11常见细胞系的比较蛋白质组学分析显示大多数蛋白质的普遍性但不同的表达*

  • 作者脚注
    ¶当前地址:以色列特拉维夫大学的人类分子遗传学和生物化学系,特拉维夫大学,特拉维夫。
    泰勒·莱格尔
    脚注
    ¶当前地址:以色列特拉维夫大学的人类分子遗传学和生物化学系,特拉维夫大学,特拉维夫。
    隶属关系
    Max-Planck Biochemistry研究所蛋白质组学与信号转导,AM Klopferspitz 18,D-82152 Martinsrid,德国
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  • Anja Wehner.
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    Max-Planck Biochemistry研究所蛋白质组学与信号转导,AM Klopferspitz 18,D-82152 Martinsrid,德国
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  • Christoph Schaab.
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    Max-Planck Biochemistry研究所蛋白质组学与信号转导,AM Klopferspitz 18,D-82152 Martinsrid,德国
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  • Juergen Cox.
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    Max-Planck Biochemistry研究所蛋白质组学与信号转导,AM Klopferspitz 18,D-82152 Martinsrid,德国
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  • Matthias Mann.
    一致
    应解决对应的通信:蛋白质组学和信号转导,Max-Planck生物化学​​研究所,AM Klopferspitz 18,D-82152 Martinsrid,德国。电话:49-89-8578-2557;传真:49-89-8578-2219
    隶属关系
    Max-Planck Biochemistry研究所蛋白质组学与信号转导,AM Klopferspitz 18,D-82152 Martinsrid,德国
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  • 作者脚注
    本文包含补充表S1至S5。
    ¶当前地址:以色列特拉维夫大学的人类分子遗传学和生物化学系,特拉维夫大学,特拉维夫。
    *该项目由欧洲委员会第7架框架计划蛋白质组学特定于时间和空间中的离子(展望,Health-F4-2008-021,648)提供支持。
      哺乳动物细胞系的深层蛋白质组学分析将产生生物研究中最常用的系统的建筑块的清单。基于质谱的蛋白质组学可以以全局和非偏见的方式识别和定量蛋白质,并且可以突出这些系统之间改变的细胞过程。我们使用LTQ-orbitrap家族质谱仪分析了11个人细胞系“high field”Orbitrap质量分析仪具有改进的分辨率和测序速度。我们鉴定了总共11,731个蛋白质,平均每种细胞系列10,361±120蛋白。这种非常高的蛋白质组覆盖使能够分析广泛的过程和功能。尽管细胞系的鲜明起源,但我们的定量结果表明表达蛋白质的令人惊讶的高相似性。然而,这种蛋白质蛋白的全球相似性并不意味着在11个细胞系上暗示单个蛋白质的相同表达水平,因为我们发现了估计的三分之二的表达水平显着差异。细胞表达水平的可变性对于低丰度和高丰度蛋白质相似,甚至许多具有家用作用的最高表达的蛋白质在细胞之间存在显着差异。具有高冗余的代谢途径表现出可变表达,而诸如基础转录机制的基本蜂窝功能变化得多。我们利用这些细胞系蛋白质蛋白质的知识,以建造广泛的覆盖范围“super-SILAC” quantification standard. Together with the accompanying paper (Schaab, C. MCP 2012, PMID: 22301388) (
      • Schaab C.
      • 盖尔特T.
      • stoehr g.
      • Cox J.
      MAXQB数据库中高精度,定量蛋白质组学数据分析。
      )这些数据可用于获得对细胞系蛋白质蛋白质内和细胞系蛋白质蛋白质的蛋白质的参考表达谱。
      哺乳动物细胞系是大部分生物工作的基础,这些生物学作品检查蛋白质功能和细胞反应对扰动,对于过去几十年中获得的许多生物学见解是不可或缺的。在大多数情况下,这些细胞系从不同起源的肿瘤中提取,然后适应生长 体外。这些细胞系不仅用作原始肿瘤或组织的代理,而且用作基本生物过程。这种细胞系的蛋白质组的系统宽和对比视图可以揭示细胞系之间的共性和差异,并突出细胞上的生物过程及其变化。
      到目前为止,只有很少的蛋白质组学研究试图确定不同细胞系的共同和不同的特征。博克德 等等。 在七种细胞系比较中定义了“中枢蛋白质组”(
      • Burkard T.R.
      • Planyavsky M.
      • Kaupe I.
      • Breitwieser F.P.
      • Bürckstmert.
      • Bennett K.L.
      • Superti-Furga G.
      • 大歌j.
      人类中枢蛋白质组的初步表征。
      )。它包括在所有这些细胞系统中鉴定的1124个蛋白质,优先参与蛋白质表达,代谢和增殖。本研究确定了每种细胞系2000-4000蛋白,因此限于细胞中的蛋白质更丰富。它还没有尝试量化蛋白质素之间的表达差异。使用Uhlen和Coworkers,我们最近通过下一代测序,定量蛋白质组学和由人蛋白质地图集提供的抗体分析了三种不同人细胞系中的基因表达。 RNA-SEQ,稳定同位素标记用细胞培养(Silac)中的氨基酸标记
      使用的缩写是:
      萨拉克
      稳定同位素标记用细胞培养中的氨基酸标记
      FDR.
      假发现率
      女士/女士
      串联质谱
      HCD.
      更高的能源碰撞解离
      LTQ.
      线性陷阱四极杆。
      1使用的缩写是:萨拉克
      稳定同位素标记用细胞培养中的氨基酸标记
      FDR.
      假发现率
      女士/女士
      串联质谱
      HCD.
      更高的能源碰撞解离
      LTQ.
      线性陷阱四极杆。
      蛋白质组学和基于抗体的共聚焦显微镜全部发现表达基因的高度相似性(
      • Lundberg E.
      • Fagerberg L.
      • Klevebing D.
      • matic i.
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      • algenäsc.
      • Lundeberg J.
      • Uhlen M.
      在三种功能不同的人细胞系中定义转录组和蛋白质组。
      )。在该研究中,我们的蛋白质组学分析的深度限制在约5000个蛋白质中,提出了该问题的质疑,但这种限制是否有助于蛋白质水平在细胞系的高相似之处。通过对细胞系进行更全面的质谱分析来解决这个问题,并通过增加分析的细胞系的数量来检查蛋白质组的大重叠的一般性。
      基于MS的蛋白质组学的快速发展使得能够识别增加的分析蛋白质素的比例,同意试图达到系统的综合观点(
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      质谱和蛋白质分析。
      ,
      • Swaney D.L.
      • 温格C.D.
      • Coon J.J.
      使用多种蛋白酶对大规模质谱的蛋白质组学的价值。
      ,
      • Mallick P.
      • Kuster B.
      蛋白质组学:一种务实的观点。
      ,
      • 贝克米
      • Claassen M.
      • Aeberberold R.
      综合蛋白质组学。
      )。在酵母模型中,具有6000个基因组的基因组,这种综合蛋白质组学分析鉴定了4400个蛋白质(
      • De Godoy L.M.
      • 奥尔森J.V.
      • Cox J.
      • Nielsen M.L.
      • 哈伯纳N.C.
      • Fröhlichf.
      • Walther T.C.
      综合质谱型蛋白质组定量单倍体与二倍体酵母。
      )。对于人类细胞尚未达到相同程度的覆盖,其基因组由约20,000个基因组成,其蛋白质素更复杂。哺乳动物系统的常规分析目前可以在几天内识别4000-6000蛋白(
      • wiśniewskij.r.
      • 邹格曼A.
      • Nagaraj N.
      蛋白质组分析的通用样品制备方法。
      ,
      • SchwanhäusserB.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      ,
      • Rigbolt K.T.
      • prokhorova t.a.
      • Akimov V.
      • Henningsen J.
      • 约翰森P.T.
      • Kratchmarova I.
      • 卡西姆M.
      • 奥尔森J.V.
      • Blagoev B.
      人胚胎干细胞分化的蛋白质组和磷酸磷蛋白酶的系统宽的时间表征。
      ),其基于单细胞类型表达10,000个蛋白的共同估计,对应于约50%的表达蛋白质组。到目前为止仅通过在一个分析中组合多种不同的细胞系或组织来实现更高数量的鉴定蛋白(
      • Huttlin E.L.
      • Jedrychowski M.P.
      • eliasj.e.
      • Goswami T.
      • RAD R.
      • Beausoleil S.A.
      • VillénJ.
      • 哈斯W.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      小鼠蛋白磷酸化和表达的组织特异性地图。
      ),或通过投资几周的单个样品测量(
      • Nagaraj N.
      • wisniewski J.R.
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      • Kircher M.
      • Kelso J.
      • PääboS.
      人癌细胞系的深层蛋白质组和转录组映射。
      ,
      • 贝克米
      • 施密特A.
      • Malmstroem J.
      • Claassen M.
      • ori a。
      • Szymborska A.
      • 赫罗特F.
      • rinner o.
      • Ellenberg J.
      • Aeberberold R.
      人细胞系的定量蛋白质组。
      )。
      在这里,我们采用最新的蛋白质组学技术,以实现多种人细胞系的非常广泛的蛋白质组学覆盖。线性陷阱四肢杆(LTQ)-Obbitrap Velos质谱仪具有更高的更高能量的碰撞解离(HCD)能力,因此能够在不影响分析深度的情况下获取高分辨率串联MS(MS / MS)光谱(
      • 奥尔森J.V.
      • 施瓦茨J.C.
      • Griep-raming J.
      • Nielsen M.L.
      • 达莫e.
      • Denisov E.
      • lange O.
      • 弥补P.
      • 泰勒D.
      • 灿烂的玉米
      • Wouters e.r.
      • Senko M.
      • Makarov A.
      • 角horn
      具有非常高的测序速度的双压力线性离子阱Orbitrap仪器。
      )。在这里,我们还使用具有更高分辨率和更高的测序速度的新型“高场”轨道分析仪(
      • Makarov A.
      • Denisov E.
      • lange O.
      高场围场质量分析仪的性能评价。
      )。该问题中的另一个稿件中详细描述了该壁图质谱仪(
      • Michalski A.
      • 达莫e.
      • lange O.
      • Denisov E.
      • 挖掘D.
      • 穆勒M.
      • Viner R.
      • 施瓦茨J.
      • 弥补P.
      • 贝尔福德米
      • DUNYACH J.J.
      • Cox J.
      • 角horn
      • Makarov A.
      超高分辨率线性离子捕集器(orbitrap Elite)(orbitrap Elite)促进顶部下降LC MS / MS和通用肽碎片模式。
      )。我们在相对较短的分析时间内对11个细胞系进行了深入的分析,并获得了它们的蛋白质素的非常广泛的表征。数据存放在MAXQB数据库中,该数据库是随附的稿件的主题,并且允许这些参考蛋白质的复杂分析和可视化[www.biochem.mpg.de/maxqb.](
      • Schaab C.
      • 盖尔特T.
      • stoehr g.
      • Cox J.
      MAXQB数据库中高精度,定量蛋白质组学数据分析。
      )。

      实验步骤

       细胞培养样品制备

      A549,GAMG,HEK293,HELA,HEPG2,K562,MCF7,RKO和U2OS细胞的细胞培养物与Dulbecco的改良Eagle的培养基增长,补充有10%胎牛血清和抗生素。将LNCAP和Jurkat细胞用补充有10%胎牛血清和抗生素的RPMI培养。将来自子环戊培养物的三个单独的细胞粒料在液氮中冷冻并储存在-80℃。用0.1组成的缓冲液裂解细胞 m Tris-HCl,pH 7.5,0.1 m 二硫醇和4%SDS,并在95℃温育5分钟。使用Branson型Sonicator来超声处理裂解物,然后通过以16,100×离心澄清 g 10分钟。对于Silac实验Jurkat,HEK293,LNCAP,LNCAP和K562细胞在含有Lys8和Arg10的培养基中培养,而不是天然氨基酸,并补充有10%的透析血清。将细胞培养为氧化培养基中的约8个倍增,以达到完全标记。用于制备超级硅酸混合物(
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      • ostasiewicz p.
      • wisniewski J.R.
      用于人肿瘤组织的定量蛋白质组学的超级硅酸混合物。
      )混合等量的重质裂解物,然后将非标签细胞与结果部分中所述组合。

       蛋白质消化和分馏

      将细胞裂解物(100μg)在8中稀释 m 尿素0.1 m Tris-HCl随后根据FASP协议与胰蛋白酶消化(
      • wiśniewskij.r.
      • 邹格曼A.
      • Nagaraj N.
      蛋白质组分析的通用样品制备方法。
      )。在用25米的过滤器中洗脱过夜消化肽后m 碳酸氢铵缓冲液。 FASP消化的产率大于50%。通过如前所述,通过强阴离子交换将40μg肽分化为六个级分,如前所述(
      • wiśniewskij.r.
      • 邹格曼A.
      FASP和基于STAGETIP的分馏的组合允许对海马膜蛋白质组进行深入分析。
      )。浓缩洗脱的肽并在C上纯化18 StageTips (
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      使用缘物的蛋白质组学的微纯化,富集,分馏和储存的微纯化,富集,分馏和储存的方案。
      )。

       LC-MS / MS分析

      通过内部内部的20-cm柱(内径75μm,1.8μmReprosil-pur C,通过反相色谱分离肽18-AQ媒体),使用纳米流动HPLC(Easy Nanolc,Thermo Fishific)。高效液相色谱(HPLC)偶联至LTQ-轨道螺旋螺母质谱仪(Thermo Fisher Scientific)(
      • 奥尔森J.V.
      • 施瓦茨J.C.
      • Griep-raming J.
      • Nielsen M.L.
      • 达莫e.
      • Denisov E.
      • lange O.
      • 弥补P.
      • 泰勒D.
      • 灿烂的玉米
      • Wouters e.r.
      • Senko M.
      • Makarov A.
      • 角horn
      具有非常高的测序速度的双压力线性离子阱Orbitrap仪器。
      )。用缓冲液A(0.5%乙酸)将肽加载到柱上,并用200分钟的线性梯度从2至30%缓冲液B(80%乙腈,0.5%乙酸)洗脱。梯度后,用90%缓冲液B洗涤柱并用缓冲液A重新平衡。
      以数据相关方式获取质谱,使用前10个方法,在MS和MS / MS扫描之间自动切换。 MS光谱是在壁画分析仪中获得的,质量范围为300-1650秒,目标值为106 离子。用HCD方法进行肽片段化(
      • 奥尔森J.V.
      • MACEK B.
      • lange O.
      • Makarov A.
      • 角horn
      肽改性分析的较高能量C-Trap解离。
      )在壁图分析仪中获得MS / MS光谱和40,000离子的目标值。离子选择阈值设置为5000计数。使用高场轨道电池获取两个数据集,其中分辨率为60,000,而不是30,000(400 m/z)对于MS扫描。在两个具有高场的重复中,使用15,000分辨率获得高场轨道扫描MS / MS扫描,并在第二个分辨率的第二个分辨率中获得,与标准Orbitrap中的相同,但瞬态较短。

       数据分析

      MaxQuant分析了原始MS文件(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )版本1.2.0.28。 MS / MS Spectra由Andromeda搜索引擎搜索(
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      andromeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      )针对诱饵IPI-Human数据库3.68版包含前向和反向序列(总共174,166个条目,包括前进和反向序列)。此外,数据库包括248个常见污染物。 MaxQuant分析包括具有20ppm的前体质量公差的初始搜索,其结果用于质量重新校准(
      • Cox J.
      • Michalski A.
      软件锁定质量通过二维最小化肽质量误差。
      )。在主要的Andromeda搜索前体质量和片段质量分别具有6ppm和20ppm的初始质量耐受性。搜索包括甲硫氨酸氧化和N-末端乙酰化的可变改性,以及固定改性氨基甲酰半胱氨酸。将最小的肽长度设定为六个氨基酸,并且最多允许两种白切片。对于肽和蛋白质标识,假发现率(FDR)设定为0.01。在鉴定的肽,这些肽在两种蛋白质之间共用,这些肽组合并报告为一种蛋白质组。为了在样品之间进行比较,我们使用无标记量化,至少两倍计数,以确定规范化的蛋白质强度(
      • Luber C.A.
      • Cox J.
      • Lauterbach H.
      • Fancke B.
      • Selbach M.
      • Tschopp J.
      • Akira S.
      • Wiegand M.
      • Hochrein H.
      • o'keeffe M.
      定量蛋白质组学揭示树突细胞中特异性病毒识别。
      )。用于排名单个样本内不同蛋白质的绝对丰度我们使用的是IBAQ算法(
      • SchwanhäusserB.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      )。过滤蛋白质表以消除反向数据库和常见污染物的识别。肽和蛋白质表是给出的 补充表S2和S3。使用以下散列可以从ProteomeCommons.org Tranch下载与此稿件相关联的MS原始文件

       生物信息分析

      分类注释以基因本体(GO)生物过程,分子功能和细胞组分,Transfac数据库(
      • Matys V.
      • Kel-Margoulis O.v.
      • Fricke E.
      • Liebich I.
      • 土地S.
      • Barre-Dirrie A.
      • 路透社I.
      • Chekmenev D.
      • Krull M.
      • Hornischer K.
      • voss n ..
      • 斯特格尔斯P.
      • Lewicki-Potapov B.
      • Saxel H.
      • kel a.e.
      • 翼梁E.
      Transfac及其模块复制:真核生物中转录基因调控。
      )以及参加由Corum定义的蛋白质复合物中的Kegg途径和会员资格(
      • Ruepp A.
      • Waegele B.
      • Lechner M.
      • 祝福尔B.
      • Dunger-Kaltenbach I.
      • Fobo G.
      • 弗里什曼G.
      • 蒙特隆C.
      • Mewes H.W.
      珊瑚:哺乳动物蛋白质复合物的综合资源-2009。
      )。注释矩阵算法测试了来自总体强度分布的任何蛋白质注释的差异。我们使用的特定测试是非参数曼诺惠特尼测试的二维版本。通过使用0.05的Benjamini-Hochberg FDR阈值来控制多个假设测试。 FRIS精确测试进行了FDR值0.02。
      在过滤数据后对对数强度进行分层聚类,以具有至少六个有效的值和数据的Z分数标准化,使用平均之间的欧几里德距离。对于多次T检验(ANOVA)进行分组,并进行统计测试,FDR值为0.05和s0 = 0.5. The S0 因子由特劳赫描述 等等。 为了 t test (
      • Tusher V.G.
      • Tibshirani R.
      • 楚G.
      微阵列施加到电离辐射响应的显着性分析。
      )并且在这里推广了ANOVA测试。

      结果

       细胞系蛋白质组学分析

      对于细胞系蛋白质蛋白蛋白的比较,我们选择了来自不同起源的11个常用细胞系,并进行了深度蛋白质组学分析(Fig. 1A)。其中包括来自各种起源的癌细胞:A549来自肺癌,来自颈母母细胞瘤的GAMG,来自肝癌的Heph2,来自急性T细胞白血病的Jurkat,来自慢性骨髓性白血病的K562,来自前列腺癌,来自乳腺癌的MCF7,来自乳腺癌的MCF7 ,来自结肠癌的RKO,来自骨肉瘤的U2OS和非癌症细胞系HEK293(表I.)。我们对每种细胞系进行了一式三份分析,在每次重复中,我们使用强阴离子交换以陡峭的形式将肽分成六个部分(
      • wiśniewskij.r.
      • 邹格曼A.
      FASP和基于STAGETIP的分馏的组合允许对海马膜蛋白质组进行深入分析。
      )。 LC-MS / MS分析的一个复制是在LTQ-orbitrap Velos质谱仪上完成的,该质谱仪使能够采集高分辨率MS / MS谱(
      • 奥尔森J.V.
      • 施瓦茨J.C.
      • Griep-raming J.
      • Nielsen M.L.
      • 达莫e.
      • Denisov E.
      • lange O.
      • 弥补P.
      • 泰勒D.
      • 灿烂的玉米
      • Wouters e.r.
      • Senko M.
      • Makarov A.
      • 角horn
      具有非常高的测序速度的双压力线性离子阱Orbitrap仪器。
      )。在另外两种复制中,我们使用了一种新型LTQ-orbitrap家族质谱仪,具有高野外的横向质量分析仪,其分辨率加倍(
      • Michalski A.
      • 达莫e.
      • lange O.
      • Denisov E.
      • 挖掘D.
      • 穆勒M.
      • Viner R.
      • 施瓦茨J.
      • 弥补P.
      • 贝尔福德米
      • DUNYACH J.J.
      • Cox J.
      • 角horn
      • Makarov A.
      超高分辨率线性离子捕集器(orbitrap Elite)(orbitrap Elite)促进顶部下降LC MS / MS和通用肽碎片模式。
      )。该仪器在一个复制中运行,通过调查扫描组成的循环,分辨率为60,000(瞬态长度384 ms),然后具有15,000个分辨率的10 ms / MS扫描。在其他复制MS / MS扫描中,以7500分辨率获取以减少扫描时间。该项目共生成198个原始文件(11个细胞系×6分数×3重复)和每个细胞系需要3天的仪器时间。通过使用Andromeda搜索引擎的MaxQuant软件分析这些文件,并且通过无标记定量(实验程序)确定了蛋白质的相对丰度。每种细胞系的三个重复的比较表明,使用高场轨道图的使用增加了25%和MS / MS扫描的MS扫描的数量33%,将检测到的同位素簇的数量乘以两个到三倍,提高质量准确性(补充表S1)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1十一细胞系的深层蛋白质组分析。 A,培养11种常用的人细胞系,在基于SDS的缓冲液中裂解胰蛋白酶,根据FASP方案消化,并使用SAX以静止的形式分离成六个级分。分析一式三份(每种蛋白质组每次测量)进行。 LC MS / MS具有4-H运行和HCD碎片,在配备有高场轨道分析仪的LTQ-orbitrap Velos中进行。 B,对每种染色体的总基因(蓝色)的鉴定基因(红色)分布。在每条染色体中覆盖了略微超过一半的基因组。 C,在细胞系的全部或各种子集中鉴定的蛋白质的比例。
      表I.十一细胞系中的蛋白质鉴定。各细胞系三份分析中鉴定蛋白数量的概述。在MaxQuant中使用“运行之间的匹配”选项,LC MS / MS之间的识别传输基于保留时间和精确的质量,因此增加了每个细胞系的识别次数
      细胞系起源鉴定的蛋白质
      三重分析'跑步之间的匹配'
      A549肺癌800810,432
      GAMG.胶质母细胞瘤829210,503
      HEK293胚胎肾细胞854310,504
      赫拉颈癌癌778110,371
      HepG2肝瘤713110,204
      Jurkat.急性T细胞白血病780410,443
      K562慢性骨髓白血病739510,156
      lncap.前列腺癌763010,369
      MCF7乳腺癌783610,411
      rko.结肠癌733610,252
      U2OS骨肉瘤802510,402
      将所有细胞系的三份含量分析在一起,使用1%的肽和蛋白质FDR,鉴定为158,294序列独特和完全胰蛋白肽(补充表S2)。这些肽组装成11,731个蛋白质基团(由MS可区分的蛋白质)。平均Andromeda鉴定得分为113,平均每种蛋白质的肽数为17(中值11),导致平均序列覆盖率为35%(补充表S3)。单个肽仅鉴定总细胞系蛋白质的2.5%。 11,731鉴定的蛋白质对应于10,216个集合体基因,其占完全人类基因组的50.5%。蛋白质鉴定在染色体上均匀地涂抹,平均每条染色体中鉴定的基因的52%(Fig. 1B)。有趣的是,我们发现四种蛋白质专门由Y染色体基因编码,并且这些蛋白质的独特肽仅在雄性原产地(LNCAP,Jurkat,HepG2和A549)中表达。当分别分析细胞系时,在它们中的每一个中鉴定出7000-8500蛋白(表I.)。 MaxQuant可以基于保留时间和在orbitrap分析仪中确定的非常精确的质量转移匹配运行之间的肽标识。使用该“运行之间的匹配”选项添加了25-30%的蛋白质鉴定,导致每种细胞系列超过10,000个蛋白质(表I.)。在所有细胞系中鉴定了总共8522个蛋白质(占所有鉴定的蛋白质中的73%),并且在至少两种蛋白质部分之间共用了96%的蛋白质鉴定(Fig. 1C)。该重叠远高于蛋白质组学研究中通常报道的重叠。在这些研究中,蛋白质组未作为深入进行取样,在这种情况下,在肽的肽选择中的偶像性偶数可能导致所鉴定的蛋白质的显着差异,即使对于相同的样品也是如此。这说明了在不使用稳定同位素标记的不使用量化时,对细胞的准确比较是必要的。
      为了控制运行之间的潜在假匹配,我们构建了一种估计从LC-MS运行转移肽鉴定的FDR的方法,其中肽已被MS / MS识别到另一个LC-MS中,在没有MS的情况下运行/ MS谱已经获得用于该MS肽特征或无法基于MS / MS光谱识别肽。在所有LC-MS运行的保留时间彼此对齐之后计算FDR。要生成FDR计算的输入数据,每个运行都与基于其预分馏索引的随机选择的其他运行匹配。基于精确质量和保留时间的错误匹配MS特征的可能性对于具有两个涉及的MS同位素图案的高信号强度的肽的肽较低。对于所有这些对准,我们收集所有数字对δt, 日志(I),其中δt 是两个匹配的同位素模式和日志之间保留时间的差异(I)是两个同位素模式的强度组合的对数。从这些数字对,我们估计ΔT-log中的匹配的密度(I)通过voronoi曲面细分飞机。我们基于假设假匹配的背景密度不依赖于Δ,将这种密度分解为真正的正面和假阳性贡献,不依赖于δt 虽然真正匹配的密度不依赖于日志(I)。通过应用合适的缩放因子,我们可以从匹配试图导致错误正匹配的强度依赖性假阳性密度来计算强度相关的概率。为了估算我们的数据中的匹配FDR,我们将上述过程应用于与MCF7,A549和U2OS细胞线相对应的18 LC-MS运行。基于这三种细胞系之间的分数限制匹配的FDR估计为0.12%。因为实际上我们在11个细胞系之间匹配,我们估计FDR低于11/3 * 0.12%= 0.44%。
      11蛋白蛋白的完整数据集被存入MaxQB数据库,这是本问题中另一个论文的主题(
      • Schaab C.
      • 盖尔特T.
      • stoehr g.
      • Cox J.
      MAXQB数据库中高精度,定量蛋白质组学数据分析。
      )。这些数据可以用作蛋白质标识和量化的库,以及可用于靶向蛋白质组学分析的高分辨率MS / MS光谱的资源(
      • Mallick P.
      • Kuster B.
      蛋白质组学:一种务实的观点。
      ,
      • 施密特A.
      • Claassen M.
      • Aeberberold R.
      定向质谱:朝向假设驱动的蛋白质组学。
      ,
      • Picotti P.
      • Bodenmiller B.
      • 穆勒L.N.
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      靶影科酿酒酵母的全动态范围蛋白质组分析。
      )。

       细胞系蛋白质蛋白质的无标记定量

      量化蛋白质并比较他们的水平 穿过 我们使用无标记量化的各种细胞系。对于该分析,在不同细胞系中检测到的相同肽的MS信号相对于彼此(实验过程)量化。相比之下,粗略估计蛋白质的丰富性 之内 蛋白质组,鉴定蛋白质的肽的MS信号可以求和和标准化为理论肽的大小,长度或数量(
      • Silva J.C.
      • Gorenstein M.v.
      • 李G.Z.
      • vissers J.P.
      • Geromanos S.J.
      LCMSE绝对定量蛋白质:平行MS采集的德形。
      ,
      • MalmströmJ.
      • 贝克米
      • 施密特A.
      • Lange V.
      • 德意曲e.w.
      • Aeberberold R.
      蛋白质组宽的人病原体睑蛋白蛋白浓度蛋白质浓度。
      ,
      • Shinoda K.
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      Empai Calc-通过液相色谱 - 串联质谱法从大规模识别数据估计蛋白质丰度。
      )。在这里,我们使用IBAQ算法,其基本上通过蛋白质的理论可观察肽的数量将总和肽强度归一化。在11个细胞系蛋白质组中的每一个中,IBAQ值在大约七个数量级变化。我们计算了细胞系上的中值值,并绘制了复合细胞系蛋白质组的大约12,000蛋白的估计绝对丰度。与个体蛋白质片一样,蛋白质表达的表观动态范围是七个数量级(Fig. 2A)。 25个最表达的蛋白质含有核心组蛋白,烯醇酶,GAPDH,管蛋白和热休克蛋白以及核糖体的蛋白质(Fig. 2B)。具有最低MS信号的25个蛋白质包括若干新颖和无特征蛋白质以及众所周知的蛋白质的同种型(Fig. 2C)。在这个表达范围内, 在Silico. 丰富的估计只是实际表达水平的非常粗略的指示。特别地,对于显然最少表达的蛋白质可以低估表达水平。相反,这里测量的蛋白质部分不完整,并且缺失的蛋白质可能具有非常低的表达值。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2复合细胞系蛋白质组的动态范围。 A,通过IBAQ估计了11个细胞系中每种蛋白质的中值绝对表达值,估计典型的S形分布在MS信号的七个动态范围内的七个阶数。 B,25个最丰富的蛋白质(A左侧红色盒子)是染色质或细胞骨架的结构成分,或者它们是富力酶,伴侣,和转换装置的成分。 C,25个具有最低丰度的蛋白质(右红色盒子 A)包括无表征蛋白质和同种型蛋白质。注意,在该丰度范围内,蛋白质量的硅量估计不准确。

       细胞系蛋白质蛋白质的比较

      我们使用三份分析中的标准化蛋白强度的中值来检查细胞系的相似性。无监督的分层群集创建了四个细胞系群,包括除Jurkat细胞之外的所有细胞。 (Fig. 3A)。第一个包括RKO,MCF7和U2OS,第二LNCAP和HEPG2,第三k562,HEK293和第四簇由A549,HELA和GAMG细胞组成。令人惊讶的是,细胞系的聚类与原产地组织之间几乎没有连接。例如,来自上皮起源的细胞系不一定是共聚的,而是用源自不同组织类型的细胞分组。然而,大多数细胞系显示了典型的细胞类型原始功能的蛋白质簇。例如,肝细胞系HepG2坐标表达涉及互补系统(通常从肝脏分泌的蛋白质),多种代谢过程和由Transfac数据库注释的HNF1和HNF4的靶标(
      • Luber C.A.
      • Cox J.
      • Lauterbach H.
      • Fancke B.
      • Selbach M.
      • Tschopp J.
      • Akira S.
      • Wiegand M.
      • Hochrein H.
      • o'keeffe M.
      定量蛋白质组学揭示树突细胞中特异性病毒识别。
      )(Fig. 3A)。同样,在来自T细胞白血病的Jurkat细胞中,富含表达蛋白质的簇被富集蛋白质注释“淋巴细胞活化的正调节”和“免疫系统过程”(Fig. 3A)。尽管存在这些差异,但细胞系之间的Pearson相关性相对较高为0.74(Fig. 3B)。在0.67 jurkat和hepg2细胞的相关性最低,而heLa和a549细胞的蛋白质素是最相似的蛋白质素(r = 0.83).
      图缩略图GR3.
      Fig. 3基于无标记蛋白质组定量的分层聚类。 A,细胞系中所有蛋白质的中值蛋白质表达值的双向无监督的分层聚类不会根据起源组织对细胞系分组。这表明了与之相比的去生 体内 细胞类型。然而,保留了进行细胞类型特定功能的Coregumated蛋白的簇(有关实施例的黄色盒子)。列出的函数具有FDR值(大大)以下0.02,渔民精确测试。 B,将每种细胞系蛋白质组的无标记蛋白质丰富对其他细胞蛋白质蛋白质丰富的矩阵表示。相关性是均匀的高,只有不同于 r = 0.68 and 0.83.

       三分之二的蛋白质组各种细胞系

      接下来我们希望提取在细胞系之间显着变化的蛋白质。我们首先检查重复之间的无标记蛋白质定量的再现性,发现平均Pearson相关系数为0.83。一种相对于另一个复制的强度分布的散射图显示了典型的非均匀扩散,其在低强度下比在高度下更宽。举个例子, Fig. 4A 将复制1与LNCAP细胞系的复制2进行比较。这种不均匀的分布是较近背景水平的肽测量的准确性和再现性的结果,并且需要正确考虑这种效果,因为它在a中完成 t 测试。因此,我们确定通过执行多个在细胞系之间显着改变的蛋白质 t 测试(ANOVA)。该测试统计学地确定关于细胞系之间的差异的三份测量中的再现性。 Fig. 4B 表明细胞系之间的蛋白质表达值的差异显着大于重复内。注意,在细胞系之间的比较中,使用三份值的中值,进一步提高了比较的准确性。相同细胞系的两种三倍体的比较通常导致大于0.9的相关性,而单个重复的比较具有0.8-0.9的相关性。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4丰富范围蛋白质组学变化的意义。 A,在前列腺癌细胞系LNCAP的第一和第二复制之间散射无标记的蛋白质强度。 B,两种不同细胞系LNCAP三份酸盐的散射图中的散点图和T细胞白血病衍生的Jurkat细胞大于 A. C.,与整个蛋白质组相比,至少一个11细胞系中的至少一个中的显着改变蛋白质似乎更加丰富。 D,过滤鲁棒定量的蛋白质(最小16个有效量化值)显示,蛋白质组的超过三分之二在显着变化,并且该比例不依赖于蛋白质丰度。
      以这种方式检查完整的数据集提取了4881个蛋白质,其在至少一种细胞系中的表达值具有统计学上显着的变化(FDR 0.05;实验程序)。令人惊讶的是,其中大多数是高度丰富(Fig. 4C)。该结果是通过极低丰度的蛋白质来解释的是通过无标签MS分析来准确地量化蛋白质,因此它们不会达到统计学意义。为了消除这种效果,我们过滤了在33个蛋白质组测量的至少一半中鉴定的蛋白质的数据。对该更稳定定量的蛋白质组的检查现在表明,超过三分之二的蛋白质(4753的6630)显着变化,并且它们的强度分布与整体分布没有差异(Fig. 4D)。因为蛋白质强度与其在细胞之间差异表达的可能性之间没有相关性,所以我们得出结论,三分之二的整个蛋白质组可能会显着变化。这些结果表明,细胞类型之间的蛋白质的差异表达涉及它们的功能而不是它们的丰富。

       丰度范围内细胞系的功能分析

      要检查细胞系之间的功能差异,我们使用了多种蛋白质注释数据库:GO,Kegg途径,珊瑚分子复合物数据库(
      • Ruepp A.
      • Waegele B.
      • Lechner M.
      • 祝福尔B.
      • Dunger-Kaltenbach I.
      • Fobo G.
      • 弗里什曼G.
      • 蒙特隆C.
      • Mewes H.W.
      珊瑚:哺乳动物蛋白质复合物的综合资源-2009。
      )和Transfac转录因子目标数据库(
      • Matys V.
      • Kel-Margoulis O.v.
      • Fricke E.
      • Liebich I.
      • 土地S.
      • Barre-Dirrie A.
      • 路透社I.
      • Chekmenev D.
      • Krull M.
      • Hornischer K.
      • voss n ..
      • 斯特格尔斯P.
      • Lewicki-Potapov B.
      • Saxel H.
      • kel a.e.
      • 翼梁E.
      Transfac及其模块复制:真核生物中转录基因调控。
      )。对于该分析,我们使用了最近开发的算法,确定了任何注释和整体蛋白质分布的平均表达水平之间的差异的重要性(
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      基因拷贝数变异导致癌细胞的蛋白质组学变化。
      )。在这里,我们将该算法概括为具有两个以上的维度并创建了注释矩阵 相对 十一个细胞系(Fig. 5A; 补充表S4;实验步骤)。在11个细胞系中的注释分布相对均匀,暗示通常具有相似的功能谱。我们根据其成分蛋白的平均丰度将注释分布分为四组。最丰富的四分位数的主要注释是HSP90复合物,H2AX复合物,蛋白酶体和核糖体,在第二个最丰富的四分位数中,它们是细胞周期,核苷酸代谢和呼吸链。第三组包括溶酶体蛋白,参与细胞死亡的蛋白质,以及蛋白激酶,并且在最少的四分位数主要注释中是氧气转运,视黄醇结合,脂质生物合成和缺口信号传导。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5蛋白质丰度依赖性蜂窝功能的可变性。 A,蛋白质属性的注释矩阵,例如途径,复合物和基因本体 相对 十一个细胞系。颜色代码表示属于类别的蛋白质的正常化中值丰度(红色最丰富;绿色最小丰富)。蛋白质注释分为四个块,并用代表性的单独注释标记。 B,包含“核糖体”类别的蛋白质在细胞系(上板)上高度且均匀地表达。包含“H2AX”类别的蛋白质是高度丰富的,但它们的表达水平在细胞系上显着变化。
      注释属于相同强度块的事实并不意味着所涉及的蛋白质始终以相同的水平表达。虽然这是我们细胞系中核糖体蛋白的情况(Fig. 5B),对同等丰富的组蛋白复合H2AX来说不是真的。如图所示,该函数中涉及的蛋白质通常在细胞系之间表达中的表达变化超过五倍。
      为了更详细地确定细胞之间的注释,并且哪些注释是恒定的,我们对该组显着变化的蛋白质中的蛋白质注释进行了饲料的捕捞量度测试。在高度可变的注释中,我们发现多种代谢途径,包括脂肪酸代谢,氨基酸代谢和谷胱甘肽代谢( 补充表S5)。这证明了不同细胞使用的能量产生和生物合成途径的多样性。根据其不同的形态,血小杂素细胞骨架中还存在大的差异。高度常数的方法与基础转录机械和蛋白翻译有关。在细胞之间有趣地氧化磷酸化也相对恒定,是多重分解代谢途径的能量生产机械的共同终点。这些结果表明,基本过程和非还原途径保留了相等的蛋白质水平,而例如,细胞代谢和一些结构蛋白质表现出高多样性的蛋白质表达值。

       使用细胞系作为“秒筒”硅胶标准

      除了在基础细胞生物过程中的脱落光,各种细胞系的深蛋白质组学数据也可以放在实用目的。在这里,我们说明了其在建造Spike标准中的使用以进行相对量化。我们以前表明,使用作为尖峰标准的五种乳腺癌细胞系的超级硅酸盐组合能够精确,精确地定量乳腺癌组织样本(
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      • ostasiewicz p.
      • wisniewski J.R.
      用于人肿瘤组织的定量蛋白质组学的超级硅酸混合物。
      )。本研究中发现的细胞系蛋白质蛋白质的高总体相似性表明,一组相对较少的重型硅酸标记的细胞系可以同样用作广泛的常见细胞系的标准。我们使用了无标签数据和先前通过标签定量确定的相关矩阵( Fig. 3B),选择五个细胞系,选择与彼此相互不同的(Jurkat,HEK293,LNCAP,HELA和K562)。
      从高相关预期的那样,即使是重型和光标记细胞系的二元组合之间的氧化硅量化实验也导致窄比率分布(Fig. 6A, 6B)。在对单细胞系的重型超级硅酸混合物的定量中进一步改善了这一点(Fig. 6C)。这些实验还提出了一种构建超级硅酸混合物的一般策略,并评估它们适合量化感兴趣的任何细胞系(或组织)的适用性。重要的是,这仅涉及标记用于超级硅胶混合物(重或光)的各种细胞系的标记对无标签的感兴趣的蛋白质组。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6使用细胞系作为尖峰硅酸盐标准。 了解蛋白质谱的总体相似性来构建五种细胞系重标记的“超级硅酸”参考标准。 A,Hela和K562以及Jurkat和K562(B)蛋白质足够类似的是,大多数氧化硅比在高于和低于1比例的五折比内。 C,由五种细胞系组成的重型超硅胶混合物的定量量化在五折比内的96%的K562蛋白质中。

      讨论和前景

      在这里,我们采用了现有的质谱技术的状态,并在每种情况下表征11种常见细胞系的蛋白质组到超过10,000个蛋白质的深度。值得注意的是,这种覆盖深度可实现而无需大幅分馏并且具有相对简单的蛋白质组学工作流程。每天的一个蛋白质组的总测量时间增加了所有十六细胞系的三倍一次蛋白质的33天,均衡使用下一代测序技术的转录组测量相比。尽管这里显示的分析深度目前仅限于专业群体,但它没有主要障碍在广泛的科学家中占据了主要障碍。我们研究的一个有趣的推论是基于MS的蛋白质组学不受蛋白质鉴定率的限制 本身。如果可以发现各种样品在10,000个最丰富的蛋白质中存在所有蛋白质,则可以相当快地测序为人类基因组中所有基因的蛋白质。因此,对每个基因获得鉴定的蛋白质的主要困难,如人类蛋白质组组织所谓的(
      • 羊l
      • Aeberberold R.
      • Archakov A.
      • Bairoch A.
      • 巴拉K.
      • Beretta L.
      • Bergeron J.
      • 博赫斯C.H.
      • Corthals G.L.
      • Costello C.E.
      • 德意曲e.w.
      • Domon B.
      • 汉考克W.
      • Hochstrasser D.
      • Marko-Varga G.
      • salekdeh g.h.
      • SECHI S.
      • 斯奈德米
      • Srivastava S.
      • Uhlen M.
      • 吴C.H.
      • Yamamoto T.
      • Paik Y.K.
      • OPENN G.S.
      人类蛋白质组项目:当前的国家和未来方向。
      ),处于合适的蛋白质组供应。这里描述的单个项目已经可以作为从一半人基因组的蛋白质中测定特定细胞系中感兴趣的蛋白质表达的资源。它还为这些蛋白提供参考肽及其高分辨率HCD碎片光谱(参见附带纸Schaab 等等。)。此外,我们希望我们的数据具有许多实际应用,例如在此处展示的蛋白质组标准。
      在生物学研究中,选择特异性细胞系来研究其原产地组织中发生的细胞过程。鉴于该事实,本研究的意外发现是多种细胞系蛋白质蛋白质的高度相似性。例如,我们技术可检测的蛋白质组的深度在所有情况下非常相似,无标记的蛋白质组相关性范围为0.68至0.83。然而,我们的研究结果确实同意,最近在转录组和蛋白质组水平上的研究也发现不同细胞类型中表达基因的大重叠(
      • Lundberg E.
      • Fagerberg L.
      • Klevebing D.
      • matic i.
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      • algenäsc.
      • Lundeberg J.
      • Uhlen M.
      在三种功能不同的人细胞系中定义转录组和蛋白质组。
      ,
      • 羊l
      • Aeberberold R.
      • Archakov A.
      • Bairoch A.
      • 巴拉K.
      • Beretta L.
      • Bergeron J.
      • 博赫斯C.H.
      • Corthals G.L.
      • Costello C.E.
      • 德意曲e.w.
      • Domon B.
      • 汉考克W.
      • Hochstrasser D.
      • Marko-Varga G.
      • salekdeh g.h.
      • SECHI S.
      • 斯奈德米
      • Srivastava S.
      • Uhlen M.
      • 吴C.H.
      • Yamamoto T.
      • Paik Y.K.
      • OPENN G.S.
      人类蛋白质组项目:当前的国家和未来方向。
      ,
      • Ponténf。
      • Gry M.
      • Fagerberg L.
      • Lundberg E.
      • Asplund A.
      • 贝格尔顿L.
      • oksvold p.
      • björlinge.
      • 回暖
      • Kampf C.
      • 纳瓦尼S.
      • Nilsson P.
      • ottsson J.
      • 佩尔森A.
      • wernérush.
      • Wester K.
      • UhlénM.
      人体细胞,组织和器官中蛋白质表达的全球视图。
      )。蛋白质组的这种高共性可能是部分导致细胞系的适应 体外 生长。在这种情况下,选择迅速增殖的细胞克隆,而对于许多对其生长和生存率不至关重要的许多细胞类型和组织特异性功能可能会丧失。我们以前通过量化肝细胞系对针对原发性肝细胞的蛋白质组来直接解决了这个问题,我们的结果支持上述结论(
      • 锅C.
      • Kumar C.
      • Bohl S.
      • Klingmueller U.
      细胞系和原发性细胞的比较蛋白质组学表型评估细胞类型特异性功能的保存。
      )。
      尽管总体蛋白质组学相似之处,但细胞类型的蛋白质表达簇明显存在于细胞系中(Fig. 3A)。此外,表达谱的统计分析表明,大部分蛋白质在至少一种细胞系中显着变化。有趣的是,当每种蛋白质过滤稳健的定量事件时,我们发现超过三分之二的蛋白质组可能会显着变化,并且这不受蛋白质丰富的影响。蛋白质函数的生物信息分析显示冗余途径的变化较高,而基因诸如基因和蛋白质表达的基础函数倾向于在细胞系上更均匀地表示。这些分析可以指导研究人员选择最佳的细胞系列生物兴趣。我们的数据表明,甚至通过丰富和普遍的蛋白质进行的功能并不一定意味着这些蛋白质需要在所有细胞系中的相同水平表达。相反,他们经常会变化几倍。
      这些结果是什么意思,对于由每种细胞类型所需的蛋白质组成的“核心”或“家庭”蛋白质组的常见概念,这是非常丰富的?在最小的情况下,深的蛋白质组学表现出一种家庭蛋白质组,并不像经常相信的概念那样直截了当。例如,至少在细胞系中,蛋白质倾向于以非常多样化的细胞类型存在,不仅非常常见,而且还用于更专业的功能。此外,家庭蛋白质本身不一定均匀地表达。对于家庭蛋白质的生物学上所需的定义,可能需要研究细胞类型的蛋白质 体内,我们希望在未来几年内成为技术可能的事项。

      致谢

      我们感谢蛋白质组学系的成员和富有成效的讨论的信号转移。特别是,我们感谢Annette Michalski for MS专业知识和BiancaSplettstöber,用于帮助细胞文化和Nadin Neuhauser进行计算支持。

      补充材料

      参考

        • Burkard T.R.
        • Planyavsky M.
        • Kaupe I.
        • Breitwieser F.P.
        • Bürckstmert.
        • Bennett K.L.
        • Superti-Furga G.
        • 大歌j.
        人类中枢蛋白质组的初步表征。
        BMC系统。 BIOL。 2011; 5: 17
        • Lundberg E.
        • Fagerberg L.
        • Klevebing D.
        • matic i.
        • 盖尔特T.
        • Cox J.
        • algenäsc.
        • Lundeberg J.
        • Uhlen M.
        在三种功能不同的人细胞系中定义转录组和蛋白质组。
        摩尔。系统。 BIOL。 2010; 6: 450
        • Domon B.
        • Aeberberold R.
        质谱和蛋白质分析。
        科学。 2006; 312: 212-217
        • Swaney D.L.
        • 温格C.D.
        • Coon J.J.
        使用多种蛋白酶对大规模质谱的蛋白质组学的价值。
        J.蛋白质组。 2010; 9: 1323-1329
        • Mallick P.
        • Kuster B.
        蛋白质组学:一种务实的观点。
        NAT。 Biotechnol。 2010; 28: 695-709
        • 贝克米
        • Claassen M.
        • Aeberberold R.
        综合蛋白质组学。
        目前的看法。 Biotechnol。 2011; 22: 3-8
        • De Godoy L.M.
        • 奥尔森J.V.
        • Cox J.
        • Nielsen M.L.
        • 哈伯纳N.C.
        • Fröhlichf.
        • Walther T.C.
        综合质谱型蛋白质组定量单倍体与二倍体酵母。
        自然。 2008; 455: 1251-1254
        • wiśniewskij.r.
        • 邹格曼A.
        • Nagaraj N.
        蛋白质组分析的通用样品制备方法。
        NAT。方法。 2009; 6: 359-362
        • SchwanhäusserB.
        • 巴士D.
        • 李恩
        • Dittmar G.
        • Schuchhardt J.
        • 狼J.
        • 陈W.
        • Selbach M.
        哺乳动物基因表达控制的全局量化。
        自然。 2011; 473: 337-342
        • Rigbolt K.T.
        • prokhorova t.a.
        • Akimov V.
        • Henningsen J.
        • 约翰森P.T.
        • Kratchmarova I.
        • 卡西姆M.
        • 奥尔森J.V.
        • Blagoev B.
        人胚胎干细胞分化的蛋白质组和磷酸磷蛋白酶的系统宽的时间表征。
        SCI。信号。 2011; 4: rs3
        • Huttlin E.L.
        • Jedrychowski M.P.
        • eliasj.e.
        • Goswami T.
        • RAD R.
        • Beausoleil S.A.
        • VillénJ.
        • 哈斯W.
        • Sowa M.E.
        • Gygi S.P.
        小鼠蛋白磷酸化和表达的组织特异性地图。
        细胞。 2010; 143: 1174-1189
        • Nagaraj N.
        • wisniewski J.R.
        • 盖尔特T.
        • Cox J.
        • Kircher M.
        • Kelso J.
        • PääboS.
        人癌细胞系的深层蛋白质组和转录组映射。
        摩尔。系统。 BIOL。 2011; 7: 548
        • 贝克米
        • 施密特A.
        • Malmstroem J.
        • Claassen M.
        • ori a。
        • Szymborska A.
        • 赫罗特F.
        • rinner o.
        • Ellenberg J.
        • Aeberberold R.
        人细胞系的定量蛋白质组。
        摩尔。系统。 BIOL。 2011; 7: 549
        • 奥尔森J.V.
        • 施瓦茨J.C.
        • Griep-raming J.
        • Nielsen M.L.
        • 达莫e.
        • Denisov E.
        • lange O.
        • 弥补P.
        • 泰勒D.
        • 灿烂的玉米
        • Wouters e.r.
        • Senko M.
        • Makarov A.
        • 角horn
        具有非常高的测序速度的双压力线性离子阱Orbitrap仪器。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2009; 8: 2759-2769
        • Makarov A.
        • Denisov E.
        • lange O.
        高场围场质量分析仪的性能评价。
        J.IM。 SOC。质谱。 2009; 20: 1391-1396
        • Michalski A.
        • 达莫e.
        • lange O.
        • Denisov E.
        • 挖掘D.
        • 穆勒M.
        • Viner R.
        • 施瓦茨J.
        • 弥补P.
        • 贝尔福德米
        • DUNYACH J.J.
        • Cox J.
        • 角horn
        • Makarov A.
        超高分辨率线性离子捕集器(orbitrap Elite)(orbitrap Elite)促进顶部下降LC MS / MS和通用肽碎片模式。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011;
        • Schaab C.
        • 盖尔特T.
        • stoehr g.
        • Cox J.
        MAXQB数据库中高精度,定量蛋白质组学数据分析。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2012;
        • 盖尔特T.
        • Cox J.
        • ostasiewicz p.
        • wisniewski J.R.
        用于人肿瘤组织的定量蛋白质组学的超级硅酸混合物。
        NAT。方法。 2010; 7: 383-385
        • wiśniewskij.r.
        • 邹格曼A.
        FASP和基于STAGETIP的分馏的组合允许对海马膜蛋白质组进行深入分析。
        J.蛋白质组。 2009; 8: 5674-5678
        • Rappsilber J.
        • Ishihama Y.
        使用缘物的蛋白质组学的微纯化,富集,分馏和储存的微纯化,富集,分馏和储存的方案。
        NAT。 protoc。 2007; 2: 1896-1906
        • 奥尔森J.V.
        • MACEK B.
        • lange O.
        • Makarov A.
        • 角horn
        肽改性分析的较高能量C-Trap解离。
        NAT。方法。 2007; 4: 709-712
        • Cox J.
        MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
        NAT。 Biotechnol。 2008; 26: 1367-1372
        • Cox J.
        • Neuhauser N.
        • Michalski A.
        • 施泰米r.a.
        • 奥尔森J.V.
        andromeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
        J.蛋白质组。 2011; 10: 1794-1805
        • Cox J.
        • Michalski A.
        软件锁定质量通过二维最小化肽质量误差。
        J.IM。 SOC。质谱。 2011; 22: 1373-1380
        • Luber C.A.
        • Cox J.
        • Lauterbach H.
        • Fancke B.
        • Selbach M.
        • Tschopp J.
        • Akira S.
        • Wiegand M.
        • Hochrein H.
        • o'keeffe M.
        定量蛋白质组学揭示树突细胞中特异性病毒识别。
        免疫。 2010; 32: 279-289
        • Matys V.
        • Kel-Margoulis O.v.
        • Fricke E.
        • Liebich I.
        • 土地S.
        • Barre-Dirrie A.
        • 路透社I.
        • Chekmenev D.
        • Krull M.
        • Hornischer K.
        • voss n ..
        • 斯特格尔斯P.
        • Lewicki-Potapov B.
        • Saxel H.
        • kel a.e.
        • 翼梁E.
        Transfac及其模块复制:真核生物中转录基因调控。
        核酸RES。 2006; 34: D108-D110
        • Ruepp A.
        • Waegele B.
        • Lechner M.
        • 祝福尔B.
        • Dunger-Kaltenbach I.
        • Fobo G.
        • 弗里什曼G.
        • 蒙特隆C.
        • Mewes H.W.
        珊瑚:哺乳动物蛋白质复合物的综合资源-2009。
        核酸RES。 2010; 38: D497-D501.
        • Tusher V.G.
        • Tibshirani R.
        • 楚G.
        微阵列施加到电离辐射响应的显着性分析。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2001; 98: 5116-5121
        • 施密特A.
        • Claassen M.
        • Aeberberold R.
        定向质谱:朝向假设驱动的蛋白质组学。
        Curr。拍摄。化学。 BIOL。 2009; 13: 510-517
        • Picotti P.
        • Bodenmiller B.
        • 穆勒L.N.
        • Domon B.
        • Aeberberold R.
        靶影科酿酒酵母的全动态范围蛋白质组分析。
        细胞。 2009; 138: 795-806
        • Silva J.C.
        • Gorenstein M.v.
        • 李G.Z.
        • vissers J.P.
        • Geromanos S.J.
        LCMSE绝对定量蛋白质:平行MS采集的德形。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2006; 5: 144-156
        • MalmströmJ.
        • 贝克米
        • 施密特A.
        • Lange V.
        • 德意曲e.w.
        • Aeberberold R.
        蛋白质组宽的人病原体睑蛋白蛋白浓度蛋白质浓度。
        自然。 2009; 460: 762-765
        • Shinoda K.
        • Tomita M.
        • Ishihama Y.
        Empai Calc-通过液相色谱 - 串联质谱法从大规模识别数据估计蛋白质丰度。
        生物信息学。 2010; 26: 576-577
        • 盖尔特T.
        • Cox J.
        基因拷贝数变异导致癌细胞的蛋白质组学变化。
        Plos Genet。 2010;
        • 羊l
        • Aeberberold R.
        • Archakov A.
        • Bairoch A.
        • 巴拉K.
        • Beretta L.
        • Bergeron J.
        • 博赫斯C.H.
        • Corthals G.L.
        • Costello C.E.
        • 德意曲e.w.
        • Domon B.
        • 汉考克W.
        • Hochstrasser D.
        • Marko-Varga G.
        • salekdeh g.h.
        • SECHI S.
        • 斯奈德米
        • Srivastava S.
        • Uhlen M.
        • 吴C.H.
        • Yamamoto T.
        • Paik Y.K.
        • OPENN G.S.
        人类蛋白质组项目:当前的国家和未来方向。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011; 10 (M111 009993)
        • Ponténf。
        • Gry M.
        • Fagerberg L.
        • Lundberg E.
        • Asplund A.
        • 贝格尔顿L.
        • oksvold p.
        • björlinge.
        • 回暖
        • Kampf C.
        • 纳瓦尼S.
        • Nilsson P.
        • ottsson J.
        • 佩尔森A.
        • wernérush.
        • Wester K.
        • UhlénM.
        人体细胞,组织和器官中蛋白质表达的全球视图。
        摩尔。系统。 BIOL。 2009; 5: 337
        • 锅C.
        • Kumar C.
        • Bohl S.
        • Klingmueller U.
        细胞系和原发性细胞的比较蛋白质组学表型评估细胞类型特异性功能的保存。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2009; 8: 443-450