通过单次超高HPLC在台面绕绕线上运行酵母蛋白质组几乎完全覆盖的系统宽扰动分析。

  • 作者脚注
    § 这些作者同等贡献这项工作。
    Nagarjuna Nagaraj.
    脚注
    § 这些作者同等贡献这项工作。
    隶属关系
    Max Planck Biochemistry研究所的蛋白质组学与信号转导,AM Klopferspitz 18,D-82152 Martinsrid,德国
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  • 作者脚注
    § 这些作者同等贡献这项工作。
    nils亚历山大kulak
    脚注
    § 这些作者同等贡献这项工作。
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    Max Planck Biochemistry研究所的蛋白质组学与信号转导,AM Klopferspitz 18,D-82152 Martinsrid,德国
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  • Juergen Cox.
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    Max Planck Biochemistry研究所的蛋白质组学与信号转导,AM Klopferspitz 18,D-82152 Martinsrid,德国
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  • Nadin Neuhauser.
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    Max Planck Biochemistry研究所的蛋白质组学与信号转导,AM Klopferspitz 18,D-82152 Martinsrid,德国
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  • Korbinian Mayr.
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  • OLE HOERNING.
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    Thermo Fisher Scientific,Edisonsvej 4,DK-5000 Odense C,丹麦
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  • OLE vorm.
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    Thermo Fisher Scientific,Edisonsvej 4,DK-5000 Odense C,丹麦
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  • Matthias Mann.
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    Max Planck Biochemistry研究所的蛋白质组学与信号转导,AM Klopferspitz 18,D-82152 Martinsrid,德国
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  • 作者脚注
    本文包含 表I-V和图3和图1和2.
    § 这些作者同等贡献这项工作。
    *这项工作得到了欧洲委员会第七框架计划授予协议卫生卫生/潜在客户的支持。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      酵母仍然是系统生物学和评估蛋白质组学策略的重要模式。深入的霰弹枪蛋白质组学研究已经达到了几乎全面的覆盖范围,并且已经为该有机体开发了快速,有针对性的方法。最近,我们证明,使用长柱和梯度耦合到线性离子捕集器仪器的单一LC-MS / MS分析具有意外的大量蛋白质识别(Thakur,SS,Geiger,T.,Chatterjee,B.,Bandilara ,P.,Frohlich,F.,Cox,J。和Mann,M。(2011)LC-MS / MS的深度和高敏感的蛋白质组覆盖,而无需预分化。摩尔。细胞蛋白质组学10,10.1074 / mcp.m110.003699)。在这里,我们将超高压液相色谱系统耦合到新的台阶顶部横向谱仪(Q辐射),目的是对酵母蛋白质组的几乎完全,快速和鲁棒分析。单次过滤辅助样品制备(FASP) - 制备和LysC消化的酵母细胞裂解物鉴定了3923蛋白的平均值。六种单次运行的综合分析将这些值改善至4000多个鉴定的蛋白质/运行,接近标准条件下表达的蛋白质总数,中值序列覆盖率为23%。由于不存在分级步骤,仅需要小含量的样品。因此,酵母模型蛋白质组现在可以在几小时的测量时间和高灵敏度内覆盖。基因和基因组途径中的蛋白质中位数覆盖蛋白质和至少10个成员的基因组途径为88%,并且未覆盖的途径预计不会在所用条件下活跃。为了研究酵母蛋白质组的扰动,我们开发了代表不同蛋白质组态的外部,重质赖氨酸标记的硅胶酵母标准。这种尖峰标准用于测量酵母蛋白质组的热休克响应。热休克反应的生物信息分析表明,翻译相关功能突出调节,包括核仁过程。相反,对压力相关的途径是上调的。这里描述的蛋白质组学技术是简单的,快速和坚固的,可能在酵母和其他生物研究社区中广泛使用。
      酵母是分子生物学中最熟悉的模型系统之一。它用于研究大量保守的细胞过程,包括细胞周期,代谢和应力反应。酵母是基因组完全测序的第一个生物(
      • 去FFEAU A.
      • Barrell B.G.
      • Bussey H.
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      生活有6000个基因。
      ),并且许多其他系统宽的生物学屏幕首先在酵母模型中进行(
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      功能基因组和蛋白质组学:绘制酵母细胞的多维图。
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      收获基因组的赏金:综合基因组学。
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      萌芽酵母蛋白质定位的全局分析。
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      酵母遗传互动网络的全局映射。
      )。大规模的蛋白质组学也已在酵母中开创,鉴定了数百人,然后是成千上万的蛋白质(
      • 舍甫琴科A.
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      通过质谱将基因组和蛋白质组连接:来自二维凝胶的大规模鉴定酵母蛋白。
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      质谱法分析完全蛋白质组分析的状态:硅胶标记为酵母作为模型系统。
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      • Coon J.J.
      使用多种蛋白酶对大规模质谱的蛋白质组学的价值。
      )。使用三种不同的分析策略,包括具有亚细胞分级的一种,并且涉及肽分离成24分数,我们的组已经报道了基本上完整的酵母蛋白质组,例如判断基因组宽标记实验(
      • De Godoy L.M.
      • 奥尔森J.V.
      • Cox J.
      • Nielsen M.L.
      • 哈伯纳N.C.
      • Fröhlichf.
      • Walther T.C.
      综合质谱型蛋白质组定量单倍体与二倍体酵母。
      )。然而,到目前为止,迄今为止,与深入蛋白质组的测量相关的专业知识和分析时间却妨碍了酵母研究界中的深入蛋白质组学的广泛采用。靶向蛋白质组学,以多种反应监测的形式提供了对该问题的可能解决方案,并且最近用于检测酵母蛋白质组的动态范围内的蛋白质,以及量化代谢移位后关键蛋白的变化(
      • Picotti P.
      • Bodenmiller B.
      • 穆勒L.N.
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      靶影科酿酒酵母的全动态范围蛋白质组分析。
      )。然而,靶向蛋白质组学的旨在表征在许多条件下相对较少的关键蛋白质,因此不太适合于在全球范围内发现生物反应。
      MS保留时间轮廓图中可检测到的总特征的多重反应监测实验和分析表明,LC-MS的总蛋白质组消解中存在非常大量的肽(
      • KöcherT.
      • Swart R.
      • Mechtler K.
      超高压RPLC连字符到LTQ-ORBITRAP VELOS显示峰值容量和鉴定的肽数之间的线性关系。
      ,
      • Michalski A.
      • Cox J.
      在单次霰弹枪蛋白质组学中,超过100,000种可检测的肽种类研磨,但大多数是数据依赖的LC-MS / MS无法访问的。
      )。我们最近调查了单个LC-MS / MS的动态范围,发现甚至可以在此模式下检测到非常低丰度蛋白质(
      • Thakur S.S.
      • 盖尔特T.
      • Chatterjee B.
      • Bandilla P.
      • Frohlich F.
      • Cox J.
      通过LC-MS / MS的深度和高敏感的蛋白质组覆盖,而无需预先分量。
      )。此外,没有预分化的直接分析意味着高灵敏度,因为只需要几微克肽将柱子装载到容量。但是,我们以前的研究是用专用的色谱设置进行的,并且对于非专业团体采用并不直接。
      一种新型质谱仪,Q辐射,将质量选择性四轮仪耦合到壁图分析仪(
      • Michalski A.
      • 达莫e.
      • Hauschild J.P.
      • Lange O.
      • Wieghaus A.
      • Makarov A.
      • Nagaraj N.
      • Cox J.
      • 角horn
      基于质谱的蛋白质组学使用Q辐射,高性能台式四轴锻体质谱仪。
      )。在该台面仪器中,前体离子由四极,通过更高的能量碰撞解离(
      • 奥尔森J.V.
      • MACEK B.
      • Lange O.
      • Makarov A.
      • 角horn
      肽改性分析的较高能量C-Trap解离。
      ),并以高分辨率和骨质分析仪中的质量精度测量。 TOP10方法的循环时间(调查扫描后,最多10毫秒/ ms扫描)是~1 s,与镶嵌家族的先前仪器一样快。因此,Q辐射提供了在给定时间内分析更多肽的可能性,具有非常高的MS / MS数据质量。我们希望将这些益处与超HPLC(UHPLC)结合起来,
      使用的缩写是:
      UHPLC
      超HPLC.
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      抚慰
      过滤辅助样品制备
      基因本体。
      1使用的缩写是:UHPLC
      超HPLC.
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      抚慰
      过滤辅助样品制备
      基因本体。
      在以前的一次运行分析中,我们无法使用。利用新开发的紧凑型UHPLC系统称为Easy-NLC 1000,我们通过相对长的柱和小粒径实现了更高的色谱性能。在这里,我们描述了这种简单但强大的台式平台,并评估其在高吞吐量中表征酵母蛋白质的能力,也可以深入了解。
      为了量化酵母中的蛋白质组状态,可以以标准格式使用硅酸盐标记,这需要标记控制和实验条件(
      • Walther T.C.
      • 奥尔森J.V.
      高分辨率质谱法酵母表达蛋白质组学。
      )。为了使酵母蛋白质组的扰动的更精简的系统分析,我们进一步希望通过使用“尖峰”氧化渣策略从实际实验中解耦氧化硅酸代谢标记步骤(
      • 盖尔特T.
      • wisniewski J.R.
      • Cox J.
      • Zanivan S.
      • 克鲁格米
      • Ishihama Y.
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记用作定量蛋白质组学中的穗标准标准。
      )。在这里,我们开发了这样的标准,考虑了酵母的几种蛋白质组状态。然后我们使用本标准来量化酵母蛋白质组的热休克对酵母蛋白质组的变化,常见的扰动经常遇到温度敏感突变体菌株和同步实验(
      • Futcher B.
      细胞周期同步。
      ,
      • Walker G.M.
      酵母细胞群的同步。
      )。

      实验步骤

       酵母培养和裂解

      酵母菌菌株W303Matα在YPD培养基中生长,直至最早到中间对立阶段,并通过4000×离心收获 g 在4°C下5分钟。将细胞沉淀重悬于100米m TRIS,pH 7.6,含100米m 二硫醇和5%SDS。将裂解液加热至95℃,然后使用Bioruptor Songator(20kHz,320W,60次循环)在最大功率下使用Bioruptor Sonicator(20kHz,320W,60次循环)进行超声处理,以实现完全裂解。裂解物以16,000×离心 g 5分钟澄清蛋白质提取物。

       酵母穗标准

      通过使用pym-缺失Lys2基因构建重型赖氨酸标记的W303Matα菌株natNT2 janke的质粒 等等。 (
      • Janke C.
      • Magiera m.m.
      • rathfelder n。
      • Taxis C.
      • 雷伯斯。
      • Maekawa H.
      • Moreno-Borchart A.
      • 院长G.
      • Schwob E.
      • Schiebel E.
      • KNOP M.
      一种基于PCR的酵母基因标记的多功能工具箱:新的荧光蛋白,更多标记和启动子取代盒。
      )。细胞仅用重赖氨酸(而不是重度精氨酸)标记,以减少样品复杂性并避免精氨酸转化。尖峰标准用于比较不同条件的表达水平。我们培养了250毫升的日志阶段(A600 = 0.9)在包含[13C6/15N2]l-Lysine。为了在穗混合物中表示进一步的生物条件,我们还用2%乙醇作为碳源以及在较高温度(在24℃之前37℃的37℃下30分钟的细胞培养细胞。将这三种条件以相等的比例混合以产生尖峰混合物。该量的培养细胞在单次测量(在几μg/分析)中具有成千上万的峰值实验,并用上前移液管的强阴离子交换分级分级(
      • wiśniewskij.r.
      • 邹格曼A.
      抚慰和基于STAGETIP的分馏的组合允许对海马膜蛋白质组进行深入分析。
      )。

       酵母热休克治疗

      酵母被培养到中日期阶段以获得 A600 2.5在YPD培养基中为24℃的细胞,随后通过水浴孵育转移至37℃,以实现均匀和有效的热传递。在收集样品 t 在37℃温育后= 0和30分钟,以分析热冲击时蛋白质组变化。如上所述裂解样品。

       蛋白质消化

      使用FASP法消化蛋白质(
      • wiśniewskij.r.
      • 邹格曼A.
      • Nagaraj N.
      蛋白质组分析的通用样品制备方法。
      )。简而言之,在过滤器上装载140μg蛋白质,通过含有8的缓冲液洗涤两到三次,将SDS完全取代 m 尿素。然后使用碘乙酰胺烷基化蛋白质,并通过过滤器洗涤过量的试剂。使用内蛋白酶LysC消化还原和烷基化蛋白质,其在赖氨酸残基的C末端切割,酶与蛋白质比为1:50。使用c脱悬浮通过fasp获得的肽18 StageTips (
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      蛋白质组学中的蛋白质组学中的基质辅助激光解吸/电离,纳米电子涂布剂和LC / MS样品预处理的停止和去提取提示。
      )。

       超高压容易LC

      Thermo Scientific Easy-NLC 1000(Thermo Fisher Scientific,Odense,Denmark)是一种无分的纳米流动液晶LC,旨在以高达1000巴(15,000 P.I.)的超高压力运行。该系统采用两个直驱注射器泵,以产生二进制梯度,最小稳定流量下降到〜50 nL / min。流量和压力传感器(每个移动阶段的一个设置)被放置在高压混合T恤上游,使得传感器输出可以精确地控制梯度。 LC系统是预配置的,只需要两个液体连接,用户通过该液体连接将柱连接到洗脱液流线和废物/通风线。这种简单性有助于每日使用,并通过指示纳维夏(Thermo Fisher Scientific)的手指紧密配件来获得进一步的使用,确保零死块密封件高达1200巴。该紧凑型LC仪器,其最大压力限制为1000巴,可以在35°C的温度范围内使用具有250 nL / min的线速度的长柱,而不是所需的相对高的温度高达60°C在我们之前的设置没有超高压(
      • Thakur S.S.
      • 盖尔特T.
      • Chatterjee B.
      • Bandilla P.
      • Frohlich F.
      • Cox J.
      通过LC-MS / MS的深度和高敏感的蛋白质组覆盖,而无需预先分量。
      )。

       LC-MS / MS

      肽在50cm柱上装载75μm内径,内部填充,含有1.8μmc18 颗粒(Maisch博士GmbH,德国)。使用具有0.5%乙酸(缓冲液A)和80%乙腈(缓冲液B)的二元缓冲液和80%乙腈组成的二元缓冲液和80%乙腈进行反相色谱。将肽通过缓冲液B的线性梯度分离,在240分钟内为4-H梯度在Easy-NLC 1000系统中以250 nL / min的流速进行4-H梯度。该柱在由内部设计的烤箱调节的35°C的恒定温度下操作,具有珀耳帖元件(
      • Thakur S.S.
      • 盖尔特T.
      • Chatterjee B.
      • Bandilla P.
      • Frohlich F.
      • Cox J.
      通过LC-MS / MS的深度和高敏感的蛋白质组覆盖,而无需预先分量。
      )。 LC耦合到Q辐射质谱仪(
      • Michalski A.
      • 达莫e.
      • Hauschild J.P.
      • Lange O.
      • Wieghaus A.
      • Makarov A.
      • Nagaraj N.
      • Cox J.
      • 角horn
      基于质谱的蛋白质组学使用Q辐射,高性能台式四轴锻体质谱仪。
      )(Thermo Fisher Scientific)通过纳米电池源(Proxeon Biosystems,现在Thermo Fisher Scientific)。在数据依赖模式下,Q助力运行,调查扫描以50,000的分辨率获得 m/z 400(瞬态时间= 256毫秒)。从调查扫描中选择了从调查扫描充电≥2的前10种最丰富的同位素图案,并通过一个1.6汤匙的隔离窗口选择,并通过更高的能量碰撞解离(
      • 奥尔森J.V.
      • MACEK B.
      • Lange O.
      • Makarov A.
      • 角horn
      肽改性分析的较高能量C-Trap解离。
      )归一化碰撞能量为25.测量扫描和MS / MS扫描的最大离子注入时间分别为20〜60ms,并且将两个扫描模式的离子目标值设置为1E6。通过动态排除测序的肽40秒,通过动态排除肽的重复序列至最小。

       数据分析

      使用MaxQuant计算蛋白质组学平台(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )版本1.2.0.34。使用Andromeda搜索引擎搜索酵母ORF数据库(2011年2月3日的日期)的碎片谱(2011年2月3日的第6752条参赛作品)(
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      和romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      )初始前体和片段质量公差分别设定为7和20ppm,并且最多可错过的裂解。将半胱氨酸的carabamidemination被设定为固定改性,选择蛋氨酸和蛋白质N-末端乙酰化的氧化作为数据库搜索的可变修改。将肽和蛋白质鉴定均以1%的假发现率过滤,因此不依赖于肽评分。使用MaxQuant环境中可用的Perseus工具进行生物信息学分析。对于2%的错误发现率,本杰里尼-Hochberg校正进行了所有浓缩分析和方差试验分析。原始数据可以从Tranche蛋蛋白质储存库中获取,使用以下访问代码:BZ9HLKJ5EAEQ / RGOVH0 + FHEHRGTSACCD2 + 879Q1JNJM3D9SFACPNGFNPPZT9WFU5K5MXKZ8O1B9QAK7WBFXDFPU2THKAAAAAAAAAAPMA = =。

      结果和讨论

       单次LC-MS / MS系统

      我们的目标是使用最低可能数量的加工和分析步骤设计霰弹枪蛋白质组学工作流程,因此高强大( Fig. 1)。在SDS存在下裂解酵母细胞,确保所有蛋白质类别(“实验程序”)的有效变性和溶解。通过使用FASP方法通过LysC消化将蛋白质降低至肽(
      • wiśniewskij.r.
      • 邹格曼A.
      • Nagaraj N.
      蛋白质组分析的通用样品制备方法。
      ),并将所得肽纯化在酸纤饼上(
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      蛋白质组学中的蛋白质组学中的基质辅助激光解吸/电离,纳米电子涂布剂和LC / MS样品预处理的停止和去提取提示。
      )。这些程序仅涉及基于移液管的操作,并且可以在几个小时内进行,并且在几个小时内进行若干条件。然后将肽混合物装载到UHPLC系统(易NLC 1000)的自助泵器上,并通过在台面上的高弦玻璃壁图质谱仪上通过LC-MS / MS以自动方式进行分析(Q.辐射)(
      • Michalski A.
      • 达莫e.
      • Hauschild J.P.
      • Lange O.
      • Wieghaus A.
      • Makarov A.
      • Nagaraj N.
      • Cox J.
      • 角horn
      基于质谱的蛋白质组学使用Q辐射,高性能台式四轴锻体质谱仪。
      )。 LC设置不使用预先静音或流量分裂,避免样品损耗并降低溶剂消耗。 UHPLC系统本身专为紧凑和简单性而设计(“实验程序”)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1Minimalistic蛋白质组学设置。 酵母样品溶解并通过FASP方法制备。肽在缘物上纯化并放置在自动进样器中,该自相取像器将它们直接装入相对长的柱(50cm)。二进制梯度系统由UHPLC系统(EASY NLC 1000)系统提供,该系统耦合到台上电源源的台式顶部四极杆轨体质谱仪(Q. Q.Capactive)。在MaxQuant计算蛋白质组学平台中分析所获得的数据,使用Perseus工具进行生物信息学分析。
      为了促进蛋白质组的深度取样,我们使用相对长的柱和小粒度(50cm,1.8μm)。通过UHPLC泵容易地容纳,它在500巴中产生稳定的250nl / min流动。 UHPLC系统的另一个优点是其能够以更高的流速将样品加载并更快地平衡柱,从而缩短架空时间。我们发现50厘米柱和4小时梯度的组合是标准使用的良好组合。

       酵母蛋白质组分析深度

      已经建立了单次工作流程,我们接下来测量了六个酵母细胞裂解物,其模拟了一式三份控制和三份扰动的实验。将大约4μg的肽材料加载到50cm柱上并用4小时梯度分离。 MaxQuant中六个LC-MS / MS文件的联合分析平均为26,173±286肽鉴定,单次运行具有独特的氨基酸序列。根据其质量精度和保留时间(MaxQuant中的运行“功能之间的”匹配“)在运行之间传输识别,每单行术语为33,122±405序列 - 独特的肽标识Fig. 2A)。在该实验中鉴定了41,035个肽,其占据了总测量时间的〜24小时。尽管LysC肽平均大于胰蛋白肽,因此更难以识别,但运行的鉴定率高于51%。这可能是由于高分辨率高能量碰撞解离光谱使能的高质量精度。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2深入覆盖酵母蛋白质组。 A,个人中鉴定的肽数与运行之间的匹配而达到。通过匹配确定的肽 绿色。 B.,在个人中识别的蛋白质以匹配在所示的跑步之间运行 绿色。用单肽命中鉴定的蛋白质显示在 红色的。 C,匹配后个体的中位序列覆盖率为~17%。从组合的4099蛋白的中值序列覆盖率如图所示为22.9%。 D, 这 联合圈子 代表六次运行中蛋白质鉴定的频率。在所有六次运行中鉴定的蛋白质被指定为最内部圆圈的核心蛋白质。
      当运行之间的匹配时,每次运行4084±8蛋白。在组合数据集中,鉴定了4206个蛋白质(不计算污染物如角蛋白),其中只有180个具有单一肽(Fig. 2B补充表I和II以及含有用单肽鉴定的所有蛋白质的光谱的其他补充材料)。我们重复了数据库搜索的任意andromeda肽评分阈值为60,这对于具有酵母蛋白质组大小的数据库高,并且仍然鉴定了4137个蛋白质。这进一步证明我们的数据不依赖于低分肽。我们以前的研究使用了8-H梯度,自定义LC设置以及在三份实验中仅在3000个蛋白下识别的先前一代orbitrap仪器(
      • Thakur S.S.
      • 盖尔特T.
      • Chatterjee B.
      • Bandilla P.
      • Frohlich F.
      • Cox J.
      通过LC-MS / MS的深度和高敏感的蛋白质组覆盖,而无需预先分量。
      )。在这里,我们实现了近似增加的性能 - 接近完全表达的蛋白质组(见下文) - 非常流线型和最简单的蛋白质组学系统。
      鉴定的蛋白的中值序列覆盖率为23.4%,七个肽序列的中值(Fig. 2C)。在LC MS图中可以检测到更多的肽,而不是通过串联质谱法测序和鉴定。在我们的数据集中,碎片同位素模式的中值强度比非分叉同位素图案的〜10倍(补充图1)。这表明,在单次中存在比分段和识别的单次蛋白肽存在更多,但是数据驱动的LC-MS / MS可能无法访问(
      • Michalski A.
      • 达莫e.
      • Hauschild J.P.
      • Lange O.
      • Wieghaus A.
      • Makarov A.
      • Nagaraj N.
      • Cox J.
      • 角horn
      基于质谱的蛋白质组学使用Q辐射,高性能台式四轴锻体质谱仪。
      )。
      霰弹枪蛋白质组学的关键挑战是“缺失值”问题,这是指在一系列序列的一些测量中没有关于特定蛋白质或肽的数据,并且由峰值选择的半随机性引起的碎片。值得注意的是,当比较单次分析的不同子集中的标识时,我们发现在所有六次运行中确定了4206蛋白的完整3887(92%)(称为 Fig. 2D),96%在六个数据集中至少五个中识别。这表明对于绝大多数蛋白质,没有或很少“缺失的价值问题”。在肽水平,当然,重叠不像六个跑赛中至少五次仍然识别出75%的肽(补充图2)。 Q之间的高再现性大概是Q辐射的非常高的测序速度的结果,与Maxquant之间的运行之间的肽的有效匹配结合。
      为了评估我们数据集的完整性,我们将其与之前的深入研究进行了比较(
      • De Godoy L.M.
      • 奥尔森J.V.
      • Cox J.
      • Nielsen M.L.
      • 哈伯纳N.C.
      • Fröhlichf.
      • Walther T.C.
      综合质谱型蛋白质组定量单倍体与二倍体酵母。
      )。尽管酵母背景存在差异(W303 相对 S288C)在过去4年中,酵母基因组的稍微不同的条件和轻微的成果,这里的4206个基因的95%包含在我们之前的数据集中。在没有报告的217个蛋白质中,在六次运行中有六个( Fig. 2D)。酵母有809个ORF,被酵母酵母组织数据库分类为“可疑”,并且这些ORF被认为不编码相应的蛋白质(表I.)。如前所述(
      • De Godoy L.M.
      • 奥尔森J.V.
      • Cox J.
      • Nielsen M.L.
      • 哈伯纳N.C.
      • Fröhlichf.
      • Walther T.C.
      综合质谱型蛋白质组定量单倍体与二倍体酵母。
      ),这组基因提供了对假阳性识别率的有用独立测试。合并的单次数据集仅确定了两个可疑ORF(“大多数”蛋白质柱 补充表II),而在1%的假阳性率的基础上,我们将在这个子集中预期五个误报点击(鉴于我们的6717酵母ORF的覆盖率为809个可疑ORF的1%; 表I.)。此外,我们之前的研究中也发现了两个可疑ORF命中之一,因为这个子集中只有四次命中(YBR126W-A)中的一个,这表明它可能实际上可能不是假的。这些数据提供了独立的证据表明我们的假阳性率低于1%。
      表I.造成酵母瘤的覆盖范围数据库注释和去除富集的生物过程术语
      酵母ORF蛋白质确定蛋白质鉴定 - 核心蛋白质组
      全部的67174206(63%)3887(58%)
      Saccharomyces基因组数据库
          Verified49413856(87%)3587(73%)
          Uncharacterized857335(39%)287(33%)
          Dubious8092 (0%)2 (0%)
          可转换元素8917(19%)13(15%)
          Pseudogenes211 (5%)1 (5%)
          Silenced41(25%)1 (5%)
      去生物过程
          麦芽糖代谢过程111 (9%)0 (0%)
          Synapsis102(18%)2(18%)
          Multidrug transport110 (0%)0 (0%)

       检测到的蛋白质组的途径分析

      表I. 表明六次单次运行一起鉴定了78%的ORF,酿酒孢组数据库验证为真正基因产品;因此,至少该数量在实验室酵母中表达为蛋白质。在实验室条件下不需要许多途径和功能,并且可能不表达相应的蛋白质。在88%的情况下,在单次酵母蛋白组中,基因和基因组数据库的京都大腰科蛋白质的覆盖率非常高,占三种基因本体(GO)类别(GOCC,85%; GOMF,82% ;和GOBP,85%CC细胞成分,MF分子功能,BP-生物过程)。 (因为某些途径只由少量蛋白质组成,我们将分析限制对10个蛋白质或更多蛋白的途径;没有这种过滤器的覆盖率甚至更高。)有趣的是,大多数缺失蛋白质的途径属于糖代谢和减数分裂(表I.),预计在葡萄糖培养基中的单倍体酵母中未能活跃的功能。

       单次蛋白质组的动态范围

      鉴于已识别的蛋白质的数量,我们预计单次蛋白质组具有大动态的蛋白质表达。实际上,所有已识别的蛋白质的集成肽信号在单次测量中跨越大约5个数量级(Fig. 3)。最近的多重反应监测研究检测了选择127蛋白选择的可检测性,以代表来自最丰富至最少蛋白质类别的酵母蛋白表达的全部范围(
      • Picotti P.
      • Bodenmiller B.
      • 穆勒L.N.
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      靶影科酿酒酵母的全动态范围蛋白质组分析。
      )。我们的单次蛋白质组包括这些蛋白质中的121个,六个缺失的蛋白质都在最低丰度等级中。鉴定了类别中的所有蛋白质,但它们可能被错误分类(
      • Thakur S.S.
      • 盖尔特T.
      • Chatterjee B.
      • Bandilla P.
      • Frohlich F.
      • Cox J.
      通过LC-MS / MS的深度和高敏感的蛋白质组覆盖,而无需预先分量。
      )。这些结果表明,我们的数据集涵盖了一个非常大的动态范围。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3鉴定的蛋白质组的动态范围。 使用其总结肽强度粗略地估计所鉴定的蛋白质的表达水平。基于其丰度,将蛋白质排名为五个量数。在每个匹配层中提取丰富的GO术语(假发现率<本杰里尼 - Hochberg修正后0.02)。
      正如预期的,在分布的最丰富量级中的富集术语的生物信息浓缩分析,将细胞细胞骨架和生物发生相关的功能在最丰富的蛋白质中进行。将细胞周期相关的功能在非同步细胞中稀释,因此富含量化。

       斯卡拉标准的峰值性能

      尽管Silac已成为许多系统中的标准和高度准确的量化方法,但代谢标签的要求可防止一些研究人员采用这项技术。此外,在一些系统中,没有外部氨基酸的培养基的要求可能对预期实验施加限制。这些问题是由Spike-in Silac方法解决的(
      • 盖尔特T.
      • wisniewski J.R.
      • Cox J.
      • Zanivan S.
      • 克鲁格米
      • Ishihama Y.
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记用作定量蛋白质组学中的穗标准标准。
      )。在该策略中,代表感兴趣蛋白质组的标准是重质赖氨酸标记的,并作为各种实验的参考。可以像往常一样进行生物实验,并且在样品制备之前混合尖峰标准。
      为了使酵母的峰值策略,我们硅酸标记为W303Matα菌株,其中通过同源重组敲除Lys2基因。对于大量实验(“实验程序”),较少量的标准足够。选择标准是有利的,使其代表不同的条件。因此,我们还在不同的生长条件下培养酵母(2%乙醇)和温度应激条件。通过将所有三种条件相等的量组合来制备尖峰混合物。为了在单次条件下用尖峰氧化硅胶标准进行定量,我们将其混合到富培养基的正常实验室条件下酵母生长。全齐全的单次分析一起确定了3794酵e蛋白(补充表III)。此数字略低于上述“无标签”实验,因为氧化铝使肽混合物的复杂性翻倍,因为运行的数量较低。在这些蛋白质中,3656和3553分别用两和三个“比计数”量化,分别在最大分析中指定有效的硅酸量定量比。中位数计数/蛋白质数为16( Fig. 4A)。尽管使用了包括若干条件的尖峰标准,但这些单次实验中的比率的分布非常窄,但在2倍的变化中有89%的蛋白质比率(Fig. 4, BC)。此外,所有单独复制之间的相关分析导致 R 值至少为0.83(Fig. 4D)。值得注意的是,在最近的多次反应监测研究中,将乙醇生长条件纳入混合物中的乙醇生长条件,使糖酵解和葡糖生成途径,TCA循环和糖氧化合物循环(45个蛋白中的45个)(
      • Picotti P.
      • Bodenmiller B.
      • 穆勒L.N.
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      靶影科酿酒酵母的全动态范围蛋白质组分析。
      )。这些结果表明,酵母穗 - 氧化酶充分代表酵母蛋白质组,其在一次运行量化分析中表现良好。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4用穗硅酸盐标记定量酵母蛋白质组。 从四次单次运行中,超过3200个蛋白质相对于尖峰硅酸混合物量化。 A,比率的箱图数有助于定量每种蛋白质。 BC,将蛋白质比率分布到尖峰硅酸盐标准。 D,如蛋白质比率相关性所示,生物重复的峰值氧化硅酸盐定量的再现性如这里所示。

       系统范围内的热休克反应

      为了在系统生物学上下文中测试一次运行工作流程,我们选择调查热量休克响应。这是酵母中研究的重大应激反应。尽管很多微阵列研究(
      • 喘息A.P.
      • 斯派曼P.T.
      • kao c.m.
      • Carmel-Harel O.
      • eisen m.b.
      • 斯托斯G.
      • Botstein D.
      • 棕色p.o.
      酵母细胞对环境变化的响应中的基因组表达程序。
      ,
      • Causton H.C.
      • ren
      • Koh S.S.
      • 哈利比亚C.T.
      • Kanin E.
      • 詹宁斯尤。
      • Lee T.I.
      • 真正的H.L.
      • 着陆器E.S.
      • 年轻的R.A.
      酵母基因组表达反应环境变化的重塑。
      ),没有报告对该过程的无深入蛋白质组学研究。此外,热休克是涉及温度敏感突变体的实验的不可避免的组分,因此有趣的是知道热冲击如何调节蛋白质组。
      通过将酵母培养物从24至37℃移位,在0分钟和37℃下30分钟后进行时间点,并在30分钟后进行热冲击实验Fig. 5A)。将样品与尖峰标准组合并用四分之一的四分之一分析4-H单次。在使用“运行之间的匹配”功能的“匹配”的“匹配”分析后,我们确定了4072个蛋白质。热冲击数据集具有3708蛋白的重叠,具有所描绘的核心蛋白质 Fig. 2D。我们过滤蛋白质,该蛋白质至少在两倍于两倍于两次定量并获得3152酵母蛋白(补充表IV.)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5在氧化体策略中的尖峰定量热休克反应。 A,热休克实验的示意图。样品at. t 在37℃温育后= 0和30分钟混合1:1,在30℃下生长尖峰标准。 B,在日志中表示的折叠变化2 将比率显示为选定的蛋白质。
      Fig. 5B 显示蛋白质的折叠变化,在对数上的热冲击时具有显着变化的变化2 规模。对于每种蛋白质,通过将未标记的样品的比例除以硅酸纤维标准(轻度为重比率)来计算这些折叠变化作为“比率”。 t = 0)和热冲击(t = 30分钟)。具有最高折叠变化的蛋白质(接近4倍诱导)是HSP12(热休克蛋白12),已知通过热休克以及其他应力因子高度诱​​导(
      • Praekelt U.M.
      • Meacock P.A.
      HSP12,一种新的小型热休克基因 酿酒酵母酿酒酵母:结构,调节和功能分析。
      )。其他热休克蛋白也上调,包括SSA4,SSA2,HSP104,HSP82和HSP60(Fig. 5B),这个组总体上显示了最高的折叠变化。在下调因素中,我们注意到核糖体生物发生的突出组蛋白质。例如,NSA2,NOG1,RPF1,NOP4和NOP12都显着下调。这些蛋白质的折叠变化在0.6和8.0之间,最小值仍然可靠地定量(见 误差酒吧Fig. 5B)。
      接下来,我们使用Perseus Bioinformatics环境探索了全球蛋白质组学响应,这些环境是MaxQuant的一部分。我们在四分之一之间进行单向分析 t = 0且 t 截止假假设检测的30分钟和Benjamini-Hochberg校正,截止假发现率值0.02。这产生了234个蛋白质,其在表达中显着变化(补充表V.)。超过一半的这些蛋白质被上调(Fig. 6A)。任何设定的富集分析都揭示了GO术语“核仁”和“核糖体生物发生”,其高度显着下调(p < 10−16)。在上调的蛋白质中,“对压力”和“分解酵素过程的反应”是最多的。绘制了负责这些效果的蛋白质的谱 Fig. 6 (BC)。作为一个控制,我们检查了“运输”类别中的概况,这在热休克时不会显着改变。这些曲线在热休克时不会显示相干趋势。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6显着改变蛋白质的分层聚类。 A,在热冲击时聚类显着上调蛋白质。通过对多假设检测的校正的差异分析来确定显着性。 BC,富含核糖体生物发生的簇的表达模式(B)和反应压力(C)显示蛋白质调节的两大趋势。
      仔细检查下调流程突出了与翻译规范相关的其他类别。例如,属于“TRNA代谢过程”的蛋白质是在热冲击期间显着下调(p < 10−5)。通过相同的令牌,rRNA转录,成熟和核糖体组装将被预测下调,这确实是我们的生物信息学分析显示的结果。核仁本身是用于许多这些过程的位点,并且独立地已知是细胞应力的关键传感器(
      • 布隆S.
      • 威斯曼B.J.
      • Hutten S.
      • Boisvert F.M.
      • Lamond A.I.
      胁迫下的核仁。
      )。我们的分析现在针对这一有趣的连接定位蛋白质。

       结论与前景

      在这里,我们已经设计了一种简约的蛋白质组学工作流程,这些工作流量仅由诸如液体的消化酵母细胞裂解物制备,Spike-in Silac作为定量化技术,单一UHPLC在台式质谱仪上运行,通过自由可用的最大框架进行数据分析。尽管其简单性,但这种技术达到了酵母蛋白质组的非常大的覆盖范围,并且容易允许系统宽地分析扰动等压力反应。
      我们工作流的有吸引力的特征包括其灵敏度和快速的分析时间。因为没有对标记的要求,所以可以根据标准方案进行实验,并且可以使用标准酵母菌株。我们认为,单次系统确实是使用分馏和有针对性方法的深入霰弹枪蛋白质组学之间的有效第三种方法。也就是说,蛋白质组学的应用许多应用,其中单次技术如此所述,这里描述的不是理想的方法。例如,根据需要区分所有异构型的蛋白质组的非常大的序列覆盖,不能预期这种策略。同样,翻译后修改的分析通常需要富集和分馏步骤。然而,几乎所有对酵母蛋白质组覆盖的改进都会携带对标准霰弹枪蛋白质组学方法中的级分的分析。
      在这里,我们已经将单射技术应用于酵母模型系统。人蛋白质组比酵母蛋白质组更复杂,但在技术的进一步进展中,蛋白质组中的大部分也可以通过单次方法来分析。

      补充材料

      参考

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