二维差异凝胶电泳和质谱肺癌患者人类唾液的蛋白质组学分析*

  • 作者脚注
    ‖‖ 菲利克斯也支持DTW&纯净的yip赋予了教授。
    华晓
    脚注
    ‖‖ 菲利克斯也支持DTW&纯净的yip赋予了教授。
    隶属关系
    加利福尼亚州洛杉矶牙科研究所90095
    搜索本作者的文章
  • 雷张
    隶属关系
    加利福尼亚州洛杉矶牙科研究所90095
    搜索本作者的文章
  • 惠周
    隶属关系
    加利福尼亚州洛杉矶牙科研究所90095
    搜索本作者的文章
  • Jay M. Lee.
    隶属关系
    加利福尼亚州洛杉矶大卫·格芬医学院外科部90095

    加利福尼亚州洛杉矶朱森综合癌症中心90095
    搜索本作者的文章
  • 爱德华B.加仑
    隶属关系
    加利福尼亚州洛杉矶大卫·格芬医学院医学系90095
    搜索本作者的文章
  • David T.W.黄
    一致
    应当解决谁的通信:牙科研究所,牙科学院,加州大学 - 洛杉矶,10833 le Conte Ave,Chs 73-024,洛杉矶,加利福尼亚州90095。电话。:1-310-206-1138;传真:1-310-825-7609对谁应该解决谁:牙科研究所,加州大学牙科学院 - 洛杉矶,10833 Le Conte Ave,Chs 73-024,洛杉矶,加利福尼亚州90095 .: 1 -310-206-1138;传真:1-310-825-7609
    隶属关系
    加利福尼亚州洛杉矶牙科研究所90095

    牙科学院,加利福尼亚州洛杉矶90095

    头颈外科/耳鼻喉科,加利福尼亚州洛杉矶90095

    亨利萨默利加州大学加利福尼亚大学工程学院,加利福尼亚州洛杉矶洛杉矶90095
    搜索本作者的文章
  • 作者脚注
    ‖‖ 菲利克斯也支持DTW&纯净的yip赋予了教授。
    *该工作得到了国家卫生机构U01-DE16275和R21-CA0126733至DTW的支持。
      肺癌往往是无症状的,或者在早期阶段只引起非特异性症状。早期检测代表了降低肺癌不断增长的肺癌负担的最有希望的方法之一。人类唾液是一种有吸引力的诊断液,因为其收集侵入性比组织或血液的侵入性较少。在疾病进展过程中唾液中蛋白质的分析可以揭示潜在的生物标志物,其患有口腔或系统疾病,可在未来的医学诊断中广泛使用。根据批准的协议,有72名唾液样品收集招收本研究。二维差异凝胶电泳联合MS是唾液蛋白质组分离,定量和两种合并样品的鉴定平台。通过使用免疫测定方法验证候选蛋白质组学生物标志物并耐久化。通过二维差异凝胶电泳和MS发现了16种候选蛋白生物标志物。在发现样品集,预验证样品集和肺癌细胞系中进一步验证了三种蛋白质。肺癌患者和健康对照受试者中这些候选生物标志物的歧视力可达到88.5%的敏感性和92.3%的特异性AUC = 0.90。该初步数据报告表明,当人们发育肺癌时,人类唾液中存在蛋白质组学生物标志物。这些候选生物标志物的歧视力表明,可以为肺癌临床筛查和检测建立简单的唾液测试。
      肺癌长期以来一直是一个重要的全球公共卫生问题。在美国,肺癌是男女癌症相关死亡的最常见原因。根据美国癌症协会,主要类型的肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)
      使用的缩写是:
      NSCLC.
      nonsmall-细胞肺癌
      2d-dige.
      二维差异凝胶电泳
      SCLC.
      小细胞肺癌
      MALDI-TOF MS
      基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱
      LC-MS / MS
      液相色谱串联质谱法
      生命值
      Haptoglobin HP2.
      AZGP1
      锌α2-糖蛋白
      ANXA1
      Annexin A1
      接收器操作特征
      AUC
      鹏曲线下的区域
      COPD.
      慢性阻塞性肺疾病。
      1使用的缩写是:NSCLC.
      nonsmall-细胞肺癌
      2d-dige.
      二维差异凝胶电泳
      SCLC.
      小细胞肺癌
      MALDI-TOF MS
      基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱
      LC-MS / MS
      液相色谱串联质谱法
      生命值
      Haptoglobin HP2.
      AZGP1
      锌α2-糖蛋白
      ANXA1
      Annexin A1
      接收器操作特征
      AUC
      鹏曲线下的区域
      COPD.
      慢性阻塞性肺疾病。
      ,其中包含〜85%的肺癌(
      • 伊利米
      • 咪淋巴
      • 霍夫曼五。
      • Ammadi R.E.
      • Ortholan C.
      • BONNETAUD C.
      • 哈维特K.
      • Venissac n.
      • 莫格拉比B.
      • mouroux J.
      • PouysségurJ.
      • 霍夫曼P.
      肿瘤组织和血浆中高水平的碳酸酐酶IX是非小细胞肺癌患者预后的生物标志物。
      ,
      • Hoagland 4th,L.F.
      • Campa M.J.
      • 戈尔林E.B.
      • Herndon 2nd,J.E.
      • Patz Jr.,E.F.
      哈达福蛋白和后期甘草改性衍生物作为血清生物标志物,用于诊断非物质细胞肺癌。
      )。小细胞肺癌(SCLC)是另一种类型的肺癌,占案件的约15%(
      • 宠物E.D.
      • 斯蒂芬斯P.J.
      • O'Meara S.
      • 麦克布莱德D.J.
      • Meynert A.
      • 琼斯D.
      • 林M.L.
      • bear
      • 刘k.w.
      • 格林曼C.
      • 瓦雷拉I.
      • Nik-Zainal S.
      • 戴维斯H.R.
      • ordoñezg.r.
      • Mudie L.J.
      • latimer C.
      • 埃德金斯S.
      • Stebbings L.
      • 陈L.
      • 贾米
      • Leroy C.
      • 马歇尔J.
      • Menzies A.
      • 巴特勒A.
      • Teague J.W.
      • Mangion J.
      • 太阳y.a.
      • Mclaughlin s.f.
      • Peckham H.E.
      • 宗教公司
      • Costa G.L.
      • 李C.C.
      • Minna J.D.
      • Gazdar A.
      • Birney E.
      • 罗得岛M.D.
      • mckernan k.j.
      • stratton m.r.
      • futreal p.a.
      • 坎贝尔P.J.
      具有复杂烟草暴露的小细胞肺癌基因组。
      )。吸烟导致肺癌,这是迄今为止的主要风险因素(
      • Hecht S.S.
      吸烟和肺癌:化学机制和预防方法。
      ,
      • Jessie K.
      • 庞瓦姆。
      • Haji Z.
      • 拉希姆A.
      • Hashim O.H.
      与非吸烟者相比,整个人类唾液的蛋白质组学分析检测到白细胞介素-1受体拮抗剂,Thioredoxin和Lipocalin-1的表达。
      ,
      • vanni h.
      • Kazeros A.
      • 王R.
      • 哈维B.G.
      • 弗里斯B.
      • DE B.P.
      • 卡罗兰B.J.
      • Hübnerr.h.
      • O'Connor T.P.
      • 水晶r.g.
      吸烟吸烟会诱导人类脂肪消耗基因Azgp1的过表达。
      )。恶性肿瘤中的死亡率高,部分原因是症状,直到疾病已经转移,因此不可治于(
      • Gohagan J.K.
      • 马库斯下午
      • Fagerstrom r.m.
      • PINSKY P.F.
      • Kramer B.S.
      • PROROK P.C.
      • ascher s.
      • Bailey W.
      • 酿酒师B.
      • 教堂T.
      • Engelhard D.
      • 福特M.
      • Fouad M.
      • Freedman M.
      • 格尔曼E.
      • Gierada D.
      • 挖掘W.
      • Inampudi S.
      • 熨斗B.
      • 约翰逊C.C.
      • 琼斯阿。
      • kucera g。
      • kvale p.
      • Lappe K.
      • 庄园W.
      • 摩尔A.
      • Nath H.
      • neff s.
      • OKEN M.
      • Plunkett M.
      • 价格H.
      • reding d。
      • 莱利T.
      • Schwartz M.
      • Spizarny D.
      • Yoffie R.
      • Zylak C.
      肺筛查研究的最终结果,一种随机可行性研究螺旋CT与胸X射线筛选肺癌。
      ,
      • Hirsch F.R.
      • 富兰克林W.A.
      • Gazdar a.f.
      • Bunn Jr.,P.A.
      早期检测肺癌:近期生物学和放射学进步的临床观点。
      ,
      • spira a。
      • Beane J.E.
      • 莎第五。
      • Steining K.
      • 刘G.
      • Schembri F.
      • 吉尔曼S.
      • Dumas Y.M.
      • CALNER P.
      • Sebastiani P.
      • Sridhar S.
      • Beamis J.
      • 羔羊C.
      • 安德森T.
      • 格里N.
      • 基恩J.
      • 莱堡米。
      • BRODY J.S.
      呼吸道上皮基因在患者诊断评价中患有可疑肺癌的诊断评价。
      )。早期检测代表了一种非常有前途的方法,可降低肺癌发病率和死亡率。然而,肺癌的常规诊断方法不适合普遍筛查,因为它们是昂贵的且偶尔会错过肿瘤或侵袭性癌症(
      • 扫战器V.
      生物标志物研究比比早期检测肺癌。
      ,
      • 彭G.
      • TISCH U.
      • adams o.
      • Hakim M.
      • Shehada N.
      • Broza Y.Y.
      • 贝兰斯。
      • Abdah-Bortnyak R.
      • Kuten A.
      • Haick H.
      使用金纳米颗粒诊断呼吸呼吸中的肺癌。
      ,
      • Brambilla C.
      • Fieget F.
      • Jeanmart M.
      • de fraipont f.
      • LantueJoul S.
      • Frappat V.
      • Ferretti G.
      • Brichon P.Y.
      • Moro-Sibilot D.
      早期检测肺癌:生物标志物的作用。
      ,
      • Hirsch F.R.
      • Merrick D.T.
      • 富兰克林W.A.
      生物标志物在早期检测肺癌和化学预防的作用。
      )。计算机断层扫描已经疯狂地用于肺癌早期筛查,尽管它经常产生高频率的误率(
      • Gohagan J.K.
      • 马库斯下午
      • Fagerstrom r.m.
      • PINSKY P.F.
      • Kramer B.S.
      • PROROK P.C.
      • ascher s.
      • Bailey W.
      • 酿酒师B.
      • 教堂T.
      • Engelhard D.
      • 福特M.
      • Fouad M.
      • Freedman M.
      • 格尔曼E.
      • Gierada D.
      • 挖掘W.
      • Inampudi S.
      • 熨斗B.
      • 约翰逊C.C.
      • 琼斯阿。
      • kucera g。
      • kvale p.
      • Lappe K.
      • 庄园W.
      • 摩尔A.
      • Nath H.
      • neff s.
      • OKEN M.
      • Plunkett M.
      • 价格H.
      • reding d。
      • 莱利T.
      • Schwartz M.
      • Spizarny D.
      • Yoffie R.
      • Zylak C.
      肺筛查研究的最终结果,一种随机可行性研究螺旋CT与胸X射线筛选肺癌。
      ,
      • yau g.
      • 锁m。
      • 罗德里格G.
      基线低剂量CT肺癌筛选的系统综述。
      ,
      • van klaveren r.j.
      • Oudkerk M.
      • Prokop M.
      • Spolten e.t.
      • Nackaerts K.
      • vernhout r.
      • van iersel C.A.
      • van den bergh k.a。
      • van'T Westeinde S.
      • 范德阿尔斯特C.
      • Thunnissen E.
      • 徐D.M.
      • 王Y.
      • 赵玉。
      • Gietema H.A.
      • de hoop b.j.
      • 呻吟H.J.
      • de bock g.h.
      • 范Ooijen P.
      • Weenink C.
      • 凡尔赛克莱恩J.
      • Lammers J.W.
      • Timens W.
      • Willebrand D.
      • vink a。
      • 马里W.
      • de koning h.j.
      体积CT扫描检测的肺结节管理。
      )。迫切需要更好的诊断方法来改善肺癌的检测。
      组织和血液已经广泛用于试图检测肺癌(
      • 伊利米
      • 咪淋巴
      • 霍夫曼五。
      • Ammadi R.E.
      • Ortholan C.
      • BONNETAUD C.
      • 哈维特K.
      • Venissac n.
      • 莫格拉比B.
      • mouroux J.
      • PouysségurJ.
      • 霍夫曼P.
      肿瘤组织和血浆中高水平的碳酸酐酶IX是非小细胞肺癌患者预后的生物标志物。
      ,
      • yee J.
      • 萨达尔M.D.
      • 罪恶D.D.
      • Kuzyk M.
      • xing l.
      • Kondra J.
      • McWilliams A.
      • 男子s.f.
      • 林S.
      结缔组织 - 活化肽III:一种新型血液生物标志物,用于早期肺癌检测。
      ,
      • 丁L.
      • Getz G.
      • 惠勒D.A.
      • Mardis e.r.
      • McLellan M.D.
      • Cibulskis K.
      • Sougnez C.
      • Greulich H.
      • Muzny D.M.
      • 摩根M.B.
      • 富尔顿L.
      • 富尔顿R.S.
      • 张Q.
      • Wendl M.C.
      • 劳伦斯M.S.
      • Larson D.E.
      • 陈克。
      • dooling d.j.
      • SABO A.
      • Hawes A.c。
      • 沉H.
      • jhangiani s.n.
      • Lewis L.R.
      • 大厅O.
      • 朱y
      • Mathew T.
      • ren y.
      • 姚杰。
      • Scherer S.E.
      • Clerc K.
      • Metcalf G.A.
      • NG B.
      • Milosavljevic A.
      • gonzalez-garay m.l.
      • 奥斯本J.R.
      • Meyer R.
      • 施X.
      • 唐y.
      • Koboldt D.C.
      • 林L.
      • 雅培R.
      • 矿工T.L.
      • pohl c.
      • 小格。
      • Haipek C.
      • 施密特H.
      • Dunford-Shore B.H.
      • Kraja A.
      • Crosby S.D.
      • Sawyer C.S.
      • vickery t.
      • 桑德尔S.
      • 罗宾逊J.
      • Winckler W.
      • Baldwin J.
      • Chirieac L.R.
      • 杜尔特A.
      • Fennell T.
      • 汉娜米
      • 约翰逊B.E.
      • Onofrio R.C.
      • 托马斯r.k.
      • Tonon G.
      • 韦尔B.A.
      • 赵X.
      • Ziaugra L.
      • zody m.c.
      • Giordano T.
      • orringer m.b.
      • 罗斯J.A.
      • Spitz M.R.
      • Wistuba II.
      • ozenberger B.
      • 好p.j.
      • Chang A.C.
      • 啤酒D.G.
      • Watson M.A.
      • Ladanyi M.
      • 布罗德里克S.
      • Yoshizawa A.
      • Travis W.D.
      • Pao W.
      • 省M.A.
      • Weinstock G.M.
      • varmus h.e.
      • 加布里埃尔S.B.
      • 着陆器E.S.
      • 吉布斯r.a.
      • Meyerson M.
      • 威尔逊r.k.
      躯体突变影响肺腺癌的关键途径。
      ,
      • Patz e.f.
      • Campa M.J.
      • 戈尔林E.B.
      • Kusmartseva I.
      • 关X.R.
      • Herndon 2nd,J.E.
      血清生物标志物小组诊断肺癌。
      )。 Sputum还被用于通过检测其异常启动子甲基化来预测肺癌(
      • Palmisano W.A.
      • 神圣的K.K.
      • Saccomanono G.
      • Gilliland F.D.
      • Baylin S.B.
      • 赫尔曼J.G.
      • Belinsky S.A.
      通过检测痰中的异常启动子甲基化预测肺癌。
      ,
      • Belinsky S.A.
      • klingee d.m.
      • Dekker J.D.
      • 史密斯M.W.
      • Bocklage T.J.
      • Gilliland F.D.
      • 挤压队
      • karp d.d.
      • 斯蒂德利C.A.
      • picchi m.a.
      基因启动子在血浆和痰中的甲基化随着肺癌的风险增加。
      )或金属离子(
      • 灰色r.d.
      • 邓肯A.
      • 贵族D.
      • Imrie M.
      • O'Reilly D.S.
      • Innes J.A.
      • Porteous D.J.
      • 绿化A.P.
      • Boyd A.c.
      痰痕量金属是炎症和化脓性肺病的生物标志物。
      );然而,筛选可能受到样品可用性或组成变异性的限制。不同的蛋白质组学技术已经从事这种类型的生物标志物发现。定量蛋白质组学技术,如ITRAQ(
      • 哈拉e.b.
      • Muller A.
      • Breitwieser F.P.
      • 李杰恩。
      • 格里比亚F.
      • 大歌j.
      • Bennett K.L.
      使用ITRAQ结合串联亲和纯化,以增强与肺癌有组有细胞突变的EGFR核心复合物相关的低丰度蛋白质。
      ,
      • Bortner J.D.
      • Richie J.P.
      • DAS A.
      • 廖J.
      • Umstead T.M.
      • 斯坦利A.
      • 斯坦利B.A.
      • Belani C.P.
      • El-Bayoumy K.
      ITRAQ人类血浆的蛋白质组学分析显示了香烟吸烟的ITI-HC3和VDBP的下调。
      ,
      • Pernemalm M.
      • de petris l.
      • Eriksson H.
      • Branden E.
      • koyi h.
      • Kanter L.
      • Lewensohn R.
      • LehtiöJ.
      窄距肽IEF改善血浆肺腺癌标志物的检测及胸腔积液。
      )和二维凝胶电泳(2-de)(
      • Jessie K.
      • 庞瓦姆。
      • Haji Z.
      • 拉希姆A.
      • Hashim O.H.
      与非吸烟者相比,整个人类唾液的蛋白质组学分析检测到白细胞介素-1受体拮抗剂,Thioredoxin和Lipocalin-1的表达。
      ,
      • 卢X.M.
      • 肖T.
      • 赵克。
      • 王H.
      • 郑H.W.
      • 林D.
      • 卢y.
      • 高雅。
      • 郑科
      • 刘S.
      • 徐恩
      组织蛋白酶D由M-FE细胞分泌:其作为肺癌的生物标志物的潜在作用。
      )已广泛用于不同类型的肺癌样品中的蛋白质组分析。
      人类唾液是一种有吸引力的早期检测生物流体(
      • Kaufman E.
      • Lamster I.B.
      唾液的诊断应用 - 评论。
      ,
      • 胡斯
      • lo j.a.
      • Wong D.T.
      人类唾液蛋白质组分析与疾病生物标志物发现。
      ,
      • 胡斯
      • 日益。
      • 安德。
      • Wong D.T.
      唾液蛋白质组学在药物发现与发展中的影响 - 一种关注癌症药物发现。
      )因为它的收集是非侵入性的,并且它含有大量蛋白质,其中许多蛋白质被证明是对口腔检测的信息(
      • 胡斯
      • 阿勒拿诺M.
      • Boontheung P.
      • 王继夫。
      • 周H.
      • 江j。
      • elashoff d.
      • 魏R.
      • lo j.a.
      • Wong D.T.
      口腔癌生物标志物发现的唾液蛋白质组学。
      ,
      • 胡斯
      • 王继夫。
      • Meijer J.
      • 梁S.
      • 谢Y.M.
      • yu t.
      • 周H.
      • 亨利S.
      • Vissink A.
      • Pijpe J.
      • Kallenberg C.
      • elashoff d.
      • lo j.a.
      • Wong D.T.
      原发性Sjogren综合征的唾液蛋白质组学和基因组生物标志物。
      )和全身疾病(
      • 张L.
      • 肖H.
      • 卡尔兰S.
      • 周H.
      • 总j.
      • elashoff d.
      • 一种。
      • yan x.
      • 嘉D.
      • karlan b.
      • Wong D.T.
      唾液转录组和蛋白质组学生物标志物的发现与临床前验证乳腺癌的非侵入性检测。
      ,
      • 张L.
      • Farrell J.J.
      • 周H.
      • elashoff d.
      • 一种。
      • 公园N.H.
      • 嘉D.
      • Wong D.T.
      唾液转录组生物标志物用于检测可重症胰腺癌。
      ,
      • 肖H.
      • Wong D.T.
      蛋白质组学及其对人类唾液生物标志物发现的应用。
      )。如肺癌,如肺癌,可直接或间接地影响唾液腺,并且可能影响生产的唾液的数量,以及组合物(
      • Kaufman E.
      • Lamster I.B.
      唾液的诊断应用 - 评论。
      ,
      • 胡斯
      • lo j.a.
      • Wong D.T.
      人类唾液蛋白质组分析与疾病生物标志物发现。
      ,
      • 维卡利诺R.
      • lobo m.j.c.
      • Ferrer-Correira A.J.
      • 拜宾J.R.
      • Tomer K.B.
      • 奄奄一息
      • 阿玛多。
      使用蛋白质组学鉴定人体整体唾液蛋白质组分。
      )。最近的一项研究表明,在小鼠肺癌模型中,唾液生物标志物显着且始终如一地改变,这表明唾液腺可能由远程肿瘤释放的介质调节(
      • 高K.
      • 周H.
      • 张L.
      • 李约。
      • 周问
      • 胡斯
      • Wolinsky L.E.
      • Farrell J.
      • EIBL G.
      • Wong D.T.
      黑素瘤和非小细胞肺癌小鼠模型中的全身性疾病诱导的唾液生物标志物谱。
      )。
      在这项研究中,从肺癌患者和匹配的健康对照受试者中收集人类唾液样品。分析唾液蛋白并在来自每组的两个合并的样品中进行比较。我们假设人类唾液中存在肺癌相关蛋白质,这可以在临床上用于区分肺癌患者免受健康对照受试者的影响。随着来自唾液的鉴别蛋白质组学标志物的发现和验证,具有高特异性和敏感性的肺癌将被非血液检测。

      实验步骤

       患者和学习设计

      该研究由两种阶段组成,包括发现阶段和确认阶段(Fig. 1)。总共使用72个唾液样品。所有这些唾液样本都在由我们的机构审查委员会(IRB)批准的议定书中收集,并提供书面知情同意的所有患者。全部收集,加工,并以类似的方式收集样品。如前所述,始终收集,稳定和保存未刺激的唾液样品(
      • 张L.
      • 肖H.
      • 卡尔兰S.
      • 周H.
      • 总j.
      • elashoff d.
      • 一种。
      • yan x.
      • 嘉D.
      • karlan b.
      • Wong D.T.
      唾液转录组和蛋白质组学生物标志物的发现与临床前验证乳腺癌的非侵入性检测。
      )。在测定之前将样品上清液保持在-80℃。首先在发现样品组(10个肺癌样品和10个健康对照样品)中首先验证已鉴定的蛋白质。在生物标志物确认阶段使用预防样品组(26个肺癌样品和26个健康对照样品)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1肺癌唾液蛋白质组学生物标志物发现的研究设计。

       肺癌细胞系

      NSCLC.细胞系(NCI-H1299和NCI-H460)和健康的肺细胞系(MRC-5)获得ATCC(Manassas,VA)。它们在DMEM培养基中培养,重复并裂解62.5米m Tris-HCl(pH = 6.8)含有2%SDS(W / V),10%甘油和0.2米m dithiothreitol.

       蛋白质组学平台

      使用二维差异凝胶电泳(2D-Dige)用于分离和量化来自肺癌患者的唾液蛋白和匹配的健康对照受试者。 MALDI-TOF MS和LC-MS / MS用于鉴定所选凝胶斑点中的蛋白质。

       2d-dige.

      通过BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Scientific Pierce蛋白质研究产品,Rockford,IL)测定唾液蛋白质浓度。通过从每个样品中取出等量的蛋白质,分别通过10肺癌样品和10个健康对照样品制成汇集的唾液样品。将200μg唾液样品中的蛋白质通过乙醇沉淀,然后重悬于2D细胞裂解缓冲液(30米m Tris-HCl,pH 8.8,含7 m 尿素,2 m 硫脲和4%3 - [(3-胆氨基甲基)二甲基胺]丙二磺酸盐)。两种合并的唾液样品,肺癌患者和健康对照受试者的总蛋白质分别由最小的Cydee Cy3和Cy5标记。然后组合两个标记的样品并进行2D-Dige。简而言之,在加载标记的样品后,按照Amersham Biosciences提供的协议进行等电聚焦(PH3-10)。在转移到13.5%SDS-凝胶中,将17cm固定的pH梯度条在SDS-凝胶运行缓冲液中冲洗。将SDS-凝胶在15℃下运行,直至染料前线从凝胶中耗尽。在运行SDS-PAGE之后,通过使用台风三重组(Amersham Bioscience,GE Healthcare,Waukesha,Wi)立即扫描凝胶图像。通过使用软件代理示例(3.3版,非线性动力学有限),通过凝胶内分析手动获得蛋白质表达水平的折叠变化。在凝胶图像分析之后,基于它们的折叠变化(大于或等于1.5),丰度和凝胶上的相对位置,将253个斑点位于凝胶上,折叠变化范围为1.1至8。通过胰蛋白酶消化的切除和凝胶。

       凝胶胰蛋白酶消化和质谱鉴定

      对于基质辅助激光解吸电离/飞行时间(MALDI-TOF)MS分析,切割选定的斑点并多次洗涤以去除染色染料和其他抑制化学品。干燥的凝胶斑在含有测序级修饰胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)的消化缓冲液中再水化。将蛋白质在37℃下在凝胶中消化过夜。用三氟乙酸萃取缓冲液和摇动从凝胶中萃取消化的肽。通过使用C-18 Zip-Tips(Millipore,Billerica,MA),脱盐的消化胰蛋白肽。将脱盐肽与CHCA基质(α-氰基-4-羟基氨基酸)混合,并发现到MALDI-TOF MS / MS(ABI4800)鉴定的MALDI板的孔中。蛋白质鉴定基于肽指纹质量映射(使用MS Spectra)和肽片段化映射(使用MS / MS光谱)。组合的MS和MS / MS Spectra使用全局蛋白质Server Explorer软件3.6版(应用生物系统,CA)提交了数据库搜索,配备了吉祥物搜索引擎(版本2.2.0, http://www.matrixscience.com)为了鉴定来自国家生物技术中心的蛋白质无余额 HOMO SAPIENS. 氨基酸序列数据库(9937670序列中的224815序列)。搜索的参数是胰蛋白酶的酶,1个错过的切割,固定修饰氨基甲酰(c),可变改性氧化(m),肽质量耐受:±0.5da,片段质量耐受:±0.5da,肽电荷1+的肽电荷和单同质缺乏。只有显着的命中,如吉祥物概率分析所定义(p <0.05),被接受。两种肽和C.I的标准。 %>95用于蛋白质鉴定。
      对于LC-MS / MS分析,消化所选斑点中的蛋白质与MALDI-TOF MS分析相同,并加载到LC-MS / MS(具有ThermoLTQ X1的Eksigent Nanolc-2d)。首先在反相捕集柱上富集肽(Proteopep II,100μm×2.5cm,C18,5μm,300,新目的,然后洗脱至分析柱(Proteopep II,75μm×10cm,C18,5μm ,300Å,新目标)。流动相由水中的缓冲液(a)5%乙腈和0.1%甲酸组成,缓冲液(B)0.1%甲酸在乙腈中。施加从15%B至95%B的400nl / min和60分钟的梯度的流速用于分离肽。通过Xcalibur软件版本3.3.0(Thermo Scientific,Waltham,MA)收集和加工光谱。组合的MS和MS / MS Spectra从RAW转换为MZXML(READW版本4.3.1),并通过使用x!Tandem(版本2010.04.21)提交数据库搜索。搜索参数是胰蛋白酶的酶,1个错过的切割,固定修饰氨基甲酰基(c),可变改性氧化(m),母离子耐受4da和片段质量耐受性:±0.4 da。两种肽和数值的标准(E-Value)<-10用于蛋白质鉴定。

       Western Blot.

      将唾液蛋白或细胞蛋白(每巷总量为15μg)加载到10%BIS-TRIS凝胶中并在MES SDS运行缓冲液中以150V运行一小时。呈现蛋白质标准(Invitrogen,Carlsbad,CA)用于跟踪蛋白质迁移。使用iBlot(Invitrogen)将蛋白质转移到硝酸纤维素膜中。然后将膜洗涤缓冲液(10米m Tris-HCl,pH 7.6,150米m 在含有5%的非比干牛奶(Santa Cruz,Santa Cruz,CA)的洗涤缓冲液中,NaCl和0.1%(v / v)吐温-20(西格玛-Aldrich,St.Louis,MI))在洗涤缓冲液中封闭,然后含有5%的脱脂剂(Santa Cruz,Santa Cruz,CA)。在洗涤缓冲液中进一步洗涤后,将膜与一抗抗体(小鼠单克隆到膜蛋白A1(ANXEX1)(AB2487,ABCAM,剑桥,MA),小鼠单克隆到Haptoglobin HP2(HP)(LS-B2863,Lifespan Bioscience) ,小鼠单克隆与锌α2-糖蛋白(AZGP1)(SC-13585,Santa Cruz生物技术),小鼠单克隆到β-肌动蛋白(A1978,Sigma-Aldrich)的单克隆根据制造商的说明在室温下阻塞缓冲液2小时。然后根据制造商说明在室温下施加二抗(抗小鼠IgG,来自绵羊,GE Healthcare)的二抗(抗小鼠IgG,过氧化物酶连接物种的整个抗体,在室温下施加膜。最后,使用ECL加检测试剂盒(GE Healthcare)洗涤并可视化膜。通过使用图像J软件(国家健康机构,Bethesda,MD)和相应的β-肌动蛋白表达作为参考来测量带的信号强度。

       埃莉莎

      人类CalProtectin的ELISA测试是根据制造商的指示(细胞科学)进行的。将所有唾液样品用样品稀释剂稀释100次。所有标准和唾液样品都是重复的。对于细胞裂解物,将3μg总蛋白质重复加载到每个孔中。

       数据分析

      软件GraphPad Prism(版本5.01)和R用于所有数据分析。 p 基于Wilcoxon测试计算价值 p <0.05用作截止值的意义。在预测模型建筑中使用了逻辑回归方法。对于所有经过验证的生物标志物,我们通过ROC曲线的数值集成来构建接收器操作特性(ROC)曲线并计算曲线(AUC)值下的区域。通过逻辑回归分析确认的肺癌相关蛋白质,进行逐步落后选择以确定生物标志物的最终组合。通过鉴定出现最高敏感性和特异性的预测概率的阈值来估计生物标志物组合的灵敏度和特异性。

      结果

       学习规划

      简要展示了研究设计 Fig. 1。根据我们的IRB(IRB#10-000505)批准的议定书收集所有唾液样本,并提供书面知情同意的所有注册科目。从罗纳德里根UCLA医疗中心使用活检,从诊断为肺癌的患者收集36种肺癌唾液样本,并进行手术;他们中的大多数都是nsclc(表I.)。通过将其年龄,性和种族与癌症组相匹配,将来自36个健康对照受试者的唾液样本作为对照组(p >0.05)。他们的吸烟历史通常是符合当前或前吸烟者及其持续时间和强度的匹配。患者人口统计学和临床​​概况 表I..
      表I.患者人口统计学和临床​​曲线
      人口统计学发现集确认集
      癌症 (n = 10)控制 (n = 10)癌症 (n = 26)控制 (n = 26)
      年龄段59.2±6.36.60.4±4.72.63.15±11.6361.65±9.4
      范围45–6945–7143–9045–89
      性别
          Male551211
          Female551415
      种族(美国)
          Caucasian882219
          Others2247
      烟雾史
          Yes671617
      肺癌
          NSCLC924
          SCLC12

       肺癌唾液蛋白质组分析

      对于蛋白质组学生物标志物发现,为唾液样品收集招募了10名未经处理的肺癌患者和10种匹配的健康对照受试者。癌症和对照组的汇集唾液是通过从每个单独的样品中汇集等量的蛋白质进行,以进行以下分析。然后通过2D-Dige分析两个合并的唾液样品。合并的2D-Dige图像显示在 Fig. 2。在凝胶图像分析后,基于它们的折叠变化,凝胶上的丰度和相对位置,将30个斑点进一步切除,进一步切除30个斑点,进一步切除30点,进一步切除凝胶,凝胶胰蛋白酶,凝胶胰蛋白酶(In-Gel胰蛋白酶)消化质谱分析。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2唾液蛋白质组学生物标志物发现。 来自肺癌患者(红色)和健康对照受试者(绿色)的合并2D-Dige图像。
      在这30个斑点中,19个折叠变化大于或等于2。将消化的肽加载到MALDI-TOF板上,并通过吉祥物搜索引擎针对国家生物技术信息中心搜索数据 HOMO SAPIENS. 氨基酸序列数据库。将这些斑点的十四个被鉴定为11个独特的蛋白质。所识别的蛋白质显示在 表二A. 30个斑点的11个折叠变化大于或等于1.5但小于2,将其消化的肽加载到LC-MS / MS中,并且对X串数据库进行搜索。结果 (表二b)显示八个斑点被鉴定为七种独特的蛋白质。
      表二鉴定人唾液蛋白,肺癌患者与健康对照受试者的显着变化
      (一种)
      斑点ID.蛋白质名称加入否。蛋白质MW(KDA)蛋白质pi.肽数蛋白质得分蛋白质得分C. I.%折叠变化
      443Annexin A1GI11958295040.26.610336100.04.5
      704白细胞介素1受体拮抗剂GI27894317.19.94.75242100.0−2.1
      742催乳素诱导的蛋白质GI116642259.9.15.36359100.0−2.1
      771Lipocalin 1.gi450496319.25.44115100.0−2.0
      778,785,947,948锌α2-糖蛋白GI14557964113.55.58,4,3,2356,89,85,62100.0(2.5),(2.0),(3.0),(4.3)
      779Cellophilin A.gi163305417.97.82174100.02.0
      815胱抑素S.GI4503109.16.25.05115100.02.0
      827人类calprotectinGI82407447.13.15.73182100.05.7
      886S100钙结合蛋白A8GI2161454410.86.57232100.0−5.3
      943Haptoglobin HP2.GI223976.41.76.26132100.03.6
      950胱抑素D.GI1988225616.16.74305100.02.2
      (b)
      斑点ID.蛋白质名称加入否。蛋白质MW(KDA)蛋白质pi.独特的肽日志(e)日志(i)折叠变化
      676HBA2ENSP00000251595.15.27.32−18.34.61.6
      723Lipocalin 1.ENSP00000360846.19.25.47−74.35.4−1.5
      725,932催乳素诱导的蛋白质ENSP00000291009.16.65.36, 7(-89.1),(-111.1)(5.6),(5.8)(-1.8),(-1.8)
      848CST5ensp0000030713216.16.74−34.15.11.6
      854S100钙结合蛋白A9ENSP0000035772713.25.77−91.26.2−1.5
      901SerpinB1.ensp00000370115.42.75.96−57.54.51.9
      909碳酸酐酶VI.ENSP00000366661.28.76.62−12.63.8−1.5
      总共22个斑点被鉴定为具有高置信度的蛋白质,根据数据库搜索,鉴定了16个独特的蛋白质。所有斑点都标记在合并的2D-Dige图像上 Fig. 2。列出了有关这些已识别的蛋白质的详细信息 表二。根据它们的折叠变化,生物功能和验证试剂的可用性,选择了四种蛋白质进行验证,包括HP,ANXA1,AZGP1和人类CalProtecin。就电流免疫测定方法的相对标准偏差而言,仅选择具有倍数变化≥2的那些斑点进行生物标志物验证。

       发现样本集中候选人的验证

      使用免疫测定用于验证这四种蛋白质。 Western Blot用于测试ANXA1,HP和AZGP1。人类的CalProtectin由ELISA试剂盒测试。在这四种蛋白质中,除了ANXA1之外,所有这些都可以很好地检测到。 HP,AZGP1和相应的β-肌动蛋白的蛋白质印迹如图所示 Fig. 3。肺癌和健康对照组中HP,AZGP1和人类CalProtectin的分布表现出显着差异 p 值为0.0041,00040和0.015。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3生命值的Western印迹(A),AZGP1(B)和β-肌动蛋白(C)在肺癌患者和健康对照科的唾液中。 将相同的蛋白质加载到每个车道上。

       预验证样本集中的确认

      为了进一步确认这些蛋白质在人类唾液中的存在,使用了预防样品(26个肺癌样品和26个健康对照样品)。通过使用上述相同的免疫测定方法,所有三种唾液蛋白(HP,AZGP1和人类CalProtectin)仍然表现出肺癌患者和健康对照受试者的显着差异 p 值为1.48E-4,1.05E-4和4.56E-5。

       生物标志物性能

      进一步评估了这些验证的蛋白质标记物的性能,用于检测肺癌在预验证样品集中。所有三种蛋白质的点图都显示在 图。 4.A, 4 B, 4C)。人类calProtectin的ROC曲线显示在 Fig. 4D。 HP,AZGP1和人类CalProtectin的相应AUC值分别为0.807,0.813和0.817。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4唾液蛋白质组学生物标志物评估和确认。 HP的点图(A),AZGP1(B)和人类calprotectin(C)在肺癌患者的唾液中和普雷浏览样本集的健康对照组。 D,人类CalProtectin的ROC曲线(ROC = 0.817)。
      Logistic回归用于通过软件R组合不同的标记。列出了三种潜断唾液蛋白质组学生物标志物的所有组合的生物标志物性能 表III。基于最大敏感性和特异性的最大总和选择相应的阈值。在 表IIIA,阈值来自预验证样本集。而在 表IIIB,阈值来自发现样本集。即使它们具有相同的AUC值,阈值 表IIIb比那更大 表IIIa(除了HP和人类钙保护蛋白的组合),这导致不同的敏感性和特异性。 Logistic回归组合生物标志物的DOT图,显示了HP和AZGP1 Fig. 5A。相应的ROC曲线显示在 Fig. 5B。如上所列 表IIIA,HP,AZGP1和人类CalProtectin的组合性能可以达到88.5%的灵敏度和92.3%的AUC = 0.90。还显示了相应的PPV(阳性预测值)和NPV(阳性预测值)。
      表III不同生物标志物组合在预验证样本集中的性能
      (a)基于预验证样本集的阈值的生物标志物性能
      AUC临界点灵敏度%特异性%PPV%NPV%
      calprotectin + azgp10.880.423484.692.391.785.7
      CalProtectin + HP.0.850.494673.188.586.476.7
      生命值 + AZGP1.0.820.503865.492.389.572.7
      calprotectin + azgp1 + hp0.900.427788.592.392.088.9
      (b)基于来自发现样本集的阈值的生物标志物性能
      AUC临界点灵敏度%特异性%PPV%NPV%
      calprotectin + azgp10.880.691165.4100.0100.074.3
      CalProtectin + HP.0.850.245192.346.263.285.7
      生命值 + AZGP1.0.820.651553.996.293.367.6
      calprotectin + azgp1 + hp0.900.644673.196.295.078.1
      图缩略图GR5.
      Fig. 5生物标志物面板的性能。 A,人类CalProtectin,HP和AZGP1的逻辑回归组合生物标志物的点曲线图; B,用于组合三个生物标志物的ROC曲线。

       肺癌细胞的确认

      为了确定三种唾液蛋白是否有肺癌相关,在NSCLC细胞(NCI-H1299和NCI-H460细胞系)和健康肺细胞(MRC-5细胞系)中测试所有三种蛋白质。结果表明,MRC-5细胞中人类酸蛋白素的浓度为0.156ng /(μg总蛋白)。它分别在NCI-H460细胞和NCI-H1299细胞中上调至0.235ng /(μg总蛋白)和0.336ng /(μg总蛋白)。 HP,AZGP1和相应β-Actin的蛋白质印迹显示在 Fig. 6A。它们的量化数据(Fig. 6B)表明,这两种蛋白质也升高在肺癌细胞中。与健康肺细胞相比,共同地,所有三种蛋白质的浓度在两种肺癌细胞中增加。这些发现与我们在人类唾液中的发现一致,这可能有助于确认为什么这三种蛋白质在肺癌患者的唾液中升高。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6肺癌细胞系中的生物标志物核查。 A,不同肺癌细胞系中HP(A)和AZGP1(B)的Western印迹。它们相应的β-肌动蛋白如(c)所示; B,(a)中的蛋白质印迹的相应量化。

       吸烟的影响

      在预验证样本集中的52个样本中,其中33个有吸烟历史,其中19个是非吸烟者。此外,17例肺癌患者吸烟历史,九种肺癌患者是非造影患者。综合地比较了这些非莫克风和吸烟受试者的三次生物标志物分布。数据显示在 Fig. 7。每个组之间的显着差异标记。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7生命值的量化数据(A),AZGP1(B)和人类calprotectin(C)在吸烟和非烹饪团体中(*: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001).

      讨论

      在这个手稿中,我们已经证明,当肺癌发育时,歧视性蛋白质组物生物标志物存在于人类唾液中。虽然概念研究证明,这是第一项学习订婚 德诺维 唾液中肺癌检测的生物标志物发现方法。首先通过2D-Dige和MS发现三种蛋白质,然后在发现样品组中进一步验证,预验证样品组和肺癌细胞系。这些候选生物标志物在肺癌患者和健康对照受试者中的歧视力可以达到92.0%PPV和88.9%NPV(表III)。这些数据共同证明,这三种唾液蛋白可能被用作歧视生物标志物,以区分肺癌免受健康对照受试者的患者。

       候选生物标志物

      在这项研究中,我们的目标是开发歧视性蛋白质组学生物标志物,用于早期检测肺癌。虽然在凝胶图像分析后,凝胶上有253个斑点,但仅进行了相对较大的变化(≥1.5)的斑点,以进一步识别和验证。它的兴趣感到兴趣:这些鉴定的蛋白质是肺癌相关的。注意是HP,已在血清中发现,并用作生物标志物,用于诊断NSCLC(
      • Hoagland 4th,L.F.
      • Campa M.J.
      • 戈尔林E.B.
      • Herndon 2nd,J.E.
      • Patz Jr.,E.F.
      哈达福蛋白和后期甘草改性衍生物作为血清生物标志物,用于诊断非物质细胞肺癌。
      ,
      • Bharti A.
      • 马P.C.
      • Maulik G.
      • 辛格r.
      • 汗E.
      • skarin a.t.
      • Salgia R.
      Haptoglobinα-亚基和肝细胞生长因子可能是小细胞肺癌中的血清肿瘤生物标志物。
      )。免疫组织和Western印迹确认了人肺癌组织中这种急性期蛋白的过表达(
      • 阿卜杜拉米
      • Schultz H.
      • 卡勒D.
      • Branscheid D.
      • 达尔霍夫克。
      • Zabel P.
      • Vollmer E.
      • 戈德曼T.
      急性期蛋白耳蛋白在人肺癌和肿瘤免肺组织中的表达。
      )。值得注意的是,肺的原发性肿瘤可以释放诱导诱导表达人类钙保护素的可溶性因子,这可以促进转移癌细胞的存活和增殖(
      • Ghavami S.
      • Chitayat S.
      • Hashemi M.
      • eShraghi M.
      • Chazin W.J.
      S100A8 / A9:癌症治疗和肿瘤内的颈部脸部分子。
      )。人类CalProtectin是S100A8和S100A9的复合物。它具有人类唾液中的抗菌,抗真菌,免疫调节和抗增殖作用。 S100A8单独抑制真菌生长,S100A9本身具有中度的抗真菌效果(
      • Sroussi H.Y.
      • KöhlerG.A.
      • 阿比亚人N.
      • D.
      • 普法斯基省
      S100A8中的S100A8和半胱氨酸42中的蛋氨酸63或83取消S100A8 / A9的抗真菌活性:氧化调控的潜在作用。
      )。一种可能的原因是,在疾病的情况下,更多的S100a8和s100a9可以共轭,这导致人类calpotectin的上调和S100a8和s100a9的下调( 表二)。通过免疫组织化学染色测试肺癌组织S100A8和S100A9的上调(
      • 苏y.j.
      • 徐F.
      • yu J.P.
      • 岳D.。
      • ren x.b.
      • 王C.L.
      S100A8和S100A9在肺腺癌中表达及其与炎症和其他临床特征的相关性的上调。
      )。据报道,人肺组织中AZGP1的mRNA水平与肺癌疾病状态相关(
      • Falvella F.S.
      • Spinola M.
      • Pignatiello C.
      • Noci S.
      • Conti B.
      • 牧师U.
      • 碳锅A.
      • dragani t.a.
      正常人肺组织中的AZGP1 mRNA水平与肺癌疾病状态相关。
      )。免疫组织化学染色证明了肺组织中AZGP1蛋白的表达(
      • vanni h.
      • Kazeros A.
      • 王R.
      • 哈维B.G.
      • 弗里斯B.
      • DE B.P.
      • 卡罗兰B.J.
      • Hübnerr.h.
      • O'Connor T.P.
      • 水晶r.g.
      吸烟吸烟会诱导人类脂肪消耗基因Azgp1的过表达。
      )。 AZGP1血清自身抗体的存在可以用作肺腺癌患者的预后标志物。通过组蛋白乙酰化的染色质重塑的染色质重塑的AZGP1 mRNA的上调可能受到染色体的影响(
      • Albertus D.L.
      • SEDER C.W.
      • 陈G.
      • 王X.J.
      • 哈特乔W.
      • 林L.
      • 银行A.
      • 托马斯D.G.
      • giordano t.j.
      • Chang A.C.
      • orringer m.b.
      • bigbee w.l.
      • Chinnaiyan上午
      • 啤酒D.G.
      AZGP1自身抗体预测存活率和组蛋白脱乙酰化酶抑制剂增加肺腺癌的表达。
      )。此外,吞并是细胞溶质蛋白质,其可以以钙依赖性的方式与细胞膜相关联,并且在肺肿瘤中发现了ANXA1(
      • 弗里切雅好
      • Misek D.E.
      • yim上午
      • 克劳德米
      • giordano t.j.
      • 啤酒D.G.
      • 汉尚三
      肺癌中吞噬膜I和II自身抗体和II-6的高循环水平表现出一种免疫反应。
      ,
      • 李Y.
      • yu J.Y.
      • Durr E.
      • Krasinska K.M.
      • 雕刻师L.A.
      • Testa J.E.
      • 斯科尼策J.E.
      组织特异性治疗中内皮表面的降解蛋白质组学映射。
      )。在这些选定的候选者中,其中三个可以康复。 ANXA1的阴性结果可能是因为其唾液中的低丰度或抗体的特异性有限。
      基于预验证样本集中的生物标志性性能(表III),基于所选阈值,已经针对该样本集计算了不同的灵敏度和特异性。在 表IIIA,阈值来自预验证样本集,基于最大程度的灵敏度和特异性。为了验证在发现样本集中内置的模型,将其阈值应用于预验证样本集(表IIIb)。与此相比 表III a,敏感性和特异性的总和 表III由于所选阈值,B通常较弱。对于人类calProtectin和HP组合,来自发现样本集的阈值小于从预验证样本集的阈值。这导致理想的敏感性(92.3%),同时具有令人沮丧的特异性(46.2%)。对于所有三种蛋白质的组合,即使施加了更高的阈值,达到了良好的敏感性(73.1%)和特异性(96.2%)。该数据展示了我们发现生物标志物在肺癌患者的差异较强的正常对照对象中的强大力量。

       吸烟对唾液生物标志物的影响

      吸烟是肺癌的主要风险因素(
      • 宠物E.D.
      • 斯蒂芬斯P.J.
      • O'Meara S.
      • 麦克布莱德D.J.
      • Meynert A.
      • 琼斯D.
      • 林M.L.
      • bear
      • 刘k.w.
      • 格林曼C.
      • 瓦雷拉I.
      • Nik-Zainal S.
      • 戴维斯H.R.
      • ordoñezg.r.
      • Mudie L.J.
      • latimer C.
      • 埃德金斯S.
      • Stebbings L.
      • 陈L.
      • 贾米
      • Leroy C.
      • 马歇尔J.
      • Menzies A.
      • 巴特勒A.
      • Teague J.W.
      • Mangion J.
      • 太阳y.a.
      • Mclaughlin s.f.
      • Peckham H.E.
      • 宗教公司
      • Costa G.L.
      • 李C.C.
      • Minna J.D.
      • Gazdar A.
      • Birney E.
      • 罗得岛M.D.
      • mckernan k.j.
      • stratton m.r.
      • futreal p.a.
      • 坎贝尔P.J.
      具有复杂烟草暴露的小细胞肺癌基因组。
      ,
      • Hecht S.S.
      吸烟和肺癌:化学机制和预防方法。
      ,
      • 丁L.
      • Getz G.
      • 惠勒D.A.
      • Mardis e.r.
      • McLellan M.D.
      • Cibulskis K.
      • Sougnez C.
      • Greulich H.
      • Muzny D.M.
      • 摩根M.B.
      • 富尔顿L.
      • 富尔顿R.S.
      • 张Q.
      • Wendl M.C.
      • 劳伦斯M.S.
      • Larson D.E.
      • 陈克。
      • dooling d.j.
      • SABO A.
      • Hawes A.c。
      • 沉H.
      • jhangiani s.n.
      • Lewis L.R.
      • 大厅O.
      • 朱y
      • Mathew T.
      • ren y.
      • 姚杰。
      • Scherer S.E.
      • Clerc K.
      • Metcalf G.A.
      • NG B.
      • Milosavljevic A.
      • gonzalez-garay m.l.
      • 奥斯本J.R.
      • Meyer R.
      • 施X.
      • 唐y.
      • Koboldt D.C.
      • 林L.
      • 雅培R.
      • 矿工T.L.
      • pohl c.
      • 小格。
      • Haipek C.
      • 施密特H.
      • Dunford-Shore B.H.
      • Kraja A.
      • Crosby S.D.
      • Sawyer C.S.
      • vickery t.
      • 桑德尔S.
      • 罗宾逊J.
      • Winckler W.
      • Baldwin J.
      • Chirieac L.R.
      • 杜尔特A.
      • Fennell T.
      • 汉娜米
      • 约翰逊B.E.
      • Onofrio R.C.
      • 托马斯r.k.
      • Tonon G.
      • 韦尔B.A.
      • 赵X.
      • Ziaugra L.
      • zody m.c.
      • Giordano T.
      • orringer m.b.
      • 罗斯J.A.
      • Spitz M.R.
      • Wistuba II.
      • ozenberger B.
      • 好p.j.
      • Chang A.C.
      • 啤酒D.G.
      • Watson M.A.
      • Ladanyi M.
      • 布罗德里克S.
      • Yoshizawa A.
      • Travis W.D.
      • Pao W.
      • 省M.A.
      • Weinstock G.M.
      • varmus h.e.
      • 加布里埃尔S.B.
      • 着陆器E.S.
      • 吉布斯r.a.
      • Meyerson M.
      • 威尔逊r.k.
      躯体突变影响肺腺癌的关键途径。
      ,
      • 教堂T.R.
      • 安德森K.E.
      • Caporaso N.E.
      • Geisser M.S.
      • Le C.T.
      • 张Y.
      • BENOIT A.R.
      • carmella s.g.
      • Hecht S.S.
      在吸烟者中进行了一种预期测量的烟草特异性致癌物和肺癌的血清生物标志物。
      )。其对唾液生物标志物的影响得到了全面的比较。在这项研究中,吸烟升高了AZGP1和人类CalProtectin的表达,并降低了癌症组中HP的表达(Fig. 7)。但是,我们的数据表明,吸烟没有表现出对这些标志的重大影响。值得一提的是,无论是吸烟者还是非吸烟者,HP和AZGP1的分布都表现出健康控制和肺癌群之间的显着差异。在健康对照受试者组中,吸烟对这些蛋白质的表达没有显着影响。这些结果表明,这些已验证的蛋白质生物标志物大部分由肺癌升高。

       唾液蛋白质组物生物标志物对肺癌的特异性

      本研究中使用的临床样品与癌症组和对照组之间的年龄,性和种族相匹配。他们的吸烟历史是否符合他们是当前或前吸烟者及其吸烟的持续时间和强度。
      大多数肺癌患者将具有慢性阻塞性肺疾病(COPD),因为这两个条件主要是吸烟引起的。我们的已验证的唾液生物标志物也据报道与吸烟有关(
      • Jessie K.
      • 庞瓦姆。
      • Haji Z.
      • 拉希姆A.
      • Hashim O.H.
      与非吸烟者相比,整个人类唾液的蛋白质组学分析检测到白细胞介素-1受体拮抗剂,Thioredoxin和Lipocalin-1的表达。
      ,
      • vanni h.
      • Kazeros A.
      • 王R.
      • 哈维B.G.
      • 弗里斯B.
      • DE B.P.
      • 卡罗兰B.J.
      • Hübnerr.h.
      • O'Connor T.P.
      • 水晶r.g.
      吸烟吸烟会诱导人类脂肪消耗基因Azgp1的过表达。
      )。参考文献表明,三种已验证的生物标志物也与组织中的COPD相关(
      • 阿卜杜拉米
      • Schultz H.
      • 卡勒D.
      • Branscheid D.
      • 达尔霍夫克。
      • Zabel P.
      • Vollmer E.
      • 戈德曼T.
      急性期蛋白耳蛋白在人肺癌和肿瘤免肺组织中的表达。
      ),支气管肺泡灌洗液(
      • Merkel D.
      • rist w.
      • SEPE P.
      • Weith A.
      • 扁豆M.C.
      通过组合表面增强的激光解吸/电离质谱分析与质谱蛋白质鉴定的慢性阻塞性肺疾病中吸烟者人支气管肺泡灌洗液的蛋白质组学研究。
      )和血液(
      • yee J.
      • 萨达尔M.D.
      • 罪恶D.D.
      • Kuzyk M.
      • xing l.
      • Kondra J.
      • McWilliams A.
      • 男子s.f.
      • 林S.
      结缔组织 - 活化肽III:一种新型血液生物标志物,用于早期肺癌检测。
      ,
      • ENGSTROM G.
      • Segelstorm N.
      • Ekberg-Aronsson M.
      • 尼尔森下午
      • lindgärdef.
      COPD.炎症的炎症和入院发生率的血浆标记:基于人群的群组研究结果。
      )。但是,只有1或2%的COPD患者将继续开发肺癌。尽管COPD被认为是正常和肺癌之间的“过渡状态”,但其蛋白质分析可能不太可能是中位数。本研究的目标是发现可以区分肺癌患者的正常受试者的生物标志物。因此,对肺癌生物标志物发现的这项研究不包括COPD。然而,为了进一步验证发现的肺癌生物标志物的特异性,COPD应包括在进一步的最终验证中。

       概念证明

      通过两相试验研究唾液生物标志物发育的肺癌检测,初步数据显示鉴定了三种蛋白质并呈呈态屏验证。所有这些也被证实在肺癌细胞中升高。进一步评估这些蛋白质的性能。肺癌患者唾液中这些蛋白质的分布并匹配健康对照受试者已经证明了它们对肺癌检测的歧视性能。据我们所知,本研究是第一个概念验证报告 德诺维 唾液蛋白质组学生物标志物发现和肺癌检测的预验证。尽管在更大的样本集中进行进一步验证对于确定性验证是必要的,但是这些发现和确认的唾液蛋白生物标志物具有用于检测肺癌的可能性。唾液测试可以在临床中轻松进行,并且当治疗疗法的可能性更大时,可能会在较早的时间点检测疾病。

      致谢

      我们感谢杰平杨博士为肺癌细胞实验的善意帮助。我们感谢David Akin在临床样本收集,过程和储存方面的帮助。

      参考

        • 伊利米
        • 咪淋巴
        • 霍夫曼五。
        • Ammadi R.E.
        • Ortholan C.
        • BONNETAUD C.
        • 哈维特K.
        • Venissac n.
        • 莫格拉比B.
        • mouroux J.
        • PouysségurJ.
        • 霍夫曼P.
        肿瘤组织和血浆中高水平的碳酸酐酶IX是非小细胞肺癌患者预后的生物标志物。
        布尔。 J.癌症。 2010; 102: 1627-1635
        • Hoagland 4th,L.F.
        • Campa M.J.
        • 戈尔林E.B.
        • Herndon 2nd,J.E.
        • Patz Jr.,E.F.
        哈达福蛋白和后期甘草改性衍生物作为血清生物标志物,用于诊断非物质细胞肺癌。
        癌症。 2007; 110: 2260-2268
        • 宠物E.D.
        • 斯蒂芬斯P.J.
        • O'Meara S.
        • 麦克布莱德D.J.
        • Meynert A.
        • 琼斯D.
        • 林M.L.
        • bear
        • 刘k.w.
        • 格林曼C.
        • 瓦雷拉I.
        • Nik-Zainal S.
        • 戴维斯H.R.
        • ordoñezg.r.
        • Mudie L.J.
        • latimer C.
        • 埃德金斯S.
        • Stebbings L.
        • 陈L.
        • 贾米
        • Leroy C.
        • 马歇尔J.
        • Menzies A.
        • 巴特勒A.
        • Teague J.W.
        • Mangion J.
        • 太阳y.a.
        • Mclaughlin s.f.
        • Peckham H.E.
        • 宗教公司
        • Costa G.L.
        • 李C.C.
        • Minna J.D.
        • Gazdar A.
        • Birney E.
        • 罗得岛M.D.
        • mckernan k.j.
        • stratton m.r.
        • futreal p.a.
        • 坎贝尔P.J.
        具有复杂烟草暴露的小细胞肺癌基因组。
        自然。 2010; 463: 184-190
        • Hecht S.S.
        吸烟和肺癌:化学机制和预防方法。
        柳叶刀 2002; 3: 461-469
        • Jessie K.
        • 庞瓦姆。
        • Haji Z.
        • 拉希姆A.
        • Hashim O.H.
        与非吸烟者相比,整个人类唾液的蛋白质组学分析检测到白细胞介素-1受体拮抗剂,Thioredoxin和Lipocalin-1的表达。
        int。 J.Mol。 SCI。 2010; 11: 4488-4505
        • vanni h.
        • Kazeros A.
        • 王R.
        • 哈维B.G.
        • 弗里斯B.
        • DE B.P.
        • 卡罗兰B.J.
        • Hübnerr.h.
        • O'Connor T.P.
        • 水晶r.g.
        吸烟吸烟会诱导人类脂肪消耗基因Azgp1的过表达。
        胸部。 2009; 135: 1197-1208
        • Gohagan J.K.
        • 马库斯下午
        • Fagerstrom r.m.
        • PINSKY P.F.
        • Kramer B.S.
        • PROROK P.C.
        • ascher s.
        • Bailey W.
        • 酿酒师B.
        • 教堂T.
        • Engelhard D.
        • 福特M.
        • Fouad M.
        • Freedman M.
        • 格尔曼E.
        • Gierada D.
        • 挖掘W.
        • Inampudi S.
        • 熨斗B.
        • 约翰逊C.C.
        • 琼斯阿。
        • kucera g。
        • kvale p.
        • Lappe K.
        • 庄园W.
        • 摩尔A.
        • Nath H.
        • neff s.
        • OKEN M.
        • Plunkett M.
        • 价格H.
        • reding d。
        • 莱利T.
        • Schwartz M.
        • Spizarny D.
        • Yoffie R.
        • Zylak C.
        肺筛查研究的最终结果,一种随机可行性研究螺旋CT与胸X射线筛选肺癌。
        肺癌。 2005; 47: 9-15
        • Hirsch F.R.
        • 富兰克林W.A.
        • Gazdar a.f.
        • Bunn Jr.,P.A.
        早期检测肺癌:近期生物学和放射学进步的临床观点。
        临床。癌症res。 2001; 7: 5-22
        • spira a。
        • Beane J.E.
        • 莎第五。
        • Steining K.
        • 刘G.
        • Schembri F.
        • 吉尔曼S.
        • Dumas Y.M.
        • CALNER P.
        • Sebastiani P.
        • Sridhar S.
        • Beamis J.
        • 羔羊C.
        • 安德森T.
        • 格里N.
        • 基恩J.
        • 莱堡米。
        • BRODY J.S.
        呼吸道上皮基因在患者诊断评价中患有可疑肺癌的诊断评价。
        NAT。 Med。 2007; 13: 361-366
        • 扫战器V.
        生物标志物研究比比早期检测肺癌。
        J. Natl。癌症inst。 2009; 101: 11-13
        • 彭G.
        • TISCH U.
        • adams o.
        • Hakim M.
        • Shehada N.
        • Broza Y.Y.
        • 贝兰斯。
        • Abdah-Bortnyak R.
        • Kuten A.
        • Haick H.
        使用金纳米颗粒诊断呼吸呼吸中的肺癌。
        NAT。纳米技术。 2009; 4: 669-673
        • Brambilla C.
        • Fieget F.
        • Jeanmart M.
        • de fraipont f.
        • LantueJoul S.
        • Frappat V.
        • Ferretti G.
        • Brichon P.Y.
        • Moro-Sibilot D.
        早期检测肺癌:生物标志物的作用。
        欧元。呼吸。 j。 2003; 21: 36s-44s.
        • Hirsch F.R.
        • Merrick D.T.
        • 富兰克林W.A.
        生物标志物在早期检测肺癌和化学预防的作用。
        欧元。呼吸。 j。 2002; 19: 1151-1158
        • yau g.
        • 锁m。
        • 罗德里格G.
        基线低剂量CT肺癌筛选的系统综述。
        肺癌。 2007; 58: 161-170
        • van klaveren r.j.
        • Oudkerk M.
        • Prokop M.
        • Spolten e.t.
        • Nackaerts K.
        • vernhout r.
        • van iersel C.A.
        • van den bergh k.a。
        • van'T Westeinde S.
        • 范德阿尔斯特C.
        • Thunnissen E.
        • 徐D.M.
        • 王Y.
        • 赵玉。
        • Gietema H.A.
        • de hoop b.j.
        • 呻吟H.J.
        • de bock g.h.
        • 范Ooijen P.
        • Weenink C.
        • 凡尔赛克莱恩J.
        • Lammers J.W.
        • Timens W.
        • Willebrand D.
        • vink a。
        • 马里W.
        • de koning h.j.
        体积CT扫描检测的肺结节管理。
        n.ngl。 J.Med。 2009; 361: 2221-2229
        • yee J.
        • 萨达尔M.D.
        • 罪恶D.D.
        • Kuzyk M.
        • xing l.
        • Kondra J.
        • McWilliams A.
        • 男子s.f.
        • 林S.
        结缔组织 - 活化肽III:一种新型血液生物标志物,用于早期肺癌检测。
        J. Clin。 oncol。 2009; 27: 2787-2792
        • 丁L.
        • Getz G.
        • 惠勒D.A.
        • Mardis e.r.
        • McLellan M.D.
        • Cibulskis K.
        • Sougnez C.
        • Greulich H.
        • Muzny D.M.
        • 摩根M.B.
        • 富尔顿L.
        • 富尔顿R.S.
        • 张Q.
        • Wendl M.C.
        • 劳伦斯M.S.
        • Larson D.E.
        • 陈克。
        • dooling d.j.
        • SABO A.
        • Hawes A.c。
        • 沉H.
        • jhangiani s.n.
        • Lewis L.R.
        • 大厅O.
        • 朱y
        • Mathew T.
        • ren y.
        • 姚杰。
        • Scherer S.E.
        • Clerc K.
        • Metcalf G.A.
        • NG B.
        • Milosavljevic A.
        • gonzalez-garay m.l.
        • 奥斯本J.R.
        • Meyer R.
        • 施X.
        • 唐y.
        • Koboldt D.C.
        • 林L.
        • 雅培R.
        • 矿工T.L.
        • pohl c.
        • 小格。
        • Haipek C.
        • 施密特H.
        • Dunford-Shore B.H.
        • Kraja A.
        • Crosby S.D.
        • Sawyer C.S.
        • vickery t.
        • 桑德尔S.
        • 罗宾逊J.
        • Winckler W.
        • Baldwin J.
        • Chirieac L.R.
        • 杜尔特A.
        • Fennell T.
        • 汉娜米
        • 约翰逊B.E.
        • Onofrio R.C.
        • 托马斯r.k.
        • Tonon G.
        • 韦尔B.A.
        • 赵X.
        • Ziaugra L.
        • zody m.c.
        • Giordano T.
        • orringer m.b.
        • 罗斯J.A.
        • Spitz M.R.
        • Wistuba II.
        • ozenberger B.
        • 好p.j.
        • Chang A.C.
        • 啤酒D.G.
        • Watson M.A.
        • Ladanyi M.
        • 布罗德里克S.
        • Yoshizawa A.
        • Travis W.D.
        • Pao W.
        • 省M.A.
        • Weinstock G.M.
        • varmus h.e.
        • 加布里埃尔S.B.
        • 着陆器E.S.
        • 吉布斯r.a.
        • Meyerson M.
        • 威尔逊r.k.
        躯体突变影响肺腺癌的关键途径。
        自然。 2008; 455: 1069-1075
        • Patz e.f.
        • Campa M.J.
        • 戈尔林E.B.
        • Kusmartseva I.
        • 关X.R.
        • Herndon 2nd,J.E.
        血清生物标志物小组诊断肺癌。
        J. Clin。 oncol。 2007; 25: 5578-5583
        • Palmisano W.A.
        • 神圣的K.K.
        • Saccomanono G.
        • Gilliland F.D.
        • Baylin S.B.
        • 赫尔曼J.G.
        • Belinsky S.A.
        通过检测痰中的异常启动子甲基化预测肺癌。
        癌症res。 2000; 60: 5954-5958
        • Belinsky S.A.
        • klingee d.m.
        • Dekker J.D.
        • 史密斯M.W.
        • Bocklage T.J.
        • Gilliland F.D.
        • 挤压队
        • karp d.d.
        • 斯蒂德利C.A.
        • picchi m.a.
        基因启动子在血浆和痰中的甲基化随着肺癌的风险增加。
        临床。癌症res。 2005; 11: 6505-6511
        • 灰色r.d.
        • 邓肯A.
        • 贵族D.
        • Imrie M.
        • O'Reilly D.S.
        • Innes J.A.
        • Porteous D.J.
        • 绿化A.P.
        • Boyd A.c.
        痰痕量金属是炎症和化脓性肺病的生物标志物。
        胸部。 2010; 137: 635-641
        • 哈拉e.b.
        • Muller A.
        • Breitwieser F.P.
        • 李杰恩。
        • 格里比亚F.
        • 大歌j.
        • Bennett K.L.
        使用ITRAQ结合串联亲和纯化,以增强与肺癌有组有细胞突变的EGFR核心复合物相关的低丰度蛋白质。
        J.蛋白质组。 2011; 10: 182-190
        • Bortner J.D.
        • Richie J.P.
        • DAS A.
        • 廖J.
        • Umstead T.M.
        • 斯坦利A.
        • 斯坦利B.A.
        • Belani C.P.
        • El-Bayoumy K.
        ITRAQ人类血浆的蛋白质组学分析显示了香烟吸烟的ITI-HC3和VDBP的下调。
        J.蛋白质组。 2011; 10: 1151-1159
        • Pernemalm M.
        • de petris l.
        • Eriksson H.
        • Branden E.
        • koyi h.
        • Kanter L.
        • Lewensohn R.
        • LehtiöJ.
        窄距肽IEF改善血浆肺腺癌标志物的检测及胸腔积液。
        蛋白质组学。 2009; 9: 3414-3424
        • 卢X.M.
        • 肖T.
        • 赵克。
        • 王H.
        • 郑H.W.
        • 林D.
        • 卢y.
        • 高雅。
        • 郑科
        • 刘S.
        • 徐恩
        组织蛋白酶D由M-FE细胞分泌:其作为肺癌的生物标志物的潜在作用。
        J.蛋白质组。 2007; 6: 1083-1092
        • Kaufman E.
        • Lamster I.B.
        唾液的诊断应用 - 评论。
        暴击。 Rev.口服BIOL。 Med。 2002; 13: 197-212
        • 胡斯
        • lo j.a.
        • Wong D.T.
        人类唾液蛋白质组分析与疾病生物标志物发现。
        专家Rev.蛋白质组学。 2007; 4: 531-538
        • 胡斯
        • 日益。
        • 安德。
        • Wong D.T.
        唾液蛋白质组学在药物发现与发展中的影响 - 一种关注癌症药物发现。
        药物讨论。今天。 2007; 12: 911-916
        • 胡斯
        • 阿勒拿诺M.
        • Boontheung P.
        • 王继夫。
        • 周H.
        • 江j。
        • elashoff d.
        • 魏R.
        • lo j.a.
        • Wong D.T.
        口腔癌生物标志物发现的唾液蛋白质组学。
        临床。癌症res。 2008; 14: 6246-6252
        • 胡斯
        • 王继夫。
        • Meijer J.
        • 梁S.
        • 谢Y.M.
        • yu t.
        • 周H.
        • 亨利S.
        • Vissink A.
        • Pijpe J.
        • Kallenberg C.
        • elashoff d.
        • lo j.a.
        • Wong D.T.
        原发性Sjogren综合征的唾液蛋白质组学和基因组生物标志物。
        关节炎Rheum。 2007; 56: 3588-3600
        • 张L.
        • 肖H.
        • 卡尔兰S.
        • 周H.
        • 总j.
        • elashoff d.
        • 一种。
        • yan x.
        • 嘉D.
        • karlan b.
        • Wong D.T.
        唾液转录组和蛋白质组学生物标志物的发现与临床前验证乳腺癌的非侵入性检测。
        Plos一个。 2010; 5: e15573
        • 张L.
        • Farrell J.J.
        • 周H.
        • elashoff d.
        • 一种。
        • 公园N.H.
        • 嘉D.
        • Wong D.T.
        唾液转录组生物标志物用于检测可重症胰腺癌。
        胃肠病学。 2010; 138 (E941-947.): 949-957
        • 肖H.
        • Wong D.T.
        蛋白质组学及其对人类唾液生物标志物发现的应用。
        生物信息。 2010; 5: 294-296
        • 维卡利诺R.
        • lobo m.j.c.
        • Ferrer-Correira A.J.
        • 拜宾J.R.
        • Tomer K.B.
        • 奄奄一息
        • 阿玛多。
        使用蛋白质组学鉴定人体整体唾液蛋白质组分。
        蛋白质组学。 2004; 4: 1109-1115
        • 高K.
        • 周H.
        • 张L.
        • 李约。
        • 周问
        • 胡斯
        • Wolinsky L.E.
        • Farrell J.
        • EIBL G.
        • Wong D.T.
        黑素瘤和非小细胞肺癌小鼠模型中的全身性疾病诱导的唾液生物标志物谱。
        Plos一个。 2009; 4: e5875
        • Bharti A.
        • 马P.C.
        • Maulik G.
        • 辛格r.
        • 汗E.
        • skarin a.t.
        • Salgia R.
        Haptoglobinα-亚基和肝细胞生长因子可能是小细胞肺癌中的血清肿瘤生物标志物。
        抗癌es。 2004; 24: 1031-1038
        • 阿卜杜拉米
        • Schultz H.
        • 卡勒D.
        • Branscheid D.
        • 达尔霍夫克。
        • Zabel P.
        • Vollmer E.
        • 戈德曼T.
        急性期蛋白耳蛋白在人肺癌和肿瘤免肺组织中的表达。
        Pathol。 res。实践。 2009; 205: 639-647
        • Ghavami S.
        • Chitayat S.
        • Hashemi M.
        • eShraghi M.
        • Chazin W.J.
        S100A8 / A9:癌症治疗和肿瘤内的颈部脸部分子。
        欧元。 J. Pharmacol。 2009; 625: 73-83
        • Sroussi H.Y.
        • KöhlerG.A.
        • 阿比亚人N.
        • D.
        • 普法斯基省
        S100A8中的S100A8和半胱氨酸42中的蛋氨酸63或83取消S100A8 / A9的抗真菌活性:氧化调控的潜在作用。
        有限元免疫性。 Med。微生物。 2009; 55: 55-61
        • 苏y.j.
        • 徐F.
        • yu J.P.
        • 岳D.。
        • ren x.b.
        • 王C.L.
        S100A8和S100A9在肺腺癌中表达及其与炎症和其他临床特征的相关性的上调。
        下巴。 Med。 J.(Engl。)。 2010; 123: 2215-2220
        • Falvella F.S.
        • Spinola M.
        • Pignatiello C.
        • Noci S.
        • Conti B.
        • 牧师U.
        • 碳锅A.
        • dragani t.a.
        正常人肺组织中的AZGP1 mRNA水平与肺癌疾病状态相关。
        oncogene。 2008; 27: 1650-1656
        • Albertus D.L.
        • SEDER C.W.
        • 陈G.
        • 王X.J.
        • 哈特乔W.
        • 林L.
        • 银行A.
        • 托马斯D.G.
        • giordano t.j.
        • Chang A.C.
        • orringer m.b.
        • bigbee w.l.
        • Chinnaiyan上午
        • 啤酒D.G.
        AZGP1自身抗体预测存活率和组蛋白脱乙酰化酶抑制剂增加肺腺癌的表达。
        J. Thorac。 oncol。 2008; 3: 1236-1244
        • 弗里切雅好
        • Misek D.E.
        • yim上午
        • 克劳德米
        • giordano t.j.
        • 啤酒D.G.
        • 汉尚三
        肺癌中吞噬膜I和II自身抗体和II-6的高循环水平表现出一种免疫反应。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2001; 98: 9824-9829
        • 李Y.
        • yu J.Y.
        • Durr E.
        • Krasinska K.M.
        • 雕刻师L.A.
        • Testa J.E.
        • 斯科尼策J.E.
        组织特异性治疗中内皮表面的降解蛋白质组学映射。
        自然。 2004; 429: 629-635
        • 教堂T.R.
        • 安德森K.E.
        • Caporaso N.E.
        • Geisser M.S.
        • Le C.T.
        • 张Y.
        • BENOIT A.R.
        • carmella s.g.
        • Hecht S.S.
        在吸烟者中进行了一种预期测量的烟草特异性致癌物和肺癌的血清生物标志物。
        癌症流行病。 Biomarkers Prev。 2009; 18: 260-266
        • Merkel D.
        • rist w.
        • SEPE P.
        • Weith A.
        • 扁豆M.C.
        通过组合表面增强的激光解吸/电离质谱分析与质谱蛋白质鉴定的慢性阻塞性肺疾病中吸烟者人支气管肺泡灌洗液的蛋白质组学研究。
        蛋白质组学。 2005; 5: 2972-2980
        • ENGSTROM G.
        • Segelstorm N.
        • Ekberg-Aronsson M.
        • 尼尔森下午
        • lindgärdef.
        COPD.炎症的炎症和入院发生率的血浆标记:基于人群的群组研究结果。
        胸部。 2009; 64: 211-215