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量化方法 体内 蛋白酶体和脱硫酶抑制后蛋白质泛素的变化*

  • Namrata D. Udeshi.
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    Broad Institute of Mit As Harvard,7号剑桥中心,马萨诸塞州剑桥市02142
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  • D.R.玛尼
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    Broad Institute of Mit As Harvard,7号剑桥中心,马萨诸塞州剑桥市02142
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  • 托马斯艾森哈鲁克
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    Broad Institute of Mit As Harvard,7号剑桥中心,马萨诸塞州剑桥市02142

    Massachusetts综合医院,查尔斯敦,马萨诸塞州的免疫学和炎症疾病中心02129
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  • Philipp Mertins.
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    Broad Institute of Mit As Harvard,7号剑桥中心,马萨诸塞州剑桥市02142
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  • 雅各布D. Jaffe
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  • Karl R. Clauser.
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    Broad Institute of Mit As Harvard,7号剑桥中心,马萨诸塞州剑桥市02142
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  • NIR HACOHEN.
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    Broad Institute of Mit As Harvard,7号剑桥中心,马萨诸塞州剑桥市02142

    Massachusetts综合医院,查尔斯敦,马萨诸塞州的免疫学和炎症疾病中心02129
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  • 史蒂文A. Carr.
    一致
    应该解决谁的通信:广泛的麻省理工学院和哈佛大学,剑桥市剑桥中心,剑桥,MA 02142。电话:617-714-7630;传真:617-714-8957
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    Broad Institute of Mit As Harvard,7号剑桥中心,马萨诸塞州剑桥市02142
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  • 作者脚注
    本文包含补充方法。 S1至S8和表S1和S2。
    *部分由广泛的麻省理工学院和哈佛大学和国家癌症研究所(U24CA160034)和全国心肺和血液研究所(HHSN268201000033C和R01HL096733)提供给SAC,提供对此工作的支持。我们想承认James Strickler的Lifesensors Inc.为有用的讨论。
      泛素化在蛋白质降解和信号转导中起着关键作用。泛素是一种小蛋白质改性剂,其通过E1,E2和E3酶的组合功能在赖氨酸残基中加工,并通过脱硫酶除去。泛素化位点的表征对于了解这种修饰在细胞过程和疾病中的作用是重要的。然而,直到最近,由于缺乏有效的富集技术,缺乏高效的繁殖位点的大规模表征已经阻碍了。在胰蛋白酶消化后,特别识别含有含有赖氨酸残基(K-ε-GG)的赖氨酸残基的抗体的引入已经显着提高了从细胞裂解物中富集和鉴定普发染色位点的能力。通过定量高性能质谱法通过定量高性能质谱研究PR-619对PR-619对人Jurkat细胞中泛素抑制的蛋白酶体抑制和脱水素酶抑制的影响。在免疫亲和富集之前消化的裂解物的最小分馏增加了K-ε-gg肽的产率,得到了在硅胶三重编码实验中检测到高达约3300个不同的K-GG肽的检测,从5mg蛋白质为每个标签状态。总共确定,在本研究中鉴定了5533个不同的K-ε-GG肽,其在本研究中量化了4907,表明所提出的策略是细胞系统中扰动研究的实用方法。我们发现,PR-619的Mg-132和脱水素酶抑制的蛋白酶体抑制诱导泛素景观的显着变化,但并非所有由Mg-132和PR-619调节的泛素化位点可能是遍税蛋白 - 蛋白酶体系的底物。此外,我们发现蛋白酶体和脱水素酶抑制剂仅诱导蛋白质表达水平的微小变化,而不管在泛素位点位点诱导的调节程度如何。我们将这种发现归因于本研究中鉴定的大多数泛素化位点的低化学计量。
      泛素化是翻译后修饰,在通过26S蛋白酶体(以下)通过降解来调节蛋白半衰期(
      • myung J.
      • Kim K.B.
      • 船员C.M.
      泛素 - 蛋白酶体途径和蛋白酶体抑制剂。
      )。除了这种原型作用外,泛素化对于调节杂种其他方法是必不可少的,包括蛋白质内吞作用,溶酶体靶向和染色质重塑(
      • 迪克斯I.
      • Wakatsuki S.
      • 沃尔特斯K.J.
      从结构到功能的泛素绑定域[mdash]。
      )。与磷酸化类似,泛素化是可逆的,ATP依赖性和酶促驱动的(
      • 科恩P.
      • Tcherpakov M.
      泛素系统是否会作为蛋白激酶提供多种药物靶标的药物?
      )。相反,泛素本身是一种保守的76个氨基酸蛋白,其以高模块化方法在其基材上加入。通过三个离散酶,泛素激活酶(E1),泛素 - 缀合酶(E2)和泛素 - 结扎酶(E3),通过连续作用促进泛素与赖氨酸残留物的ε-氨基的附着。在泛素级联的第一步中,E1酶的活性位点半胱氨酸残基与泛素的C-末端羧基形成硫虫蛋白酶(
      • 科恩P.
      • Tcherpakov M.
      泛素系统是否会作为蛋白激酶提供多种药物靶标的药物?
      )。然后将遍基粘蛋白分子转移到E2酶上的半胱氨酸残基,最后通过用E2缀合酶和E3连接酶进行的相互作用与其底物蛋白连接。泛素通过泛素的C末端与底物中赖氨酸的ε氨基之间的酰胺键合(Fig. 1)。大约10 e1,40 e2,和>600E3S在人类基因组中编码,导致泛素级联的每个步骤后的复杂性和特异性增加(
      • 科恩P.
      • Tcherpakov M.
      泛素系统是否会作为蛋白激酶提供多种药物靶标的药物?
      ,
      • SACCO J.J.
      • Coulson J.M.
      • Clague M.J.
      • urbés。
      脱盐素酶在癌症相关途径中的培养作用。
      )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1用抗k-ε-gg抗体富集K-ε-gg肽的示意图。 在胰蛋白的C末端的胰蛋白酶消化后,来自泛素的C末端的甘氨酸残基与修饰的赖氨酸残基的ε氨基保持连接。使用抗K-ε-GG抗体用于有效地富集这些肽远离非K-ε-GG肽。
      通过脱硫酶(DUB)催化除去泛素分子
      使用的缩写是:
      配音
      脱硫蛋白酶
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      c
      碰撞诱导的解离
      SCX.
      强阳离子交换
      UPS
      泛素 - 蛋白酶体系
      基因本体。
      1使用的缩写是:配音
      脱硫蛋白酶
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      c
      碰撞诱导的解离
      SCX.
      强阳离子交换
      UPS
      泛素 - 蛋白酶体系
      基因本体。
      (
      • SACCO J.J.
      • Coulson J.M.
      • Clague M.J.
      • urbés。
      脱盐素酶在癌症相关途径中的培养作用。
      )。在人类基因组中编码大约80-90个配合,并被细分为五类:泛素特异性蛋白酶(USPS),泛素C末端水解酶(UCH),卵巢肿瘤蛋白酶(OTUS),JoeSephines和Jamm / MPN +金属酶(
      • Komander D.
      • Clague M.J.
      • urbés。
      打破链条:脱硫酶的结构和功能。
      )。 USPS,UCH,OTU和Josephines都是半胱氨酸蛋白酶(
      • 科恩P.
      • Tcherpakov M.
      泛素系统是否会作为蛋白激酶提供多种药物靶标的药物?
      ,
      • Komander D.
      • Clague M.J.
      • urbés。
      打破链条:脱硫酶的结构和功能。
      )。除了从底物分子中除去泛素的功能外,DUB也可以起到修剪多泛素链或从泛素前体产生游离泛素(
      • Komander D.
      • Clague M.J.
      • urbés。
      打破链条:脱硫酶的结构和功能。
      )。另外,三个良好的保守配合与蛋白酶组合并通过链修剪调节底物降解或通过除去泛素链en Bloc(
      • 贝德福德L.
      • Lowe J.
      • 迪克L.R.
      • Mayer R.J.
      • Brownell J.E.
      泛素样蛋白缀合和泛素蛋白酶体系作为药物靶标。
      ,
      • 奥尔森J.V.
      • Blagoev B.
      • GNAD F.
      • MACEK B.
      • Kumar C.
      • Mortensen P.
      全球性,体内和现场特异性磷酸化动力学中的信令网络。
      )。结果,蛋白酶体配合有助于在底物降解时促进细胞泛素分子的再循环(
      • Komander D.
      • Clague M.J.
      • urbés。
      打破链条:脱硫酶的结构和功能。
      )。
      由于泛素链拓扑中的多样性,泛素化促进的细胞信号传导事件具有高度通畅性。例如,衬底赖氨酸残基可以是单次粘合剂或用各种链长的多覆盖。此外,泛素的所有七个赖氨酸残基以及N末端可以以均型或异质型方式在另外的泛素分子上与赖氨酸残留物形成多泛素键(
      • 迪克斯I.
      • Wakatsuki S.
      • 沃尔特斯K.J.
      从结构到功能的泛素绑定域[mdash]。
      )。明显的泛素结合结构域识别特定的泛素链产品和触发各种信号事件阵列的功能(
      • 迪克斯I.
      • Wakatsuki S.
      • 沃尔特斯K.J.
      从结构到功能的泛素绑定域[mdash]。
      )。络泛素通常用作通过泛素 - 蛋白酶体系(UPS)降解以维持细胞稳态的信号。 26s的蛋白酶是一种大型的多层蛋白质复合物,可用于展开和蛋白水解降解染色蛋白质(
      • 贝德福德L.
      • Lowe J.
      • 迪克L.R.
      • Mayer R.J.
      • Brownell J.E.
      泛素样蛋白缀合和泛素蛋白酶体系作为药物靶标。
      )。
      直到最近,以大规模的方式表征泛素化特异性位点的蛋白质组学技术相对于表征成千上万的磷酸化位点(
      • 奥尔森J.V.
      • Blagoev B.
      • GNAD F.
      • MACEK B.
      • Kumar C.
      • Mortensen P.
      全球性,体内和现场特异性磷酸化动力学中的信令网络。
      ,
      • Huttlin E.L.
      • Jedrychowski M.P.
      • eliasj.e.
      • Goswami T.
      • RAD R.
      • Beausoleil S.A.
      • VillénJ.
      • 哈斯W.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      小鼠蛋白磷酸化和表达的组织特异性地图。
      )。泛素蛋白的分析通常面临以下挑战:(1)泛素本身是一种蛋白质,(2)普里斯化是ubiquitination算术,(3)遍在蛋白质降解,(4)泛素链的拓扑是异质的。以前,蛋白质组学方法利用了与泛素结合结构域组成的亲和标记的遍税蛋白,泛素特异性抗体,或试剂,以富集替代蛋白质改性蛋白质(
      • Komander D.
      • Clague M.J.
      • urbés。
      打破链条:脱硫酶的结构和功能。
      ,
      • 贝德福德L.
      • Lowe J.
      • 迪克L.R.
      • Mayer R.J.
      • Brownell J.E.
      泛素样蛋白缀合和泛素蛋白酶体系作为药物靶标。
      ,
      • 奥尔森J.V.
      • Blagoev B.
      • GNAD F.
      • MACEK B.
      • Kumar C.
      • Mortensen P.
      全球性,体内和现场特异性磷酸化动力学中的信令网络。
      )。虽然这些方法使得能够表征高达几百个泛素瘤位点,但它们本身是由络复杂性的增加而受到阻碍,这些方法是由于在消化后富集的蛋白质的未修饰区域的存在而导致的复杂性增加(
      • Danielsen J.M.R.
      • Sylvestersen K.B.
      • Bekker -Jensen S.
      • Szklarczyk D.
      • Poulsen J.W.
      • 喇叭H.
      • Jensen L.J.
      • mailand n。
      • Nielsen M.L.
      赖氨酸泛菌菌的质谱分析揭示了位点水平的滥交。
      )。
      用胰蛋白酶消化泛素化,NEDD8化或ISG1515151515-151515蛋白质导致遍在蛋白,NEDD8或ISG15的两个C-末端甘氨酸残基的裂解,其与任何改性赖氨酸残基的ε氨基保持连接(K-ε-GG )在消化的底物蛋白中(Fig. 1)(
      • 徐G.
      • Paige J.s.
      • jaffrey s.r.
      泛素残余免疫亲和性分析的全局分析赖氨酸泛素。
      )。修饰的赖氨酸残基未被胰蛋白酶切割,因此K-ε-Gg修饰是基底蛋白的所得的胰蛋白酶肽的内部。最近开发了抗体,其特异性地识别含有K-ε-GG残留的肽(
      • 徐G.
      • Paige J.s.
      • jaffrey s.r.
      泛素残余免疫亲和性分析的全局分析赖氨酸泛素。
      ,
      • 瓦格纳S.A.
      • Beli P.
      • Weinert B.T.
      • Nielsen M.L.
      • Cox J.
      • C.
      对体内泛素胞间位点的蛋白质整体定量调查显示出广泛的调节作用。
      ,
      • 金W.
      • 贝内特e.j.
      • Huttlin E.L.
      • 郭阿。
      • 李杰。
      • 可能A.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      • 哈珀J.W.
      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      )。在这里,我们使用市售的抗-K-​​ε-gg抗体来富集人Jurkat细胞的K-ε-Gg肽(Fig. 1)研究蛋白酶体抑制和DUB抑制对内源泛素化位点的影响。 Mg-132用于抑制蛋白酶体的胰蛋白酶样活性。对于配合抑制,我们使用非选择性可逆的DUB抑制剂PR-619(2,6-二氨基甲基-3,5-双(硫氰酸)),其靶向五个配音家族中的四个(
      • Altun M.
      • 霍尔格H.B.
      • Willems L.I.
      • McDermott J.L.
      • leach c.a.
      • Goldenberg S.J.
      • Kumar K.G.
      • KONIETZNY R.
      • 菲舍尔r.
      • Kogan E.
      • Mackeen M.m.
      • 麦克兰J.
      • Khoronenkova S.v.
      • 帕森斯J.L.
      • Dianov G.L.
      • Nicholson B.
      • 凯斯勒光明
      基于活性的化学蛋白质组学加速抑制抑制剂的抑制剂酶。
      )。总共成功地从2039蛋白鉴定了5533个不同的K-ε-GG肽,并从1883蛋白定量了4907k-ε-GG肽。涉及液相色谱 - 串联MS(LC-MS / MS)之前涉及蛋白质消化的最小分馏的技术改进允许我们使用来自每个标签状态的几毫克蛋白质裂解物在硅胶三重编码样品中获得该覆盖水平和定量。

      实验步骤

       细胞培养

      用于稳定同位素标记氨基酸在细胞培养物(Silac)实验中(
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
      ),Jurkat E6-1细胞(ATCC)在ROSWELL PARK MEMORICTE研究所1640媒体中培养 l-Arginine和 l-Lysine(康森实验室的定制制备,北洛根,UT)。培养基补充有10%透析的胎儿牛血清(Safc-sigma),青霉素,链霉素和谷氨酰胺。细胞生长在含有的培养基中 l-arginine(arg0)和 l-Lysine(Lys0), l-Arginine-13C6 (arg6)和 l-4,4,5,5-D4 (L)(LYS4),或 l-Arginine-13C6, 15N4 (arg10)和 l-Lysine-13C6,15N2 (LYS8)(SIGMA ISOTECH)用于~7倍。收获前五个小时,用0.5%v / v二甲基磺氧化物,5μm处理细胞m MG-132(Calbiochem,San Diego,CA),或5μm PR-169(LifeSensors)。所描述的细胞培养程序用于制备每个氧化钙三重编码实验的两个生物学复制。通过在混合氧化硅酸编码状态之前分析肽样品来监测硅酸氨基酸掺入。

       细胞裂解,蛋白质消化

      将细胞颗粒在8℃下裂解4℃ m urea, 50 mm Tris pH 7.5, 150 mm NaCl, and 1 mm EDTA含有2μg/ ml抑肽酶,10μg/ ml leapeptin,1米m 苯基甲基磺酰氟,50μm PR-619, and 5 mm 氯乙酰胺。使用双链烷酸(BCA)蛋白质测定(Pierce,Waltham,MA)来估计蛋白质浓度。将硅酸盐标记的样品合并使用每硅酸盐状态的5mg蛋白质,每个实验复制。从1 T175烧瓶获得约5mg蛋白质。用5米处理样品m 在室温下二硫噻钛醇45分钟。通过10米治疗完成尿甲酰化m 室温下碘乙酰胺45分钟。将蛋白质混合物稀释至2 m urea with 50 mm Tris / HCl pH 7.5并用测序级胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)在室温下消化。用三氟乙酸(TFA)酸化肽混合物,并使用500mg TC18 SEP-PAK SPE盒(水域,Milford,MA)脱盐。将脱盐肽混合物冷冻并随后使用FreeZone Triads冷冻干燥系统(Labconco,堪萨斯城,Mo)冻干。

       强阳离子交换(SCX)色谱

      在SCX缓冲液A中重新悬浮冻干肽(每硅酸盐5mg)(7米m KH24 pH 2.65,30%乙腈)并在多硫乙基柱上分离(250×9.4mm,5μm,200埃)(Polylc)使用Akta净化器10系统(GE Healthcare)。 160 min SCX梯度用于以3ml / min的流速分离。梯度由20分钟的平衡相组成,具有100%缓冲液A,线性增加至30%缓冲液B(7米m KH24,ph2.65,350 mm KCl,30%Mecn)在30分钟内,第二线性增加到80分钟的75%缓冲液B,100%B持续10分钟,并与缓冲液A的最终平衡20分钟。注射样品后,在整个运行过程中用P950馏分收集器收集60个级分。通过UV 214nm迹线引导SCX级分的汇集。对于蛋白质组分析,将5%的每个SCX分数等分,并将级分组合成24个蛋白质组样品。对于实验1 /复制2仅分析23个蛋白酶SCX级分。对于K-ε-GG分析,使用每个SCX分数的95%,并且SCX级分组合成四个K-ε-GG样品。将所有级分冻干,脱盐,并再次冻干。

       K-ε-gg肽富集

      冻干肽在50米中重构m MOPS pH 7.2, 10 mm 磷酸钠和50米m NACL(IP缓冲区)。 K-ε-gg泛素残余蛋白抗体抗体珠缀合物(由供应商提供的80μl1:1浆料)(电池信号传导技术,Danvers,MA)用冰冷的IP缓冲液洗涤三次,并将其平等地分成四管。将肽混合物加入到K-ε-gg抗体珠中,并在4℃下温和旋转温育过夜。用冰冷的IP缓冲液洗涤抗体珠3次,然后用冰冷的冰2O.对于肽洗脱,将50μl0.15%三氟乙酸(TFA)加入到抗体珠中两次,收集上清液。所有肽都使用C18 st序(
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      使用缘物的蛋白质组学的微纯化,富集,分馏和储存的微纯化,富集,分馏和储存的方案。
      )。在样品加载之前,用50μl60%乙腈/ 0.1%TFA洗涤酸洗,然后用0.1%TFA洗涤两次。然后将肽混合物直接加载到滞后,随后用100μl0.1%TFA洗涤两次。用100μl60%乙腈/ 0.1%TFA洗脱肽从滞后洗脱并干燥以完成。

       LC-MS / MS

      将肽混合物在1%甲酸/ 3%乙腈中重构,并在联系着Agilent 1200 HPLC系统的LTQ orbitrap VeloS质谱仪(Thermo Fisher Scientific)上分析。将样品直接注射在毛细管柱上(360μmO.D.×75μmi.d.),内部有12厘米的3μmReprosil-pur C18-AQ树脂(Maisch GmbH)。毛细管柱配备有集成的10μm尖端。 HPLC流动相A为0.1%甲酸,流动相B为90%乙腈/ 0.1%甲酸。使用反相HPLC梯度在200nl / min的柱上从柱洗脱,其中70分钟的线性梯度(0.29%b / min),从10%溶剂A(水中0.1%甲酸)至30%溶剂B(0.1 %甲酸/ 90%乙腈)。包括样品加载和柱再现的总运行时间为140分钟。
      LTQ orbitrap Velos以数据相关的模式操作,其中MS1扫描以60,000的分辨率和1,000,000离子的分辨率获取MS1扫描。 MS1扫描之后是碰撞诱导的解离MS / MS扫描前16个最丰富的离子。在离子阱中获得所有MS / MS扫描,目标值为10,000离子,归一化碰撞能量为30,隔离宽度为2.5 Amu。动态排除已启用,排除持续时间为20秒。

       MS数据分析

      使用MaxQuant软件包,1.2.2.5版本鉴定和定量肽和蛋白质,以及下面描述的术语和设置特定于此软件,(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      ,
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      和romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      )。 MS / MS Spectra针对人类国际蛋白质指数(IPI)数据库(版本3.68),其中包含87,062个条目和248个经常观察到的实验室污染物,如MaxQuant软件包所提供的。前体质量容差设置为20ppm,用于第一个搜索,其中完成初始质量重新校准。对于主要搜索,使用6PPM前体质量耐受性。用大众耐受0.5 da检测产品离子。用于搜索的最大前体离子电荷状态为7.被搜查了半胱氨酸的氨基甲酰化,作为甲硫氨酸的固定改性和氧化,蛋白质n末端,柿子脱氨酸的乙酰化,并且在赖氨酸残留物的侧链上的甘氨酸存在于赖氨酸残留物上的存在修改。将酶特异性设定为胰蛋白酶,并且最多允许两个错过的裂解进行搜索。肽和蛋白质鉴定的基于目标诱导的基于肽的假发现率(FDR)设定为肽和蛋白质的1%(
      • eliasj.e.
      • Gygi S.P.
      目标 - 诱饵搜索策略通过质谱法对大规模蛋白质鉴定的置信度提高。
      )。为分析启用了标记的氨基酸和肽重量函数的过滤器。未经修改,氧化甲硫氨酸,脱酰胺酰胺和N-末端乙酰化肽用于蛋白质量化。
      氧化硅酸肽比从最大的证据表中获得。将鉴定为反向或污染物的所有肽从数据集中移除。在给定的实验中,所有非K-ε-GG肽氧化物比率用于归一化K-ε-GG氧化硅比。 Arg和含有含肽的肽被独立归一化以校正以校正不完全氨基酸掺入。归一化后,K-ε-GG氧化硅比是数2 对于给定实验中给定K-ε-Gg肽的所有非本意形式计算转化和中值值。仅通过充电状态,甲硫氨酸氧化,天冬酰胺脱酰胺或N-末端乙酰化不同的肽不被视为截然不同。为了帮助肽分组,简化了K-ε-GG站点定位信息,使得≥0.75的原始定位得分被认为是一个自信的本地化网站,并以1分,原始本地化得分表示<0.75和≥0.5被认为是50%的局限性,并表示得分为0.5;和原始本地化得分 <0.5被认为无百分化,因此没有给出局部分数。肽鉴定,其中将三种位点定位于肽的C末端液体中被认为是假阳性的(因为如前所述,胰蛋白酶不会与K-ε-gg位点相邻(
      • seyfried n.t.
      • 徐P.
      • Duong D.M.
      • 诚变。
      • 汉福J.
      • 彭J.
      验证泛染蛋白质组的系统方法。
      )))从数据集手动删除。在仅含有两个Lys残基的肽并且还以裂解的肽,认为甘露出的改性被认为是将第二个C末端Lys残基的第二次。
      从MaxQuant蛋白质组表中获得蛋白质水平信息。从数据集中除去鉴定为反向命中或污染物的主要蛋白质基团。所有报告的蛋白质基团被两种或更多种不同的肽鉴定并用三个或更多个比计数量化。通过计算标准化的中位值来得出蛋白质氧化蛋白硅酸硅比率2 转化为给定蛋白质组的肽氧化物比例。含有精氨酸和赖氨酸的肽分别归一化,以算解不完全标记。在蛋白质水平定量中不考虑K-ε-Gg肽。
      使用对每个治疗条件的两种复制测量,使用中度的T型统计鉴定差异(向上或向下)调节的肽和蛋白质(
      • Smyth G.K.
      用于评估微阵列实验中差异表达的线性模型和经验贝叶斯方法。
      )。该统计数据类似于普通的T统计,例外情况下,使用经验贝叶斯方法利用所有肽的信息计算标准误差,从而推断每个单独的肽更鲁棒。这 p 受体化的T统计产生的价值是标称的 p 价值(比那些从普通获得的值 t 测试),并通过控制Benjamini和Hochberg所提出的错误发现率(FDR)来校正多种测试(
      • Benjamini Y.
      • Hochberg Y.
      控制虚假发现率:多次测试的实用和强大的方法。
      )。肽和蛋白质与FDR调整 p 少于0.1的值被认为是可重复调节的。纠正 p 为本研究选择了0.1的值阈值,因为标准 p 由于使用的重复数量和大量受调节肽,值截止值为0.05或0.01导致大量敏感性损失显着损失。
      超链接嵌入中 补充表S1 链接到光谱轧机观察器,其显示用于K-ε-GG肽的带注释的MS / MS光谱。 URL.>256个字符不会有关联的超链接,需要将互联网浏览器粘贴到访问查看器。我们建议在Windows上使用Internet Explorer获取最佳效果。原始数据可用 //proteomecommons.org 他们被反映了 ftp://ftp.broadinstitute.org/distribution/proteomics/public_datasets/Udeshi_MCP_2012/.

       基因本体富集

      David生物信息学资源用于在我们的数据集中鉴定富集的基因本体(GO)术语(
      • 黄D.W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
      ,
      • 黄,达W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      生物信息学富集工具:大型基因清单综合功能分析的路径。
      )。使用David中的功能注释工具完成了浓缩分析。所有分析中使用的背景基因群是整个人类基因集。 GO条款分配了Benjamini-Hochberg调整后 p David的价值小于0.05,被认为是在背景基因集上富集。

       K-ε-GG序列窗口分析

      为了研究近端至K-ε-GG位点的氨基酸的表示,从我们的数据集中为〜5000自信地局部化K-ε-GG位点产生±10氨基酸的序列窗口。此外,从人类IPI数据库(3.66版)随机选择的~5000赖氨酸残基提取相同大小的序列窗口,以用作背景。在K-ε-GG站点和背景数据集之间的序列窗口内的每个位置计算氨基酸的频率计算对数量的差值。为了可视化这些结果,基于使用基因-E的Log-odds比产生热图()。

      结果

       预提词显着增加了硅胶三重编码样品中鉴定的k-ε-gg肽的数量

      我们工作的主要重点是建立实用的方法,用于量化在经历各种扰动条件的细胞中的泛素蛋白酶和蛋白质组中的全局变化。在本研究中,我们开始使用相对于载体处理的蛋白酶体抑制剂Mg-132或宽特异性DUB抑制剂PR-619在细胞处理后量化K-ε-GG肽的丰度变化。Fig. 2A)。我们采用了三重编码的氧化砂,是一种良好的,具有众所周知的和强大的方法,用于量化多个细胞状态肽和蛋白质丰富的变化(
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
      )。在我们的大规模实验中,我们通过比较鉴定的SCX分馏相对于直接富集,研究了在K-ε-GG富集之前预分馏样品的有用性。对于比较,我们的三个硅胶三重编码样品( Fig. 2A分开,使得50%的样品直接富集K-ε-Gg肽,而其他50%首先将50%分为四个SCX级分(Fig. 2B)。通过从初步作品获得的结果引导k-ε-gg IP的级分,以最大化每IP的K-ε-gg肽的产率(补充图S1A)。分别富集每种SCX级分的k-ε-gg肽(所有比较中使用的抗体的总量是等同的)并通过LC-MS / MS分析。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2硅胶实验设计和工作流程示意图。 两种硅胶三编码实验在生物重复液中完成,标签切换如概述(A)。我们的工作流程如下(B)。硅胶标记的Jurkat细胞被裂解,蛋白质还原,烷基化,用胰蛋白酶消化,随后通过SCX色谱法脱离。将每种SCX分数的小百分比组合以产生24种蛋白质组水平分析的总池。将剩余的SCX样品组合以产生用于K-ε-GG富集的四个总池。富含肽混合物的K-ε-Gg肽并通过LC-MS / MS分析。
      我们发现在富集之前将有限的分馏分为四个SCX级分,在三个单独的评估中通过直接富集方法进行三到四倍的鉴定的K-ε-gg肽的数量增加(补充表S1)。从加利福开始每硅酸盐状态5毫克蛋白质,预分子使得能够鉴定多于〜3300个不同的k-ε-gg肽,来自单个氧化硅酸三重编码样品(补充表S1)。平均而言,非K-ε-Gg肽构成每件IP中鉴定的所有不同肽的〜30-50%。发现K-ε-GG肽遵循具有增加的前体电荷状态随着SCX洗脱时间(补充图S1B)。比较K-ε-GG和非K-ε-GG肽之间的测序肽前体显示胰蛋白酶K-ε-GG肽具有更高的前体电荷状态,大多数K-ε-GG肽具有充电状态>2 (补充图S1C)。该发现与k-ε-gg肽倾向于含有比非K-ε-gg肽的氨基酸含有更多的氨基酸,因为胰蛋白酶不能在改性赖氨酸残基和附加的二甘氨酸残余物中裂解(补充图S1D)。最终,我们得出结论,降低复杂性,甚至微小地,显着地增加了给定样品中鉴定的K-ε-Gg肽的数量,而不会大大增加完成定量生物学比较所需的时间量。另外,在富集之前使用SCX分离结合了全蛋白质组分析的分馏和K-ε-GG分析,从而促进在同一样品上获取全局蛋白质组和全局泛素化数据。

       碘乙酰胺诱导的伪影的产生在复杂的混合物中不显着

      以前报道,在使用高浓度的碘乙酰胺(55米)的凝胶消化方案中m)可以诱导在原子组合物中与二甘氨酸残留相同的赖氨酸加合物(
      • Nielsen M.L.
      • vermeulen M.
      • Bonaldi T.
      • Cox J.
      • 莫里达尔L.
      碘丙胺酰胺诱导的伪影模拟质谱中的泛素化。
      )。虽然乙酰胺加合物可能在55米后发生m 碘丙胺酰胺处理凝胶切片,我们推定了碘乙酰胺诱导的伪影的程度是在我们的烷基化条件下复杂混合物的上下文中标称,其用10米治疗m 在Tris HCl缓冲液中的碘乙酰胺。另外,我们不会期望抗k-ε-gg抗体富集乙酰胺加合物。为了确定碘乙酰胺在我们的工作条件下诱导复杂混合物中的显着水平的二乙酰胺伪像,我们将2mg蛋白质从总细胞裂解物处理2mg,其中10米m (我们的工作浓度)或55米m (高浓度)随着D4碘乙酰胺,减少5米m Dithiothreitol。如上所述制备每个样品 补充方法。在用抗-K-ε-Gg抗体富集之前和之后分析胰蛋白肽。这些实验表明,在K-ε-GG预富集样品中赖氨酸残基和K-ε-GG富集的样品中鉴定的肽光谱匹配(PSM)的数量小于0.1%,但我们的工作浓度为0.1% 10米 m iodoacetamide (补充表S2)。另外,将碘乙酰胺浓度增加至55米m 没有导致赖氨酸上重型二乙酰胺加合物数量显着增加。我们一起结束,得出结论,治疗10米的总细胞裂解物m 在我们的反应条件下,碘乙酰胺不会有助于模拟二甘氨酸残留的赖氨酸有效伪像的显着水平。

       蛋白酶体抑制在泛素景观中诱导大效果

      我们通过用小分子抑制剂Mg-132治疗Jurkat细胞来研究蛋白酶体抑制对蛋白质泛素的影响(Fig. 2)。该化合物是20S蛋白酶体的胰蛋白酶样活性的有效抑制剂,通常用于研究普遍存在的蛋白质(
      • myung J.
      • Kim K.B.
      • 船员C.M.
      泛素 - 蛋白酶体途径和蛋白酶体抑制剂。
      ,
      • 岩石K.L.
      • 克拉姆
      • Rothstein L.
      • 克拉克K.
      • Stein R.
      • 迪克L.
      • Hwang D.
      • Goldberg A.L.
      蛋白酶体的抑制剂阻断大多数细胞蛋白的降解和在MHC I类分子上呈现的肽的产生。
      )。 Western Blotting的初始实验证实,MG-132确实增加了ubiquitination的水平随着Jurkat细胞的增加( 补充图S2)。
      对于氧化氧化剂实验,用5μm处理细胞4小时m MG-132显着改变了大量K-ε-GG肽的丰度(Fig. 3A)。我们发现〜50%的K-ε-gg肽被上调>2折,均由MG-132折叠多达30倍(补充表S1)。去生物过程(GOBP)富集用于上调的K-ε-GG改性蛋白质的富集表明,普遍富含普遍富含普遍的机制(Fig. 3B)。在组成泛素级联的三种酶类中的蛋白质上观察到Mg-132处理后的ubiquitination增加的遗址。具体地,在泛素活化酶UBA1上鉴定上调位点,几种泛素缀合酶,包括UBE2D3,UBE2T和UBE2N,以及几种E3连接酶,包括RNF168,RNF216,RAD18,TRIM41和E6-AP(补充表S1)。 20S蛋白酶体的α-和β型亚基也显着增加了泛素化位点,与先前的发现一致(
      • Tanaka K.
      • Tsurumi C.
      26s蛋白酶组:亚基和功能。
      )。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3MG-132和PR-619对K-ε-GG肽的影响。 生物复制的氧化硅比的散点图和直方图1 相对 2 for (A)5μm后的K-ε-gg肽m Mg-132治疗。被认为是受体化的T统计(Benjamini-Hochberg)可重复调节的比率(Benjamini-Hochberg p value <0.1)以红色表示。使用David BioInformatics资源导出丰富的GOBP术语。各种富集的富集(Benjamini-Hochberg p value <绘制的k-ε-gg改性蛋白质(B)上调和(C)由Mg-132下调。生物复制硅酸硅比的散点图和直方图1 相对 2 for (D)17μm后的K-ε-gg肽m PR-619治疗。一系列明显富集的GOBP术语(p <0.05)被绘制为k-ε-gg肽比例(E)上调或(F)下调17μmm PR-619 treatment.
      除了用Mg-132处理观察到的大程度上调,~15%的K-ε-Gg肽可重复下调(Fig. 3A补充表S1)。用于下调的K-ε-GG蛋白的GOBP术语富集(Fig. 3C)表明,在该亚ppulation中高度富集,包括组蛋白H2A,H 2 A,Macro-H2A,H 2B和H1的染色质相关蛋白质在该亚ppopulation中高度富集(补充表S1)。该结果由先前的工作支持,发现在蛋白酶体抑制和蛋白毒性应力下的组蛋白H2a和H2b上的组蛋白泛素水平降低(
      • DANTUMA N.P.
      • groothuis t.a.M.
      • Salomons F.A.
      • neefjes J.
      一种动态的泛素平衡对染色质重塑的蛋白酶体活性。
      ,
      • 徐Q.
      • 法拉姆。
      • 韦伯斯特准
      • wojcikiewicz r.j.h.
      Bortezomib迅速抑制泛素硫代脲酯化至遍税蛋白缀合酶,并抑制组蛋白和I型肌醇1,4,5-三磷酸受体的泛素。
      )。另外,在包括40s核糖体蛋白S20,60s核糖体蛋白L9,L11,L30,L19和L24和伸长因子1-α的转化机器中富集该下调亚群富集。

       PR-619的配音抑制增加了蛋白质泛素化水平,但比MG-132的蛋白酶体抑制较小

      接下来,我们评估了DUB抑制剂PR-619在Jurkat细胞中的一般效果。最初用于评估PR-619对普遍植物蛋白质的全球性印迹。该初始实验证实,PR-619的功能可以增加Jurkat细胞中的泛素化水平随着治疗浓度的增加(补充图S2)。对于基于氧化硅酸的研究,我们处理了两种不同浓度的PR-619,5μ的Jurkat细胞m (low) or 17 μm (high), for 4 h (Fig. 2A)。基于报告的IC选择最终治疗浓度50 values (5uM–20 μm 该化合物的范围抑制配给配音或泛素状的异肽,以及来自供应商(Lifesensors Inc.)的信息表明治疗>30 μm PR-619可以诱导细胞毒性效应。除了用低或高浓度PR-619进行治疗,还用17μ的组合治疗Jurkat细胞m PR-619 and 5 μm MG-132增加在配音抑制后可能迅速降解的那些肽的丰度(Fig. 2A)。
      高浓度PR-619处理导致相对于低浓度处理的受管K-ε-Gg肽的百分比增加(补充图S3)。高浓度PR-619治疗分别改变了〜20%和40%的量化K-ε-GG肽的丰度(Fig. 3D补充图S4)。在高浓度PR-619处理后发现与发现蛋白质相关的GOBP术语的GOBP术语揭示了参与RNA加工功能的蛋白质的富集,包括HNRNP M,HNRPN K,HNRNP H以及ATP依赖性RNA Helicase EIF4A-1和46,以及DNA定向的RNA聚合酶II亚基RPB2(Fig. 3E补充表S1)。也根据Altun等人的研究结果。 (
      • Altun M.
      • 霍尔格H.B.
      • Willems L.I.
      • McDermott J.L.
      • leach c.a.
      • Goldenberg S.J.
      • Kumar K.G.
      • KONIETZNY R.
      • 菲舍尔r.
      • Kogan E.
      • Mackeen M.m.
      • 麦克兰J.
      • Khoronenkova S.v.
      • 帕森斯J.L.
      • Dianov G.L.
      • Nicholson B.
      • 凯斯勒光明
      基于活性的化学蛋白质组学加速抑制抑制剂的抑制剂酶。
      )我们发现PR-619的配音抑制增加了几种蛋白酶体亚基的位点的泛素水平,包括PROS26和PSMA5,但不会显着改变K410(
      • Altun M.
      • 霍尔格H.B.
      • Willems L.I.
      • McDermott J.L.
      • leach c.a.
      • Goldenberg S.J.
      • Kumar K.G.
      • KONIETZNY R.
      • 菲舍尔r.
      • Kogan E.
      • Mackeen M.m.
      • 麦克兰J.
      • Khoronenkova S.v.
      • 帕森斯J.L.
      • Dianov G.L.
      • Nicholson B.
      • 凯斯勒光明
      基于活性的化学蛋白质组学加速抑制抑制剂的抑制剂酶。
      )。有趣的是,类似于Mg-132处理,高浓度PR-619导致组蛋白蛋白和核糖体蛋白的K-ε-GG位点的调节(Fig. 3F补充表S1)。
      在所有氧化钙实验中定量的K-ε-gg肽直接比较5μ的效果m MG-132 相对 17 μm PR-619 (Fig. 4A)。比较约30%的K-ε-Gg肽通过PR-619和MG-132可重复地调节(Fig. 4A)。然而,MG-132显着增加了比PR-619多的k-ε-gg位点的几乎是近两倍的水平。从每个治疗条件的个体分析中,由Mg-132和PR-619下调的K-ε-GG位点的子集在染色质相关蛋白质和平移机械中高度富集,如Po细胞组分,Gobp所示,和PFAM(一个超过13,000多个保守的蛋白质家庭的综合数据库, http://pfam.sanger.ac.uk/)富集(Fig. 4B)。正如预期的那样,两种化合物增加了遍突素本身的K-ε-GG位点的水平,并且也导致泛素样蛋白NEDD8和SUMO-2的K-ε-GG水平增加(Fig. 4B补充表S1)。仅通过Mg-132处理显着调节约30%的K-ε-Gg肽。 Mg-132上调k-ε-gg位点在蛋白酶体亚基α型-1和-6以及调节亚基4和7上发现(补充表S1)(
      • 村田村
      • YASHIRODA H.
      • Tanaka K.
      蛋白酶体组装的分子机制。
      )。仅在PR-619处理后富含k-ε-gg位点的蛋白质子集富含管蛋白(补充表S1)(
      • ren y.
      • 赵杰。
      • 冯J.
      Parkin与α/β微管蛋白结合并增加其泛素化和降解。
      )。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4Mg-132和PR-619诱导的效果比较相同k-ε-gg肽。 散射图和氧化氧化率的直方图(A)5μm后的K-ε-gg肽m MG-132 相对 17 μm PR-619治疗。要生成此图,平均日志2 针对每种治疗条件计算两个生物重复之间的氧化硅比。法规确定使用所谓的T统计(Benjamini-Hochberg p value <0.1)。黑色上色的点未被视为在任何一种治疗条件下重复调节。使用David Bioinformatics资源获得丰富的GOBP,GOCC和PFAM术语。两种最具富集的术语(Benjamini-Hochberg p value <0.05)是制表的(B)对于在每个彩色子集中的K-ε-gg改性蛋白质。星号表明没有确定无明显富集的本体论术语。
      PR-619的配音抑制可能导致在没有蛋白酶体抑制的情况下快速降解蛋白质。因此,为了研究这一点,在存在和不存在Mg-132的情况下进行具有高浓度PR-619的处理。该比较显示,在两个条件下调节近40%的K-ε-GG肽,并且这些K-ε-GG位点的大多数的调节水平相似(补充图S5补充表S1)。在PR-619和MG-132处理的组合后,大约15%的位点仅调节。将该k-ε-gg-肽的副副与用Mg-132处理后获得的设定进行比较,以确定通过PR-619和Mg-132的组合处理明显调节k-ε-gg位点。在Mg-132处理数据中观察到的总,在Mg-132处理数据中观察到的13k-ε-gg改性蛋白含有K-ε-GG位点,其仅通过组合处理PR-619和Mg-132可重复地上调。该清单包括蛋白质泛素受体ADRM1和NEDD8的K54的K21的修饰(补充表S1)。含有k-ε-gg位点的蛋白质以pr-619和mg-132处理的组合上调是潜在的候选候选者,用于在配音抑制后的ups降解。总的来说,我们发现许多K-ε-GG位点被PR-619和MG-132调节到类似的程度。然而,在研究的K-ε-GG位点中,我们发现Mg-132的抑制蛋白酶体的抑制导致较上调的K-ε-GG位点的数量几乎是相对于PR-619处理的两倍。

       K-ε-GG肽的富集促进扰动诱导对络合蛋白键的影响

      所描述的方法也可用于测量细胞扰动后全局多泛素链拓扑的变化。嵌合蛋白酶的含有钙的赖氨酸残留物的所有细胞治疗条件(Fig. 5)。与先前的发现类似,观察到蛋白酶体抑制增加了所有络合蛋白键的丰度,但对K63的效果温和的效果,已知具有非蛋白质函数的部位(
      • 瓦格纳S.A.
      • Beli P.
      • Weinert B.T.
      • Nielsen M.L.
      • Cox J.
      • C.
      对体内泛素胞间位点的蛋白质整体定量调查显示出广泛的调节作用。
      ,
      • 金W.
      • 贝内特e.j.
      • Huttlin E.L.
      • 郭阿。
      • 李杰。
      • 可能A.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      • 哈珀J.W.
      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      ,
      • 毁伤器e.b.
      • na c.h.
      • 徐P.
      • seyfried n.t.
      • Duong D.M.
      • 诚变。
      • 驾驶M.
      • Rees H.
      • LAH J.J.
      • Levey A.I.
      • 赶紧J.
      • 彭J.
      三种蛋白水解胁迫中的络合蛋白键合型材表明了阿尔茨海默病的病因。
      ,
      • 邓兰
      • 王C.
      • 斯宾塞E.
      • 杨L.
      • 布劳恩A.
      • 你j.
      • 屠宰C.
      • 扒式C.
      • 陈Z.J.
      通过Traf6激活IκB激酶复合物需要二聚体泛素 - 缀合酶络合物和独特的多化蛋白链。
      )。 PR-619对几乎所有键的Mg-132相对于Mg-132诱导较高泛素链比率的影响。这可能表明,与Mg-132相比,PR-619对蛋白酶体上的抑制作用低,如供应商所示,或者由PR-619的大部分络合蛋白链通过蛋白酶迅速降解。有趣的是,PR-619治疗减少了K6多粘合剂键的水平比较来自PR-619治疗的结果,并且没有MG-132的存在表明PR-619和MG-132的组合处理对于显着增加水平并不重要络合剂链(Fig. 5)。总体而言,我们发现Mg-132在增加相对于PR-619的多泛素键的水平时更有效。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5治疗对多泛素键的影响。 甲酸LOG2比率绘制了泛素的甘氨酸的甘氨酸赖氨酸残基。用于该分析的所有Nondistinct K-ε-Gg改性赖氨酸残基的比率用于该分析。

       邻近k-ε-gg位点的氨基酸的表示

      大规模的泛素网站测绘努力促进邻近K-ε-GG位点的氨基酸表示的研究,这有助于了解赖氨酸泛素的特异性。为了搜索近似至K-ε-GG位点的过度或不足的氨基酸,我们将所有氨基酸的频率与自信地位的K-ε-GG位点之间的±10氨基酸序列窗口(从蛋白质序列中提取)进行比较从我们的数据设置为来自人IPI数据库的随机选择的赖氨酸残留的背景。计算序列窗口中每个位置处的氨基酸频率的Log-odds比率,结果被视为热图(补充图S6)。类似于Kim的最近发现 等等。,观察到最明显的效果是碱性氨基酸赖氨酸和组氨酸的特殊效果,特别是N-末端到K-ε-GG位点,并延伸到-4位置(
      • 金W.
      • 贝内特e.j.
      • Huttlin E.L.
      • 郭阿。
      • 李杰。
      • 可能A.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      • 哈珀J.W.
      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      )。此外,我们发现脯氨酸残留物在±1位置耗尽。我们还观察到甘氨酸,丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸,谷氨酰胺和天冬酰胺残留物的一定程度的甘氨酸,丝氨酸,氨基氨基酮与K-ε-GG位点。在我们的数据集中使用主题浓缩(数据未显示)中没有发现强序列图案(
      • 施瓦茨D.
      • Gygi S.P.
      从大规模数据集鉴定蛋白质磷酸化基序的迭代统计方法。
      )。我们注意到,这些观察结果可以反映抗-K-ε-Gg抗体的序列偏差。

       稳态蛋白质水平在很大程度上不受蛋白酶体和配音抑制后的影响

      除了富集K-ε-GG肽外,我们在同一样品上进行了全蛋白质组分析(没有UB富集),以研究MG-132和PR-619对蛋白稳态水平的影响。我们可重复定量的2675和2382蛋白,分别在氧化硅酸盐实验I和II中的至少三种不同的肽比定量(Fig. 2补充表S1)。结果,我们获得了蛋白质组的级别信息,用于在氧化硅酸三重编码样本中鉴定的大约一半的K-ε-Gg改性蛋白质(图。 6.A6B)。在这种覆盖深度,我们获得了许多重要调节酶调节蛋白泛素的全部蛋白质组数据,包括>10 E2s, >20 e3s,和~15个配音。最初惊讶地发现,几乎所有蛋白质水平不受Mg-132或PR-619治疗后的影响,无论K-ε-GG水平的调节程度如何,随着普发化的规范功能被UPS降解(图。 6.C6D)。有趣的是,在所有治疗条件下发现泛素本身的蛋白质水平不变。这些结果与最近的大规模蛋白质组学努力的数据相关,所述大规模蛋白质组织还研究了蛋白酶体抑制对整个蛋白质水平的影响(
      • 金W.
      • 贝内特e.j.
      • Huttlin E.L.
      • 郭阿。
      • 李杰。
      • 可能A.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      • 哈珀J.W.
      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      )。作者表明,蛋白酶体抑制后对蛋白质水平的最小变化可以与给定蛋白质的普发蛋白质的低化学计量相连(
      • 金W.
      • 贝内特e.j.
      • Huttlin E.L.
      • 郭阿。
      • 李杰。
      • 可能A.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      • 哈珀J.W.
      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      )。对于在Mg-132处理后量化的K-ε-GG位点,我们比较了K-ε-GG肽的氧化硅比,含有改性赖氨酸残基的未改性肽,以及测量的蛋白质氧化物比例研究K-ε-GG网站化学计量(补充图S8A,S8B和S8C)(
      • 奥尔森J.V.
      • vermeulen M.
      • 桑塔马里亚A.
      • Kumar C.
      • 米勒M.L.
      • Jensen L.J.
      • GNAD F.
      • Cox J.
      • Jensen T.S.
      • nigg e.a.
      • 布鲁纳克斯。
      定量磷蛋白酶在有丝分裂期间揭示了广泛的全磷酸化位点。
      )。我们注意到,由于赖氨酸残基的泛素导致胰蛋白酶的未错过切割,因此对于大多数病例而言,不可能对K-ε-GG和非K-ε-GG状态的比较是不可能的。非K-ε-Gg肽比与蛋白质比的比较表明,只有小百分比的非k-ε-gg肽氧化物比例显着不同于测量的K-ε-gg位点的蛋白质比例(补充图。S8B)。在Mg-132处理后的非K-ε-gg和k-ε-gg氧化氧化物比的进一步比较也表明,大多数受调节的K-ε-gg位点没有显示非k-ε的互易变化-gg Silac比率(补充图S8C)。我们的数据在一起支持假设,即该研究中测量的大多数K-ε-GG位点具有低的上基质计量,这将导致蛋白质水平的最小观察到的变化。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6蛋白质组分析结果。 硅酸蛋白和k-ε-gg改性肽的重叠(A)实验我和(B)实验II。散射图和直方图显示为生物复制1的氧化脂肪差 相对 2用于蛋白质组水平蛋白质比率(C) 5 μm Mg-132治疗和(D) 17 μm PR-619 treatment.

      讨论

      这项工作的重点是开发实用的常规,鲁棒和相对快速的泛素化蛋白质组学研究方法。我们设计了我们在同一样品上启用泛素化以及整个蛋白质组分析(相对 独立样品)对样品进行保护,并减少昂贵的标记试剂和使用仪器时间的量。通过SCX采用有限预选的肽的有限预分化的工作流程与K-ε-GG富集相容,并且在给定的Silac三编码实验中鉴定的K-ε-Gg肽的数量提供三到四倍。使用加利福尼。每硅酸盐标签状态为5mg输入蛋白,我们成功鉴定了5533个不同的K-ε-GG肽,其中量化了4907个。每种状态的这些输入蛋白量可以很容易地衍生出几只(例如 4-5)细胞的盘子,以及k-ε-gg数据的获取只需要1.5天的仪器时间。因此,这里介绍的策略代表了在各种细胞扰动研究中分析全球泛素化的实用且易于可实现的方法。其他组最终表明,使用抗k-ε-gg抗体,通过将基于氧化基于氧化基的实验限制为仅两种状态,可以在给定的样品中鉴定大量的K-ε-gg肽(5000-7000)(
      • 金W.
      • 贝内特e.j.
      • Huttlin E.L.
      • 郭阿。
      • 李杰。
      • 可能A.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      • 哈珀J.W.
      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      ,
      • Emanuele M.J.
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      • 徐Q.
      • Thoma C.R.
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      • 郭阿。
      • 陈y.n.
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      • HSU P.W.
      • Yen H.C.
      • elldege s.j.
      模块化Cullin环连接酶基材的全局鉴定。
      )或通过无标记实验(
      • 瓦格纳S.A.
      • Beli P.
      • Weinert B.T.
      • Nielsen M.L.
      • Cox J.
      • C.
      对体内泛素胞间位点的蛋白质整体定量调查显示出广泛的调节作用。
      )全部结合大大增加的输入蛋白(高达35mg)。我们对瓦格纳进行的基于硅胶实验的研究结果比较 等等。 (
      • 瓦格纳S.A.
      • Beli P.
      • Weinert B.T.
      • Nielsen M.L.
      • Cox J.
      • C.
      对体内泛素胞间位点的蛋白质整体定量调查显示出广泛的调节作用。
      )显示两个生物重复的类似k-ε-gg站点标识的数量(补充图S7补充表S2)。最重要的是,这种比较揭示了在两个独立实验室中进行的Mg-132治疗中被发现的生物过程中的高度相似性。我们认为,通过优化抗体富集策略以及所用预分馏方法的具体选择,可以进一步改善量化的K-ε-Gg肽和限制性生物样品量的蛋白质。这种改进将促进将定量的泛素化分析施用于原代细胞和其他蛋白质量可以限制的情况。
      在该研究中,我们表明,常用的蛋白酶体抑制剂Mg-132的蛋白酶体抑制和由广义的DUB抑制剂PR-619的抑制作用对蛋白质泛素化水平极大的影响。正如预期的那样,蛋白酶体抑制显着增加了几乎所有络合剂键的水平,并导致测量的所有K-ε-GG位点的上半部分(补充表S1)。 DUB抑制还增加了大量蛋白质的泛素水平,包括参与所述前mRNA加工的蛋白质。我们发现,通过相对于蛋白酶体抑制的抑制作用较低的络合蛋白键通常较小,表明用蛋白酶体抑制剂的细胞治疗是一种更有效的方法,用于增加可以是UPS降解的候选蛋白水平的更有效的方法。总的来说,我们发现Mg-132的蛋白酶体抑制在增加泛素位点相对于PR-619的水平方面更有效。
      细胞泛素以各种形式分布,包括单和泛素键以及游离分子池(
      • groothuis t.a.
      • DANTUMA N.P.
      • neefjes J.
      • Salomons F.A.
      泛素串扰连接细胞过程。
      )。以前的工作表明,蛋白酶体抑制剂引起组蛋白的脱水,并将这种现象联系起来,以将免费的泛素重新分配到遍突蛋白缀合物中,这响应于这些化合物诱导的蛋白毒素应激(
      • DANTUMA N.P.
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      一种动态的泛素平衡对染色质重塑的蛋白酶体活性。
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      由蛋白酶体抑制剂和应激响应诱导剂引起的人肿瘤细胞中核肉组织的快速脱水:对复制,转录,翻译和细胞应激反应的影响。
      )。从我们的作品来看,我们发现蛋白酶体抑制以及广泛的配音抑制导致组蛋白泛素的水平降低,这表明两种化合物通过破坏泛素平衡来诱导蛋白毒性应力。知道这一点,我们建议使用全球影响泛素处理的抑制剂时考虑仔细的实验​​设计 体内 扰动诱导对蛋白质泛素的变化。
      全部蛋白质组级分析显示,稳态水平蛋白质大部分不受蛋白酶体或配音抑制的影响。虽然最初出乎意料,但我们的蛋白质组水平结果与最近的大规模蛋白质组学努力一致,也含有蛋白酶体抑制对蛋白质稳态水平的影响(
      • 金W.
      • 贝内特e.j.
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      • 哈珀J.W.
      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      )。观察到蛋白质水平的明显缺乏调节可能表明,靶向UPS降解的许多染色蛋白质相对于它们的非键合形式存在于低化学计量(
      • 金W.
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      • Huttlin E.L.
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      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      )。在这种情况下,只有一小部分遍布普遍存在的蛋白质通过蛋白质组体清除,蛋白质体的水平似乎似乎在很大程度上保持了全球蛋白质组学方法的含量。另外,已经提出,蛋白酶体的最高可达30%的新合成的蛋白质是用于除去翻译或错误折叠蛋白质的异常蛋白产物的质量控制机制(
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      通过蛋白酶体快速降解大部分新合成的蛋白质。
      )。在我们的研究中,我们观察了在涉及平晶伸长和加工的许多蛋白质上的K-ε-GG位点的调节,这可能导致新蛋白质的合成中的缺点程度,从而降低蛋白质稳态水平的可观察变化。最后,已经表明,蛋白酶体的普遍蛋白质的降解可以依赖于多泛素链长度,这可能影响我们研究中观察到的观察到的蛋白质变化的程度,特别是在配音抑制的情况下(
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      最终,我们发现识别遍布泛素残余肽的抗体引入术语遍历蛋白质泛素的巨大突破。我们表明,这种技术与定量质谱相结合,对于量化泛素景观中的扰动诱导变化非常强大。我们确定这些技术对于了解泛素系统的组分参与人类疾病的组件非常有用,希望加速患有泛素系统的药物的未来发展(
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      泛素系统是否会作为蛋白激酶提供多种药物靶标的药物?
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