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阐明 N - 人血小板彩易福彩的糖基化位点

糖彩易福彩方法*
  • urs Lewandrowski.
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    彩易福彩质质谱和功能性彩易福彩质组学组,Rudolf Virchow实验生物医学中心中心,Versbacher Strasse 9,97078 Wuerzburg,德国
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  • Jan Moebius.
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    彩易福彩质质谱和功能性彩易福彩质组学组,Rudolf Virchow实验生物医学中心中心,Versbacher Strasse 9,97078 Wuerzburg,德国
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  • 乌利希沃尔特
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    武师大学武师大学临床生物化学与病理化学系,Josef-Schneider str。 2,97080德国武师堡
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  • 阿尔伯特·斯科曼
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    应该解决对应的通信。电话:49-931-201-48730;传真:49-931-201-48123
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    彩易福彩质质谱和功能性彩易福彩质组学组,Rudolf Virchow实验生物医学中心中心,Versbacher Strasse 9,97078 Wuerzburg,德国
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  • 作者脚注
    *本文的出版成本部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
      在已知的血小板彩易福彩中,突出和功能重要的基团由糖彩易福彩同种型表示。他们账号例如对于分泌彩易福彩和血浆膜受体,包括整联彩易福彩和糖彩易福彩VI以及细胞溶胶和细胞器的细胞内组分,包括储存彩易福彩(多彩易福彩1等)。虽然已经研究了许多这些彩易福彩质的一段时间关于其功能,但对其糖基化位点进行了很少的关注。在这里,我们报告了对的分析N - 人血小板彩易福彩的糖基化位点。为了富集糖肽,使用凝集素亲和层析以及彩易福彩质结合寡糖的化学捕获。因此,Concanavalin A用于与碳水化合物物种的特异性相互作用以及糖基化彩易福彩的周期性酸氧化和酰肼珠俘获。肽衍生化:N - 糖苷酶F产生的脱糖基化肽,为彩易福彩质及其改性位点提供了基础。使用两种方法与纳米LC-ESI-MS / MS分析组合70不同彩易福彩质中的不同糖基化位点。与Swiss-Prot数据库的比较确定这70个网站中的大多数尚未由以前的研究项目具体确定。通过这种方法,包括酰肼珠亲和力俘获,其中已知在免疫系统中耦合到Ras-mit-活化的彩易福彩激酶途径的免疫球彩易福彩受体G6f在这里首次出现在人血小板中。
      近年来,彩易福彩质组学领域的综合性进展是大量的进展。除了常见的差分彩易福彩质组学分析,重点是两种不同,控制状态的彩易福彩质模式的表征, 例如 健康和患病,来自完全生物的彩易福彩质库存,细胞类型(
      • Maguire P.B.
      • Fitzgerald D.J.
      血小板彩易福彩质组学。
      )或细胞器(
      • 镰刀A.
      • 驯鹿J.
      • 瓦格纳Y.
      • joppich c.
      • Zahedi R.
      • Meyer H.E.
      • Schonfisch B.
      • Perschil I.
      • Chacinska A.
      • GUIARD B.
      • 击败P.
      • Pfanner N.
      • Meisinger C.
      酿酒酵母酿酒酵母细胞粒细胞彩易福彩质组。
      )受到相当大的关注。然而,大多数这些调查都几乎没有注意调查彩易福彩质的翻译后修饰, 例如 糖基化和磷酸化位点。在这方面的大多数数据仍然通过对个体彩易福彩质的研究获得。
      通常称为对彩易福彩质的最常异质的改性。丰富的类型 O- N - 糖基化包含最常见的丝氨酸,苏氨酸和天冬酰胺残基以及糖基磷脂酰肌醇锚。此外,碳水化合物添加如 C - 甲糖基化和 O- 已知岩藻糖基化存在于感兴趣的彩易福彩质上(
      • Hofsteenge J.
      • Huwiler K.G.
      • MACEK B.
      • 赫索斯D.
      • 劳勒J.
      • mosher d.f.
      • Peter-Katalinic J.
      C - 甲糖基化和 O- 血压素型1模块的岩藻丝化。
      )。这些修改的巨大复杂性通常由于单个同种型的低样品和结构多样性而导致的详细分析。 O- 例如,糖基化可以分布到八种不同的核心结构,具有许多可能的延伸和修改(
      • van den Steen P.
      • rudd下午
      • DWEK R.A.
      • Opdenakker G.
      O型糖基化的概念和原则。
      )。结构甘油数据库包括到目前为止彩易福彩质的2000多种不同的糖修改(
      • Cooper C.A.
      • 哈里森M.J.
      • 威尔金斯M.R.
      • 包装机N.H.
      glycosuitedb:糖彩易福彩甘油结构及其生物源的一种新的愈合关系数据库。
      )。
      然而,尽管糖基化的重要性,甚至在血小板彩易福彩的糖基化上的基本数据仍然很少见 例如 在细胞 - 细胞识别(
      • 顾J.
      • Taniguchi N.
      N-Glycans对整联彩易福彩功能的调节。
      ),配体结合,抗原呈递,病原体结合及其在疾病中的作用。碳水化合物附着于肽骨架的部位是主要的兴趣。此外,附着的聚糖的详细结构以及在一系列糖基化位点上的同种型的分布是潜在的研究主题。为了 N-glycosylation通过已知的共识序列(n)支持糖基化位点的搜索(nX(S / T)在哪里 X 不等于pro)。结合 例如 具有来自结晶研究和关于糖基化类型的实验细节的结构数据,这些信息将有助于确认先前的发现, 例如 彩易福彩质 - 聚糖相互作用研究。在相互作用表面上的修改位点的存在可以在这种情况下揭示完全新的特征。
      为了阐明 N - 糖基化位点非常方便的方法利用Pngasef的性质
      使用的缩写是:pngasef,peptide:N - 糖苷酶F.
      1使用的缩写是:pngasef,peptide:N - 糖苷酶F.
      (
      • tarentino a.l.
      • 戈麦斯下午
      • Plummer Jr.,T.H.。
      肽的柿酰胺连接聚糖的脱糖基化:N-糖苷酶F.
      )。这种酶不仅可以切割所有类型的类型 N-glycans,少数例外(
      • Tretter V.
      • altmann f.
      • Marz L.
      肽-N4-(N-乙酰-β-葡糖苷基)天冬酰胺酰胺酶F不能释放含有岩藻糖的聚糖α1→3至天冬酰胺连接的N-乙酰葡糖胺残余物。
      )来自多肽骨干,但在该过程中也具有额外的酰基酶活性。因此,PNGASEF在切割反应过程中将天冬酰胺转化为天冬氨酸。这导致最近可用质谱仪大部分最近可检测的1 -DA质量偏移。关于分析的主要缺点是完全细胞消化中的大量非糖基化肽。通常只有主要的结构彩易福彩质化合物, 例如 肌动彩易福彩和菲素,被鉴定而不是低丰度分子,这具有优异的兴趣。对于糖肽的比富集,使用了两种方法。因为主要是 N - 糖基化彩易福彩在这种方法中靶向,我们使用康乃馨A用于捕获广泛的范围 N-glycans(
      • Baenziger J.U.
      • Fiete D.
      康丹林的结构决定簇对寡糖的特异性。
      ,
      • Bhattacharyya L.
      • Haraldsson M.
      • 啤酒c.f.
      康丹林与天冬酰胺连接的糖肽的相互作用。二醇的偏见性寡糖的偏差。
      )。 2倍凝集素亲和色谱法产量主要是糖肽作为主要物种。由此,从凝集素柱洗脱捕获的糖彩易福彩并用胰彩易福彩酶消化。通过第二凝集素亲和层析去除非糖基化肽后,使用PNGASEF进行衍生化。一种更少的特定方法,不限于某些类型 N-glycans,通过使用聚糖残留物的化学衍生化和在酰肼官能化树脂上使用聚糖残基的化学衍生化和糖基化彩易福彩质的诱捕。由此,通过在大多数六角体中存在的邻甲基二醇的周期性酸氧化将反应性醛基引入糖侧链中。这些醛可以与酰肼 - 衍生的琼脂糖珠子共价偶联。通过使用Pngasef进行糖肽的洗脱。由于所得肽的复杂性混合物在质谱中的分离是必要的。我们使用纳米反相HPLC与ESI-MS / MS组合。使用的仪器结合了高灵敏度和选择性,以及对衍生糖肽的分析的必要分辨率和质量准确性。

      实验步骤

       材料-

      从Vector Laboratories,Burlingame,Ca和肼珠中购买了琼脂糖约束的Concanavalin A来自Perbio Science,Bonn,德国。 Pngasef是从罗氏应用的科学获得的。胰彩易福彩酶是从德国Steinheim的Fluka订购的。本研究中使用的所有其他化学物质从Sigma订购,并且具有分析或更高的等级。

       纯化人血小板 -

      使用已发表的程序的修饰制备纯化的人血小板(
      • Tandon N.N.
      • Lipsky R..
      • Burgess W.H.
      • 杰米森G.A.
      血小板糖彩易福彩IV(CD36)的分离与表征。
      )包括重复的离心和洗涤步骤和洗涤剂衍生的血小板制剂(德国Wuerzburg大学输血医学系)。为了除去血浆彩易福彩,潜在地污染白细胞和红细胞,将样品在50ml离心管中以380×离心两次。 g 室温下15分钟。两个颗粒都被丢弃了。上清液以380×离心 g 20分钟,用10米洗涤颗粒两次m 含有5米的柠檬酸缓冲液m KCl, 145 mm NaCl, 14 mm glucose, and 1 mm MgCl2,pH 6.4。将获得的血小板粒料在液氮中冷冻直至进一步使用。

       肼亲和力捕获 -

      通过加入15μl1%SDS,100米来进行血小板裂解m NaCl, 50 mm Tris,每毫克血小板湿重的pH 7.8。加入10个玻璃珠(1.2毫米直径,VWR International,Nuernberg,德国),体积为1000μL,通过超声波负载裂解。减少25米后m 使用60米的二硫醇和烷基化m 碘丙胺酰胺样品被透析为100米m 磷酸钠,pH7.0过夜。将钠碘酸钠加入到4mg / ml的浓度中,并在室温下在黑暗中进行温育40分钟。第二次透析到100米后m 将磷酸钠缓冲液样品与500μl酰肼珠浆料一起在室温下孵育7小时。用100米洗涤树脂m urea, 50 mm TRIS,PH 7.8随后是在37℃下用胰彩易福彩酶(0.5μg/μl)的被困糖彩易福彩的彩易福彩水解裂解过夜。除去上清液,用1彻底洗涤珠子 m urea in 50 mm Tris,pH 7.8在用Pngasef(0.02单位/ ml)之前在37℃下在100米的过夜消化m 磷酸钠,pH7.0。

       concanavalin a亲和捕获 -

      对于凝集素的富集素富集肽血小板裂解为1.6% n - 缓冲液A中的 - 氯葡萄糖(100米m NaCl, 1 mm MgCl2, 1 mm CaCl2, 30 mm TRIS,pH 7.4)导致7mg / mL浓度的彩易福彩质。在1:1用缓冲液稀释后,将样品施加到自填充的4.6mm - 内直径×100mm长的柱上,填充康丹林彩易福彩溶液,衍生化琼脂糖珠与缓冲A平衡,用200μm洗脱样品m 缓冲液中的α-甲基甲酰诺斯核苷。在重复的超滤期间重复缓冲液交换(Centricon;分子量截止,5000; Millipore,Bedford,MA)对抗20米m 碳酸氢铵,pH7.8在37℃下在37℃下以80μg/μl胰彩易福彩酶浓度在37℃下试质16小时。通过加热至95℃去激活胰彩易福彩酶3分钟后,将样品稀释1:1(v / v)并在类似条件下进行第二章凝集素亲和色谱法。浓缩洗脱液,用Pngasef(0.02单位/ ml)消化在37℃下在100米处进行过夜。m 磷酸钠缓冲液,pH7.0。

       肽混合物的反相分离 -

      通过使用反相色谱法实现复合肽混合物的分离。对于Nano-LC-ESI-MS / MS实验,使用AutoSampler(Famos™,Dionex,Idstein,德国)和预先填充(Switchos™,Dionex)组成的设置(Ultimate™,Dionex)组成的设置。预柱(300μm内径×1毫米长)和分离柱(75μm内径×150毫米长度,C18 Pepmap™)购自Dionex。在2小时的时间内使用从5至50%溶剂B(84%乙腈,0.1%甲酸)的线性梯度进行梯度洗脱。溶剂A在水中是0.1%甲酸。在下一分离循环之前,在将5%溶剂B平衡至5%溶剂B之前,将柱子用95%B漂洗5分钟的分离。

       质谱分析 -

      对QSTAR®XL系统(应用生物系统,框架,MA)或Qtrap 4000线性离子阱系统(应用生物系统)进行质谱分析,都配备有纳米ESI源。对于两个系统,使用远端涂覆熔融二氧化硅提示(新目的,Woburn,MA)喷射电压约为2200V。调查扫描(m/z 350-2000)之后是三个MS / MS扫描,分段三种最强烈的肽信号。对于QSTAR,MS和MS / MS扫描周期的采集时间为2秒。 Qtrap扫描周期包括增强的多电荷测量扫描(1秒,在4000 AMU / s设置)和单个增强型分辨率扫描(0.5秒,在250 AMU / s中为三个前体离子)。以下三种增强产品离子光谱中的每一个以4000AMU / s记录为1.5秒(再次在该过程中求和两个光谱)。排除时间为QSTAR XL系统设置为16秒,为Qtrap 4000设置为30 s。

       数据解释 -

      通过数据库搜索使用Mascot™(1.9版,矩阵科学,伦敦,英国,英国)搜索算法来评估实验衍生的质谱数据集。 PEAK列表由分析师QS(QSTAR®XL)和分析师1.4(Qtrap 4000)软件插件(Mascot.dll; Matrix Science)生成。使用此脚本,在峰值列表中省略了具有低于0.1%低于0.1%的强度的峰值,并且该数据在该过程中被厘定。质量偏差被设定为低于或等于0.2Da,以容易地识别ASN的1-DA转换到ASP转换。搜索是使用国家生物技术信息中心(NCBI)非冗余数据库的人类子集进行的(www.ncbi.nih.gov.)。胰彩易福彩酶用作特定的彩易福彩酶,允许两个错过的切割。此外,重复搜索,无需说明彩易福彩酶以寻找未指定的切割产品。只有匹配概率的光谱>选择95%用于手动修订。

      结果

      两种不同的技术用于降低全细胞裂解物的复杂性:凝集素亲和力和氧化肽的氧化/酰肼捕获。在捕获/富集后消除碳水化合物,并将如此改性的(+ 1Da)胰彩易福彩胨进行LC-ESI-MS / MS分析。 70个不同糖彩易福彩的单个糖基化位点被提出的这些实验分配 表I.。与良好的注释瑞士 - Prot数据库进行比较(www.expasy.org.)揭示了之前未经实验证实的高比例的糖基化位点。该数据库主要在已知站点之间差异,具有实验证据存在的存在和通过筛选N注释的潜在网站X(S / T)共有序列。此外,通过在密切相关的彩易福彩质家庭成员之间转移现场信息或在所有其他情况下被称为未知,可以作为类似的网站。单独使用相似性研究确定的未知网站,潜在网站和站点,迄今为止,69%的网站尚未确定(见 Fig. 1)。超过一半的已识别的网站(52%)以前在每次自动注释 N - 由于已知彩易福彩质是彩易福彩质的事实,糖基化共识序列 N - 糖基化。此外,在未知的彩易福彩质中发现10位点在全部或其糖基化位点未知的彩易福彩质中未知。
      表I.在人血小板彩易福彩中鉴定的N-糖基化位点
      图缩略图GR1.
      Fig. 1分类 N - 糖基化位点。 “已知”的分类“未知”,“潜在”(在没有实验证据的情况下自动分配的站点)和“通过相似性”是基于实验数据集与注释的瑞士 - Prot数据库的比较(www.expasy.org.)。总共70个位点可以从人的血小板彩易福彩鉴定。
      描绘了在本研究过程中鉴定的人血栓样彩易福彩1糖基化位点的代表性光谱 Fig. 2。光谱清楚地表现出天冬酰胺的1-Da转移到序列(k)Vvn * sttgpgehlr(n)内的天冬氨酸转化(在彩易福彩质序列中的位置1065-1077;残留物 括弧 与发现的肽序列相邻)以及总肽质量(星号标记ASN-1067在ASN-1067的前者糖基化部位)。然而,仅存在近完整系列的Y-离子以及共有序列的事实验证了该糖基化位点的发现。结合使用所用仪器的合理质量精度(<0.2AD)和定义的彩易福彩水解条件(胰彩易福彩酶摘要导致Arg和Lys作为C-末端氨基酸;很少有非特异性切割产品标有星号 表I.)存在保障实验结果的一系列标准。此外,通过特异性亲和力确保在样品中富集糖肽的样品制剂提供预选标准,用于可能的肽命中。对于大部分仅仅是主要的结构彩易福彩, 例如 可以在制剂中观察到肌动彩易福彩和菲霉素,尽管它们表现出强烈的丰富性,但与靶肽的无亲和选择的设置相比, 例如 多维液相色谱(数据未显示)。与吉祥物算法的更保守的评分参数一起,在这种情况下可以最小化错误正面标识的数量。因此,自发的脱胺似乎相当不可能产生所提出的结果,尽管它不能完全排除。大多数MS / MS光谱源于阳性击中,其来自双电荷的前体离子,主要在综合Y离子系列中产生。尽管使用23个三次电荷的前体用于现场测定,但由于糖基化的部位通常不会明确地分配糖基化的部位而弃去。因此,由于双电荷的前体,可以分配56个识别的大部分。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2纳米ESI-Q-TOF-MS / MS谱的人血栓其1肽。 光谱识别肽序列VVN * sttgpgehlr(星号标记前者的糖基化部位)内的糖基化位点。光谱的主要特征是酶促脱糖基化后ASN转化为1-DA偏移,酶脱糖基化和澄清系列的Y离子。已被观察到这种仪器配置的典型信息。 Y7离子的高强度对应于肽序列中的不稳定脯氨酸键的定位。
      评估两种亲和定向的糖基化位点分析方法的结果显示互补行为。虽然可以观察到一些重叠,但许多位点是通过康昔伐素A或酰肼亲和力来确定但不确定(见 Fig. 3)。该分布反映了亲和纯化的某些不同的特异性。同时康丹林A考虑捕获含有α连接甘露糖残基的结构,肼化学表现出略微更广泛的特异性。这是由于几乎所有携带静脉内二醇组的糖的结合。该组以衍生自生物样品的大多数低聚糖存在。在凝集素亲和层析中发现更多位点,尽管每种彩易福彩质的确定位点的比例有利于化学亲和力方法。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3用于的数值比较 N - 糖基化分析。 通过凝集素亲和色谱法测定大部分位点和彩易福彩质,并通过化学亲和色谱法(氧化/酰肼)较小程度。重叠识别量较少强调需要使用冗余方法。 Cona.,concanavalin A.
      确定的彩易福彩质和网站的完整列表 表I.。为了使能够更轻松,更可靠地访问标识符作为Swiss-Pret条目提供,而不是NCBI非冗余数据库登录号,如图所示。因此,所有鉴定的彩易福彩质序列都使用NCBI Blast效用(
      • altschul s.f.
      • Madden T.L.
      • Schaffer A.A.
      • 张继夫
      • 张Z.
      • 米勒W.
      • Lipman D.J.
      Papped Blast和Psi-Blast:新一代彩易福彩质数据库搜索程序。
      )。列表中包含的彩易福彩质可以分为许多不同的函数和类, 例如 受体,酶和转运彩易福彩/储存彩易福彩。除了整联彩易福彩α2,α6和β3之外,在血小板中鉴定膜结合的受体G6F,证明还可以使用所述方法检测膜结合和低丰度彩易福彩。作为鉴定为糖彩易福彩乙酰肝素酶和内皮素的酶的实例。肝胰酶本身对于肝素硫酸普肽彩易福彩多糖的分解代谢至关重要。怀疑这些酶以帮助在损伤或炎症期间降解基底膜硫酸肝素彩易福彩多糖(
      • k.j.
      乙酰肝素:降解硫酸乙酰肝素彩易福彩增彩易福彩的内糖苷酶。
      )。在类似的研究期间还鉴定了分子伴侣的内皮彩易福彩,旨在鉴定人血浆彩易福彩上的糖基化位点(
      • 张H.
      • 李X.J.
      • 马丁D.B.
      • Aeberberold R.
      使用酰肼化学,稳定同位素标记和质谱法鉴定和定量N-连接的糖彩易福彩。
      )。然而,只有ASN-217和ASN-445以SWISS-PRAT制定和注释,而在我们的研究过程中,也可以验证网站ASN-62和ASN-107。显然,因为实验的布局以及样品材料的不同程度不同,所以必须多方刻渐多方面寻求复杂样品的分析的方法。

      讨论

      在本报告中,提出了对人血小板彩易福彩的天冬酰胺连接糖基化位点的第一系统分析。虽然所识别的彩易福彩质的数量相对较小,但它清楚地识别了许多可疑和新的糖基化位点。通常涉嫌涉嫌场地尚未彻底调查,但仅通过间接证据(如凝胶转移测定)(
      • Patel O.v.
      • Takahashi T.
      • Imai K.
      • Hashizume K.
      本地和重组牛妊娠相关糖彩易福彩的表征。
      )和定期的酸 - 席克夫染色。这些方法表明存在糖基化但不是不同类型或精确的附着位点。在我们的研究中,凝集素亲和层析和含有甘糖基化肽的酰肼珠俘获与纳米LC-ESI-MS / MS的组合提供了直接证明糖基化类型和位点,同时最小化了假阳性作用。
      所识别的彩易福彩质可以分为一系列函数或本地化。这里,将解决一些有趣的彩易福彩质,属性和观点。尽管很多彩易福彩质都表现出来 表I. 已知在一段时间内,尚未详细表征它们的糖基化位点。整联彩易福彩和其他糖彩易福彩被强烈地研究了细胞 - 细胞通信和细胞 - 矩阵相互作用以及这种情况下的信号转导,因为它们是重要的药物靶标。实际上,在整联彩易福彩α2,α6和β3上发现了六种糖基化位点,其仅在其之前注释。因此,我们的数据肯定会刺激这些粘合分子的功能性质的(重新)调查。然而,当前数据库中翻译后修改的注释需要在不久的将来改善。虽然Swiss-Prot数据库已经具有一定数量的糖基化站点,但缺少仍然未知的数字。其他举措,例如人类彩易福彩质参考数据库(
      • Peri S.
      • Navarro J.D.
      • Amanchy R.
      • Kristiansen T.Z.
      • jonnalagadda c.k.
      • Surendranath V.
      • 尼兰江州V.
      • Muthusamy B.
      • Gandhi T.K.
      • 格罗戈尔米
      • ibarrola n。
      • deshpande n。
      • Shanker K.
      • Shivashankar H.N.
      • Rashmi B.P.
      • ramya m.a.
      • 赵Z.
      • Chandrika K.N.
      • Padma N.
      • Harsha H.C.
      • yatish a.j.
      • kavitha m.p.
      • menezes m.
      • choudhury d.r.
      • 苏珊S.
      • Ghosh N.
      • Saravana R.
      • 克兰德兰州
      • 克里希纳S.
      • 欢乐M.
      • Anand S.K.
      • 麦兜V.
      • 约瑟夫A.
      • 黄G.W.
      • Schiemann W.P.
      • Constantinescu s.n.
      • 黄兰
      • Khosravi-FAR R.
      • 斯丁H.
      • Tewari M.
      • 渴哈鹦鹉
      • Blobe G.C.
      • 当C.V.
      • 加西亚J.G.
      • Pevsner J.
      • Jensen O.N.
      • Roepstorff P.
      • Deshpande K.S.
      • Chinnaiyan上午
      • HAMOSH A.
      • Chakravarti A.
      • Pandey A.
      人体彩易福彩质参考数据库的发展作为人类逼近系统生物学的初始平台。
      ),还向文献提供验证的数据集以提高数据库的质量。因此,参考数据库中彩易福彩质组学研究和直接手动输入的组合可能导致序列数据库内更有效的数据存储。
      在我们现在的研究中发现的新血小板彩易福彩的一个非常有趣的例子是G6F。这里示出了作为一些描述的较少已知或未知彩易福彩质的示例 表I. (例如 CLPTM1,GRGP2438和Emilin1)。人G6F由主要组织相容性复合物中的基因编码,并且代表了属于免疫球彩易福彩超家族的I型跨膜彩易福彩。它代表具有细胞内酪氨酸磷酸化位点的推定细胞表面受体。细胞培养实验表明,G6F通过其SRC同源性2结构域与GRB2和GRB7相互作用,并且参与RAS-丝裂原活化彩易福彩激酶途径的下游信号传导(
      • de vet e.c.
      • Aguado B.
      • 坎贝尔R.D.
      适配器信号传导彩易福彩GRB2和GRB7由人G6F募集,该新型在MHC中编码的免疫球彩易福彩超细植物。
      )。有趣的是,迄今未在血小板中描述G6F受体。 G6F在血小板中的可能的功能作用是我们实验室正在进行的调查的主题。
      作为更常见的血小板彩易福彩,血压回彩易福彩1,介导细胞对细胞和细胞至基质相互作用的粘合剂糖彩易福彩(
      • 亚当斯J.C.
      血小板波动素-1。
      ),在我们目前的研究中也被识别出来。它与纤维彩易福彩原,纤连彩易福彩,层粘连彩易福彩,v胶原彩易福彩,和整合αv/β1,αv/β3和αiib/β3结合。它包括四个地点 N底糖基化只有ASN-248已经在瑞士语法数据库中注释了。如所示 Fig. 1,可以将附加站点分配给ASN-1067。
      还观察到一些轻微的污染,例如血浆彩易福彩质,其可以粘附到血小板的质膜上。 α.1 - 钛合金是人血浆的良好表征彩易福彩质,并与两个已知的位点一起鉴定 N - 糖基化(Asn-70和Asn-271)。显然,由于使用的血小板隔离程序,因此不能完全排除来自该来源的血浆污染,其旨在维持血小板函数和完整性。然而,一些彩易福彩质在等离子体液以及血小板中存在, 例如 凝血因子V.该彩易福彩质是参与因子XA以激活凝血酶彩易福彩的辅助因子。 75-80%分布到血浆液,20-25%分布到血小板的α-颗粒(
      • 特雷西P.B.
      • EIDE L.L.
      • Bowie E.J.
      • 曼K.G.
      人体等离子体和血小板中因子V的放射免疫测定。
      )。结果表明它的 N - 链接的碳水化合物部分在活化的彩易福彩C催化切割和凝血因子V的灭活中起着重要作用(
      • Silveira J.R.
      • Kalafatis M.
      • 特雷西P.B.
      碳水化合物部分对ProPofactor因子V,但不是衍生的辅助因子因子Va,通过活化彩易福彩C调节其失活。
      )。四个地点 N因子V的糖基化可以明确地确定,其中ASN-297靠近ARG-334的凝血酶裂解位点。凝血因子V与多国彩易福彩1密切相关,位于血小板α-颗粒中的储存彩易福彩(
      • 海沃德C.P.
      • 释顿D.F.
      • 史密斯J.W.
      • 马伍德P.
      • Stead R.H.
      • podor t.j.
      • Warkentin T.E.
      • 克尔顿·贾斯特
      多方素在静止血小板的α-颗粒中发现,并由巨核细胞系合成。
      )。这种巨大的糖彩易福彩(
      • 海沃德C.P.
      • Warkentin T.E.
      • 马伍德P.
      • 克尔顿·贾斯特
      多体液:一系列大型二硫键在血小板内的多聚体彩易福彩。
      )有23个潜在的糖基化位点,现在可以使用酰肼和凝集素亲和力的组合验证近50%的糖基化位点。以下因子V激活多方素1凝血因子V复合物被解剖,表明多方素1在凝血酶酶组合物之前将因子V输送和定位因子V递送和定位在血小板上(
      • JEIMY S.B.
      • Woram R.A.
      • 富勒N.
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      • Nicolaes G.A.
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      • 凯恩W.H.
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      人因子V的C2结构域内的MMRN1结合区域的鉴定。
      )。
      关于所用捕获方法的特异性,只能在鉴定的糖肽的碳水化合物部分上绘制微不足道的结论。是多年来一直在广泛研究的少数糖彩易福彩之一,α1 - 在实验过程中鉴定了钛合金。相同的彩易福彩质,而是不同的糖基化位点(本研究中的ASN-271和张的ASN-70 等等。 (
      • 张H.
      • 李X.J.
      • 马丁D.B.
      • Aeberberold R.
      使用酰肼化学,稳定同位素标记和质谱法鉴定和定量N-连接的糖彩易福彩。
      ))以先前的酰肼亲和策略鉴定(
      • 张H.
      • 李X.J.
      • 马丁D.B.
      • Aeberberold R.
      使用酰肼化学,稳定同位素标记和质谱法鉴定和定量N-连接的糖彩易福彩。
      )。 Glycosuitedb提供的糖粉扩展(
      • Cooper C.A.
      • 哈里森M.J.
      • 威尔金斯M.R.
      • 包装机N.H.
      glycosuitedb:糖彩易福彩甘油结构及其生物源的一种新的愈合关系数据库。
      )包含一系列复合聚糖(
      • Mega T.
      • 卢豪E.
      • Yoshida A.
      人α的寡糖链研究1-Protease抑制剂。 II。寡糖的结构。
      )。这些结构明显被纳西肼化学捕获,如前所述,也可以通过康乃馨和生物所证明的相互作用(
      • Baenziger J.U.
      • Fiete D.
      康丹林的结构决定簇对寡糖的特异性。
      )。此外,必须考虑单个细胞内碳水化合物多样性的复杂性。可以使用两种方法捕获含有差异处理的糖基化前体的阶段。网站的分布(Fig. 3)通过两种方法阐明,显示了中等重叠,但也只有一种方法或另一个方法发现的高位。该结果可以是捕获方法不同特异性的结果,但也可能是由于在两个分析途径期间的个体样品处理。
      通过与已经存在于X射线释放的彩易福彩质结构的形式的结构数据的组合给出了使用糖基化位点信息的有趣申请。因此,基于Web的工具Glyprot(www.glycosciences.de.),已经可用。它使用彩易福彩质数据库(
      • 贝尔曼芬
      • 威斯布鲁克J.
      • 冯Z.
      • 吉利兰G.
      • Bhat T.N.
      • Weissig H.
      • shindyalov i.n.
      • Bourne P.E.
      彩易福彩质数据库。
      )参赛作品(来自彩易福彩质数据库)并附上 N-glycans到序列中的用户定义的位置。该计划提供所选不同构象之间的选择 N-glycan将附在网站上。还支持使用定制设计的聚糖。 在Silico. 糖基化有时是进入结构细节的洞察力的唯一方法。许多糖基化的彩易福彩质不良好结晶,因此在X射线分析之前除去糖。该算法基于使用关于氨基酸和糖部分之间的连杆的实验数据集(
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      N-糖基化位点彩易福彩质环境的统计分析:占用,结构和折叠的影响。
      )。 Glycan本身的结构由甜美II程序的部分模拟(
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      基于Sweet-WWW的寡糖和多糖的快速施工。
      )。基本上,Glyprot在彩易福彩质的晶体数据和碳水化合物添加到多肽骨架的结构特征之间产生可能的组合。在 Fig. 4, AB, 这 在Silico. 表皮生长因子p-选择素的糖基化结构(彩易福彩质数据库入口1G1Q(
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      通过与SLE结合的P-和E-SELIEN素的结构揭示了白细胞束缚和轧制的分子基础的见解X 和 PSGL-1.
      )))与不凝胶化的变体一起显示(图4C.)。 p-Selectin的表皮生长因子结构域已连接到几种细胞粘附模型(
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      ) 在过去。 ASN-54的糖基化完全改变畴结构的相互作用表面。在这种情况下,附着的寡糖是高甘露糖甘油,但对于细胞表面糖彩易福彩可以改变该结构(
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      血小板唾液酸作为冠心病潜在的致病因子。
      )。表面充电差异 N - 在在这些情况下建模的相互作用表面或设计实验设置时,也必须考虑 - 乙酰甘氨酸附着。因此,显而易见的是,通过添加关键信息,糖基化现场信息的阐明在该领域进行了实质性的益处, 例如 用于设计互动研究。此外,当应用于遗传工程可能性的细胞类型时,该技术是强制性的。因为血小板没有核,因此没有基因组DNA,常规方法用于糖基化分析, 例如 特定于综合序列的特异性突变,根本无法访问。在这种情况下,如本报告中所示,必须直接分析彩易福彩质修改。三肽基肽酶I是该问题的有效示例。它的糖基化位点已在中国仓鼠卵巢和人胚胎肾脏293细胞的模型系统中进行了审查(
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      )但不是血小板。因此,在一个系统中获得的结果可能不会容易地转移到另一个系统中。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4在Silico. 表皮生长因子的糖基化(egf.)p-selectin的域。 表皮生长因子结构域已用高甘露糖进行修饰 N在ASN-54的位置(彩易福彩质数据库入口1G1Q中等于ASN-13)。 AB 描绘域的功能区和固体表面图像,以及 C 显示表皮生长因子结构域而没有聚糖。
      分析方法的主要缺点是由于除去甘油部分而导致的信息的大量损失。因此,少量假设可以对低聚糖结构的性质进行。因为PNGASEF几乎劈开 N-Glycans在该过程中不可能增加额外的特异性,因此可以获得有关检测到的肽的额外信息。然而,通过扩大使用的树脂和内甘油酶的范围可以解决这个问题。具有增强的特异性的凝集素 例如 可以使用杂种或复杂结构或聚糖的特定天线构象。另外,使用组合的内糖苷酶消化使用 例如 可以执行内皮糖苷酶F2和H.虽然内切糖苷酶F2切割了双炔芳糖和高甘露糖结构,但是内甘油酶H对比是抗杂种和低哥域聚糖的活性。因此,通过比较两个单独的实验,可以阐明聚糖部分的性质。总之,血小板彩易福彩的糖彩易福彩研究预计会刺激成立和新型人血小板彩易福彩的未来(重新)调查肯定会有助于解释血小板功能在健康和疾病中的一些异质性。

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