算和意义 t test.

      结果

       Activin A改变了ECM的矿化能力

      Activin先前证明了通过改变ECM成熟度抑制人骨细胞培养物的矿化(
      • Eijken M.
      • Swagemakers S.
      • Koedam M.
      • Steenbergen C.
      • derkx p.
      • Uitterlinden A.G.
      • van der spek p.j.
      • visser j.a.
      • 德继辉
      • Pols H.A.
      • van leeuwen J.P.
      活素A-Follistatin系统:人体细胞外基质矿化有效调节剂。
      )。我们目前的研究结果证实了这一数据。 Activin A治疗导致AlP活性降低,然后在培养物中耐矿物沉积受损(Fig. 1A)与载体处理培养物(数据未显示)相比,它没有改变培养中细胞总数。在激活素下产生的ECM的成熟通过评估在缺血2D ECMS中是否可能发生矿化而进行刺激测试。为此,载体和活性素在矿化开始前逃离治疗的成骨细胞培养物(Fig. 1B;方案),撤回活细胞,但保持ECM建立在那一刻的内容(
      • Eijken M.
      • Swagemakers S.
      • Koedam M.
      • Steenbergen C.
      • derkx p.
      • Uitterlinden A.G.
      • van der spek p.j.
      • visser j.a.
      • 德继辉
      • Pols H.A.
      • van leeuwen J.P.
      活素A-Follistatin系统:人体细胞外基质矿化有效调节剂。
      )。我们观察到培养基对ECM的补充足以诱导车辆ECM的矿化(Fig. 1B)。相比之下,在Activin下合成的ECM A处理未能变成矿化(Fig. 1B)。为了评估激活素A在成骨细胞分化期间的细胞外效应,我们分离ECM以及来自载体的MVS并激活蛋白质细胞培养物。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1活性素A在成骨细胞分化和矿化中的影响。 HMSC在含有活体A的成骨培养基(载体)和骨质发生培养基存在下培养。 A这些培养物中的ALP活性和钙含量(n = 3)。在培养结束时,通过茜素红S染色也可视化钙含量。 B,载体和活素在矿化开始之前培养处理过的细胞,在第10和12天之间发生。在该阶段细胞培养物固定。在骨质发生培养基中进一步温育细胞(n = 4)。在培养物结束时(第17天),通过茜素红S染色测量和可视化钙含量。值表示±S.D. * p < 0.05; ** p < 0.01.

       Activin A显着降低了ECM和MV的ALP活动

      最初获得矿化发作的ECM和MVS,用于ALP活性。我们观察到与其载体处理的对应物相比,ECM和ActioN的ECM和MVs的ALP活性显着降低了ACTIN治疗的成骨细胞(Fig. 2)。该结果进一步支持激活素A对成骨细胞细胞外环境显着影响的概念。因此,我们首先使用定量硅酸基质谱法来分析和比较来自载体的ECM和MVS蛋白质组,并激活处理过的培养物。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2活性素A在ECM和MV ALP活性的影响。 A,ECM和(B从载体和激活素的矿化开始时分离的MVS用于ALP活性的治疗培养物(n = 3)。值表示±S.D. * p < 0.05 ** p < 0.01.

       Activin A诱导ECM组成的变化,强烈减少MVS标记的表达

      ECM.的分析导致鉴定293蛋白(补充表S1)。我们使用基因本体(GO)注释富集分析,将鉴定的蛋白质分类为其蜂窝定位(Fig. 3)。 FOT术语ECM(GO:0044420)被发现为3.7倍,富集验证ECM隔离方法。其他过度代表的蛋白质基团包括与膜结构相关的蛋白质,如细胞器包络蛋白(4.8倍; GO:0031967)或密切接近膜,如细胞前缘(4.3倍; GO:0031252)和细胞表面(3.9倍;去:0009986)蛋白质。有趣的是,囊泡蛋白(GO:0031982)也被鉴定为ECM样品中的4.3倍。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3在ECM中鉴定的293蛋白的过度特性细胞室注释。 条形图中的数字表示富集级别。条内的数量表示鉴定为属于每个细胞室术语的蛋白质,并且在括号中发现在ECM中的活性蛋白的局部条件下被发现上/下调。只有显着的(p <0.05)富集的基因本体论术语被认为进行分析。
      在定量术语中,质谱分析产生104个蛋白质,在激活素治疗后调节超过1.5倍。超过一半的蛋白质,74个蛋白质被激活素A对抗,而仅调节30个蛋白质。 10个最强大的上调和下调的蛋白质显示在 表I.。胶原蛋白,XII型,α1(COL12A1)是最上调的ECM蛋白(2.7倍)。 Osteonectin(上),纤连蛋白1(FN1)和Fibrillin-1(FBN)也上调超过1.9倍(表I.)。最强的下调蛋白质包括参与碳水化合物分解代谢的酶,例如UDP-葡萄糖焦磷酸化酶2(UGP2; 0.28倍),磷光血糖酶1(PGM1; 0.30倍)和磷酸葡糖苷脱氢酶(PGD; 0.37倍; 表I.)。
      表I.通过激活在ECM中的信号传导调节蛋白质。 ECM在硅胶标记培养物的矿化开始时分离出ECM,并通过质谱测量测定蛋白质调节。比率是互惠氧化钙实验的平均值。 a = sctivin a; v =车辆。 #肽=蛋白质鉴定的最小肽数。比率计数=用于定量的Silac对数。从ECM 104中鉴定的293个蛋白质被发现超过1.5倍,但仅显示20个最强的蛋白质(见 补充表1 有关确定的蛋白质清单和各自的监管)
      #蛋白质名称IPI.标识符基因符号比率a / v#肽比率计数
      >由Activin A上调1.5倍
      1胶原醛alpha-1(xii)链IPI.00329573COL12A12.665289
      2发育规管内皮细胞基因座1蛋白IPI.00306046.DEL12.291116
      3CFR-1IPI.00414717.CFR12.241011
      4基底膜蛋白40IPI.00014572.2.2024
      5FN1蛋白质IPI.00845263FN12.112357
      6乳腺上皮抗原BA46IPI.00966900.MFGE82.07226
      7cDNA FLJ58980,与Sideroflexin-3高度相似IPI.00871988.hcg_24661.2.0123
      8130 kDa富含富含蛋白质的蛋白质IPI.00783271LRP.1302.00612
      9Fiblillin-1IPI.00328113.FBN.1.971319
      10CD49抗原类家庭成员eIPI.00306604.FNRA.1.93716
      >由Activin A下调1.5倍
      1cDNA,FLJ95012,高度相似于同源SAPIENS UDP-葡萄糖溶解酶2IPI.00873223.UGP20.2867
      2葡萄糖磷酸酯酶1IPI.00219526PGM10.3044
      3UDP-葡萄糖6-脱氢酶IPI.00031420UGDH.0.3023
      470 KDA Lamin.IPI.00021405.LMN10.3169
      5折叠响应介质蛋白2IPI.00257508.CRMP20.3156
      6细胞迁移诱导基因10蛋白IPI.00169383.MIG100.341222
      7Triosephosphate异构酶IPI.00465028hcg_25936.0.3469
      8Calgizzarin.IPI.00013895.MLN700.3423
      9BPG依赖PGAM 1IPI.00549725.cdabpp00060.3555
      106-磷酸葡糖酸脱氢酶,脱羧IPI.00219525PGD​​.0.3754
      在MVS中,我们已经确定了27个蛋白质(补充表2)。总共12种蛋白质≥1.5倍,由Activin A调节(表二)。在那些12中,Actiacin A,透明质酸结合蛋白CRT11(1.76倍)和骨蛋白多糖II(DCN; 1.51倍),仅增加两种蛋白质。在10个下调蛋白质中,五个是钙依赖性磷脂结合蛋白,称为anchins。尽管MVS(<0.25-fold; 表二),ECM中的膜质不变。该MV的特异性调制以及这些蛋白质已知存在的事实是在MV中存在和功能(
      • 陈n.x.
      • 奥尼尔K.D.
      • 陈X.
      • MOE S.M.
      腔内介导的血管平滑肌细胞中的基质囊泡钙化。
      ,
      • Genge B.R.
      • 吴l.n.
      • Wuthier R.E.
      鉴别磷脂依赖性钙结合蛋白作为基质囊泡的成分。
      ,
      • Kirsch T.
      • 哈里森G.
      • golub e.e.
      • 纳,
      annexins和类型II和X胶原在基质囊泡介导的生长钢板软骨中的作用的作用。
      )导致我们考虑激活素,文化严重改变或甚至受损的MV生产。
      表二通过在MVS中激活信号调节蛋白质。分离MV样品在硅胶标记培养物的矿化开始时分离,并通过质谱测量测定蛋白质调节。比率是互惠氧化钙实验的平均值。 a = sctivin a; v =车辆。 #肽=蛋白质鉴定的最小肽数。比率计数=用于定量的Silac对数。从MVS 12中鉴定的27种蛋白质被发现受到调节超过1.5倍(见 补充表2 有关确定的蛋白质清单和各自的监管)
      #蛋白质名称IPI.标识符基因符号比率a / v#肽比率计数
      >由Activin A上调1.5倍
      1软骨连接蛋白1IPI.00023601.CRTL11.7644
      2骨蛋白多糖IIIPI.00012119.DCN.1.5146
      >由Activin A下调1.5倍
      1Annexin A1IPI.00218918.ANX10.111010
      2Anchorin CII.IPI.00329801.ANX50.141213
      335-beta钙咪嗪IPI.00793199.ANX40.1523
      467 KDA CelelitinIPI.00221226.ANX60.232038
      5Annexin A2IPI.00418169ANX20.241630
      6l-乳酸脱氢酶IPI.00947127LDHA0.3634
      718 kda磷蛋白IPI.00012011.CFL.0.3933
      8丙二醇氨基肽酶IPI.00221224ANPEP.0.46912
      9肺抗性相关蛋白质IPI.00000105.LRP.0.5043
      10cytotactin.IPI.00031008.HXB.0.6077

       Actiacin治疗细胞在矿化开始时损伤了Mv生物发生

      为了解决激活素治疗后的成骨细胞中抑制MV产生的假设,我们分离和计数载体的MV数并激活治疗的成骨细胞培养物。使用FACS测定总MVS和ALP阳性MVS(ALP + MVS)的数量。 MVS,总和ALP +的生产在矿化前的载体和活力之间没有差异(Fig. 4A)。然而,在矿化的开始时,在载体成骨细胞中的AlP + MVs的产生急剧增加,而Activin急剧下来这是显着抑制的条件(Fig. 4A)。在矿化的开始时,只有8%的总MV在活性素中的Alp +条件下,与载体状况的72%(Fig. 4A4B)。在MVS中的Annexin 2免疫缩编(Fig. 5)通过定量蛋白质组学证实结果证明了测量的差异是MV特异性的,而不是衍生自血清微泡。总之,我们的结果表明,通过改变ECM组成和抑制生物矿化引发剂,MVS的致敏素A对激活素A的双峰效应。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4激活骨质细胞MV生产的效果。 A,用载体分泌的MV和ALP + MV的数量和矿化前和在矿化前的处理过的培养物。 B,FACS图用于计算矿物质化之前和在矿化前和在矿化前的样品中的MV的数量(四个最左边的面板)。在矿化前的ALP + MV群体分布的直方图(n = 9)并且在矿化的开始(n = 3)对于载体和激活素,还显示了培养物(正确的 控制板)。使用ELF-97未染色的MV样品设定浇口(左下方 控制板)。 PBS和培养基显示其他阴性对照 (底部中间右下方 小组分别)。 SSC-A是侧散射区域,Amcyan-A是检测来自染色囊泡的荧光信号的通道。 * p < 0.05; ** p < 0.01.
      图缩略图GR5.
      Fig. 5mS中膜蛋白2的免疫检测。 从载体(VAVE.)和ACTIN素A(ACT。)培养物,在矿化前和在矿化前的培养物中的MV制剂被探测了膜蛋白2表达。 Med。 =还显示了从普通介质的MV制剂方案后制备的对照样品。

       ActiSin A ECM能够向骨催化剂的信号传导调节其矿化

      接下来,我们进一步调查了ECM组合物在骨发生中的影响。对于这些实验,载体和活性素在相似的矿化开始之前,脱节了处理的培养物,如图所示 Fig. 1B。然而,此次除了骨质发生培养基之外,我们还将未分化的HMSC播种在载体顶部的成骨培养基中并激活ECMS。与对照培养并联时,在标准培养板中的塑料中也接种骨质发生培养基中的HMSC(实验方案 Fig. 6A)。将HMSC的种子加剧现有的ECM增强并预期矿化(Fig. 6B,载体或激活素ECM与塑料板相比),现在发生在6-8天后而不是14天的塑料对照培养物(Fig. 1A)。尽管在载体ECM上显着较少矿物质,但当HMSC接种在激活素AECM上时,也观察到这也观察到,在没有HMSC的情况下不能矿化(Fig. 6B)。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6ECM.在骨催化剂细胞矿化中的影响。 A,载体和活素在矿化发作之前,脱脂型培养物被衰弱。将剩余的ECM用骨质发生培养基(+培养基)和未分化的HMSC培养(+ HMSC)。并行地,HMSC也直接播种在标准塑料培养板上。 B,在培养物结束时测定钙含量(n = 3)。值表示±S.D. ** p < 0.01; *** p < 0.001.
      总的来说,这些结果表明,成骨细胞ECM含有有效的信号传导线索对骨催化剂细胞。在这方面,激活素的改变组合物ECM未代表骨催化剂细胞的完全嵌段。

      讨论

      之前我们已经表明,在活素A的存在下,人骨盆矿化受到强烈抑制的,并且这些细胞在矿化前一开始之前的阶段对该激素特别敏感(
      • Eijken M.
      • Swagemakers S.
      • Koedam M.
      • Steenbergen C.
      • derkx p.
      • Uitterlinden A.G.
      • van der spek p.j.
      • visser j.a.
      • 德继辉
      • Pols H.A.
      • van leeuwen J.P.
      活素A-Follistatin系统:人体细胞外基质矿化有效调节剂。
      )。在这项研究中,我们提供了在激活蛋白产生期间蛋白质产生的变化的证据,抑制成骨细胞矿化。我们证明,骨形成期间激活的激活对ECM生产和成熟阶段的影响具有不利影响。此外,Actiacin A的负面影响通过损害MV生产来抗矿化阶段。
      激活对ECM蛋白质组的影响主要是抑制,其比上调蛋白质更下调。在后者中,我们鉴定了胶原蛋白XIIα-1(COL12A1; IPI00329573),骨胶切除素(ON; IPI00014572),纤连蛋白(FN1; IPI00845263)和FIBRILLIN-1(FBN; IPI00328113)。所有这些蛋白质都直接含有成骨细胞分化和骨形成(
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      )。例如,缺乏症负责受损的成骨细胞分化和降低的骨形成(
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      )尽管未能解释激活素A在成骨细胞分化和矿化中的抑制作用,但仍然是我们观察到的蛋白质调节。激活素的复杂性可能是与其他蛋白质在成骨细胞分化期间越来越多的蛋白质的矛盾观察背后的原因。其中一种蛋白质是Fibrillin-1(FBN)。 FBN基因中的突变对骨骼尺寸表型增加(
      • 绿色米。
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      紧身皮肤,鼠标的新突变,导致结缔组织和骨骼的过度生长。
      )。 FBN是ECM的结构组分,以调节骨细胞成熟,其能够螯合和控制潜伏的TGF-β和BMP生物利用度(
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      ),激活素中ECM中的升高的FBN水平可能是抑制活素A中观察到的成骨细胞分化和矿化的决定因素。
      将ECM蛋白联系在于激活素A对骨相关功能的调节,比上调的那些更困难。激活素抑制的许多蛋白质是细胞骨架结合蛋白( 例如 WDR1,IPI00873622; PLS3,IPI00216694; TPM3,IPI00218319)和参与碳水化合物代谢的蛋白质(UGDH,IPI00031420; MIG10,IPI00169383; LDHA,IPI00947127)。与细胞骨架结合的蛋白质的检测可能与细胞骨架机构的ECM控制有关(
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      )。另一方面,ECM中葡萄糖代谢蛋白的检测更为神秘但在萧氏症列出的成骨细胞ECM蛋白质中的态度 等等。 (
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      细胞外基质和囊泡的蛋白质组学分析。
      )。此外,其他几种研究表明存在于不同类型分泌的囊泡内含有的细胞外糖酵解酶(
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      )包括MVS(
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      细胞外基质和囊泡的蛋白质组学分析。
      )。尽管披露这些蛋白质的细胞外位置,但它们在细胞外的功能仍然未知。然而,它们被激活素A抑制的事实识别它们作为骨形成的潜在调节剂。
      ECM.制剂含有各种细胞内蛋白质,我们不能排除这些代表细胞污染。尽管无法排除这个假设,但我们认为我们的提取方法足够,因为我们发现ECM蛋白质是高度丰富的(Fig. 3)。检测ECM中细胞内蛋白的其他假设可以是与ECM结合的MV的存在(
      • 萧Z.
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      )。囊泡源的蛋白质在我们的ECM提取物中富集(Fig. 3)。由于它们的组成和细胞内起源,MVS表示对细胞内的增加而且还具有鉴定的膜相关蛋白质的增加的解释。
      通常,激活蛋白对ECM蛋白质的影响是巨大的,靶向许多蛋白质。没有单一蛋白质被引人注目的事实,强调了将ECM视为综合隔间的重要性。换句话说,ECM的功能由所有蛋白质的组合而不是单个蛋白质的组合来确定。研究骨细胞分化期间这些蛋白质的功能和相互作用是理解和鉴定骨形成的治疗靶标的重要性。考虑到我们鉴定的几种蛋白质尚未与骨骼相关联。
      在活性素A的影响下的成骨细胞显着较低的MV含有改变的蛋白质组合物。就蛋白质鉴定而言,MV蛋白质组比ECM更受限制。这可以归因于由ECM相比,由成骨细胞产生的骨细胞产生的较低的MV和MV蛋白质组的复杂性较低。然而,与ECM蛋白质组相比,MV蛋白质组包含活性蛋白A和载体培养物之间的更明显的差异。蛋白质组分析仅显示两种蛋白质在MVS中的Activin A中调节的25倍,骨蛋白多糖II(DCN; IPI00012119)和软骨 - 连接蛋白1(CRTL1; IPI00023601)蛋白生成,其与I型胶原型原纤维(
      • Svensson L.
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      胶原蛋白型胶合素的粘结位点主要位于富含亮氨酸的重复4-5。
      )透明质酸(
      • FranzénA。
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      软骨蛋白多糖蛋白聚集体形成。链接蛋白的作用。
      ) 分别。在骨缩合素A中的蛋白质糖蛋白酶体内的表达增加了蛋白质糖蛋白酶体在成骨细胞矿化中的负作用。它们的糖胺聚糖链的负电荷能够与磷酸盐竞争抑制矿物生长的羟基磷灰石结晶(
      • 陈C.C.
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      )。例如,DCN限制在从ECM中移除的未钙化骨曲面区域,因此可以进行钙化(
      • Hoshi K.
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      骨骼中的初级钙化遵循切除胶合蛋白和胶原型原纤维的融合。
      )。
      在MVS中最抑制的蛋白质中,我们发现与其矿化能力直接相关的蛋白质。 Annexin Family成员(I,II,IV,V和V)是最引人注目的,蛋白质通常在MV中丰富,在那里它们充当钙通道(
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      annexins和类型II和X胶原在基质囊泡介导的生长钢板软骨中的作用的作用。
      )。有趣的是,膜质似乎在MV中特别调节,因为在Actiacin A相对于其车辆对应物中没有发现差异。 MV生物发生仍然是争议的(
      • 安德森H.C.
      基质囊泡的分子生物学。
      )但是,我们检测到在这些囊泡中被检测到在ECM中未改变的蛋白质中的蛋白质具有相干的选择性和紧密调节的MV形成过程。
      在矿化开始之前,通过载体成骨细胞培养物产生的ECM足以使矿物化独立于进一步的细胞活性。对此可能的解释是已经附着在纤维状胶原基质上的MV的存在(
      • 安德森H.C.
      • 加里米拉R.
      • 标签S.E.
      基质囊泡在生长板开发和生物矿化中的作用。
      ),通过检测ECM中的囊泡蛋白质来证实的东西(Fig. 3)。这些MV将使矿物晶体进一步向ECM繁殖而没有额外的成骨细胞干扰。激活素损伤的事实损害了MV生物发生解释了激活素对矿化的不可能。
      成骨细胞分化是相互依赖事件的顺序顺序(
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      调节成骨细胞形成和功能。
      因此,MV损伤可能通过对ECM成熟的先前阶段的主要影响来确定。此外,我们认为,这种对ECM的这种影响不太可能是因为促成骨细胞分化的延迟,因为在该骨形成模型中,分化标记基因保持不变(
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      活素A-Follistatin系统:人体细胞外基质矿化有效调节剂。
      )。生长实验,其中通过骨催化剂细胞培养细胞2D ECM提供了有关ECM的成熟度的更多信息。尽管较低的载体有效,发现ECM能够增强骨催化剂细胞矿化,表明Activin仍然保留ECM,与对照ECM相比,增强成骨细胞分化的能力。由于其无法支持矿化的后期,我们假设激活素AECM特异性刺激骨肉的早期阶段。有趣的是,胶原蛋白和Fn1是在Activin A ECM中调节的两种蛋白质,其在这种作用中特别良好。已显示涂有胶原蛋白或FN1的培养板以增强成骨细胞分化(
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      致谢

      我们感谢Marijke Koedam和Tanja Strini用于细胞培养实验的技术援助。

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