通过定量蛋白质组学分析和遗传筛来鉴定自噬体相关蛋白和调节剂*

  • 作者脚注
    ** 这些作者同等贡献这项工作。
    jörn邓布尔
    一致
    应该解决对应的通信
    脚注
    ** 这些作者同等贡献这项工作。
    隶属关系
    南丹麦大学生物化学与分子生物学系,5230欧登塞M,丹麦

    弗莱堡高级研究所 - 弗里堡大学弗里布尔大学,79104弗莱堡,德国

    生物系统分析中心(ZBSA),弗莱堡大学,德国弗莱堡79104

    生物信号研究中心(BIOS),弗莱堡大学,德国弗莱堡79104
    搜索本作者的文章
  • 作者脚注
    ** 这些作者同等贡献这项工作。
    玛丽亚·赫伊尔 - 汉森
    脚注
    ** 这些作者同等贡献这项工作。
    隶属关系
    丹麦丹麦癌症学会凋亡课程和遗传毒性应力研究中心,丹麦2100哥本哈根
    搜索本作者的文章
  • 玛丽亚O. Nielsen.
    隶属关系
    南丹麦大学生物化学与分子生物学系,5230欧登塞M,丹麦
    搜索本作者的文章
  • 托比亚艾森伯格
    隶属关系
    奥地利格拉茨8010格拉茨大学分子生物科学研究所
    搜索本作者的文章
  • Lea M.更努力
    隶属关系
    南丹麦大学生物化学与分子生物学系,5230欧登塞M,丹麦
    搜索本作者的文章
  • SørenSchandorff
    隶属关系
    南丹麦大学生物化学与分子生物学系,5230欧登塞M,丹麦
    搜索本作者的文章
  • Thomas Farkas.
    隶属关系
    丹麦丹麦癌症学会凋亡课程和遗传毒性应力研究中心,丹麦2100哥本哈根
    搜索本作者的文章
  • Thomas Kirkegaard.
    隶属关系
    丹麦丹麦癌症学会凋亡课程和遗传毒性应力研究中心,丹麦2100哥本哈根
    搜索本作者的文章
  • Andrea C. Becker.
    隶属关系
    弗莱堡高级研究所 - 弗里堡大学弗里布尔大学,79104弗莱堡,德国

    生物系统分析中心(ZBSA),弗莱堡大学,德国弗莱堡79104
    搜索本作者的文章
  • Sabrina Schroeder.
    隶属关系
    奥地利格拉茨8010格拉茨大学分子生物科学研究所
    搜索本作者的文章
  • Katja Vanselow.
    隶属关系
    南丹麦大学生物化学与分子生物学系,5230欧登塞M,丹麦
    搜索本作者的文章
  • Emma Lundberg.
    隶属关系
    RoslagstullsBacken 21,Se-10691斯德哥尔摩,瑞典皇家理工学院
    搜索本作者的文章
  • Mogens M. Nielsen.
    隶属关系
    南丹麦大学生物化学与分子生物学系,5230欧登塞M,丹麦
    搜索本作者的文章
  • Anders R. Kristensen
    隶属关系
    南丹麦大学生物化学与分子生物学系,5230欧登塞M,丹麦
    搜索本作者的文章
  • Vyacheslav Akimov.
    隶属关系
    南丹麦大学生物化学与分子生物学系,5230欧登塞M,丹麦
    搜索本作者的文章
  • Jakob Bunkenborg.
    隶属关系
    南丹麦大学生物化学与分子生物学系,5230欧登塞M,丹麦
    搜索本作者的文章
  • 弗兰克迈莫
    隶属关系
    奥地利格拉茨8010格拉茨大学分子生物科学研究所
    搜索本作者的文章
  • MarjaJäättelä.
    一致
    应该解决对应的通信
    隶属关系
    丹麦丹麦癌症学会凋亡课程和遗传毒性应力研究中心,丹麦2100哥本哈根
    搜索本作者的文章
  • Jens S. Andersen.
    一致
    应该解决对应的通信
    隶属关系
    南丹麦大学生物化学与分子生物学系,5230欧登塞M,丹麦
    搜索本作者的文章
  • 作者脚注
    本文含有补充材料。
    ** 这些作者同等贡献这项工作。
    *该项目由丹麦癌症协会(MH-H.,JSA和MJ)的资金支持,欧洲共同体的第七框架计划授予FP7 / 2007-2013为合作项目授予FP7 / 2007-200767 apo-sys(TE,FM,JSA和MJ)和Health-F4-2008-201648 /展望(埃尔和杰萨),德国联邦和州政府的卓越倡议(弗赖堡高级研究所,生物研究所;致JD),Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant GZ De1757 / 2-1(JD和ACB),德国联邦教育部和研究授予031 5896 A通过Gerontosys II-Nephage(对JD),丹麦国家研究基金会(对MJ和MJ)丹麦医学研究委员会(MJ),迈耶基金会(MJ),Novo Nordisk Foundation(到MJ)和Lundbeck Foundation(到MJ))。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      自噬是主要的细胞内分解代谢途径之一,但对自噬复印物的组成知之甚少。为了研究相关的蛋白质,我们使用两种不同的生物化学方法和三种刺激类型分离出从人乳腺癌细胞中的自噬细胞分离出:氨基酸剥夺或雷帕霉素或治疗方法。自噬体相关的蛋白质依赖于刺激,但核心蛋白含量毫无刺激。值得注意的是,刺激无关的常见自噬体相关蛋白质中的蛋白酶体蛋白质丰富,并且自噬激活显着降低了细胞蛋白酶体水平和活性在两个降解途径之间的相互作用。在编码用于常见的一组自噬体相关蛋白的人类基因的原始型缺陷的酵母菌筛显示出几种自噬的调节因子,包括转器复合物的亚基。这里呈现的同时的时空蛋白质组学和遗传数据集提供了进一步表征自噬体生物生成和货物选择的基础。
      宏观摄影(以下简称自噬)是一种进化保守的溶酶体途径,涉及长期蛋白质,细胞质和整个细胞器的营业额(
      • kroemer g.
      • jäätteläm。
      细胞死亡控制中的溶酶体和自噬。
      ,
      • Mizushima N.
      • Levine B.
      • Cuervo上午
      • Klionsky D.J.
      自噬通过细胞自我消化抗击疾病。
      ,
      • Nakatogawa H.
      • 铃木K.
      • kamada y。
      • ohsumi Y.
      自噬机制中的动态与多样性:酵母的课程。
      ,
      • Engelke R.
      • Becker A.c.
      • 邓布尔J.
      细胞的降解库存:蛋白质组学见解。
      )。它的放松症对小鼠导致胚胎或围产期杀伤性(
      • Tsukamoto S.
      • Kuma A.
      • Murakami M.
      • Kishi C.
      • Yamamoto A.
      • Mizushima N.
      自噬对小鼠胚胎的预体开发至关重要。
      ,
      • Kuma A.
      • HATANO M.
      • 松山M.
      • Yamamoto A.
      • Nakaya H.
      • Yoshimori T.
      • ohsumi Y.
      • Tokuhisa T.
      • Mizushima N.
      自噬在新生儿饥饿期间的作用。
      ),神经变性(
      • Rubinsztein D.C.
      细胞内蛋白质降解途径在神经变性中的作用。
      )或癌症(
      • Mathew R.
      • KANTANZA-WADSWORTH V.
      • 白e.
      自噬在癌症中的作用。
      ),强调这种分解代谢过程的生理重要性。尽管自噬在于在低基础水平,饥饿,生长因子剥夺和蛋白质聚集中同时发生,但以及其他细胞应激迅速增加其活性。在这些条件下,自噬对产生营养成分或去除受损的细胞质组分至关重要,从而主要用作保护性细胞反应(
      • Mizushima N.
      • Levine B.
      • Cuervo上午
      • Klionsky D.J.
      自噬通过细胞自我消化抗击疾病。
      )。
      自噬过程开始于扁平膜芯片的成核,所述扁平膜芯细胞形成细胞质细胞器和/或一部分细胞溶胶。膜伸长,直到膜熔丝的边缘,从而形成称为自噬体的双膜结构,其用形成两栖组的内体熔化(
      • 戈登P.B.
      • Seglen P.O.
      自噬和内吞径的孕妇组合。
      )通过融合溶酶体囊泡,随后将其成熟到自然体上。该货物的最终降解发生在自溶细胞中,其中溶酶体水解酶消化腔含量,允许氨基酸的再循环,核苷酸和脂肪酸(
      • 芬恩P.F.
      • 骰子J.F.
      蛋白水解和脂肪溶解的饥饿反应。
      )。该过程由最初在酵母中鉴定的一组进化的保守自噬相关蛋白(ATG蛋白)控制(
      • Klionsky D.J.
      • Cregg J.M.
      • Dunn Jr.,W.A.
      • EMR S.D.
      • Sakai Y.
      • 桑托伊I.v.
      • Sibirny A.
      • Subramani S.
      • 捶打
      • veenhuis m.
      • ohsumi Y.
      酵母自噬相关基因的统一命名。
      ,
      • ohsumi Y.
      自噬的分子解剖:两种泛素状的系统。
      )。由磷脂酰肌醇3-磷酸三磷酸激酶3,P150肌肌蛋白化蛋白激酶和BECLIN 1(ATG6)组成的蛋白质复合物对于初始膜组件是必不可少的,而下列膜伸长率取决于两个泛素状的缀合系统。其中一个转化微管相关蛋白1轻链3(LC3 / ATG8)
      使用的缩写是:
      LC.
      轻链子
      内质网
      MTORC
      哺乳动物的雷帕霉素综合体
      PCP.
      PROM Lation Profilling.
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      GFP.
      绿色荧光蛋白
      egfp.
      增强GFP.
      alp.
      碱性磷酸酶
      HBSS.
      汉克斯的平衡盐溶液
      siRNA
      小干扰RNA
      Cona.
      Cancanamycin A.
      rapa.
      雷帕霉素
      Rheb.
      Ras Homolog富含大脑
      gabarapl2.
      加布A 受体相关蛋白质2
      EEF1G
      真核翻译伸长因子1γ
      PSM
      蛋白酶体亚基。
      1使用的缩写是:LC.
      轻链子
      内质网
      MTORC
      哺乳动物的雷帕霉素综合体
      PCP.
      PROM Lation Profilling.
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      GFP.
      绿色荧光蛋白
      egfp.
      增强GFP.
      alp.
      碱性磷酸酶
      HBSS.
      汉克斯的平衡盐溶液
      siRNA
      小干扰RNA
      Cona.
      Cancanamycin A.
      rapa.
      雷帕霉素
      Rheb.
      Ras Homolog富含大脑
      gabarapl2.
      加布A 受体相关蛋白质2
      EEF1G
      真核翻译伸长因子1γ
      PSM
      蛋白酶体亚基。
      从其自由形式(LC3-I)到磷脂酰乙醇胺 - 共轭形式(LC3-II),其与自噬体的两个膜相关联(
      • 杨Z.
      • Klionsky D.J.
      哺乳动物自噬:核心分子机械和信号调节。
      )。该过程经常用作自噬标记,因为可以容易地可视化来自扩散到虚线的LC3染色图案的变化。
      自噬通常被认为是非选择性大部分劣化途径。然而,在某些条件下,已经提出自噬体来选择性地除去例如受损的线粒体(
      • 金I.
      • Rodriguez-entiquez S.
      • Lemasters J.J.
      乳化物选择性降解线粒体。
      ),内质网(ER)(
      • 伯纳尔斯S.
      • 麦当劳K.L.
      • 沃尔特P.
      自噬逆损在展开蛋白质反应过程中的内质网膨胀。
      ),过氧化血剂(
      • Dunn Jr.,W.A.
      • Cregg J.M.
      • Kiel J.A.
      • van der klei i.j.
      • oku m.
      • Sakai Y.
      • sibirny a.a.
      • Stasyk O.v.
      • veenhuis m.
      pexophagy:过氧化血剂的选择性自噬。
      ),核糖体(
      • 牛皮纸C.
      • 消失A.
      • Sohrmann M.
      • 彼得M.
      通过需要UBP3P / BRE5P泛素蛋白酶的自噬途径在饥饿后选择性地降解成熟的核糖体。
      ),并且在细胞因子末端的仲比戒指(
      • pohl c.
      • jesthchs.
      自噬中的米德托戒指是细胞因子的后脱落事件。
      )。此外,我们最近饥饿细胞的蛋白质组学分析表明,细胞蛋白根据其亚细胞定位(
      • 克里斯滕森A.R.
      • Schandorff S.
      • Høyer-hansen M.
      • Nielsen M.O.
      • jäätteläm。
      • 邓布尔J.
      • 安德森J.S.
      饥饿诱导的自噬期间有序细胞器降解。
      )。因此,自噬还可以用作特定的降解系统,类似于蛋白酶体,其识别泛素偶联的蛋白质进行降解(
      • Ciechorover A.
      蛋白水解:从溶酶体到泛素和蛋白酶体。
      )。尽管泛素 - 蛋白酶体系和自噬只被视为没有交叉点的互补劣化系统,但最近显示了当遍历蛋白 - 蛋白酶体系损害时自噬可以补偿地行动 果蝇黑胶基 (
      • Pandey U.B.
      • 聂z.
      • Batlevi Y.
      • 麦克雷B.A.
      • Ritson G.P.
      • nedelsky n.b.
      • Schwartz S.L.
      • diprospero n.a.
      • 骑士M.A.
      • Schuldiner O.
      • Padmanabhan R.
      • 希尔德米
      • Berry D.L.
      • Garza D.
      • 隆堡C.C.
      • 姚明。
      • baehrecke e.h.
      • 泰勒J.P.
      HDAC6救出神经变性,并提供自动侵入和UPS之间的基本环节。
      )。这些数据表明,两种主要细胞蛋白水解途径之间可能存在联系(
      • Korolchuk v.i.
      • Mansilla A.
      • Menzies F.M.
      • Rubinsztein D.C.
      自噬抑制损害泛素 - 蛋白酶体途径底物的降解。
      ,
      • 牛皮纸C.
      • 彼得M.
      • 霍夫曼K.
      选择性自噬:泛素介导的识别和超越。
      ,
      • 拉马克T.
      • 约翰森T.
      自噬:与蛋白酶组合的链接。
      )。
      本研究的目的是鉴定与成熟自噬体相关的蛋白质,并比较不同刺激诱导的自噬蛋白的蛋白质组成。为此目的,我们分析了在氨基酸饥饿或用雷帕霉素(哺乳动物粘蛋白复合物1(MTORC1)的哺乳动物靶标)或酸霉素A的抑制剂(溶酶体H的抑制剂+-ATPase)通过定量的MS基蛋白质组学(
      • Zimmermann A.c.
      • Zarei M.
      • 艾丽泰州S.
      • 邓布尔J.
      用于分析自噬期间时空蛋白质动态的定量蛋白质组学。
      )依赖蛋白质相关性分析(PCP)(
      • 安德森J.S.
      • Wilkinson C.J.
      • 市长T.
      • Mortensen P.
      • nigg e.a.
      蛋白质相关性分析蛋白质组学表征人中子组。
      )细胞培养中的氨基酸(Silac)(
      • 邓布尔J.
      • Kratchmarova I.
      • Blagoev B.
      受体酪氨酸激酶信号传导:来自定量蛋白质组学的视图。
      ,
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
      )。我们确定了来自共纯化蛋白质的背景的728个拟起的自噬体相关蛋白。其中,只有94个蛋白质对所有刺激均常见。为了验证共迁移蛋白质源自自噬体,我们对针对自噬复印术标记LC3的GFP标记版本的GFP下拉进行了针对GFP标记的版本,并通过荧光显微镜检查所选候选蛋白的亚细胞定位。为了测试是否用作自噬调节剂的常见的自噬体相关蛋白质,我们转向酵母遗传学,并在相应基因中筛选可用的酵母菌株,用于通过碱性磷酸酶(ALP)测定的自噬变化(
      • Klionsky D.J.
      在酵母中监测自噬:PHO8Delta60测定。
      )识别代言复杂的识别。随后分析了在酵母筛中鉴定的新型自噬调节剂耗尽的人细胞,通过细胞测定检测自噬体相关蛋白的成交量的细胞测定进行自噬助焊剂(
      • Farkas T.
      • Hoyer-Hansen M.
      • Jaattela M.
      基于荧光素酶的测定鉴定新型自噬调节剂的自噬磁体动力学。
      ,
      • Klionsky D.J.
      • Klionsky D.J.
      • abeliovich h.
      • 藿病虫P.
      • Agrawal D.K.
      • Aliev G.
      • 歪斜D.S.
      • 巴巴米
      • baehrecke e.h.
      • bahr b.a.
      • Ballabio A.
      • 班伯B.A.
      • Bassham D.C.
      • Bergamini E.
      • Bi X.
      • 比亚特 - Piechaczyk M.
      • Blum J.s.
      • 布里德森D.E.
      • Brodsky J.L.
      • Brumell J.H.
      • 粗鲁的U.T.
      • 卷发W.
      • Camougrand N.
      • Cebollero E.
      • Ceconi F.
      • 陈Y.
      • 下巴L.S.
      • Choi A.
      • 楚C.T.
      • Chung J.
      • 克拉克P.G.
      • 克拉克R.S.
      • 克拉克斯。
      • ClavéC.
      • 克利夫兰J.L.
      • Codogno P.
      • 科伦坡M.I.
      • Coto-Montes A.
      • Cregg J.M.
      • Cuervo上午
      • Debnath J.
      • Demarchi F.
      • 丹尼斯P.B.
      • 丹尼斯P.A.
      • 遗传五。
      • devenish r.j.
      • di sano f.
      • 骰子J.F.
      • Digiglia M.
      • Dinesh-Kumar S.
      • Distelst C.W.
      • djavaheri-mergny m.
      • DORSEY F.C.
      • Drögew.
      • 德隆M.
      • Dunn Jr.,W.A.
      • Duszenko M.
      • eissa n.t.
      • Elazar Z.
      • Esclatine A.
      • Eskelinen E.L.
      • FésüsL.
      • 芬利K.D.
      • Fuentes J.M.
      • Fueyo J.
      • 富士崎K.
      • Galliot B.
      • 高级。
      • Gewirtz D.A.
      • 吉布森S.B.
      • Gohla A.
      • Goldberg A.L.
      • Gonzalez R.
      • González-estévezz
      • 戈斯基S.
      • gottliebr.a.
      • Häussingerd。
      • 他是的。
      • Heidenreich K.
      • 山J.A.
      • Høyer-hansen M.
      • 胡X.
      • 黄温
      • Iwasaki A.
      • jäätteläm。
      • 杰克逊W.T.
      • 江X.
      • 金斯。
      • 约翰森T.
      • Jung J.u.
      • kadowaki m.
      • 康C.
      • Kelekar A.
      • 凯斯尔D.H.
      • Kiel J.A.
      • 金H.P.
      • 泡菜A.
      • kinsella t.j.
      • Kiselyov K.
      • Kitamoto K.
      • knecht E.
      • 小松M.
      • kominamie。
      • kondo s。
      • Kovácsa.l.
      • kroemer g.
      • kuan c.y.
      • Kumar R.
      • 隆都M.
      • 兰德里J.
      • Laporte M.
      • 莱赫。
      • Lenardo M.J.
      • Levine B.
      • 利伯曼A.
      • Lim K.L.
      • 林F.C.
      • 刘德
      • Liu L.F.
      • Lopez-Berestein G.
      • lópez-otínc。
      • 卢B.
      • Macleod K.F.
      • Malorni W.
      • 马提内特W.
      • Matsuoka K.
      • Mautner J.
      • Meijer A.J.
      • MeléndezA.
      • Michels P.
      • Miotto G.
      • Mistiaen W.P.
      • Mizushima N.
      • 莫格拉比B.
      • Monastyrska I.
      • 摩尔M.N.
      • 更多的ira p.i.
      • 莫里萨苏Y.
      • Motyl T.
      • MünzC.
      • 墨菲L.O.
      • naqvi n.i.
      • Neufeld T.P.
      • Nishino I.
      • 尼克松R.A.
      • Noda T.
      • NürnbergB.
      • Ogawa M.
      • Oleinick N.L.
      • olsen l.j.
      • Ozpolat B.
      • Paglin S.
      • Palmer G.E.
      • Papassideri I.
      • 帕克斯米
      • perlmuter d.h.
      • 佩里G.
      • Piacentini M.
      • Pinkas-Kramarski R.
      • Prescott M.
      • Proikas-Cezanne T.
      • raben n.
      • 拉米A.
      • Reggiori F.
      • Rohrer B.
      • Rubinsztein D.C.
      • Ryan K.M.
      • 萨文玛J.
      • Sakagami H.
      • Sakai Y.
      • Sandri M.
      • Sasakawa C.
      • Sass M.
      • 施耐德C.
      • Seglen P.O.
      • Seleverstov O.
      • Settleman J.
      • Shacka J.J.
      • Shapiro i.M.
      • Sibirny A.
      • Silva-Zacarin e.c.
      • 西蒙H.U.
      • Simone C.
      • 西蒙森A.
      • 史密斯M.A.
      • Spanel-Borowski K.
      • Srinivas V.
      • st
      • 捷卡H.
      • stromhaug p.e.
      • Subauste C.S.
      • Sugimoto S.
      • 苏尔寿D.
      • 铃木T.
      • Swanson M.S.
      • Tabas I.
      • Takeshita F.
      • Talbot N.J.
      • tallóczyz.
      • Tanaka K.
      • Tanaka K.
      • Tanida I.
      • 泰勒G.S.
      • 泰勒J.P.
      • Terman A.
      • TETTAMANTI G.
      • 汤普森C.B.
      • 捶打
      • Tolkovsky上午
      • 太太S.A.
      • 逃学r.
      • tumanovska l.v.
      • Uchiyama Y.
      • Ueno T.
      • Uzcáteguin.l.
      • van der Klei I.
      • vaquero e.c.
      • Vellai T.
      • Vogel M.W.
      • 王H.G.
      • 韦伯斯特P.
      • Wiley J.W.
      • XI Z.
      • 肖G.
      • yahalom J.
      • 杨梅。
      • 哟g。
      • 尹凌
      • Yoshimori T.
      • yu l.
      • 岳Z.
      • Yuzaki M.
      • Zabirnyk O.
      • 郑X.
      • 朱克。
      • 阻止R.L.
      用于监测高真核生物中的自噬的使用和解释的指导方针。
      )。所呈现的数据提供了鉴定一组自噬体相关蛋白和调节剂的自噬体的定量蛋白质组学表征。

      实验步骤

       细胞培养

      对于Silac实验MCF7-EGFP-LC3细胞(
      • Høyer-hansen M.
      • Bastholm L.
      • Szyniarowski P.
      • Campanella M.
      • Szabadkai G.
      • Farkas T.
      • Bianchi K.
      • Fehrenbacher N.
      • 艾琳福
      • Rizzuto R.
      • Mathiasen I.S.
      • jäätteläm。
      通过钙,钙调蛋白依赖性激酶激酶-β和Bcl-2的控制控制宏观摄影。
      )在Dulbecco的改性Eagle的培养基(Invitrogen)中培养,补充有青霉素/链霉素(100个单位/ ml,100μg/ ml),谷氨酰胺和10%透析的胎牛血清(Invitrogen)并用两种标记 l-Lysine和 l-Arginine(Lys.0,arg.0), l-Lysine-2H4l-Arginine-13C6 (Lys4,arg.6), 或者 l-LYSINE.13C6-15N2l-Arginine.13C6-15N4 (Lys8,arg.10)(剑桥同位素实验室,ander,ma; sigma-Aldrich)。否则细胞在Dulbecco的改性Eagle的培养基或RPMI(Invitrogen)中生长,10%FCS和青霉素/链霉素。将细胞用Cancanamycin A,雷帕霉素和依托哌肽(所有来自Sigma-Aldrich)处理或在PBS中洗涤三次,然后在含有钙,镁和1g葡萄糖/升(Invitrogen)的HBS中饥饿。

       转染

      使用载体PDSRED-C1和-N1生成DSRED和RHEB或FKBP1A的融合构建体(CLONTECH)。 RHEB和FKBP1A CDNA购自Imagenes(柏林,德国),并检查融合构建体。通过使用Metafectene通过脂质体转染产生稳定的细胞系 TM值 (Biontex,Martinsried,德国)。在瞬态转染期间,Fugene 6(Roche应用科学)用作根据制造商的说明用作转染剂。对应于人cDNA序列的siRNA序列列于 补充材料。用50 n转染细胞m 使用oligofectamine的siRNATM值 (Invitrogen).

       免疫缩编

      用于免疫印迹分析的主要抗体列于 补充“实验程序”。 合适的过氧化物酶 - 缀合的二抗来自Dako A / S(Glostrup,Denmark)和向量实验室(Burlingame,CA),ECL免疫印迹试剂来自Amersham Biosciences。
      固定细胞并染色施用标准程序(
      • Høyer-hansen M.
      • Bastholm L.
      • Szyniarowski P.
      • Campanella M.
      • Szabadkai G.
      • Farkas T.
      • Bianchi K.
      • Fehrenbacher N.
      • 艾琳福
      • Rizzuto R.
      • Mathiasen I.S.
      • jäätteläm。
      通过钙,钙调蛋白依赖性激酶激酶-β和Bcl-2的控制控制宏观摄影。
      )。对于DSRED融合蛋白的检测,将细胞固定并在3.7%多聚甲醛中透明7分钟,然后甲醇过夜。列中列入了主要抗体 补充“实验程序”。 各自的荧光二抗来自分子探针或杰克逊免疫橡胶。使用Zeiss LSM 510元共聚焦激光扫描显微镜或Zeiss Axiovert 100M共焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss,Jena,德国)获得图像。

       检测自噬体

      在3.7%甲醛和0.19%野生酸(V / V)固定的细胞中,盲目地在施用Zeiss Axiovert 100M共聚焦激光扫描显微镜(Carl蔡司)。

       自噬助焊剂

      如前所述,测量含有荧光素酶的测定的自噬磁通量(
      • Farkas T.
      • Hoyer-Hansen M.
      • Jaattela M.
      基于荧光素酶的测定鉴定新型自噬调节剂的自噬磁体动力学。
      )。

       蛋白酶体活性测定

      使用来自Chemicon International(目录号APT280; TEMECULA,CA)的20 S蛋白酶体活性测定试剂盒测量蛋白酶体活性,并且使用根据制造商的Bio-rad DC蛋白质测定试剂盒(BIO-RAD)测量蛋白质水平指示 (补充“实验程序”)。

       酵母中的自噬测量

      实验用BY4741进行(Mata HIS3Δ1LEU2Δ0MET15Δ0URA3Δ0)和从欧洲索斯(Euroscarf)获得的各自的突变体突变体(在中描述的生长条件 补充“实验程序”)。为了通过氮饥饿诱导自噬,将细胞从新鲜过夜培养物中接种至0.4 A600 (∼4 × 106 细胞/ ml)在合成完全葡萄糖中,生长4-5小时至中耳阶段达到〜1.5 A600,用双蒸馏水洗涤两次2o,并在1的SD-N培养中孵育 A600 3小时。为了通过雷帕霉素治疗诱导自噬,细胞生长至中脑期(〜1 A600)如上所述,将雷帕霉素(Ag Scientific)加入到培养物中以孵育3小时的终浓度为0.5μg/ ml。
      根据REF,通过ALP活性在1mL培养等分试样的细胞提取物中测定自噬。
      • Kissovái。
      • Deffieu M.
      • Manon S.
      • Camougrand N.
      Uth1p参与线粒体的自噬降解。
      使用各自的菌株转化并选择用于稳定插入含有PHO8P(PHO8PΔN60)的胞质形式的PTN9 HindIII片段。有关详细信息,请参阅 补充“实验程序”.

       自噬核糖纯化和质谱

      从参考文献中描述的协议中修改了自噬纯化。
      • strømhaugp.e.
      • Berg T.O.
      • Fengsrud M.
      • Seglen P.O.
      大鼠肝细胞自噬瘤的纯化和表征。
      (有关详细信息,请参阅 补充“实验程序”)。 PCP-SILAC背景分数(LYS0/ arg.0)与相应的1:1的比例合并并掺入(LYS4/ arg.6)PCP氧化酶馏分(
      • 邓布尔J.
      • jakobsen l.
      • 安德森J.S.
      细胞器蛋白质组学通过无标记物和基于氧化素的蛋白质相关性分析。
      )。将得到的级分在均质化培养基中浸入1:1并以31,000×造粒 g。将粒料重悬于SDS加载缓冲液中并减少和烷基化。通过SDS-PAGE(4-12%BIS-TRIS梯度凝胶,挤压剂; Invitrogen)分离蛋白质混合物,用胰蛋白酶消化凝胶。在GFP标签富集实验中,通过离心富含囊泡,然后通过GFP抗体下拉(补充图S3)。用胰蛋白酶和通过离子交换色谱分离的肽在溶液中消化蛋白质。通过在线C18反相纳米级液相色谱串联质谱法分析所得的肽混合物基本上如上所述(
      • Zarei M.
      • 春天的A.
      • 梅尔伯格F.
      • Gretzmeier C.
      • 邓布尔J.
      Erlic-TiO2,Hilic-TiO2和SCX-TiO2对全局磷蛋白酶方法的比较。
      )(详情见 补充“实验程序”)。

       使用吉祥物和使用MSQuant分配肽序列

      使用内部开发的软件DTASupercharge(默认值;版本1.19,MSQuant.SourceForge.Net(MSQuant.SourceForge.Net(v。3.34,v.34,v.3.34,使用68404条目)搜索,并将其被封存并合并到单个峰值列表文件中并与人类的MSIPI数据库进行搜索(
      • Schandorff S.
      • 奥尔森J.V.
      • Bunkenborg J.
      • Blagoev B.
      • 张Y.
      • 安德森J.S.
      用于CSNP识别的质谱友好的数据库。
      )基本上使用吉祥物2.0(矩阵科学,伦敦,英国)(
      • 克里斯滕森A.R.
      • Schandorff S.
      • Høyer-hansen M.
      • Nielsen M.O.
      • jäätteläm。
      • 邓布尔J.
      • 安德森J.S.
      饥饿诱导的自噬期间有序细胞器降解。
      )和以下参数:将氨基甲酰亚甲基半胱氨酸设定为固定改性,甲硫氨酸氧化,天冬酰胺和谷氨酰胺的脱酰胺,并设定蛋白质氨基 - 末端乙酰化被设定为可变修饰。选择双硅酸或三重硅胶作为定量模式。允许两种小乳腺裂解,酶特异性是胰蛋白酶,前体质量精度必须在30ppm以内的FT-DATA和7ppm用于靶向数据,并且片段光谱质量精度设定为0.6 da。使用MSQUANT重新校准已鉴定的肽(
      • Mortensen P.
      • gouw J.W.
      • 奥尔森J.V.
      • ong s.e.
      • Rigbolt K.T.
      • Bunkenborg J.
      • Cox J.
      • 福斯特L.J.
      • Heck A.J.
      • Blagoev B.
      • 安德森J.S.
      MSQUANT,一种基于质谱的定量蛋白质组学的开源平台。
      ),并使用MGFCombiner(1.05版)组合结果,并使用吉祥物2.0再次使用上述参数进行搜索,不同之处在于将前体质量容差设定为5ppm。为了确定假肽命中的数量,数据被调整到全长人类MSIPI诱饵数据库,并调整吉祥物肽评分以产生小于1%的误染色鉴定(计算如下:假阳性率(%)=反向击中×2×100 /前进点)。对于待计数的蛋白质,必须测序至少两种独特的肽(粗体红色次数,最小长度为7个氨基酸)并满足确定的标准。为了产生每种鉴定蛋白质的最大肽数,对仅考虑使用全长诱饵数据库识别的蛋白质的诱饵数据库研究数据,并且该蛋白确实通过了上面规定的严格识别标准。因此,可以将肽吉祥物鉴定得分均可滴加至15,导致相当多的肽ID /蛋白质。使用所有粗体红色和括号肽计算PCP硅胶型材。如果在六个级分中的每一个中测序相应的肽,则蛋白质仅包括在产生六个数据点谱中。在几种情况下,肽基于从邻居分析预测的洗脱时间插入。肽通过MSQUANT定量(
      • Mortensen P.
      • gouw J.W.
      • 奥尔森J.V.
      • ong s.e.
      • Rigbolt K.T.
      • Bunkenborg J.
      • Cox J.
      • 福斯特L.J.
      • Heck A.J.
      • Blagoev B.
      • 安德森J.S.
      MSQUANT,一种基于质谱的定量蛋白质组学的开源平台。
      )使用单向异位信号的提取离子色谱图。对于聚类分析,使用基部2对数归一化蛋白质比。
      使用MaxQuant(1.0.13.13)处理并分析GFP下拉数据(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )和吉祥物(2.3版)。 maxquant的量模块与参数设置如下:arg6/ Lys.4 和 Arg10/ Lys.8 作为三氧化硅标记,最多两个错过的切割,过滤MS / MS光谱以仅保留六个最强烈的峰/ 100da,以及0.5Da的MS / MS质量公差。可变修饰是甲硫氨酸氧化和蛋白质氨基 - 末端乙酰化。半胱氨酸氨基甲酰化是固定的改性。蛋白质和肽FDR 0.01,PEP基于吉祥物评分,最低肽长度为6,最小分数为7,最小独特的序列1,最小肽1,使用未修改和修饰肽的蛋白质量化,并使用两者剃刀和独特的肽,用于定量最小比数为2。

       谱分析和比较分析

      使用Gprox聚集蛋白质谱(
      • Rigbolt K.T.
      • Vanselow J.T.
      • Blagoev B.
      GPROX,一种用户友好的生物信息学分析平台和定量蛋白质组学数据的可视化平台。
      )为了鉴定具有类似已知的自噬蛋白的曲线的蛋白质。使用模糊C-means算法(
      • Futschik M.E.
      • 卡莱尔B.
      基因表达时间课程数据的噪声鲁棒软聚类。
      ),这是一种软聚类算法,其具有噪声稳健,并指示蛋白质谱的良好是如何由相应的簇表示的。模糊C-Means参数 m 对于三种刺激的三种刺激,在1.25(RAPA),2.5(HBSS)和3.0(Cona)之间变化,以补偿数据分辨率的差异,并确保自噬复印体簇的最小尺寸。如果将蛋白质与Map1LC3,P62和GABA聚集,则认为蛋白质是自噬。A 受体相关的蛋白质样2(Gabarapl2)。为了测试群集的有效性,需要将主要复合物如核糖体,外出组和位于单簇的蛋白酶(见 补充“实验程序”)。

      结果

       PCP.-Silac的定量质谱分析自血糖素

      广泛的努力集中在涉及自噬信令中涉及的蛋白质网络(
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      )。然而,自噬囊体的蛋白质组成仍然很大程度上是未知的,并且仅鉴定了少数自噬体相关的蛋白质(
      • 高W.
      • 康J.H.
      • 廖Y.
      • 丁w.x.
      • gambotto a.a.
      • Watkins S.C.
      • 刘y.j.
      • STOLZ D.B.
      • 尹凌
      小管状LC3阳性自噬体室的生化分离与表征。
      ,
      • ØverbyeA。
      • Fengsrud M.
      • Seglen P.O.
      大鼠肝自噬蛋白膜相关蛋白蛋白质组学分析。
      )。其中一个是常用的自噬复印体标记LC3-II。在这项研究中,我们利用稳定表达LC3的MCF7乳腺癌细胞融合以增强的绿色荧光蛋白(EGFP-LC3)以遵循三种良好特征刺激后7小时治疗后自噬体的积累, IE。 氨基酸饥饿,雷帕霉素和康丹霉素A(
      • Klionsky D.J.
      • Klionsky D.J.
      • abeliovich h.
      • 藿病虫P.
      • Agrawal D.K.
      • Aliev G.
      • 歪斜D.S.
      • 巴巴米
      • baehrecke e.h.
      • bahr b.a.
      • Ballabio A.
      • 班伯B.A.
      • Bassham D.C.
      • Bergamini E.
      • Bi X.
      • 比亚特 - Piechaczyk M.
      • Blum J.s.
      • 布里德森D.E.
      • Brodsky J.L.
      • Brumell J.H.
      • 粗鲁的U.T.
      • 卷发W.
      • Camougrand N.
      • Cebollero E.
      • Ceconi F.
      • 陈Y.
      • 下巴L.S.
      • Choi A.
      • 楚C.T.
      • Chung J.
      • 克拉克P.G.
      • 克拉克R.S.
      • 克拉克斯。
      • ClavéC.
      • 克利夫兰J.L.
      • Codogno P.
      • 科伦坡M.I.
      • Coto-Montes A.
      • Cregg J.M.
      • Cuervo上午
      • Debnath J.
      • Demarchi F.
      • 丹尼斯P.B.
      • 丹尼斯P.A.
      • 遗传五。
      • devenish r.j.
      • di sano f.
      • 骰子J.F.
      • Digiglia M.
      • Dinesh-Kumar S.
      • Distelst C.W.
      • djavaheri-mergny m.
      • DORSEY F.C.
      • Drögew.
      • 德隆M.
      • Dunn Jr.,W.A.
      • Duszenko M.
      • eissa n.t.
      • Elazar Z.
      • Esclatine A.
      • Eskelinen E.L.
      • FésüsL.
      • 芬利K.D.
      • Fuentes J.M.
      • Fueyo J.
      • 富士崎K.
      • Galliot B.
      • 高级。
      • Gewirtz D.A.
      • 吉布森S.B.
      • Gohla A.
      • Goldberg A.L.
      • Gonzalez R.
      • González-estévezz
      • 戈斯基S.
      • gottliebr.a.
      • Häussingerd。
      • 他是的。
      • Heidenreich K.
      • 山J.A.
      • Høyer-hansen M.
      • 胡X.
      • 黄温
      • Iwasaki A.
      • jäätteläm。
      • 杰克逊W.T.
      • 江X.
      • 金斯。
      • 约翰森T.
      • Jung J.u.
      • kadowaki m.
      • 康C.
      • Kelekar A.
      • 凯斯尔D.H.
      • Kiel J.A.
      • 金H.P.
      • 泡菜A.
      • kinsella t.j.
      • Kiselyov K.
      • Kitamoto K.
      • knecht E.
      • 小松M.
      • kominamie。
      • kondo s。
      • Kovácsa.l.
      • kroemer g.
      • kuan c.y.
      • Kumar R.
      • 隆都M.
      • 兰德里J.
      • Laporte M.
      • 莱赫。
      • Lenardo M.J.
      • Levine B.
      • 利伯曼A.
      • Lim K.L.
      • 林F.C.
      • 刘德
      • Liu L.F.
      • Lopez-Berestein G.
      • lópez-otínc。
      • 卢B.
      • Macleod K.F.
      • Malorni W.
      • 马提内特W.
      • Matsuoka K.
      • Mautner J.
      • Meijer A.J.
      • MeléndezA.
      • Michels P.
      • Miotto G.
      • Mistiaen W.P.
      • Mizushima N.
      • 莫格拉比B.
      • Monastyrska I.
      • 摩尔M.N.
      • 更多的ira p.i.
      • 莫里萨苏Y.
      • Motyl T.
      • MünzC.
      • 墨菲L.O.
      • naqvi n.i.
      • Neufeld T.P.
      • Nishino I.
      • 尼克松R.A.
      • Noda T.
      • NürnbergB.
      • Ogawa M.
      • Oleinick N.L.
      • olsen l.j.
      • Ozpolat B.
      • Paglin S.
      • Palmer G.E.
      • Papassideri I.
      • 帕克斯米
      • perlmuter d.h.
      • 佩里G.
      • Piacentini M.
      • Pinkas-Kramarski R.
      • Prescott M.
      • Proikas-Cezanne T.
      • raben n.
      • 拉米A.
      • Reggiori F.
      • Rohrer B.
      • Rubinsztein D.C.
      • Ryan K.M.
      • 萨文玛J.
      • Sakagami H.
      • Sakai Y.
      • Sandri M.
      • Sasakawa C.
      • Sass M.
      • 施耐德C.
      • Seglen P.O.
      • Seleverstov O.
      • Settleman J.
      • Shacka J.J.
      • Shapiro i.M.
      • Sibirny A.
      • Silva-Zacarin e.c.
      • 西蒙H.U.
      • Simone C.
      • 西蒙森A.
      • 史密斯M.A.
      • Spanel-Borowski K.
      • Srinivas V.
      • st
      • 捷卡H.
      • stromhaug p.e.
      • Subauste C.S.
      • Sugimoto S.
      • 苏尔寿D.
      • 铃木T.
      • Swanson M.S.
      • Tabas I.
      • Takeshita F.
      • Talbot N.J.
      • tallóczyz.
      • Tanaka K.
      • Tanaka K.
      • Tanida I.
      • 泰勒G.S.
      • 泰勒J.P.
      • Terman A.
      • TETTAMANTI G.
      • 汤普森C.B.
      • 捶打
      • Tolkovsky上午
      • 太太S.A.
      • 逃学r.
      • tumanovska l.v.
      • Uchiyama Y.
      • Ueno T.
      • Uzcáteguin.l.
      • van der Klei I.
      • vaquero e.c.
      • Vellai T.
      • Vogel M.W.
      • 王H.G.
      • 韦伯斯特P.
      • Wiley J.W.
      • XI Z.
      • 肖G.
      • yahalom J.
      • 杨梅。
      • 哟g。
      • 尹凌
      • Yoshimori T.
      • yu l.
      • 岳Z.
      • Yuzaki M.
      • Zabirnyk O.
      • 郑X.
      • 朱克。
      • 阻止R.L.
      用于监测高真核生物中的自噬的使用和解释的指导方针。
      )(Fig. 1, AB)。然后使用该实验系统表征自噬蛋白的刺激依赖性蛋白质组成和使用定量蛋白质组学和遗传分析的组合(Fig. 1A)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1PCP.-SILAC对自噬体分析。 A,进行鉴定和表征与自噬蛋白相关的蛋白质进行的实验的示意性概要。 B,通过荧光显微镜测试MCF7-EGFPLC3细胞中自噬体的积累。代表的共焦图像(尺度条将20μm)显示为未处理的细胞(控制, Ctrl.)或用1μ处理m rapa. and 2 nm Cona或饥饿的HBSS持续7小时。值得注意的是,表达EGFP-LC3-G120A的突变形式的细胞不能成为脂质缀合的细胞在刺激时未形成点(数据未示出),强烈表明观察到的点是自噬体而不是非特异性聚集体。 C,为了使用PCP-SILAC方法鉴定自噬体相关的蛋白质,细胞是标记的同位素,随后用2N待处理7小时m Cona。通过梯度离心纯化自噬体,收集六个级分,液体0/ arg.0 组合级分,在梯度上产生蛋白质的内标混合物。该内标在1:1的比例分布到原始LYS4/ arg.6 标记的级分,并通过SDS-PAGE,由胰蛋白酶消化的凝胶分离,并由MS分析。使用100 n重复实验m 雷帕霉素和HBSS中的饥饿作为刺激。应用此设置,我们能够通过180 LC-MS / MS / MS实验识别7935蛋白,每长140分钟。 D,LC3肽FLVPDHVNMMSELIK的质谱显示信号双峰的同位素包膜,其代表PCP-SILAC实验中的梯度相对富集。这 彩色圈子 代表各自的氧化渣标签。 E,PCP-SILAC蛋白质富集谱与抗EGFP蛋白质印迹与饥饿(HBSS)的生物重复的抗EPFP蛋白质印迹分析或用CONA或雷帕霉素处理7小时。显示是EGFP-LC3-I(上行)和EGFP-LC3-II(下行)乐队。两种实验表明级分2和3中的自噬粒峰。 FR., 分数。
      为了区分自噬复印体候选蛋白,我们施加了PCP-SILAC方法(
      • 安德森J.S.
      细胞细胞蛋白质组学:将库存转化为见解。
      ,
      • jakobsen l.
      • Vanselow K.
      • 麻烦M.
      • 丰田Y.
      • Lundberg E.
      • Poser I.
      • Falkenby L.G.
      • 本网站
      • Westendorf J.
      • nigg e.a.
      • Uhlen M.
      • Hyman A.A.
      • 安德森J.S.
      通过互补蛋白质组学方法鉴定的人体中心的新颖性分析组分。
      )。该方法基于假设驻留在同一细胞器中的蛋白质通过密度梯度具有类似的分布。如概述 Fig. 1C,从用同位素编码的赖氨酸和精氨酸的不同组合标记的MCF7-EGFP-LC3细胞并联分离自噬体的两次制备(
      • Blagoev B.
      定量蛋白质组学研究丝裂原激活蛋白激酶。
      )。通过Western印迹分析测试在最终碘烷醇密度梯度离心(1.05-1.25g / ml碘依克隆)后收集的级分(1.05-1.25g / ml碘烷醇),通过Western印迹分析(Fig. 1E补充图。S1)。对于肽同位素的比例测定,组合含有从未标记的细胞的自噬体标记物的六个部分,以产生常见的内标,该常见的内标是从标记的细胞中分布到相应的六个级分中。然后通过LC-MS分析这六个样品中的蛋白质,并使用所得的数据来确定每个馏分中的蛋白质的相对富集(Fig. 1D)。 EGFP-LC3的LC3和蛋白质印迹分析的蛋白质富集谱表明,无论刺激,大多数自噬体都出现在级分2和3中(Fig. 1E)。相比之下,用于其他细胞器的标记蛋白显示明显不同的曲线(补充图S1B)。总共,在三种刺激中的每种刺激中的单个代表性PCP-SILAC实验中鉴定了7935个蛋白质(来自总组的一个康那霉素A实验,两个雷帕霉素实验和两个饥饿实验; 补充图S2)。在所有六个部分中检测到4516个蛋白质的完全蛋白质富集曲线(补充图。S2和表S1-S3)。将这些4516个蛋白质基于使用噪声鲁棒模糊C算法(
      • Futschik M.E.
      • 卡莱尔B.
      基因表达时间课程数据的噪声鲁棒软聚类。
      )。簇在级分2和3中达到峰值,包括已知的自噬蛋白,例如LC3,P62(SQSTM1)和GabaraPL2(图。 2A补充图S2)。簇B含有蛋白质,其在级分2和3中也达到峰值,但显示额外的级别升高6.簇C包括达到级分5和6的蛋白质,并且被认为是非特异性共纯化蛋白质。自噬菌体簇(簇A)从康那霉素治疗,雷帕霉素处理和饥饿的细胞分别含有238,359和482个蛋白质谱( 补充表S1-S3)。这些型材代表728种不同的蛋白质,其中三种刺激的自噬体组中发现了94个(表I.Fig. 2B)。为了支持PCP-SILAC方法,我们鉴定了94个蛋白质中的42个蛋白质,其已知的自噬体蛋白或最近报道的自噬相关蛋白的相互作用伴侣(表I.补充表S4)。鉴定脑(RHEB)中富含FK506结合蛋白1(FKBP1A)和RAS同源物等自噬调节剂的鉴定表明它们在自噬体脚手架上运行。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2PCP.-SILAC数据的集群分析。 A,从Cona处理细胞PCP-SILAC实验中获得的蛋白质富集谱的聚类分析。使用模糊C型算法分别由238,273和285个蛋白组成三种簇。簇A含有已知与自噬体相关的所有已识别的蛋白质。蛋白质富集谱的群集成员值表明由此表示 颜色刻度。从HBSS-和RAPA处理细胞的PCP-Silac实验中蛋白质富集谱的聚类分析 . B,簇的Venn图是从HBSS,Rapa-和Cona处理的细胞中鉴定的蛋白质。虽然94个蛋白共常见的三种刺激,但只有一个或两种刺激检测大部分蛋白质。所示是五个生物重复的三组代表性数据集。 C基于基因本体学的簇A-C常见蛋白质的亚细胞定位。
      表I.酵母菌菌中的自噬菌株涉及常见的自噬甙相关蛋白的基因的原肠病缺陷
      蛋白质基因ID(人)酵母直播自噬活动
      a 通过碱性磷酸酶(ALP)活性测定来测量。值表示三倍体,并指示标准偏差。以粗体型标记的数字表示与随机选择的控制KO菌株相比,ALP测定值的显着变化(p <0.05,单向方差分析)。
      参考
      d 引用了先前在自噬体中描述的蛋白质。
      EGFP-IP.
      e 除了Cancanamycin A之外,用HBSS或雷帕霉素处理的细胞中的一种(+)或两(++)EGFP-IPS鉴定。
      氮饥饿
      b 氮饥饿(3小时)。
      雷帕霉素
      c 雷帕霉素处理(0.5μg/ ml; 3小时)。
      alanyl trna合成酶AARS.ALA1
      f 敲除菌株不可行。
      +
      Annexin A4ANXA4
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      Annexin A5ANXA5
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      ++
      原座1ARCN1RET2
      f 敲除菌株不可行。
      ++
      ADP-核糖基化因子1ARF1ARF2126.1±16.0.
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      ++
      Agininosuccinate合成酶1ASS1ARG1115.8±11.6.++
      5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸甲酰基转移酶/ IMP环烃酶aticADE1799.7±13.5.
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      Biliverdin还原酶B.BLVRB.++
      γ-戊二基循环转移酶C7ORF24
      钙环结合蛋白Cacybp.
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      +
      Calpain,小亚基1CAPNS1
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      +
      含有TCP1,亚基2的伴侣素2CCT2CCT2
      f 敲除菌株不可行。
      ++
      含有TCP1,亚基5的伴侣素CCT5CCT5
      f 敲除菌株不可行。
      ++
      含有TCP1,亚基8的伴侣素CCT8CCT8
      f 敲除菌株不可行。
      ++
      Cofilin 1.CFL1COF1
      f 敲除菌株不可行。
      ++
      染色质修饰蛋白6CHMP6
      Coatomer蛋白复合物,亚单位ζ1COPZ1RET3
      f 敲除菌株不可行。
      +
      COPINE III.CPNE3
      细胞视黄酸结合蛋白2CRABP2+
      胱抑素B.CSTB.
      毁坏DSTN.++
      真核翻译伸长因子1γEEF1GTEF456.2±16.3.84.3±19.1.++
      真核翻译伸长因子2EEF2EFT2104.5±23.2.++
      enolase 1ENO1ENO195.8±38.0.
      • ØverbyeA。
      • Fengsrud M.
      • Seglen P.O.
      大鼠肝自噬蛋白膜相关蛋白蛋白质组学分析。
      h 大鼠ortholog。
      ++
      脂肪酸合成酶Fasn.CEM1101.4±14.2.++
      果糖-1,6-双磷酸酶1FBP1FBP199.2±16.9.
      • ØverbyeA。
      • Fengsrud M.
      • Seglen P.O.
      大鼠肝自噬蛋白膜相关蛋白蛋白质组学分析。
      h 大鼠ortholog。
      +
      FK506结合蛋白4,59 KDAFKBP4FPR186.2±17.0.
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      +
      葡萄糖-6-磷酸脱氢酶G6PDZWF1108.3±12.8.++
      加布A 受体相关蛋白质2gabarapl2.ATG826.1±21.4.44.7±26.3.
      • Kabeya Y.
      • Mizushima N.
      • Yamamoto A.
      • Oshitani-Okamoto S.
      • ohsumi Y.
      • Yoshimori T.
      LC.3,Gabarap和Gate16根据形式II形成定位于自噬体膜。
      +
      GDP解离抑制剂2GDI2
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      ++
      鸟嘌呤核苷酸结合蛋白,β多肽2状1GNB2L1ASC1148.0±21.5.210.7±43.1.+
      葡萄糖磷酸异构酶GPI.PGI1
      f 敲除菌株不可行。
      ++
      谷胱甘肽还原酶GSR.GLR190.7±9.1.
      缺氧磷磷酰基转移酶1HPRT1+
      热休克蛋白90-KDAα,A级成员1HSP90AA1.HSC82100.0±15.9.++
      热休克蛋白90-KDAα,B类成员1hsp90ab1.HSP8290.6±6.8.++
      热休克27-KDA蛋白1HSPB1++
      Kiaa1609.Kiaa1609.++
      LIM和SH3蛋白1LASP1
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      +
      凝集素,半乳糖糖苷结合,可溶性,3LGALS3++
      微管相关蛋白1轻链3βmap1lc3b.ATG826.1±21.4.44.7±26.3.
      • Kabeya Y.
      • Mizushima N.
      • Yamamoto A.
      • Oshitani-Okamoto S.
      • ohsumi Y.
      • Yoshimori T.
      LC.3,Gabarap和Gate16根据形式II形成定位于自噬体膜。
      苹果酸脱氢酶1MDH1
      • ØverbyeA。
      • Fengsrud M.
      • Seglen P.O.
      大鼠肝自噬蛋白膜相关蛋白蛋白质组学分析。
      h 大鼠ortholog。
      巨噬细胞迁移抑制因子MIF.++
      嘌呤核苷磷酸化酶NP.PNP146.0±5.930.1±10.6
      氨肽酶,嘌呤霉素敏感NP.EPPS.AAP1101.4±34.4.
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      +
      血小板活化因子乙酰水溶液1b,催化亚基3pafah1b3.
      聚(RC) - 粘连蛋白1PCBP1PBP2103.4±8.8
      • 高W.
      • 康J.H.
      • 廖Y.
      • 丁w.x.
      • gambotto a.a.
      • Watkins S.C.
      • 刘y.j.
      • STOLZ D.B.
      • 尹凌
      小管状LC3阳性自噬体室的生化分离与表征。
      ++
      磷脂酰乙醇胺结合蛋白1PEBP1
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      +
      Profilin 1PFN1PFY1
      f 敲除菌株不可行。
      ++
      Profilin 2.PFN2
      磷酸糖苷脱氢酶PGD​​.GND1111.5±25.2.
      磷酸性脱氢酶PHGDH.SER3398.7±31.8.++
      丙酮酸激酶,肌肉PKM2CDC19
      f 敲除菌株不可行。
      ++
      肽基脯氨酰异构酶A.PPIA.CPR194.9±16.3.
      • ØverbyeA。
      • Fengsrud M.
      • Seglen P.O.
      大鼠肝自噬蛋白膜相关蛋白蛋白质组学分析。
      h 大鼠ortholog。
      ++
      蛋白质磷酸酶3,催化亚单元,α同种型PPP3CACMP2102.7±11.1. +
      过氧杂志1PRDX1TSA196.8±11.6.
      • ØverbyeA。
      • Fengsrud M.
      • Seglen P.O.
      大鼠肝自噬蛋白膜相关蛋白蛋白质组学分析。
      h 大鼠ortholog。
      ++
      过氧杂志2PRDX2TSA196.8±11.6.
      • ØverbyeA。
      • Fengsrud M.
      • Seglen P.O.
      大鼠肝自噬蛋白膜相关蛋白蛋白质组学分析。
      h 大鼠ortholog。
      ++
      过氧杂志6.PRDX6PRX190.9±6.0
      • ØverbyeA。
      • Fengsrud M.
      • Seglen P.O.
      大鼠肝自噬蛋白膜相关蛋白蛋白质组学分析。
      h 大鼠ortholog。
      ++
      蛋白酶体亚基,α型,2PSMA2PRE8
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      +
      蛋白酶体亚基,α型,3PSMA3PRE10
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      蛋白酶体亚基,α型,5PSMA5PUP2
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      +
      蛋白酶体亚基,α型,6PSMA6SCL1
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      +
      蛋白酶体亚基,α型,7PSMA7PRE6
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      +
      蛋白酶体亚基,β型,1PSMB1PRE7
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      蛋白酶体亚基,β型,2PSMB2PRE1
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      +
      蛋白酶体亚基,β型,3PSMB3PUP3
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      蛋白酶体亚基,β型,4PSMB4PRE4
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      蛋白酶体亚基,β型,5PSMB5PRE2
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      蛋白酶体亚基,β型,6PSMB6PRE3
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      蛋白酶体亚基,β型,7PSMB7PUP1
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      蛋白酶体26s亚基,ATP酶,6PSMC6RPT4
      f 敲除菌株不可行。
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      蛋白酶体活化剂亚基1PSME1
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      ++
      蛋白酶体活化剂亚基2PSME2
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      ++
      Ras Homolog富含大脑1Rheb.1RHB136.3±11.1.37.2±4.2
      • 斯科特·罗克
      • Schuldiner O.
      • Neufeld T.P.
      饥饿诱导的自噬的作用和调节 果蝇 fat body.
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      核糖体蛋白S21RPS21RPS21B85.5±4.3
      核糖体蛋白SArpsa.RPS0A90.8±32.7.+
      S100钙结合蛋白A11S100A11++
      S100钙结合蛋白A13S100A13
      SH3结构域结合富含谷氨酸的蛋白质SH3BGRL.
      封粒剂1SQSTM1
      • Bjørkøyg。
      • 拉马克T.
      • 布里奇A.
      • 偏出H.
      • 佩兰特M.
      • overvatn A.
      • 捷卡H.
      • 约翰森T.
      P62 / SQSTM1形成蛋白质聚集体通过自噬降解,对亨廷汀诱导的细胞死亡具有保护作用。
      ++
      亚硫酸盐合成酶SRM.SPE3119.1±23.1.
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      应激诱导磷蛋白1STIP1STI1113.4±24.3.++
      肿瘤蛋白D52样2TPD52L2++
      Triosephosphate异构酶1TPI1TPI1
      f 敲除菌株不可行。
      ++
      管蛋白,βtubTUB2
      f 敲除菌株不可行。
      ++
      管蛋白,β2ctub2C++
      ThioredoxinTXN.TRX2101.2±29.7.+
      硫昔林还原酶1TXN.RD1
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      泛素样改性剂活化酶1UBE1UBA1
      f 敲除菌株不可行。
      泛素缀合酶E2NUBE2NUBC13106.5±19.4++
      色氨酸-TRNA合成酶战争WRS1
      f 敲除菌株不可行。
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      +
      酪氨酸3-单氧基酶/色氨酸5-单氧基酶活化蛋白,β多肽YWHAB.
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      ++
      酪氨酸3-单氧基酶/色氨酸5-单氧基酶活化蛋白,Ⅳ多肽Ywhaz.BMH298.7±20.7++
      锌和戒指手指2ZNRF2
      与自噬复印体簇相关的其他蛋白质
          帽,腺苷酸环酶相关蛋白1CAP1SRV250.4±11.1.42.4±10.4++
          真空蛋白质分选35个同源物VPS35VPS3512.4±3.236.3±21.1.++
      a 通过碱性磷酸酶(ALP)活性测定来测量。值表示三倍体,并指示标准偏差。以粗体型标记的数字表示与随机选择的控制KO菌株相比,ALP测定值的显着变化(p <0.05,单向方差分析)。
      b 氮饥饿(3小时)。
      c 雷帕霉素处理(0.5μg/ ml; 3小时)。
      d 引用了先前在自噬体中描述的蛋白质。
      e 除了Cancanamycin A之外,用HBSS或雷帕霉素处理的细胞中的一种(+)或两(++)EGFP-IPS鉴定。
      f 敲除菌株不可行。
      g 相关的蛋白质,但到目前为止没有与自噬瘤相关联。
      h 大鼠ortholog。
      使用基因本体(
      • ashburner m.
      • 球C.A.
      • 布莱克J.A.
      • Botstein D.
      • 巴特勒H.
      • 樱桃准晚
      • 戴维斯A.P.
      • Dolinski K.
      • 德怀特S.S.
      • EPPIG J.T.
      • 哈里斯M.A.
      • 山D.P.
      • ISSEL-TARVER L.
      • Kasarskis A.
      • 刘易斯S.
      • Matese J.C.
      • Richardson J.E.
      • Ringwald M.
      • 鲁宾上午
      • Sherlock G.
      基因本体:生物学统一的工具。基因本体组织。
      ),我们分析了独立于自噬体刺激治疗的同一簇中检测到的蛋白质的亚细胞定位。因为蛋白质可以携带多于一种基因本体论术语,所以所有注释蛋白的总和可以高于100%。自噬复印体簇A中的大多数蛋白质被注释为细胞质/细胞溶质(Fig. 2C)。除了细胞质/细胞溶质蛋白外,群体B富含内体隔室,ER,GOLGI,细胞膜和核糖体的蛋白质,而簇C主要包含膜,细胞外和ER蛋白。因此,我们能够通过我们的PCP-SILAC方法区分不同的凹形隔室,并将群体A鉴定为自血糖群。

       免疫纯化自噬体的定量质谱分析

      为了进一步支持簇A中的自噬体相关蛋白质的富集,并将它们与共同迁移的藻结构区分开,我们通过使用抗GFP抗体(proM)通过免疫沉淀从MCF7-EGFP-LC3细胞纯化自噬体(Fig. 3A)(
      • 高W.
      • 康J.H.
      • 廖Y.
      • 丁w.x.
      • gambotto a.a.
      • Watkins S.C.
      • 刘y.j.
      • STOLZ D.B.
      • 尹凌
      小管状LC3阳性自噬体室的生化分离与表征。
      )。通过离心将细胞提取物耗尽,以使非自杀蛋白酶蛋白的结合最小化。通过基于硅酸基质谱法测定特异性自噬体相关的蛋白质,比较来自未处理和饥饿细胞的相对丰度的蛋白质(Fig. 3A)。饥饿诱导高自噬通量(见 Fig. 5C)挑战鉴定亲和纯化的自噬蛋白富集的蛋白质富集。因此,分析了第三种条件:用甘蔗酰霉素A且含有糖霉素A处理的饥饿细胞,通过阻断溶酶体降解导致自噬体的显着积累(Fig. 3A 和数据未显示)。污染蛋白在所有三种条件下同样丰富,因此具有1:1:1的比例,而自噬复印体蛋白如LC3和P62在Cona样品中显示出较高的血糖堆积的比例(补充表S5)。实际上,常见的聚类蛋白质显示出非random分布,与支持自噬蛋白酶的群体B和C蛋白质的群体B和C蛋白相比,显着富集。p < 0.001; Fig. 3, BC, 和 补充图。S3和表S5)。对细胞进行第二个EGFP-IP,无论是用雷帕霉素和CONA治疗的细胞,并证实了聚类蛋白质的富集(补充表S5)。总共65个常见聚类在EGFP下拉中鉴定了蛋白质(表I.)。此外,免疫荧光显微镜检查验证了三种聚类蛋白质P62,RHEB和FKBP1A的共定位,LC3在所有三种刺激之后(Fig. 4补充图S4和S5)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3免疫纯化自噬蛋白鉴定蛋白质。 A,进行的基于氧化硅酸的免疫沉淀实验的示意图,以鉴定和量化HBSS-和Cona治疗的自噬体相关蛋白质(20 nm)与未处理的细胞相比,细胞(3小时)。将裂解物离心以富集自噬体相关的LC3并在使用抗GFP抗体涂覆的磁珠之前释放到亲和力纯化之前的LC3的自由池。 B,图表显示亲和实验中鉴定的蛋白质的相对比(HBSS和Cona 相对 控制,GFP-IP)。从PCP-SILAC实验中鉴定在簇A-C中鉴定的常见蛋白显示非random比率分布。 C,常见的聚类蛋白质显着富集免疫纯化的自噬体(HBSS和Cona 相对 与常见群体B和C蛋白相比(方差单向分析,Tukey Post Hoc测试)相比。 Ctrl., 控制。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5自噬体相关的蛋白质动态。 A,簇的比较通过PCP-SILAC鉴定的蛋白质表明了基于基因本体学分析的RAPA-和CONA治疗和饥饿细胞的刺激依赖性的自噬蛋白蛋白质结合。 B,通过100 n处理的MCF7细胞分离的基于硅酸基于自噬体的自噬体的定量分析直接比较自噬甙组相关蛋白m rapa. or 2 nm Cona或在HBSS中饥饿7小时,比例为1:1:1。每个自噬体组的蛋白质的相对丰度被标准化为Cona同位素信号。显示的是两个生物学重复的组合结果。 C,用1μ处理MCF7细胞的P62水平m rapa. or 2 nm 通过使用GAPDH作为加载对照通过免疫印迹分析CONA或饥饿的HBSS。 D,对处理和分析的细胞的自噬囊体中所指出的附睾的相对丰度 B。显示的是两个生物学重复的组合结果。 E,自噬相关蛋白质动态。从氧化硅酸盐标记细胞中分离自噬体,并在饥饿后的比例为1:1:1,饥饿3,6和12小时。观察到蛋白质依赖的靶向动态。显示的是两个生物学重复的组合结果。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4P62,RHEB和FKBP1A自噬复印体定位验证。 MCF7细胞表达EGFP-LC3(A),DSRED-RHEB(B)或fkbp1a-dsred(C)用2 n处理7小时m Cancanamycin A并用抗P62染色(A)或抗LC3-抗体(BC)。 黄色的 在所有三种情况下观察到表明LC3点和候选蛋白的共定位的染色(尺度条,20μm)。共定位的荧光团谱显示在 。相应蛋白的PCP-SILAC轮廓紧密遵循所示的MAP1LC3B型材 E.

       自噬体蛋白组刺激依赖性和动力学差异

      自噬可以通过广泛的压力刺激引起,涉及不同的信号传导途径。为了评估不同的刺激是否赋予组合物的变化和与自噬粒相关的蛋白质的变化,我们比较了在不同PCP-Silac实验之间的聚类A中鉴定的蛋白质进行了比较并进行了额外的比较和时间定量实验。有趣的是,PCP-SILAC揭示了自噬体组簇中的刺激依赖性蛋白质(Fig. 5A)。例如,饥饿触发与血浆膜蛋白相关的自噬体,类似于雷帕霉素,囊泡蛋白质。这些蛋白质在很大程度上缺乏从康那霉素A处理的细胞纯化的自噬体中。我们将蛋白质丰富的蛋白质与从饥饿的,雷帕霉素处理和康尼霉素治疗细胞分离的自噬体之间进行比较。与雷帕霉素和甘氨酸霉素A诱导的自噬瘤相比,已知已知涉及自噬(如LC3,P62和GabaraPL2)的自噬体显着少于饥饿细胞的自噬体中的大量较小。Fig. 5B补充表S6)。这表明饥饿诱导最高水平的自噬助焊剂,如饥饿细胞中快速耗尽的P62(Fig. 5C)。相反,少数蛋白质包含阑尾家族的几个成员,最丰富的饥饿细胞的自噬体(Fig. 5D)。另一方面的蛋白质蛋白质存在于类似的量,无论刺激如何(Fig. 5B)。
      为了研究蛋白质的募集动态,饥饿的细胞3,6和12小时,分离的自噬体,分析了自噬体相关蛋白丰度的变化(补充表S7)。 P62在分析框架内最快地减少,而蛋白酶蛋白(PSMB1)和例如真核转换伸长因子1γ(EEF1G)显示出轻微增加(Fig. 5E)。这表明自噬体是高度动态结构,其组成受到应力刺激的性质和时序的影响。

       自噬调制蛋白酶体活性

      我们的研究结果表明,自噬机械和蛋白酶是相互联系的(图。 2C5A)。最近提出了两种降级系统之间的相互作用(
      • 拉马克T.
      • 约翰森T.
      自噬:与蛋白酶组合的链接。
      )。然而,由于仍然缺少这两个主要细胞降解途径的连接的详细描述,我们更详细地调查了它们的相互作用。首先,我们通过荧光显微镜和蛋白质印迹分析证实了蛋白酶体蛋白和LC3的刺激无关的部分共定位(Fig. 6, A-J.)。这种与自噬体相关的蛋白酶体20的亚基的证据导致我们推测自噬是否可能降低细胞中的蛋白酶体水平。实际上,全细胞裂解物中的蛋白酶体蛋白的丰度降低,氨基酸饥饿后,重要的是,通过加入3-甲基腺嘌呤,可以通过加入自噬抑制剂(
      • Seglen P.O.
      • 戈登P.B.
      3-甲基腺嘌呤:分离的大鼠肝细胞中的自噬/溶酶体蛋白质降解特异性抑制剂。
      )(Fig. 6K)。因此,通过雷帕霉素或饥饿诱导自噬助焊剂导致蛋白酶体活性的显着降低(Fig. 6L)。值得注意的是,诱因抑制自噬体载体的降解(Fig. 5C),没有影响蛋白酶体活性(Fig. 6L)。此外,通过用抗GFP抗体的免疫沉淀纯化的自噬体,含有抗GFP抗体含有蛋白酶体亚基,其支持其与自噬体的关联。有趣的是,用洗涤剂孵育这些纯化的自噬体废除了蛋白酶体亚基的下拉。这表明蛋白酶体亚基与LC3没有直接相互作用,而是与自噬磁体相关联。相反,通过预期的洗涤剂治疗,用EGFP-LC3拉下P62(Fig. 6M)。总之,这些数据表明,独立于LC3的蛋白酶体与自噬体相关,并且该功能自噬导致蛋白酶体量和活性降低。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6靶向蛋白酶体对自噬体。 广告,使用MCF7-EGFP-LC3细胞中的多克隆抗体可视化20S核心蛋白酶体亚基,其留下未经处理的(对照)或用2 n处理7小时m Cona. or 100 nm RAPA或饥饿的HBSS中的氨基酸。虽然未经处理的对照细胞显示出均匀分布的染色(A),可以在自噬诱导的细胞中检测自噬蛋白 - 蛋白质共定位(B-D.)。 尺度条,20μm。 例如,从两种荧光团的相对强度观察到自噬诱导后的蛋白酶体和自噬物的部分共定位,沿着各个荧光团的相对强度观察 白线 标记为 B-D。 H-J.,通过生物复制(Cona,Rapa和HBSS)的Western印迹分析验证了蛋白酶体蛋白的PCP-Silac谱。示出了20 S核心子单元的带,其在所有三种刺激中遵循MS型材。 K,蛋白酶体亚基的相对丰度通过细胞的基于硅酸基质的质谱法测定,留下或饥饿12小时或没有10米m 3-甲基腺苷的比例为1:1。显示与对照细胞相比的相对变化(检测到的PSMA,PSMB,PSMC和PSMD蛋白的平均比例;该 误差酒吧 表示标准偏差)。 *, p <由一个样本分析的0.01 t 测试。 L,在MCF7细胞的裂解物中分析了未处理(对照)的裂解物中的蛋白酶体活性的变化,或用2 n处理24小时m Cona. or 1 μm RAPA或饥饿的HBSS中的氨基酸。与未处理的对照样品相比,该值是蛋白酶体活性/蛋白质浓度的百分比,并且代表平均值±S.D。来自四个独立实验。 *, p <由一个样本分析的0.01 t 测试。 M,通过使用MCF7-EGFP-LC3细胞未处理(对照)或用2N刺激,通过硅酸基质谱法分析与LC3亲和纯化的自噬粒组合的蛋白酶体相关性。m 康娜7小时。在裂解缓冲液中进行抗GFP免疫沉淀,其具有或不含1%Nonidet P-40。没有洗涤剂,纯化完整的自噬体。在这些条件下,观察到富集蛋白酶体蛋白的富集(检测到的PSMA,PSMB,PSMC和PSMD蛋白和PSMD蛋白的平均比率)类似于P62 / SQSTM1。在洗涤剂存在下,破坏自噬体,并不再与直接结合到LC3如Sqstm1的蛋白质相反富含蛋白质蛋白质。该值代表两个独立实验的平均值±S.D。 Ctrl., 控制。

       常见的自噬体相关蛋白的功能分析

      我们的实验设置不允许我们直接区分货物和核心蛋白。饥饿诱导的LC3易位需要P62(
      • Bjørkøyg。
      • 拉马克T.
      • 布里奇A.
      • 偏出H.
      • 佩兰特M.
      • overvatn A.
      • 捷卡H.
      • 约翰森T.
      P62 / SQSTM1形成蛋白质聚集体通过自噬降解,对亨廷汀诱导的细胞死亡具有保护作用。
      ),我们推测了是否涉及自噬调节的其他候选者是94个常见的自噬体相关蛋白质。为了进一步调查这一点,我们在酵母中进行了正轨屏幕 酿酒酵母酿酒酵母 谁的基因组含有59个原始的人类基因编码的94个常见的自噬体相关蛋白,产生32个可行的敲除菌株(表I.)。此外,我们包括两种涉及囊泡贩运,CAP1和VPS35的蛋白质​​,其存在于三种自噬体组中的一两种或两种中,富集在自噬体下,也产生了可行的酵母敲除菌株。所有菌株均饥饿并通过ALP测定进行自噬反应(
      • Klionsky D.J.
      在酵母中监测自噬:PHO8Delta60测定。
      )指示自噬助焊剂(Fig. 7A)。哺乳动物CAP1酵母直肠菌株缺乏菌株(SRV2),EEF1G(TEF4),LC3(ATG8),NP(PNP1),Rheb(RHB1)和vps35(VPS35)患有显着较低的自噬活性,而哺乳动物GNB2L1的酵母菌菌株缺乏(ASC1)与野生型菌株相比,饥饿后的自噬活性显着更高(Fig. 7A)。除了酵母菌株缺乏 TEF4,当通过雷帕霉素治疗引发自噬时,观察到自噬磁通量的类似变化(Fig. 7B)。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7酵母和哺乳动物细胞新型自噬调节剂的遗传筛。 AB,ALP屏幕 S. Cerevisiae。 在表明中测量ALP活性 S. Cerevisiae. 用于氮气饥饿的敲除菌株(A)或用500ng / ml雷帕霉素治疗(B)3小时。将组氨酸依赖性菌株和ATG7敲除菌株分别用作阴性和阳性对照。与野生型对照菌株相比,该值是ALP活性/μg蛋白的百分比,并且代表平均值±S.D。来自三个独立实验。 *, p < 0.05; **, p <0.005通过单向差异分析,然后是HOC测试最低差异。 C,酵母回报亚基的功能分析。指示的回转酵母敲除菌株被视为 AB。与野生型对照菌株相比,该值是ALP活性/μg蛋白的百分比,并且代表平均值±S.D。来自三个独立实验。 ATG7敲除菌株用作阳性对照。 D通过用QRT-PCR(数据未示出)验证,从MCF7-EGFP-LC3细胞64h裂解64小时的P62和GAPDH(加载控制)的免疫斑分析。将细胞未经处理或用50μm处理m 在收获之前,依托酸或饥饿的氨基酸为16或8小时。实验重复至少三次,结果基本相同。 E,人体候选蛋白的功能分析。 MCF7细胞稳定地表达RLUC-LC3WT或RLUC-LC3G120A 在96孔盘的单独孔中镀层并用指示的siRNA转染。在里面 上图, 50 nm EnduRenTM值 转染后17小时加入,在指示的时间点测量荧光素酶活性。为了 下图, 50 nm EnduRenTM值 转染后加入54小时。两小时后,测量荧光素酶活性(T = 0),细胞未经处理(对照)或用50μ处理m 在指定的时间点测量依托泊苷和荧光素酶活性。实验重复五次,结果是相似的。 F,人体候选蛋白的功能分析。将MCF7-EGFP-LC3细胞未经处理或用50μ处理m 埃托普西蛋白剂6小时。显示了具有超过五个LC3阳性点的绿色细胞横截面百分比的直方图。值表示平均值±S.D.从三到六个独立实验。 *, p value <由双尾未配对分析0.05 t 测试。 Ctrl., 控制; WT., 野生型; mm,模拟处理的对照。
      对于真空蛋白质分选蛋白VPS35观察到的强表型提出了迄今为止的前后复合物在自噬中的未知作用。该复杂的介导从内心子宫到跨roggi网络的逆行运输货物,并由货物选择性亚基VPS26,VPS29和VPS35以及分类Nexin亚基VPS5和VPS17组成(
      • 柯林斯下班
      回报蛋白复合物的结构和功能。
      )。为了证实VPS35的表型数据,我们分析了回报器复合物的附加亚基。有趣的是,亚基VPS29,VPS5和VPS17缺乏缺乏的菌株在饥饿或用雷帕霉素处理的细胞中显示出同样低的自噬活性。这些数据进一步支持酵母中的Tor依赖性自噬需要转换复杂度(Fig. 7C)。
      为了测试哺乳动物细胞中酵母蛋白的自噬调节功能是否在哺乳动物细胞中保存,我们使用RNA干扰耗尽的MCF7细胞,并测量了对照条件下的P62水平,并通过氨基酸饥饿或依托普苷治疗进行自噬诱导,我们最近使用了建立基于荧光素酶的自噬屏幕(
      • Farkas T.
      • Hoyer-Hansen M.
      • Jaattela M.
      基于荧光素酶的测定鉴定新型自噬调节剂的自噬磁体动力学。
      )(Fig. 7D)。在siRNA介导的CAP1,GNB2L1或VPS35的衰竭时没有观察到对照条件下的P62水平的主要差异,而RHEB的耗竭降低了细胞P62水平,表明RHEB siRNA诱导自发的自噬(Fig. 7D 和数据未显示)。因此,两种非诱导的RHEB siRNA增加了通过RLUC-LC3-WT / RLUC-LC3比率的降低来测量的自噬助焊剂G120A (
      • Farkas T.
      • Hoyer-Hansen M.
      • Jaattela M.
      基于荧光素酶的测定鉴定新型自噬调节剂的自噬磁体动力学。
      )(Fig. 7E)通过EGFP-LC3易位增加细胞数量(Fig. 7F)。如预期的对照实验,氨基酸饥饿和依托磷脂的自噬诱导降低了P62的水平,并且依托磷脂降低了RLUC-LC3-WT / RLUC-LC3的比例G120A 并增加用对照siRNA处理的细胞中具有EGFP-LC3易位的细胞数量(Fig. 7, D-F.)。所有这些改变都抑制了两种非正斑siRNA耗尽的细胞中的所有改变(Fig. 7, D-F.和未显示的数据)。有趣的是,ef1g的耗尽也减弱了通过P70S6K磷酸化水平测量的MTORC1的依托钠和饥饿诱导的抑制(补充图S6)。饥饿诱导但不被雷帕霉素诱导的自噬在酵母缺乏效果缺乏EEF1G Ortholog TEF4(Fig. 7, AB)。这表明EEF1G是MTORC1上游自噬信令所需的自噬的正稳压器。

      讨论

      上面提出的数据提供了自噬体相关蛋白质的框架,并有助于表征潜在的细胞过程,调节生物发生和自噬复印的货物选择。采用PCP-SILAC,我们将鉴定的蛋白质在每组织制剂中对三种簇进行了用甘氨酸A,雷帕霉素和HBSS处理的细胞。簇由自噬复印体候选蛋白(聚类a)组成;在自噬体组分和其他细胞器中发现蛋白质,如底糖瘤,ER和GOLGI装置(簇B);和非自动蛋白蛋白,如ER和核蛋白(簇C)。为了进一步调查,我们集中在群体A中观察到的蛋白质。
      本研究之前的自噬蛋白最全面的蛋白质组学分析确定了39和101个蛋白质分别定位于饥饿大鼠肝细胞和人细胞系中的自噬体膜(
      • 高W.
      • 康J.H.
      • 廖Y.
      • 丁w.x.
      • gambotto a.a.
      • Watkins S.C.
      • 刘y.j.
      • STOLZ D.B.
      • 尹凌
      小管状LC3阳性自噬体室的生化分离与表征。
      ,
      • ØverbyeA。
      • Fengsrud M.
      • Seglen P.O.
      大鼠肝自噬蛋白膜相关蛋白蛋白质组学分析。
      )。我们选择了不同的方法,其特征不仅是自噬复印体膜蛋白,而且还表征了自噬复印体蛋白质,以在自噬期间了解有关细胞蛋白酶动态的更多信息。通过这种方法,我们鉴定了728次自噬体候选蛋白,其在自噬体组中发现94,无论刺激如何。我们的数据表明,预先与自噬相关的31种蛋白质也与自噬核糖组合有关,其中蛋白酶体。
      与另外两个报告的数据集的94个常见蛋白的比较揭示了与Øverbye鉴定的自噬体大鼠蛋白共享的七种人矫肌 等等。 (
      • ØverbyeA。
      • Fengsrud M.
      • Seglen P.O.
      大鼠肝自噬蛋白膜相关蛋白蛋白质组学分析。
      )和与高保性鉴定的101种共用的单一蛋白质 等等。 (
      • 高W.
      • 康J.H.
      • 廖Y.
      • 丁w.x.
      • gambotto a.a.
      • Watkins S.C.
      • 刘y.j.
      • STOLZ D.B.
      • 尹凌
      小管状LC3阳性自噬体室的生化分离与表征。
      )。相当小的重叠可能反映刺激,隔离程序,细胞类型和MS方法的差异。 Øverbye. 等等。 未鉴定任何已知的ATG蛋白质,我们确定了两种人ATG8同源物,MAP1LC3B和GABARAPL2的完全蛋白质谱。高 等等。 识别的MAP1LC3B,ATG7和ATG9。我们鉴定了ATG3和ATG4B,并从ATG9A和ATG5检测到单肽。后者蛋白质的丰度对于完全蛋白质谱的提取而言过低,因此从进一步的分析中省略它们。然而,这些蛋白质的部分轮廓非常类似于蛋白质A中的蛋白质曲线(未显示的数据),表明这些ATG也可以如前所述地定位于自噬体(
      • 谢Z.
      • Klionsky D.J.
      自噬体组:核心机械和适应。
      )。一起服用,ATG蛋白似乎是低丰富的,并且不常见的是大规模蛋白质组学研究。对于他们的分析,专用的亲和净化协议似乎更有前途(
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      )。
      通过通过氨基酸饥饿,雷帕霉素诱导的自噬和基底自噬分析来自经历应激诱导的自噬的自噬细胞,其被Cancanamycin A阻断,我们与基本不同条件下的细胞与细胞进行了比较了自噬细胞。这些分析揭示了总是似乎与自噬蛋白和其他似乎以细胞条件相关的方式相关联的其他蛋白质的蛋白质。因此,应激诱导的显微育药物似乎与基础大规模植物不同,并且需要进一步的研究来了解依赖于刺激的货物募集对自噬体。
      我们研究中有趣的发现是蛋白酶体和自噬体之间的关联。过去,蛋白酶体和自噬体/溶酶体途径被认为是离散的降解途径。最近,更近的连接变得更有可能(
      • Engelke R.
      • Becker A.c.
      • 邓布尔J.
      细胞的降解库存:蛋白质组学见解。
      ,
      • 拉马克T.
      • 约翰森T.
      自噬:与蛋白酶组合的链接。
      ,
      • 赵杰。
      • Brault J.J.
      • SCHILD A.
      • CAO P.
      • Sandri M.
      • 肖弗诺州S.
      • Lecker S.H.
      • Goldberg A.L.
      FOXO3协调通过萎缩肌细胞中的自噬/溶酶体和蛋白酶体途径进行激活蛋白质降解。
      ),已经描述了蛋白酶体可以在溶酶体中降解(
      • Cuervo上午
      • 帕尔默A.
      • Rivett A.J.
      • knecht E.
      大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
      )。然而,没有报道任何详细分析这两个降解途径之间的相互作用。在这里,我们表明该蛋白酶在三种刺激上定位于自噬体,并且蛋白酶体的量和活性通过功能自噬显着降低。令人惊讶的是,在自噬过程中随着总体蛋白质降解增加,蛋白酶体与自噬体的缔合物增加。但是,可能存在几种可能的原因。首先,自噬诱导通常与细胞应激和细胞生长降低有关。因此,去除蛋白酶体和随后的蛋白酶体底物的积累,例如细胞素可能有助于细胞周期停滞。我们测试了这一假设,但在自噬诱导后,不能检测细胞裂解物中的细胞周期蛋白D水平增加(数据未显示)。这可能是由于几种补偿机制:1)抑制蛋白质合成的抑制作用在自噬激活期间MTORC1或2)自噬可能降解通常通过蛋白酶除去的蛋白质, 例如 通过去除P62-普适蛋白质聚集体(
      • Korolchuk v.i.
      • Mansilla A.
      • Menzies F.M.
      • Rubinsztein D.C.
      自噬抑制损害泛素 - 蛋白酶体途径底物的降解。
      )。其次,自噬的主要功能之一是保持细胞能量,从而降低多余的蛋白酶,在激活自噬的情况下不需要,并且 德诺维 通过抑制MTORC1最小化的蛋白质合成可以作为能量和氨基酸的重要来源。此外,自糖蛋白酶中蛋白酶体底物的降解可能比蛋白酶体的蛋白水解更低的能量要求。最后但并非最不重要的是,蛋白质可以“帮助”在自噬核糖中降解泛素化/展开的货物。有利于该理论,在自噬体组中检测到PSMA(亚基2,3,5,6和7)和PSMB(亚基1,2,3,4,5,6和7)的若干亚基。因为这些亚基形成“活性蛋白酶体”,所以功能性蛋白酶体络合物似乎是自噬复昔体的。通过PCP-SILAC,免疫荧光和Western印迹(未示出)检测蛋白质缀合的泛素,并通过含有含有自噬蛋白的自噬蛋白的细胞,蛋白质体活性不会降低蛋白酶体活性,进一步支持这一点蛋白质体在这些细胞中积聚。
      我们的数据表明,在我们的案例中可以转移到一个或另一个可以转移的两个降解系统之间存在平衡,导致蛋白酶体活性降低。为了支持这种观念,当通过温度敏感的预1-1或预2-1突变体灭活蛋白酶灭活时,我们观察到酵母中雷帕霉素诱导的自噬水平增加。 Pre1-1 / 2-1双突变体显示协同效应(补充图S7)。蛋白质损伤的增强自噬表明,据此报告的补偿机制(
      • Pandey U.B.
      • 聂z.
      • Batlevi Y.
      • 麦克雷B.A.
      • Ritson G.P.
      • nedelsky n.b.
      • Schwartz S.L.
      • diprospero n.a.
      • 骑士M.A.
      • Schuldiner O.
      • Padmanabhan R.
      • 希尔德米
      • Berry D.L.
      • Garza D.
      • 隆堡C.C.
      • 姚明。
      • baehrecke e.h.
      • 泰勒J.P.
      HDAC6救出神经变性,并提供自动侵入和UPS之间的基本环节。
      )。
      在新的自噬复印体候选蛋白中,我们通过在原始屏幕中未定义的功能性酵母筛网鉴定了六种自噬调节剂 阿格 genes in yeast (
      • Tsukada M.
      • ohsumi Y.
      自噬缺陷突变体的分离与表征 酿酒酵母酿酒酵母.
      )。这种差异可能是由于不同的筛选方法。原始纸张鉴定氮饥饿诱导的自噬缺陷的突变体,作为克隆的克隆比野生型细胞更快地损失活力,并且在液泡中的自噬物体积聚有缺陷。相比之下,我们使用了ALP测定。饥饿诱导的自噬需要需要哺乳动物CAP1,EEF1G,RHEB,NP和VPS35的原位,而缺乏哺乳动物GNB2L1的垂直表道的酵母菌株表现出与野生型菌株相比增加的自噬反应。有趣的是,测试回力复合物的额外亚基揭示了VPS35亚基最初观察到的相同表型。此外,与PCP-SILAC和抗EGFP下拉鉴定的饥饿细胞中的自噬体相关的亚基VPS26。这些数据表明,回报式复合物和逆行传输在自噬中起作用,可能通过递送囊泡或再循环自噬体膜蛋白。
      在人体细胞中施加siRNA敲低,我们观察到EEF1G或RHEB的耗尽细胞后自噬响应的变化。虽然我们没有观察到CAP1,VPS35和GNB2L1耗尽的细胞中自噬水平的任何重大变化,但如果实现了更有效的下调,我们不能排除这些可能具有效果。正如预期的那样,MTORC1活化剂RHEB在人细胞中形成自噬。我们将其识别为自噬蛋白的事实适合我们最近的数据,显示饥饿诱导其降解(
      • 克里斯滕森A.R.
      • Schandorff S.
      • Høyer-hansen M.
      • Nielsen M.O.
      • jäätteläm。
      • 邓布尔J.
      • 安德森J.S.
      饥饿诱导的自噬期间有序细胞器降解。
      ,
      • 邓布尔J.
      • 克里斯滕森A.R.
      • 安德森J.S.
      通过自噬散装散装劣化。
      )。因此,通过自噬去除RhEB可能用作阳性反馈机制,以确保巨大的自噬反应。令人惊讶的是,发现饥饿和雷帕霉素诱导的自噬的酵母中的RHEB的正直。这一争议可以通过与哺乳动物相反,哺乳动物具有两个Rheb同种型,酵母只有一种Rheb类(RHB),其唯一与哺乳动物Rhebs与哺乳动物Rhebs相关,其敲除不会影响TOR的活动(
      • 乌拉诺J.
      • Tabancay A.P.
      • 杨W.
      • Tamanoi F.
      酿酒酵母酿酒酵母 Rheb. G-蛋白参与调节Canavanine抗性和精氨酸吸收。
      )。有趣的是,EEF1G被发现是一个普遍的自噬调节因素。与LC3类似,它位于自噬体中/在自动体验中,并且是该过程所必需的。然而,与LC3相反,它在MTORC1的上游工作。尤其是EEF1G调节MTORC1活性的确切分子机制仍有待揭示。
      总之,我们研究中的细胞素蛋白质组合物的分析突出了自噬脱落光对元素代谢途径的复杂性质,我们只开始理解。从PCP-SILAC数据组装的自噬核糖组相关蛋白的目录并通过自噬体免疫沉淀的交叉检查显示自动蛋白酶体和蛋白酶体系之间的相互作用。此外,我们确定了一种新型自噬体组分,其中发现EEF1G是酵母和人细胞中的自噬调节剂。

      致谢

      我们感谢弗莱堡高级研究所的所有实验生物信息学中心,以及凋亡部门集团成员,尤其是B. Blagoev,P. Mortensen和M. Buck。

      补充材料

      参考

        • kroemer g.
        • jäätteläm。
        细胞死亡控制中的溶酶体和自噬。
        NAT。癌症。 2005; 5: 886-897
        • Mizushima N.
        • Levine B.
        • Cuervo上午
        • Klionsky D.J.
        自噬通过细胞自我消化抗击疾病。
        自然。 2008; 451: 1069-1075
        • Nakatogawa H.
        • 铃木K.
        • kamada y。
        • ohsumi Y.
        自噬机制中的动态与多样性:酵母的课程。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2009; 10: 458-467
        • Engelke R.
        • Becker A.c.
        • 邓布尔J.
        细胞的降解库存:蛋白质组学见解。
        Antioxid。氧化还原信号。 2012;
        • Tsukamoto S.
        • Kuma A.
        • Murakami M.
        • Kishi C.
        • Yamamoto A.
        • Mizushima N.
        自噬对小鼠胚胎的预体开发至关重要。
        科学。 2008; 321: 117-120
        • Kuma A.
        • HATANO M.
        • 松山M.
        • Yamamoto A.
        • Nakaya H.
        • Yoshimori T.
        • ohsumi Y.
        • Tokuhisa T.
        • Mizushima N.
        自噬在新生儿饥饿期间的作用。
        自然。 2004; 432: 1032-1036
        • Rubinsztein D.C.
        细胞内蛋白质降解途径在神经变性中的作用。
        自然。 2006; 443: 780-786
        • Mathew R.
        • KANTANZA-WADSWORTH V.
        • 白e.
        自噬在癌症中的作用。
        NAT。癌症。 2007; 7: 961-967
        • 戈登P.B.
        • Seglen P.O.
        自噬和内吞径的孕妇组合。
        生物学习。 Biophys。 res。安排。 1988; 151: 40-47
        • 芬恩P.F.
        • 骰子J.F.
        蛋白水解和脂肪溶解的饥饿反应。
        营养。 2006; 22: 830-844
        • Klionsky D.J.
        • Cregg J.M.
        • Dunn Jr.,W.A.
        • EMR S.D.
        • Sakai Y.
        • 桑托伊I.v.
        • Sibirny A.
        • Subramani S.
        • 捶打
        • veenhuis m.
        • ohsumi Y.
        酵母自噬相关基因的统一命名。
        开发。细胞。 2003; 5: 539-545
        • ohsumi Y.
        自噬的分子解剖:两种泛素状的系统。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2001; 2: 211-216
        • 杨Z.
        • Klionsky D.J.
        哺乳动物自噬:核心分子机械和信号调节。
        Curr。拍摄。细胞生物。 2010; 22: 124-131
        • 金I.
        • Rodriguez-entiquez S.
        • Lemasters J.J.
        乳化物选择性降解线粒体。
        拱。生物学习。 Biophys。 2007; 462: 245-253
        • 伯纳尔斯S.
        • 麦当劳K.L.
        • 沃尔特P.
        自噬逆损在展开蛋白质反应过程中的内质网膨胀。
        Plos Biol。 2006; 4: e423
        • Dunn Jr.,W.A.
        • Cregg J.M.
        • Kiel J.A.
        • van der klei i.j.
        • oku m.
        • Sakai Y.
        • sibirny a.a.
        • Stasyk O.v.
        • veenhuis m.
        pexophagy:过氧化血剂的选择性自噬。
        自噬。 2005; 1: 75-83
        • 牛皮纸C.
        • 消失A.
        • Sohrmann M.
        • 彼得M.
        通过需要UBP3P / BRE5P泛素蛋白酶的自噬途径在饥饿后选择性地降解成熟的核糖体。
        NAT。细胞生物。 2008; 10: 602-610
        • pohl c.
        • jesthchs.
        自噬中的米德托戒指是细胞因子的后脱落事件。
        NAT。细胞生物。 2009; 11: 65-70
        • 克里斯滕森A.R.
        • Schandorff S.
        • Høyer-hansen M.
        • Nielsen M.O.
        • jäätteläm。
        • 邓布尔J.
        • 安德森J.S.
        饥饿诱导的自噬期间有序细胞器降解。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2008; 7: 2419-2428
        • Ciechorover A.
        蛋白水解:从溶酶体到泛素和蛋白酶体。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2005; 6: 79-87
        • Pandey U.B.
        • 聂z.
        • Batlevi Y.
        • 麦克雷B.A.
        • Ritson G.P.
        • nedelsky n.b.
        • Schwartz S.L.
        • diprospero n.a.
        • 骑士M.A.
        • Schuldiner O.
        • Padmanabhan R.
        • 希尔德米
        • Berry D.L.
        • Garza D.
        • 隆堡C.C.
        • 姚明。
        • baehrecke e.h.
        • 泰勒J.P.
        HDAC6救出神经变性,并提供自动侵入和UPS之间的基本环节。
        自然。 2007; 447: 859-863
        • Korolchuk v.i.
        • Mansilla A.
        • Menzies F.M.
        • Rubinsztein D.C.
        自噬抑制损害泛素 - 蛋白酶体途径底物的降解。
        摩尔。细胞。 2009; 33: 517-527
        • 牛皮纸C.
        • 彼得M.
        • 霍夫曼K.
        选择性自噬:泛素介导的识别和超越。
        NAT。细胞生物。 2010; 12: 836-841
        • 拉马克T.
        • 约翰森T.
        自噬:与蛋白酶组合的链接。
        Curr。拍摄。细胞生物。 2010; 22: 192-198
        • Zimmermann A.c.
        • Zarei M.
        • 艾丽泰州S.
        • 邓布尔J.
        用于分析自噬期间时空蛋白质动态的定量蛋白质组学。
        自噬。 2010; 6: 1009-1016
        • 安德森J.S.
        • Wilkinson C.J.
        • 市长T.
        • Mortensen P.
        • nigg e.a.
        蛋白质相关性分析蛋白质组学表征人中子组。
        自然。 2003; 426: 570-574
        • 邓布尔J.
        • Kratchmarova I.
        • Blagoev B.
        受体酪氨酸激酶信号传导:来自定量蛋白质组学的视图。
        摩尔。 Biosyst。 2009; 5: 1112-1121
        • ong s.e.
        • Blagoev B.
        • Kratchmarova I.
        • 克里斯滕森D.B.
        • 斯丁H.
        • Pandey A.
        细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2002; 1: 376-386
        • Klionsky D.J.
        在酵母中监测自噬:PHO8Delta60测定。
        方法mol。 BIOL。 2007; 390: 363-371
        • Farkas T.
        • Hoyer-Hansen M.
        • Jaattela M.
        基于荧光素酶的测定鉴定新型自噬调节剂的自噬磁体动力学。
        自噬。 2009; 5: 1018-1025
        • Klionsky D.J.
        • Klionsky D.J.
        • abeliovich h.
        • 藿病虫P.
        • Agrawal D.K.
        • Aliev G.
        • 歪斜D.S.
        • 巴巴米
        • baehrecke e.h.
        • bahr b.a.
        • Ballabio A.
        • 班伯B.A.
        • Bassham D.C.
        • Bergamini E.
        • Bi X.
        • 比亚特 - Piechaczyk M.
        • Blum J.s.
        • 布里德森D.E.
        • Brodsky J.L.
        • Brumell J.H.
        • 粗鲁的U.T.
        • 卷发W.
        • Camougrand N.
        • Cebollero E.
        • Ceconi F.
        • 陈Y.
        • 下巴L.S.
        • Choi A.
        • 楚C.T.
        • Chung J.
        • 克拉克P.G.
        • 克拉克R.S.
        • 克拉克斯。
        • ClavéC.
        • 克利夫兰J.L.
        • Codogno P.
        • 科伦坡M.I.
        • Coto-Montes A.
        • Cregg J.M.
        • Cuervo上午
        • Debnath J.
        • Demarchi F.
        • 丹尼斯P.B.
        • 丹尼斯P.A.
        • 遗传五。
        • devenish r.j.
        • di sano f.
        • 骰子J.F.
        • Digiglia M.
        • Dinesh-Kumar S.
        • Distelst C.W.
        • djavaheri-mergny m.
        • DORSEY F.C.
        • Drögew.
        • 德隆M.
        • Dunn Jr.,W.A.
        • Duszenko M.
        • eissa n.t.
        • Elazar Z.
        • Esclatine A.
        • Eskelinen E.L.
        • FésüsL.
        • 芬利K.D.
        • Fuentes J.M.
        • Fueyo J.
        • 富士崎K.
        • Galliot B.
        • 高级。
        • Gewirtz D.A.
        • 吉布森S.B.
        • Gohla A.
        • Goldberg A.L.
        • Gonzalez R.
        • González-estévezz
        • 戈斯基S.
        • gottliebr.a.
        • Häussingerd。
        • 他是的。
        • Heidenreich K.
        • 山J.A.
        • Høyer-hansen M.
        • 胡X.
        • 黄温
        • Iwasaki A.
        • jäätteläm。
        • 杰克逊W.T.
        • 江X.
        • 金斯。
        • 约翰森T.
        • Jung J.u.
        • kadowaki m.
        • 康C.
        • Kelekar A.
        • 凯斯尔D.H.
        • Kiel J.A.
        • 金H.P.
        • 泡菜A.
        • kinsella t.j.
        • Kiselyov K.
        • Kitamoto K.
        • knecht E.
        • 小松M.
        • kominamie。
        • kondo s。
        • Kovácsa.l.
        • kroemer g.
        • kuan c.y.
        • Kumar R.
        • 隆都M.
        • 兰德里J.
        • Laporte M.
        • 莱赫。
        • Lenardo M.J.
        • Levine B.
        • 利伯曼A.
        • Lim K.L.
        • 林F.C.
        • 刘德
        • Liu L.F.
        • Lopez-Berestein G.
        • lópez-otínc。
        • 卢B.
        • Macleod K.F.
        • Malorni W.
        • 马提内特W.
        • Matsuoka K.
        • Mautner J.
        • Meijer A.J.
        • MeléndezA.
        • Michels P.
        • Miotto G.
        • Mistiaen W.P.
        • Mizushima N.
        • 莫格拉比B.
        • Monastyrska I.
        • 摩尔M.N.
        • 更多的ira p.i.
        • 莫里萨苏Y.
        • Motyl T.
        • MünzC.
        • 墨菲L.O.
        • naqvi n.i.
        • Neufeld T.P.
        • Nishino I.
        • 尼克松R.A.
        • Noda T.
        • NürnbergB.
        • Ogawa M.
        • Oleinick N.L.
        • olsen l.j.
        • Ozpolat B.
        • Paglin S.
        • Palmer G.E.
        • Papassideri I.
        • 帕克斯米
        • perlmuter d.h.
        • 佩里G.
        • Piacentini M.
        • Pinkas-Kramarski R.
        • Prescott M.
        • Proikas-Cezanne T.
        • raben n.
        • 拉米A.
        • Reggiori F.
        • Rohrer B.
        • Rubinsztein D.C.
        • Ryan K.M.
        • 萨文玛J.
        • Sakagami H.
        • Sakai Y.
        • Sandri M.
        • Sasakawa C.
        • Sass M.
        • 施耐德C.
        • Seglen P.O.
        • Seleverstov O.
        • Settleman J.
        • Shacka J.J.
        • Shapiro i.M.
        • Sibirny A.
        • Silva-Zacarin e.c.
        • 西蒙H.U.
        • Simone C.
        • 西蒙森A.
        • 史密斯M.A.
        • Spanel-Borowski K.
        • Srinivas V.
        • st
        • 捷卡H.
        • stromhaug p.e.
        • Subauste C.S.
        • Sugimoto S.
        • 苏尔寿D.
        • 铃木T.
        • Swanson M.S.
        • Tabas I.
        • Takeshita F.
        • Talbot N.J.
        • tallóczyz.
        • Tanaka K.
        • Tanaka K.
        • Tanida I.
        • 泰勒G.S.
        • 泰勒J.P.
        • Terman A.
        • TETTAMANTI G.
        • 汤普森C.B.
        • 捶打
        • Tolkovsky上午
        • 太太S.A.
        • 逃学r.
        • tumanovska l.v.
        • Uchiyama Y.
        • Ueno T.
        • Uzcáteguin.l.
        • van der Klei I.
        • vaquero e.c.
        • Vellai T.
        • Vogel M.W.
        • 王H.G.
        • 韦伯斯特P.
        • Wiley J.W.
        • XI Z.
        • 肖G.
        • yahalom J.
        • 杨梅。
        • 哟g。
        • 尹凌
        • Yoshimori T.
        • yu l.
        • 岳Z.
        • Yuzaki M.
        • Zabirnyk O.
        • 郑X.
        • 朱克。
        • 阻止R.L.
        用于监测高真核生物中的自噬的使用和解释的指导方针。
        自噬。 2008; 4: 151-175
        • Behrends C.
        • Sowa M.E.
        • Gygi S.P.
        • 哈珀J.W.
        人类自噬系统的网络组织。
        自然。 2010; 466: 68-76
        • 高W.
        • 康J.H.
        • 廖Y.
        • 丁w.x.
        • gambotto a.a.
        • Watkins S.C.
        • 刘y.j.
        • STOLZ D.B.
        • 尹凌
        小管状LC3阳性自噬体室的生化分离与表征。
        J. Biol。化学。 2010; 285: 1371-1383
        • ØverbyeA。
        • Fengsrud M.
        • Seglen P.O.
        大鼠肝自噬蛋白膜相关蛋白蛋白质组学分析。
        自噬。 2007; 3: 300-322
        • 安德森J.S.
        细胞细胞蛋白质组学:将库存转化为见解。
        Embo Rep。 2006; 7: 874-879
        • jakobsen l.
        • Vanselow K.
        • 麻烦M.
        • 丰田Y.
        • Lundberg E.
        • Poser I.
        • Falkenby L.G.
        • 本网站
        • Westendorf J.
        • nigg e.a.
        • Uhlen M.
        • Hyman A.A.
        • 安德森J.S.
        通过互补蛋白质组学方法鉴定的人体中心的新颖性分析组分。
        Embo J. 2011; 30: 1520-1535
        • Blagoev B.
        定量蛋白质组学研究丝裂原激活蛋白激酶。
        方法。 2006; 40: 243-250
        • Futschik M.E.
        • 卡莱尔B.
        基因表达时间课程数据的噪声鲁棒软聚类。
        J. Bioinform。计算。 BIOL。 2005; 3: 965-988
        • ashburner m.
        • 球C.A.
        • 布莱克J.A.
        • Botstein D.
        • 巴特勒H.
        • 樱桃准晚
        • 戴维斯A.P.
        • Dolinski K.
        • 德怀特S.S.
        • EPPIG J.T.
        • 哈里斯M.A.
        • 山D.P.
        • ISSEL-TARVER L.
        • Kasarskis A.
        • 刘易斯S.
        • Matese J.C.
        • Richardson J.E.
        • Ringwald M.
        • 鲁宾上午
        • Sherlock G.
        基因本体:生物学统一的工具。基因本体组织。
        NAT。遗传。 2000; 25: 25-29
        • Seglen P.O.
        • 戈登P.B.
        3-甲基腺嘌呤:分离的大鼠肝细胞中的自噬/溶酶体蛋白质降解特异性抑制剂。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 1982; 79: 1889-1892
        • Bjørkøyg。
        • 拉马克T.
        • 布里奇A.
        • 偏出H.
        • 佩兰特M.
        • overvatn A.
        • 捷卡H.
        • 约翰森T.
        P62 / SQSTM1形成蛋白质聚集体通过自噬降解,对亨廷汀诱导的细胞死亡具有保护作用。
        J.细胞Biol。 2005; 171: 603-614
        • 柯林斯下班
        回报蛋白复合物的结构和功能。
        交通。 2008; 9: 1811-1822
        • 谢Z.
        • Klionsky D.J.
        自噬体组:核心机械和适应。
        NAT。细胞生物。 2007; 9: 1102-1109
        • 赵杰。
        • Brault J.J.
        • SCHILD A.
        • CAO P.
        • Sandri M.
        • 肖弗诺州S.
        • Lecker S.H.
        • Goldberg A.L.
        FOXO3协调通过萎缩肌细胞中的自噬/溶酶体和蛋白酶体途径进行激活蛋白质降解。
        细胞元。 2007; 6: 472-483
        • Cuervo上午
        • 帕尔默A.
        • Rivett A.J.
        • knecht E.
        大鼠肝脏溶酶体的蛋白酶蛋白酶降解。
        欧元。 J. Biochem。 1995; 227: 792-800
        • Tsukada M.
        • ohsumi Y.
        自噬缺陷突变体的分离与表征 酿酒酵母酿酒酵母.
        费用。 1993; 333: 169-174
        • 邓布尔J.
        • 克里斯滕森A.R.
        • 安德森J.S.
        通过自噬散装散装劣化。
        自噬。 2008; 4: 1057-1059
        • 乌拉诺J.
        • Tabancay A.P.
        • 杨W.
        • Tamanoi F.
        酿酒酵母酿酒酵母 Rheb. G-蛋白参与调节Canavanine抗性和精氨酸吸收。
        J. Biol。化学。 2000; 275: 11198-11206
        • Høyer-hansen M.
        • Bastholm L.
        • Szyniarowski P.
        • Campanella M.
        • Szabadkai G.
        • Farkas T.
        • Bianchi K.
        • Fehrenbacher N.
        • 艾琳福
        • Rizzuto R.
        • Mathiasen I.S.
        • jäätteläm。
        通过钙,钙调蛋白依赖性激酶激酶-β和Bcl-2的控制控制宏观摄影。
        摩尔。细胞。 2007; 25: 193-205
        • Kissovái。
        • Deffieu M.
        • Manon S.
        • Camougrand N.
        Uth1p参与线粒体的自噬降解。
        J. Biol。化学。 2004; 279: 39068-39074
        • strømhaugp.e.
        • Berg T.O.
        • Fengsrud M.
        • Seglen P.O.
        大鼠肝细胞自噬瘤的纯化和表征。
        生物学习。 j。 1998; 335: 217-224
        • 邓布尔J.
        • jakobsen l.
        • 安德森J.S.
        细胞器蛋白质组学通过无标记物和基于氧化素的蛋白质相关性分析。
        方法mol。 BIOL。 2010; 658: 255-265
        • Zarei M.
        • 春天的A.
        • 梅尔伯格F.
        • Gretzmeier C.
        • 邓布尔J.
        Erlic-TiO2,Hilic-TiO2和SCX-TiO2对全局磷蛋白酶方法的比较。
        J.蛋白质组。 2011; 10: 3474-3483
        • Schandorff S.
        • 奥尔森J.V.
        • Bunkenborg J.
        • Blagoev B.
        • 张Y.
        • 安德森J.S.
        用于CSNP识别的质谱友好的数据库。
        NAT。方法。 2007; 4: 465-466
        • Mortensen P.
        • gouw J.W.
        • 奥尔森J.V.
        • ong s.e.
        • Rigbolt K.T.
        • Bunkenborg J.
        • Cox J.
        • 福斯特L.J.
        • Heck A.J.
        • Blagoev B.
        • 安德森J.S.
        MSQUANT,一种基于质谱的定量蛋白质组学的开源平台。
        J.蛋白质组。 2010; 9: 393-403
        • Cox J.
        MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
        NAT。 Biotechnol。 2008; 26: 1367-1372
        • Rigbolt K.T.
        • Vanselow J.T.
        • Blagoev B.
        GPROX,一种用户友好的生物信息学分析平台和定量蛋白质组学数据的可视化平台。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011;
        • Kabeya Y.
        • Mizushima N.
        • Yamamoto A.
        • Oshitani-Okamoto S.
        • ohsumi Y.
        • Yoshimori T.
        LC.3,Gabarap和Gate16根据形式II形成定位于自噬体膜。
        J. Cell SCI。 2004; 117: 2805-2812
        • 斯科特·罗克
        • Schuldiner O.
        • Neufeld T.P.
        饥饿诱导的自噬的作用和调节 果蝇 fat body.
        开发。细胞。 2004; 7: 167-178