在鼠磷蛋白酶的各自检测平台内的彩易福彩和CID型碎片评估*

      蛋白质磷酸化调节了一种生物学功能,其调节对于适当的细胞活性至关重要。质谱是磷酸肽分析的促进工具,其中最近的线性离子阱和横梁技术的速度和敏感性的进步可以在更少的时间内产生更全面的磷蛋白酶分析。 MS的蛋白质磷酸化分析依赖于通过受控肽片段衍生的结构信息。与传统的离子阱的碰撞诱导的解离(CID)相比,最近的碎裂类型称为彩易福彩(较高的能量碰撞解离)提供束型CID串联MS,其在壁图质量分析仪中以高分辨率检测片段离子的碎片离子。在这里,我们将彩易福彩与三种单独的实验条件下的鼠脑进行大规模磷酸化分析的传统CID。这些包括相同的前体分析,其中CID和彩易福彩扫描的背对背进行,分离磷酸酪氨酸肽免疫沉淀实验的分离分析,并分离全磷酸酯组分析。 彩易福彩通常提供更高的搜索引擎分数,并鉴定更多的肽,从而为大多数度量进行背对背实验进行CID。然而,对于磷酸酪氨酸IP和小鼠脑的全部磷脂蛋白质研究,仅CID的更高的采集速度分析提供了较大的数据集。我们与那些从Nagaraj N,D直接矛盾的人协调结果'Souza RCJ 等等。(J.蛋白质组。9:6786,2010)。我们得出结论,对于大规模的磷肝蛋白质,在离子阱中快速检测的CID碎片仍然产生了基本更丰富的数据集,但背对背实验表明了彩易福彩和Orbitrap对未来检测的承诺。
      大脑留出专业的功能,例如在同步的磷酸化事件上取决于神经传输和内存(
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      缓慢突触传递的神经生物学。
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      Camkii功能在突触和行为记忆中的分子基础。
      ),蛋白质磷酸化事件的鉴定和表征是最常使用质谱法(
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      质谱法在表征蛋白质结构中的基本作用:映射后翻译修饰。
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      群体的磷蛋白质。
      )。目录脑磷酸化事件进一步扩大了我们对专业信号传导事件的理解,之前的小鼠脑磷酸化调查具有广泛的分馏,有时会产生含有数千个网站的数据集(
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      突触磷酸化和蛋白质表达的定量分析。
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      在成年小鼠脑中突触,核和组蛋白蛋白的翻译后修饰综合修饰综合映射。
      )。磷酸化位点的大规模鉴定不仅是生物学上重要的,而且呈现了传统上延伸了基于质谱的蛋白质组学技术的能力的分析挑战。获得最大磷蛋白酶分析深度需要持续改进和优化分析方法,因为介绍了新技术。
      混合质谱仪变得越来越普遍,包括飞行时间仪器,与离子疏水阀联合的四轮节,以及与离子回旋谐振电池联接的离子阱(
      • Makarov A.
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      混合线性离子阱/绕组质谱仪的性能评价。
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      FTMS改善大规模蛋白质组学的串联质谱分析,具有卓越的蛋白质定量。
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      通过电子转移解离质谱法分析肽和蛋白质序列分析。
      )。杂交线性离子陷阱组合也享有广泛的使用。对于大多数自下而上的蛋白质组学实验,最初以高分辨率和高质量精度在壁图中检测到完整的肽。然而,通常通过碰撞诱导的解离(CID)在线性离子阱中分离和检测MS / MS光谱
      使用的缩写是:
      c
      碰撞诱导的解离
      彩易福彩.
      更高的能源碰撞解离
      SCX.
      强阳离子交换
      imac.
      固定化金属亲和层析
      F A
      甲酸
      ACN.
      乙腈
      FDR.
      虚假发现率。
      1使用的缩写是:c
      碰撞诱导的解离
      彩易福彩.
      更高的能源碰撞解离
      SCX.
      强阳离子交换
      imac.
      固定化金属亲和层析
      F A
      甲酸
      ACN.
      乙腈
      FDR.
      虚假发现率。
      因为它的速度和敏感性。对于磷酸肽分析,这种组合尤其是普遍存气的(
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      磷脂蛋白分析的串联质谱策略。
      )。最近,已经出现了可以补充或取代传统CID的新型碎片技术,并包括电子捕获解离(
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      电子捕获解离用于繁殖蛋白质阳离子的结构表征。
      ),电子转移解离(
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      通过电子转移解离质谱法分析肽和蛋白质序列分析。
      ),更高的能量碰撞解离(彩易福彩)(
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      FTMS改善大规模蛋白质组学的串联质谱分析,具有卓越的蛋白质定量。
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      • 角horn
      肽改性分析的较高能量C-Trap解离。
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      • Mcalister G.C.
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      没有专用碰撞单元的更高能量碰撞激活的解离。
      )。
      LTQ orbitrap提供彩易福彩碎片(
      • 奥尔森J.V.
      • MACEK B.
      • lange O.
      • Makarov A.
      • 角horn
      肽改性分析的较高能量C-Trap解离。
      其中离子在碰撞单元而不是离子阱中碎片,然后通过C-Trap转移回到壁图中的高分辨率的C-Trap进行分析。与传统的离子阱的碰撞诱导的解离相比,具有锻造检测的彩易福彩碎片没有低质量截止,高分辨率离子检测和增加的离子片段,导致质量更高的MS / MS光谱。 彩易福彩还采用比离子陷阱CID中使用的较高的能量解剖,从而实现更广泛的碎片途径。然而,一个缺点是光谱采集时间越长,因为通过电子乘法器检测离子阱中的CID光谱的傅里叶变换检测需要更多离子。 LTQ orbitrap Velos平台提供对源区的改进,导致离子电流增加~10倍(
      • 奥尔森J.V.
      • MACEK B.
      • lange O.
      • Makarov A.
      • 角horn
      肽改性分析的较高能量C-Trap解离。
      )。当加上更有效的彩易福彩碰撞单元时,这极大地提高了彩易福彩碎片的性能,使得快速和常规分析可能(
      • 第二个T.P.
      • Blethrow J.D.
      • Schwartz J.C.
      • Merrihew G.E.
      • maccoss m.j.
      • Swaney D.L.
      • 罗素J.D.
      • Coon J.J.
      • Zabrouskov V.
      双压线性离子阱质谱仪改善复合蛋白混合物分析。
      )。
      近期复合蛋白质组学混合物的比较研究旨在测定彩易福彩与眶上检测的彩易福彩值与具有离子阱检测的CID相比,得出的结论(
      • 第二个T.P.
      • Blethrow J.D.
      • Schwartz J.C.
      • Merrihew G.E.
      • maccoss m.j.
      • Swaney D.L.
      • 罗素J.D.
      • Coon J.J.
      • Zabrouskov V.
      双压线性离子阱质谱仪改善复合蛋白混合物分析。
      ,
      • 奥尔森J.V.
      • Schwartz J.C.
      • Griep-raming J.
      • Nielsen M.L.
      • 达莫e.
      • Denisov E.
      • lange O.
      • 弥补P.
      • 泰勒D.
      • 灿烂的玉米
      • Wouters e.r.
      • Senko M.
      • Makarov A.
      • 角horn
      具有非常高的测序速度的双压力线性离子阱Orbitrap仪器。
      ,
      • NA. garaj N.
      • d'souza r.c.
      • Cox J.
      • 奥尔森J.V.
      大型磷脂蛋白质具有较高能量碰撞解离碎片的可行性。
      )。鉴于尚不清楚哪种方法最适合蛋白质组学,我们首先使用磷蛋白组设计了几种大规模比较,这是一种理想的模型系统,既不是其生物重要性,而且它在分析上具有挑战性。此外,磷酸肽通常提供相对较少的信息性MS / MS光谱,并且定位单独的磷酸化位点强调收集的光谱的质量。
      为了评估彩易福彩和CID碎片在各自的分析策略中的性能,我们设计了三个实验,包括对同一个前体的背靠背分析,从而消除了CID的速度优势,以及两个现实世界磷脂蛋白酶分析(a脑抗磷酸赖斯汀肽亲和力下拉和大规模脑磷脂蛋白酶组的比较)。我们发现,尽管通过彩易福彩获得了更高的初级评分,但在离子阱中收集基于CID的MS / MS光谱仍然是优异的,允许检测几倍的磷酸肽。鉴于这些发现,我们将结果与最近声称彩易福彩(Orbitrap检测)优于磷蛋白酶中的CID(离子阱检测)有助于解释我们的发散结论(
      • NA. garaj N.
      • d'souza r.c.
      • Cox J.
      • 奥尔森J.V.
      大型磷脂蛋白质具有较高能量碰撞解离碎片的可行性。
      )。

      材料和方法

       组织准备

      如上所述制备鼠脑组织(
      • Huttlin E.L.
      • jedrychowski m.P.
      • eliasj.e.
      • Goswami T.
      • RAD R.
      • Beausoleil S.A.
      • VillénJ.
      • 哈斯W.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      小鼠蛋白磷酸化和表达的组织特异性地图。
      )。用150μg测序级胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)孵育每种10mg等份的裂解物。通过将三氟乙酸加到终浓度为0.2%,终止胰蛋白酶消化。摘要在500 mg c上脱沉18固相提取(SPE)盒(SEP-PAK;水,米尔福德,MA)和冻干。

       磷酸富集

      通过强阳离子交换(SCX)色谱法和固定的金属亲和色谱法(IMAC)如前所述富集磷酸肽(SCX)色谱法(
      • VillénJ.
      • Gygi S.P.
      通过质谱法的全局磷酸化分析的SCX / IMAC富集方法。
      )。收集10个SCX级分,脱盐并进一步富集IMac。使用c脱盐富集的磷酸肽18StageTips(
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      蛋白质组学中的蛋白质组学中的基质辅助激光解吸/电离,纳米电子涂布剂和LC / MS样品预处理的停止和去提取提示。
      )在10μl5%甲酸(Fa)/ 5%乙腈(ACN)中重新悬浮,其中通过液相色谱 - 串联MS(LC-MS / MS)分别地分析4μL。
      使用TiO的磷肽富集2 由Thingholm和Coworkers(
      • Thingholm T.e.
      • jørgensent.j.d.
      • Jensen O.N.
      • Larsen M.R.
      使用二氧化钛对磷酸化肽的高度选择性富集。
      )使用TitanSphere Tio2-Beads(GL科学,日本)。使用C脱盐磷酸肽18StageTips。 TIO.2 - 用12μl5%FA / 5%ACN重悬了4μl的样品,用于每个LC-MS / MS分析4μL,用于CID和彩易福彩碎片的背靠背比较,如图所示 Fig. 1补充图S3.
      图缩略图GR1.
      Fig. 1通过背对背,交替的CID和彩易福彩型碎片分析的磷酸肽分析,同样前体离子进行碎片。 A,使用混合LTQ Orbitrap Velos质谱仪的数据相关扫描的工作流程。来自每个全文循环的五个最丰富的离子进行序贯CID(离子捕集检测)和彩易福彩(orbitrap检测)碎片。使用该方法通过LC-MS / MS技术分析来自1mg蛋白水小鼠脑的二氧化钛样品。 B,Xcorr,ΔCn'的散射绘制分布,以及用彩易福彩鉴定的磷酸肽的升高值(y axis) and CID (x 轴)对于2 +,3+和4次以上的电荷离子,显示彩易福彩的一般趋势。 C,表总结了该实验的肽和蛋白质标识。逆转(诱饵)序列的匹配显示在括号中。

       含磷酸丝氨酸肽的抗体富集

      PhosPophyrosine富集的程序由Rush和Coworkers的描述改编(
      • 赶紧J.
      • 莫里茨A.
      • 李克.A.
      • 郭阿。
      • 高斯v.l.
      • spek e.j.
      • 张H.
      • Zha x.m.
      • Polakiewicz R.D.
      • 梳理M.J.
      癌细胞中酪氨酸磷酸化的免疫亲和力分析。
      )。将胰蛋白酶肽(10mg)溶于2ml免疫沉淀缓冲液中:50米m MOPS-NaOH,pH 7.2,10米m Na2HPO.4和50米m NACL。将溶液在室温下超声处理30分钟,并在4℃下以15,000×离心10分钟。 g 去除任何不溶性碎片。向上清液中加入50μg抗磷酸酪氨酸抗体(Cell信号传导技术,Danvers,MA)加入到50μl蛋白-A琼脂糖(Amersham Biosciences / Ge Healthcare,Piscataway,NJ)中,将混合物孵育过夜在4°C。用冷免疫沉淀缓冲液洗涤免疫复合物三次,用水洗一次。在室温下用两体积的40μl0.15%三氟乙酸洗脱肽10分钟。他们使用c脱沉18在10μl5%Fa / 5%ACN中,依锡并重新悬浮。通过彩易福彩-和CID型碎片分析每种LC-MS / MS分析的体积为4μL。

       液相色谱电喷雾电离串联质谱(LC-ESI-MS / MS)

      我们在混合双压力线性离子阱/ orbitrap质谱仪(LTQ orbitrap velos,Thermo Scientific,San Jose,CA)上进行了LC-ESI-MS / MS),配备了Famos AutoSampler(LC Packings,Sunnyvale,CA)和一个Agilent 1200二进制HPLC泵(Agilent Technologies,Palo Alto,CA)。肽混合物在100μmi.d.中分离。 Microcapillary柱首先用~0.5厘米的魔术c包装4 树脂(5μm,100埃,Michrom Bioresources,Auburn,CA),然后是20厘米的Maccel C.18AQ树脂(3μm,200Å,巢组,南伯勒,mA)。通过在85或145分钟的梯度下以0.125%的梯度施加在0.125%的梯度的情况下以〜300nl / min的流速施加0.125%的梯度,实现分离。
      LTQ Orbitrap Velos MS用于数据相关模式。在获取MS / MS光谱时使用专门的CID片段的方法包括orbitrap全MS扫描,然后在全MS扫描中检测到的最丰富的离子上最多20个LTQ MS / MS实验(TOP20)。 Essential MS设置如下:全文(AGC 3×106;分辨率6×104; m/z 范围300-1500;最大离子时间1000毫秒); MS / MS(AGC 2×103;最大离子时间150毫秒;最小信号阈值500;隔离宽度2 da;动态排除时间设置30s(相对于前体离子±10 ppm m/z);可以从选择中排除单个带电的离子和离子,没有充电状态。归一化碰撞能量设定为35%,并激活时间为20毫秒。
      对于采集完全彩易福彩 MS / MS光谱的方法,在全MS扫描中检测到的最丰富的离子上,最多10 彩易福彩-orbitrap MS / MS光谱。全文扫描的分辨率设定为3×104。用于MS / MS实验的AGC设定为3×104 在250毫秒的最大离子累积时间。将归一化碰撞能量设定为45%,在7.5×10的分辨率设置下检测彩易福彩碎片离子。3。所有其他设置都是如使用专门CID碎片的方法所述。
      用于CID和彩易福彩光谱的背靠背比较(Fig. 1补充表S4)选择在αS/ MS(TOP5)中检测到orbitraP全文谱中的五个最丰富的离子。首先选择每种肽离子用于CID碎片,然后在对下一离子进行CID-MS / MS之前进行彩易福彩实验。在LTQ离子阱或壁图中检测到CID片段离子。 MS设置如上所述。
      LTQ orbitrap XL的实验(85分钟梯度, 补充表S1在获取MS / MS光谱时,使用离子疏水阀中的专门CID碎片进行。除了MS / MS AGC之外,设置的设置描述为5×103 以及最大MS / MS离子累积时间,设置为120 ms。

       数据分析

      在频谱数据采集之后,原始文件被转换为MZXML格式,并准备如前所述的数据库搜索(
      • Huttlin E.L.
      • jedrychowski m.P.
      • eliasj.e.
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      )。使用续集(版本28修订版13)或吉祥物(版本2.3)算法搜索MS / MS光谱(
      • ENG J.K.
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      )。搜索谱的数据库,其中包含鼠标IPI数据库中所有蛋白质的序列(3.60版,56,738蛋白条目,2009年7月下载)和常见的污染序列( 例如 人类角蛋白和胰蛋白酶在前进和逆转方向上。以下参数用于鉴定应用搜索算法的磷酸肽:10ppm前体质量耐受性,0.8de产物离子容差,完全胰蛋白酶消化,最多两个错过的切割,可变修饰:氧化氨基氨酸氧化(+15.9949)和丝氨酸的磷酸化,苏氨酸和酪氨酸(+79.9663);固定修饰:半胱氨酸的氨基甲酰化(+ 57.0214)。对于所有彩易福彩光谱和高分辨率CID光谱 补充表S3,片段离子公差设定为0.02da。
      目标 - 诱饵方法用于对照肽和蛋白质水平虚假发现率(FDR)(
      • eliasj.e.
      • Gygi S.P.
      目标 - 诱饵搜索策略通过质谱法对大规模蛋白质鉴定的置信度提高。
      )。使用线性判别分析(LDA)使用以下变量与不正确的肽鉴定区分正确:Xcorr(0.8得分最小),ΔCn',前体质量误差,电荷状态和用于SCX / IMac的溶液电荷状态。变量ΔCn'给出通过续集的MS / MS光谱和与不同氨基酸序列的下一个最高评分匹配的最高评分肽匹配的Xcorr值中的相对差异,而不考虑翻译后修改。 LDA还用于控制来自吉祥物搜索的数据集的FDR,分别通过代替吉祥物的离子评分和XCorr和ΔCn'的Δ离子分数。除去比剩余数据集中的诱饵序列数在肽水平上除去短于六个氨基酸的磷酸肽,并将肽光谱匹配在肽水平上过滤至1%FDR。在将所有磷酸肽与其相应的蛋白质分组后,基于其倍增的肽LDA概率评分蛋白质。基于反转的蛋白质命中过滤分选清单,以最大限度地含有1%的假阳性蛋白质标识。在每个补充肽表中清楚地注意到任何蛋白质冗余。
      我们使用了ascore算法来量化每种磷酸化修饰可以将其分配给每种肽中的特定残留物的置信度(
      • Beausoleil S.A.
      • VillénJ.
      • 格柏S.A.
      • 赶紧J.
      • Gygi S.P.
      基于概率的高通量蛋白磷酸化分析和现场定位方法。
      )。磷酸肽,升高13升(p 认为0.05)被认为是自信地定位于特定的残留物。要计算每个实验的唯一站点数量,所有本地化站点都被计算一次。如果无法将非划分的网站分配给任何本地化站点(
      • eliasj.e.
      • Gygi S.P.
      目标 - 诱饵搜索策略通过质谱法对大规模蛋白质鉴定的置信度提高。
      )。评估占据重叠序列范围的多个非絮凝位点作为单一磷酸化事件进行评估。因此,计算出的独特网站对所有识别的磷酸化位点具有严格的最小估计。

       曼恩和工友的彩易福彩和CID原料文件分析(25)

      获取的Xcalibur .Raw文件从ProteomeCommons.org下载(
      • 山J.A.
      • 史密斯B.E.
      • Papoulias P.G.
      • 安德鲁斯P.C.
      ProteomeCommons.org与Tranche存储库集成的协作注释和项目管理资源。
      )在下面的哈希。
      / gyf6csx8xlx8autof4 / ocfdl3tdb6j4uplcezstxl2kdzr9oub5j6ndiduk6 + ehqhj3td9gzsqtkadtum4 / gmsnyaaaaaaaatlq ==
      我们检查了在每个.raw文件中嵌入仪器方法中的所有关键频谱采集参数。然后,所有.RAW文件都被相同的参数搜索如下所述 数据分析 我们的方法部分。此外,我们重新检查提供的磷酸化地点列表 补充材料 伴随稿件:pr100637q_si_002.txt,pr100637q_si_003.txt和pr100637q_si_004.txt。

       数据传播

      所有数据都可以提供,包括所有原始数据文件
      Fig. 1:/ sf + uqxtlzcqn2oo3kkjbkut24ogz + pg5urn2haxzz8zmcii31qgwr5q4n4lgevwczgt61mjgg4aldrbzolobur2qamaaaaaaalmw ==
      Fig. 2:Rqqsjwskodoe55ftml8pxhwujwu / v1pzmfzghrezvc44e6 / q1mhtfox1hzfjuk84zrjhmvcvg6p8cqfc7lgpksdpgaaaaaaaamrq ==
      图缩略图GR2.
      Fig. 2c和彩易福彩型富含富含富含富集的富集肽的碎片。 A,PhosPophyrosine分析的工作流程。 B,含磷酸酪氨酸的Venn图含有肽及其在CID和彩易福彩之间的重叠。 C,表总结了这个实验。逆转(诱饵)序列的匹配是括号。
      Fig. 3:1V7 / Zdaflz1ddcmkfgiwtj8ewvmk5ycfxvbbnprzyrtjhm5td8qtj60seqb5dflmxpsa4k8mpfdeedcgciibh4sbd8iaaaaaaaaarza ==
      图缩略图GR3.
      Fig. 3c和彩易福彩型碎裂的小鼠脑的全磷糖膜分析。 A,磷蛋白酶分析的工作流程。脑磷酸肽富含SCX-IMAC方法(
      • VillénJ.
      • Gygi S.P.
      通过质谱法的全局磷酸化分析的SCX / IMAC富集方法。
      )通过分离的85min CID和彩易福彩运行分析10个级分。 B,SCX级分中鉴定的磷酸肽。 C,这些研究摘要。逆转(诱饵)序列的匹配是括号。 D, E,网站和磷蛋白的Venn图在CID和彩易福彩实验之间重叠。
      补充图S3:n0ksl0hrjsoisx8tg7hp5slijvkq / f3pjess + jqecfsxscjt09z + ff5ufuiu / kngjzo9nmcya1tke + alywo3cxa8v3gaaaaaaaalfa ==
      补充表S1:popja9xrvwqy671cyxsseyuqvkr0gxnajrqd6q2mwfvqlgys2zsrnky5xslvc9zhyask // fwqyleo0yixb0ndjimiuaaaaaaaaapaq ==
      此外,所有MS / MS光谱也是通过超链接提供的 补充表S1至S12。其内容的注释列表位于表的补充轮廓中。

      结果和讨论

      在LTQ orbitrap Velos上采用的彩易福彩型碎片是一种强大的技术,用于产生更高分辨率MS / MS光谱。然而,彩易福彩 MS / MS Orbitrap Spectra的采集速度约为传统的较低分辨率CID离子捕集谱的发现的一半。此外,具有斜体检测的彩易福彩具有比基于电子乘数的CID技术更低的灵敏度。尽管有这些限制,但彩易福彩的一个非常有用的特征是,与CID相比,在MS / MS光谱中,低质量区域很好地表示,使彩易福彩与等因素标记试剂组合(例如 TMT,ITRAQ)产生小的 m/z reporter ions (
      • Mcalister G.C.
      • Phanstiel D.
      • 温格C.D.
      • 李米夫。
      • Coon J.J.
      FTMS改善大规模蛋白质组学的串联质谱分析,具有卓越的蛋白质定量。
      ,
      • Boja E.S.
      • 菲利普斯D.
      • 法国S.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      具有高能量碰撞解离的LTQ-壁毯上的定量线粒体磷蛋白酶。
      ,
      • Pichler P.
      • KöcherT.
      • Holzmann J.
      • MöhringT.
      • Ammerer G.
      • Mechtler K.
      通过横向彩易福彩细胞中的轴向提取场改进ITRAQ和TMT定量的精度。
      )。此外,彩易福彩碎片支持多种切割事件,这可能导致磷酸中性损失的磷酸肽的富含碎片化,其中磷酸是不生产和共同的(
      • Beausoleil S.A.
      • jedrychowski m.
      • 施瓦茨D.
      • eliasj.e.
      • VillénJ.
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      • COHN M.A.
      • 坎特利L.C.
      • Gygi S.P.
      Hela细胞核磷蛋白的大规模表征。
      )。鉴于制作彩易福彩主流分析技术的进展和彩易福彩和CID之间的比较的最近相互矛盾的报告(
      • Mcalister G.C.
      • Phanstiel D.
      • 温格C.D.
      • 李米夫。
      • Coon J.J.
      FTMS改善大规模蛋白质组学的串联质谱分析,具有卓越的蛋白质定量。
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      • NA. garaj N.
      • d'souza r.c.
      • Cox J.
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      大型磷脂蛋白质具有较高能量碰撞解离碎片的可行性。
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      • 奥尔森J.V.
      • Schwartz J.C.
      • Griep-raming J.
      • Nielsen M.L.
      • 达莫e.
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      • lange O.
      • 弥补P.
      • 泰勒D.
      • 灿烂的玉米
      • Wouters e.r.
      • Senko M.
      • Makarov A.
      • 角horn
      具有非常高的测序速度的双压力线性离子阱Orbitrap仪器。
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      • 弗雷泽C.K.
      • Altelaar a.f.
      • Hennrich M.L.
      • 挖掘D.
      • Zeller M.
      • Griep-raming J.
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      使用CID,彩易福彩和ETD在LTQ-orbitrap Velos上改善靶向碎片的肽鉴定。
      ),我们设计了三个实验,以严格评估每种技术的性能,大规模的磷肝蛋白酶数据。

       比较相同的前体离子光谱

      为了比较彩易福彩(Orbitrap检测)和CID(离子陷阱检测)碎片差异的碎片技术,我们设计了一种背对背方法,这将均衡实验变异性,因为数据依赖性LC-MS / MS / MS分析的随机性质和通过确保在匹配的实验条件下依次检查相同的前体来估算彩易福彩和CID采集的差异。这种实验设计使我们可以比较彩易福彩和CID光谱对蛋白质组学识别的相对效用,与其在采集速度的固有视差无关。 Fig. 1A 显示通过二氧化钛固定相富集从鼠脑细胞裂解物中富集的磷酸肽样品上使用的方法的示意图。 LC-MS / MS分析(155分钟)在相同的前体离子上依次获取彩易福彩和CID光谱,导致收集16,640ms / MS光谱。使用续集搜索所有光谱(
      • ENG J.K.
      • mccormack a.l.
      • yates j.r.
      一种与蛋白质数据库中氨基酸序列相关肽的串联质谱数据的方法。
      )并过滤到1%蛋白质FDR。更多的光谱(19%)和更多位点(19%)和更多位点比彩易福彩匹配而不是CID技术(Fig. 1C),并且在吉祥物搜查时发现了类似的结果(补充表S2)。
      使用同时鉴定的所有肽,我们绘制Xcorr,ΔCn'和通过彩易福彩(orbitrap检测)和CID(离子捕集检测)碎片匹配的磷酸肽的亚升降肽的值2+,3+和4次带有4次带状肽。尽管Xcorr是续集的主要分数,但肽的ΔCn'值被定义为顶部续集匹配的Xcorr值与具有不同氨基酸序列的肽的下一个最高Xcorr值之间的差异(
      • Beausoleil S.A.
      • VillénJ.
      • 格柏S.A.
      • 赶紧J.
      • Gygi S.P.
      基于概率的高通量蛋白磷酸化分析和现场定位方法。
      )。对于从双重电荷前体的匹配光谱,CID压倒性地返回更高的Xcorr值,但彩易福彩整体鉴定了更多的2+肽( Fig. 1B, 补充图S5)。但是,对于3 +和4+肽,XCorr值偏好于彩易福彩平台,而ΔCn的值始终赞成彩易福彩策略并返回更高的XCorr值(Fig. 1B, 补充图S5)。鉴于我们通过充电状态看到了不同的Xcorr趋势,我们阐述了所有鉴定的磷酸肽 Fig. 1 通过对49种不同的化学性质进行多变量分析,以阐明这些差异的病因(补充图S6)。值得注意的是,通过对所用参数的碎片方法鉴定的肽之间几乎没有观察到的差异。这表明一项技术唯一地鉴定的肽可能反映随机差异,并且不表示关于肽的物理或化学性质的碎片策略的偏好。因此,两个平台使磷酸膜的可比覆盖。
      我们还在高分辨率下检查了一个相同的小鼠脑样本,在绕墙上收集CID和彩易福彩光谱(补充表S4)。每个碎片方法确定了相似数量的磷酸肽和独特的位点,表明MS / MS离子的改善的质量精度至少部分地负责任何差异 Fig. 1.
      虽然搜索算法如续集和吉祥物,但能够高度置信识别肽序列,但它们通常难以区分仅在翻译后修饰的定位中不同的肽的异构形式。在大多数情况下,这些算法没有为翻译后修改的各个部位的定位提供了直接措施。 ASCORE算法给出了概率分数,反映了每个站点可以将每个站点分配给其底物肽上的特定位置的相对置信度(
      • Beausoleil S.A.
      • VillénJ.
      • 格柏S.A.
      • 赶紧J.
      • Gygi S.P.
      基于概率的高通量蛋白磷酸化分析和现场定位方法。
      )。与CID获得的MS / MS相比,基于彩易福彩的光谱升高的升高值(中位数= 39.6 相对 分别为28.9)。示例光谱显示在 补充图。S1,所有MS / MS光谱都可以通过超链接获取 补充表S5-S8。总体而言,这种相同的前体离子实验使我们可以在没有采集速度的情况下评估数据质量的差异。值得注意的是,这些结果是基于实施相同的CID和彩易福彩光谱收集率,因为实验的背对背性质。

       评估磷酸酪氨酸亲和富集的样品

      接下来检查考虑磷酸酪氨酸 - (PY)含有肽的肽(PY)在大多数磷蛋白酶数据集中的肽,通常包含检测到的总位点的〜1-2%的磷酸酪氨酸(PY)含有肽的肽(离子捕集)和CID(离子捕集检测)之间的差异。
      • Huttlin E.L.
      • jedrychowski m.P.
      • eliasj.e.
      • Goswami T.
      • RAD R.
      • Beausoleil S.A.
      • VillénJ.
      • 哈斯W.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      小鼠蛋白磷酸化和表达的组织特异性地图。
      )。我们和其他人以前使用过抗体免疫尿(IPs),以选择性地富含含有Py的肽(
      • VillénJ.
      • Beausoleil S.A.
      • 格柏S.A.
      • Gygi S.P.
      小鼠肝的大规模磷酸化分析。
      ,
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      • 郭阿。
      • 高斯v.l.
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      • 张H.
      • Zha x.m.
      • Polakiewicz R.D.
      • 梳理M.J.
      癌细胞中酪氨酸磷酸化的免疫亲和力分析。
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      鼠脑中酪氨酸磷酸化位点的大规模鉴定及演化分析。
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      • 可能A.
      • yu J.
      • 海克H.
      • NA. rdone J.
      • 韭葱。
      • Reeves C.
      • 李Y.
      • 胡Y.
      • 谭Z.
      • 斯托克斯米
      • Sullivan L.
      • 米切尔J.
      • Wetzel R.
      • 麦克奈尔J.
      • 任吉。
      • 元J.
      • bakalarski c.e.
      • Villen J.
      • Kornhauser J.M.
      • 史密斯B.
      • 李德。
      • 周X.
      • Gygi S.P.
      • GU T.L.
      • Polakiewicz R.D.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      全球磷酸赖硒信令调查鉴定肺癌中的致癌酶。
      )因此,我们实施了这种方法来解决这些策略对这些富集的样本(Fig. 2A)。通过单独的CID和彩易福彩方法分析来自10mg蛋白水解的小鼠脑裂解物的PY IP。总共通过结合这两种策略来确定845个位点(0.46%肽FDR)。然而,CID分析检测了40%的含有含有的Py肽和34%的位点多于彩易福彩(Fig. 2C)。此外,网站重叠显示,只有11%的PY网站对彩易福彩独有(Fig. 2B)。我们得出结论,通过低分辨率,基于CID的策略更快地采集速度,基于高分辨率,基于高速彩易福彩的较慢的策略,从Py肽样本产生较大的数据集。

       评估小鼠脑磷脂蛋白酶

      我们接下来使用单独的CID(离子阱检测)和彩易福彩(orbitrap检测)分析来解决来自彩易福彩光谱的高搜索引擎得分的全部磷脂糖常组分析,以解决传统CID的速度优势。总共,将十种IMAC富集的SCX分数分为一半并通过彩易福彩和CID分析(Fig. 3A)。在其各自的策略中,CID分析收集了2.3倍的MS / MS光谱,匹配了1.8倍的肽,并鉴定了比彩易福彩更多的1.5倍Fig. 3C)。虽然彩易福彩碎片在后期的级分中表现较好,但是较大的肽和更高的电荷态在其中占主导地位,但它仍然没有比CID更好地提供更多的肽鉴定(Fig. 3B)。此外,彩易福彩结果更具代表性的数字,我们通过使用前一代LTQ orbitrap XL质谱仪通过CID分析的匹配脑SCX / IMAC实验中累积的数量(补充表S1)和先前发表的研究使用与此相同的垃圾来自同一垃圾(
      • Huttlin E.L.
      • jedrychowski m.P.
      • eliasj.e.
      • Goswami T.
      • RAD R.
      • Beausoleil S.A.
      • VillénJ.
      • 哈斯W.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      小鼠蛋白磷酸化和表达的组织特异性地图。
      )。
      进一步检查在CID和彩易福彩之间的部位和磷蛋白重叠(图。 3.D, 3E)揭示了绝大多数位点(87%),鉴定的磷蛋白(95%)并不是彩易福彩碎片。总共,当组合两组数据集时,我们检测到83,005种磷酸肽在5101蛋白上产生20,506个独特的位点,代表迄今为止的最大脑磷酸化数据。此外,我们试图创建一个决策树,该决策树将根据充电状态选择最佳碎片技术和 m/z 价值如文献中所述(
      • 弗雷泽C.K.
      • Altelaar a.f.
      • Hennrich M.L.
      • 挖掘D.
      • Zeller M.
      • Griep-raming J.
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      使用CID,彩易福彩和ETD在LTQ-orbitrap Velos上改善靶向碎片的肽鉴定。
      ,
      • Swaney D.L.
      • Mcalister G.C.
      • Coon J.J.
      霰弹枪蛋白质组学的决策树驱动串联质谱。
      )。我们发现,无论电荷状态如何和 m/z 值,CID在调整成功概率以进行采集速度时,CID将优先于彩易福彩(补充图S7)。我们得出结论,传统的CID(离子阱检测)允许比高质量精度彩易福彩光谱更深入地覆盖磷酸溶液,证明了CID的清晰优势。
      有趣的是,我们的调查结果直接与曼数和同事报告的结果相矛盾(
      • NA. garaj N.
      • d'souza r.c.
      • Cox J.
      • 奥尔森J.V.
      大型磷脂蛋白质具有较高能量碰撞解离碎片的可行性。
      谁从HeLa细胞(也使用10分数)进行了类似的大规模磷肝蛋白酶分析以评估彩易福彩-和CID型碎裂。与我们的数据相比,他们的研究报告说,具有腹膜检测的彩易福彩鉴定了比传统CID更多的磷酸化位点(16,559 相对 11,893)。我们最初质疑这一大差异是否可归因于所用的搜索算法(分别续集和吉祥物)。但是,在比较吉祥物和对我们的背靠背实验续集时(Fig. 1),我们发现算法性能的小差异(补充表S2)。因此,要确定我们各自研究之间的关键差异(特别是鉴于用于收集两个数据集的高度相似的方法),我们下载了作者提供的,在Tranche上提供的文件(
      • eliasj.e.
      • Gygi S.P.
      目标 - 诱饵搜索策略通过质谱法对大规模蛋白质鉴定的置信度提高。
      )。重要的是,这些文件不仅包含来自实验的原始MS数据,还包括用于数据采集的实际方法和仪器设置。这些参数中的报告和实际设置是CID分析的排除宽度容差的实际设置之间的显着差异。如图所示 补充图S3,选择用于MS / MS的峰后的排除质量宽度窗口为所有彩易福彩文件设置为±10 ppm,但为-5和+10 m/z 对于所有CID文件(在稿件中报告±10 ppm)。因此,特定于CID,15 m/z (而不是20ppm)窗口被阻塞从重新分析,每个MS / MS被获得最多1分钟(窗口大小的750倍差异 m/z 1000)。由于每分钟收集数百MS / MS光谱,因此该差异可能导致频谱中存在的大多数离子不可用,以供软件选择。当作者指出的是,当作者指出,他们的循环时间非常低效,说明“......特别地,仪器只在1%的情况下执行了10个或更多的CID扫描,在大多数情况下,在大多数情况下只有碎片或一个前体离子“(页6792)。这导致了对CID碎片触发的MS / MS事件的数量的显着减少,并且可能是彩易福彩在手中表现优于CID的主要原因。 Fig. 4 包含我们实验中每周期获得的MS / MS谱的数量。 MS / MS扫描的绝大多数(~90%)循环包含了MS / MS扫描的全部限制。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4循环深度(A)和验证率(B)对于CID和彩易福彩方法。 数据来自 通过计算从所有十个SCX运行的每个全部MS扫描触发的MS / MS谱的数量来分析循环深度。 TOP10和TOP20方法分别用于彩易福彩和CID分析。当触发MS / MS时,绝大多数循环相应地包含10或20毫秒/ ms事件。 彩易福彩光谱在一个周期内的所有MS / MS位置具有更高的验证率。级分有效表示含有1%FDR的磷酸肽的级分。
      为了完整性,我们从Mann和Coworkers提供的.RAW文件中搜索了MS / MS Spectra(
      • NA. garaj N.
      • d'souza r.c.
      • Cox J.
      • 奥尔森J.V.
      大型磷脂蛋白质具有较高能量碰撞解离碎片的可行性。
      )(包括吉祥物搜索以及本地化站点的Ascore算法)。在这里,我们再次遇到了出版结果的明显差异。他们的报告要求在包含10个彩易福彩分析的数据集中检测到16,559个站点。但是,我们的重新分析仅在同一运行中分配了8910个站点(其价值的55%)(补充表S3,S9)。然后,我们试图将我们的结果与他们的补充表协调。不幸的是,没有足够的信息共享以充分评估现场计数的差异。例如,缺少两条信息:(1)通过彩易福彩分析鉴定的磷酸肽总数,以及(2)这些鉴定的磷酸肽的序列列表。其中一张补充表包含16,559个条目,以表示其分析的一次重复中确定的网站。然而,许多条目引用了来自相同扫描和同一文件的相同单磷酸化的肽,然后将几个站点分配给它(补充图S4A,4B.)。基于这些数据,我们可以确认发生过计数,但我们无法确定其实际程度,而无需鉴定的磷酸肽的完整列表。要解决此问题,我们为此重新分析提供了所有数据 补充表S9 希望这可以在以后可以解决。
      总之,我们评估了CID(离子陷阱检测) 相对 彩易福彩(Orbitrap检测)用于全磷酸肽综合体中的磷酸肽分析。使用同样前体分析(Fig. 1),彩易福彩展示了优异的ΔCN'和升高值并鉴定了更多的磷酸肽。然而,CID极大地利用了PY IP样本和对小鼠脑磷蛋白酶组的综合分析。此时,尽管文献中的先前报告(以前的报告,CID(离子陷阱检测)的速度效益超过了深度磷蛋白质中的高分辨率彩易福彩的较高搜索引擎评分
      • NA. garaj N.
      • d'souza r.c.
      • Cox J.
      • 奥尔森J.V.
      大型磷脂蛋白质具有较高能量碰撞解离碎片的可行性。
      )。然而,彩易福彩的真实实验益处可能位于多路复用质谱分析的域中,使用诸如TMT或ITRAQ的异节标签,其中能够测量低电平 m/z 产品显然优于基于CID的方法。最后,已经报道了较新的和更快的基于Orbitra的彩易福彩分析,这可能会否定具有离子陷阱检测的CID的速度优势(

      Michalski,A.,Damoc,E.,Hauschild,JP,Lange,O.,Wieghaus,A.,Makarov,A.,Nagaraj,N.,Cox,J.,Mann,M.,角,S.,S。,S。基于光谱谱的蛋白质组学,使用Q辐射,高性能台面高杆孔玻璃质谱仪。摩尔。细胞。蛋白质组学

      )。

      致谢

      我们要感谢Deepak Kolippakkam帮助此手稿的生物信息学方面。我们还感谢John Rush的Cell Signaling Technology的Py抗体方法帮助。

      补充材料

      参考

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