突触后密度准备中磷酸化位点的综合鉴定*

  • Jonathan C. Trinidad.
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    大众光谱设施,加利福尼亚州旧金山加州大学药学化学系94143
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  • Christian G. SpecHt.
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    伦敦Gower Street大学伦敦大学学院药理学分子药理实验室,伦敦WC1E 6BT,英国
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  • Agnes Thalhammer.
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    伦敦Gower Street大学伦敦大学学院药理学分子药理实验室,伦敦WC1E 6BT,英国
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  • Ralf Schoepfer
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    伦敦Gower Street大学伦敦大学学院药理学分子药理实验室,伦敦WC1E 6BT,英国
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  • Alma L. Burlingame.
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    大众光谱设施,加利福尼亚州旧金山加州大学药学化学系94143
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  • 作者脚注
    *这项工作由惠康信托(R. S.)和国家卫生研究院研究资源国家研究资源生物医学研究技术计划授予RR01614和RR14606(至A. L. B.)。通过文森特J. Coate基金会的贡献支持蛋白质探测器软件开发。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“ 广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
    本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)含有补充材料。
    ¶现代地址:斯坦福大学精神病学和行为科学部Pritzker实验室,斯坦福大学,CA 94304-5485。
    ‖可以解决对应的通信。电话:44-20-76797242;传真:44-20-76797245;电子邮件: [电子邮件 protected].
      在哺乳动物中枢神经系统中,称为突触后密度(PSD)的结构是蛋白质的致密络合物,其功能是从突触前轴突终端释放的神经递质检测和响应神经递质。该分子机制中蛋白质磷酸化的调节对于其组分的活性至关重要,其包括神经递质受体,激酶/磷酸酶,支架分子和调节细胞骨骼结构的蛋白质。为了表征PSD样品中蛋白质的磷酸化状态,我们将强阳离子交换(SCX)色谱与IMAC合并。最初,通过阳离子交换分离胰蛋白酶肽,并通过反相色谱法分析与串联质谱法进行分析,从而导致大多数SCX级分中的磷酸肽鉴定。因为这些单独的级分中的每一个过于复杂,以完全在单一LC-MS / MS中进行,我们通过在每个SCX部分上进行IMAC来富集磷肽,相对于单独的任一种方法产生至少3倍的磷酸肽增加( SCX或IMAC)。这使我们使我们能够鉴定至少一个磷酸化位点,以上发现的所有蛋白质中的23%(287个)存在于突触后密度制剂中。总共鉴定了998个独特的磷酸化肽,将723个独特的磷酸化位点。在所有磷酸肽的62%(621个)的62%(998个)中确定至少一个精确的磷酸化位点,并且鉴定的磷酸化位点的〜80%是新的。
      蛋白质磷酸化作为调节蛋白质功能的基本机制。据估计,多达10,000或约三分之一的所有细胞蛋白质可能是磷酸化的(
      • 约翰逊S.A.
      • 猎人T.
      KINOMICS:用于破译Kinome的方法。
      )。突触后密度(PSD)
      使用的缩写是:PSD,后突触密度; Camkii,钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II; P-Camkii,磷酸化Camkii; CDK5,细胞周期蛋白依赖性激酶5; GluR1,离子粒细胞谷氨酸受体亚基1; SCX,强阳离子交换;双内, N,N-bis(2-羟乙基)甘氨酸。
      1使用的缩写是:PSD,后突触密度; Camkii,钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II; P-Camkii,磷酸化Camkii; CDK5,细胞周期蛋白依赖性激酶5; GluR1,离子粒细胞谷氨酸受体亚基1; SCX,强阳离子交换;双内, N,N-bis(2-羟乙基)甘氨酸。
      是一种用于转导和调制神经元之间信号传导的专用蛋白质复合体,其中许多组分由磷酸化事件调节(
      • Yamauchi T.
      分子成分和磷酸化依赖性调节后突触后密度。
      )。
      最近的几种研究使用了质谱方法来鉴定PSD制剂中200和500个蛋白质(
      • 约旦B.A.
      • Fernholz B.D.
      • Boussac M.
      • 徐C.
      • 格里俄罗波尔G.
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      • neubert t.a.
      新型啮齿动物突触后密度蛋白的鉴定与验证。
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      • 李克..
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      • Watson R.
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      • Gouwenberg Y.
      • 甘德福格·艾迪
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      大鼠脑后密度的蛋白质组学分析。不同蛋白质官能团对突触生理学集成的影响。
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      • 诚变。
      • Duong D.M.
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      大鼠大鼠突触突破密度级分质谱法的半定位蛋白质组学分析。
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      • Shinkawa T.
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      蛋白质组学分析使用多维液相色谱 - 串联质谱揭示的突触后密度分数的分子量。
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      • specht c.g.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      突触后密度蛋白的磷酸化状态。
      )。然而,通过在特定氨基酸残基的其相对低的化学计量中,从这些复杂的混合物中鉴定出翻译后修饰,例如磷酸化。例如,前述研究之一通过手动检查1,830 ms / ms光谱来确定13种磷酸肽(
      • 彭J.
      • kim m.j.
      • 诚变。
      • Duong D.M.
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      大鼠大鼠突触突破密度级分质谱法的半定位蛋白质组学分析。
      )。
      因此,努力专注于翻译后修饰的具体浓缩方法,以改善复杂混合物的检测。由于稳健的抗磷酸酪氨酸抗体的可用性,最有效地用于分析来自各种细胞类型的酪氨酸残基的磷酸化。
      • 赶紧J.
      • 莫里茨A.
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      癌细胞中酪氨酸磷酸化的免疫亲和力分析。
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      • 狩猎t.
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      • 吉布森N.
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      表皮生长因子受体过表达鳞状癌细胞的PhosPophyrosine信号网络。
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      • Pappin D.J.
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      表皮生长因子受体信号通信网络中酪氨酸磷酸化位点的时间分辨质谱揭示了动态模块。
      )。 IMAC已成功用于PSD中的磷酸肽(
      • 特立尼达J.C.
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      突触后密度蛋白的磷酸化状态。
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      近期密度蛋白新磷酸化位点的鉴定。
      )和突触体组制剂(
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      体内磷酸化突触蛋白的蛋白质组学分析。
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      • Carlotti Jr.,C.G.
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      • 喘气。
      • Dosemeci A.
      人脑皮层突触体的磷蛋白蛋白质分析。
      )。这些初始研究鉴定在突触蛋白质上的16-33131个总磷酸化位点,使用羧基的酯化来减少与IMAC树脂的非特异性(非磷酸盐)结合(
      • Ficarro S.
      • Chertihin O.
      • Westbrook V.A.
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      • 狩猎d.f.
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      磷酸磷蛋白酶体分析电容人精子。电容过程中激酶锚固蛋白3和含缬氨酸蛋白/ p97的酪氨酸磷酸化的证据。
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      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      • 白色。
      质谱分析质谱分析及其在酿酒酵母酿酒酵母中的应用。
      )。替代战略利用强阳离子交换(SCX)色谱期间的磷酸肽早期洗脱,与磷酸盐基团的负电荷相比,与相似组合物的非磷酸化肽相比(
      • Ballif B.A.
      • Villen J.
      • Beausoleil S.A.
      • 施瓦茨D.
      • Gygi S.P.
      显影小鼠脑的磷肝蛋白酶分析。
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      • Gygi S.P.
      Hela细胞核磷蛋白的大规模表征。
      )。此外,几组已经开始将各种离子交换方法与IMAC结合,以进一步富集LC-MS / MS分数的磷酸肽含量(
      • Nuhse T.S.
      • Stensballe A.
      • Jensen O.N.
      • Peck S.C.
      固定化金属离子亲和色谱法和质谱法大规模分析体内磷酸化膜蛋白。
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      • Gruhler A.
      • 奥尔森J.V.
      • 穆罕默德S.
      • Mortensen P.
      • FAGERMEMAN N.J.
      • Jensen O.N.
      施加到酵母信息素信号传导途径的定量磷蛋白酶。
      )。然而,组合离子交换-IMAC方法的相对性能尚未直接比较。
      在本研究中,我们将SCX色谱组合以分馏与IMAC的复合蛋白质消化,以富集来自个体SCX级分的磷酸肽,其单独超过两种技术的磷肽富集的提高3-10倍。使用此工作流程,我们在PSD级分的制剂中获得了1,264个独特蛋白质的综合数据集。我们鉴定了总共998个独特的磷酸化肽,在287个总磷蛋白组中映射到723个独特的位点。这在我们的混合物中每种独特蛋白质(728的磷酸化位点(728的1,264)转化为〜0.58磷酸化位点,表明该分析导致总突触型密度磷酸磷蛋白酶组的实质覆盖率。最后试图进一步了解磷酸化之间提出的关系 O - 链接 N - 乙酰甘氨酸胺基化,我们也开发了能够实现这种修改的方法(参见随附的纸张,vosseller 等等。 (
      • Vosseller K.
      • 特立尼达J.C.
      • Chalkley R.J.
      • specht c.g.
      • Thalhammer A.
      • 林恩A.J.
      • Snedecor J.H.
      • 关斯。
      • Medzihradszky K.F.
      • maltby d.a.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      O - 链接 N - 使用凝集素弱亲和色谱法和质谱法的突触后密度制剂的乙酰甘氨酸胺蛋白质组学。
      )))。

      材料和方法

       PSD样品制备和质量控制 -

      如前所述在4℃下进行PSD样品的纯化(
      • 特立尼达J.C.
      • Thalhammer A.
      • specht c.g.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      突触后密度蛋白的磷酸化状态。
      )。除了最终造粒步骤之外,蛋白酶和磷酸酶抑制剂均用于含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂。在40 mm Tris,pH 7.5,0.5,0.3M含有EDTA蛋白酶抑制剂(完整,罗氏应用科学)和磷酸酶抑制剂的混合物中,将成年小鼠大脑(2-16个月,20只动物,10g湿重)均质均质化均质化。 (1毫米NA3vo.4,1毫米NAF,1毫米NA2Moo.4,4mM酒石酸钠,100nm fenvalerate,250nm okaadaic酸),并通过离心清除。将膜级分在17,000×以17,000×中分离出胞质馏分分离 g 持续20分钟,然后蔗糖密度离心(120分钟为85,000× g; 0.8,1.0和1.2 m蔗糖步长梯度)。在1.0-1.2M的界面,沉淀,在10mm双线,pH 7.5中均化,含有5%的突出,突出,突出膜 N-octyl-β-D-葡糖吡喃糖苷(Calbiochem),并施加到第二梯度(120分钟,85,000× g; 1.0,1.4和2.2米蔗糖)。在没有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的情况下,在1.4-2.2M邻接的1.4-2.2M邻接中收集PSD级分并在10mM双内,pH7.5中沉淀。 PSD样品的产率通常在所用湿重组的0.1%的范围内。
      Western Blotting以前发表(
      • 特立尼达J.C.
      • Thalhammer A.
      • specht c.g.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      突触后密度蛋白的磷酸化状态。
      )以下主要抗体:山羊抗NR2A(1:500,SC1468,Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA);鼠标反NR2B(1:1,000,N38120,BD转导实验室,San Jose,CA);小鼠抗NR1(1:500,556308克隆54.1,BD转导实验室);小鼠防PSD-95(1:250,P43520,BD转导实验室);兔子反光兔(1:1,000,AB1504,Chemicon International,Temecula,CA);山羊反合酶(1:1,000,SC-8572,Santa Cruz Biotechnology);小鼠抗Camkiiα(1:1,000,MAB8699克隆6G9,Chemicon International)和抗磷(Thr-286)-Camkiiα(1:1,000,AB2724 Clone 22B1,Abcam Ltd.,剑桥,英国),由彼得提供Giese;山羊抗突触蛋白(1:200,SC7568,Santa Cruz Biotechnology);和小鼠抗α-突触核蛋白(1:1,000,S63320,BD转导实验室)。

       消化PSD样品 -

      将6mg的PSD蛋白质重悬于2ml 25mM盐酸盐的25mM碳酸氢铵中。将混合物在57℃下用2mM Tris(2-羧乙基)盐酸膦孵育1小时,以减少半胱氨酸侧链;然后将这些侧链用4.2mM碘乙酰胺在21℃下用4.2mM碘乙酰胺烷基化45分钟。将混合物用25mM碳酸氢铵稀释6倍,加入5%(W / W)改性胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)。将pH调节至8.0,将混合物在37℃下消化12小时。摘要使用C脱盐18 SEP-PAK墨盒(水域,MILFORD,MA)。

       强阳离子交换色谱 -

      使用Äkta净化器(Amersham Biosciences)进行SCX色谱法,配备有水在房屋内填充有5×115mm多硫代乙基A树脂(西方分析,Elsinore,CA)。将6.0mg样品消化物加载到30%乙腈,5mm kH的柱上。24,pH 2.7。在30%乙腈中,50分钟的梯度从0到350mm KCl运行,5mm kH24,pH 2.7。使用MAX-RP反向相C收集和脱盐的88个级分18 弹药筒(现象,托兰,CA),并使用SpeedVac集中器(Thermo Electron,San Jose,CA)干燥。使用ESI-QQ-TOF串联质谱法保留每馏分的5%用于分析,并且在适当时对剩余的95%进行IMAC富集。

       Nano-LC-ESI-QQ-TOF串联质谱分析 -

      使用75μm×15cm反相C分离对应于每个先前保留等分试样的40%的40%的样品(或每个原始SCX分数的2%)18 柱(LC填料,Sunnyvale,CA)以350 nL / min的流速,在装备自动进样器(Agilent Technologies,Palo Alto,Palo Alto,Palo Alto)的Agilent 1100系列HPLC系统上运行3-32%的乙腈梯度。加利福尼亚州)。梯度循环时间长度为1.0和2.0小时。 LC洗脱液耦合到附接到QSTAR Pulsar质谱仪(Applied Biosystems / MDS Sciex,Foster City,CA)的微观喷射源。以正离子模式分析肽。获得MS光谱1秒。对于每个MS光谱,选择两个最强烈的多元带电峰用于产生后续的CID质谱。基于肽电荷和肽电荷自动调节CID碰撞能量 m/z 比率。应用了一个动态排除窗口,以防止相同的窗口 m/z 在其初始收购后被选中3分钟。

       固定化金属亲和层析 -

      使用ÄKTA净化器对每个SCX馏分的其余部分进行IMAC纯化。聚醚醚酮柱(500μm×8cm)与孔孔亚单乙酸树脂(持久性生物系统,Framingham,MA)内部包装。注射和注射之间的流速分别为50和500μL/ min,用作流动相0.1%TFA(pH 1.9)。注射方案如下:柱平衡,1毫升; FECL.3 注射,100-200μL50 mm FECL3;柱平衡,1毫升;肽注射,个体,脱盐Scx级分,在250μl0.1%TFA中;柱平衡,500μL;洗涤注射,300μl100mMNaCl,30%乙腈,0.1%TFA,pH 1.7;柱平衡,500μL;和磷酸盐,200μl100mMna2HPO.4 在30%乙腈中,100mM NaCl,1%TFA,pH 2.9。使用真空离心将磷酸盐洗脱级分开在0.1%甲酸中,并用omix c脱落18 提示(瓦里安,核桃小溪,加州)。将肽以6μl01%的甲酸重构,使用纳米LC-ESI-QQ-TOF MS / MS进行1μl(见上文)。使用在第一次运行中脱落的肽的排除列表进行另外的1μl等分试样。

       解释MS / MS光谱 -

      使用分析师QS软件(1.1版)分析数据,使用Mascot.dll脚本(1.6b16)生成MS / MS质心峰值列表。 MS / MS质心峰在碱基峰的0%处阈值。最初使用吉祥物(2.0版本2.0,矩阵科学,波士顿,MA)和蛋白质勘探4.15(加州大学,旧金山,旧金山,旧金山,加利福尼亚州)的Uniprot啮齿动物数据库(47,398条参赛作品)进行数据。 MS和MS / MS模式中的初始肽耐受分别为200ppm和0.2道尔顿。胰蛋白酶被指定为蛋白酶,允许最多三种错过的切割。搜索氨基甲酰化作为固定改性,而甲硫氨酸的氧化,氨基 - 末端蛋白乙酰化和丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸残基的磷酸化被作为可变修饰。然后使用来自各个LC-MS / MS运行的高分肽匹配,用于内部重新校准MS母离子 m/z 运行中的值。这导致内部一致的质量精度,每个LC-MS / MS运行的平均标准偏差为10-15ppm。然后在50ppm的MS模式下搜索重新校准数据文件。如果在将数据搜索到Uniprot啮齿动物数据库时满足以下条件,则认为蛋白质被认为是肯定鉴定的。如果在一个肽的基础上鉴定蛋白质,我们设定了保守阈值以最小化假阳性蛋白质鉴定。我们将获得错误阳性蛋白质鉴定的理论概率以少于一千个,这意味着这些肽必须具有(假阳性)吉祥物期望值≤0.001。如果基于两种或更多种肽鉴定蛋白质,则每个蛋白质的最佳匹配肽必须具有吉祥物期望值≤0.01。对于蛋白质鉴定目的,检查具有吉祥物肽评分≥25的肽。在给定肽可能产生多于一种蛋白质的情况下,只要使用至少一种独特的肽鉴定它们即可肯定地鉴定这些蛋白质。

       磷酸肽MS / MS光谱的评价 -

      有关磷酸肽光谱评价的更多细节,请参阅“结果”。鉴定七磷酸肽与七种蛋白质匹配,没有观察到另外的非磷酸化肽。当使用先前的搜索参数搜索uniprot啮齿动物数据库时,这些肽的吉祥物期望值≤0.001;但是,这次允许这次最多四次错过的乳沟。剩余的991种磷酸肽与也观察到非磷酸肽的蛋白质。当使用先前搜索参数搜索本研究中识别的蛋白质子集时,这些肽具有牵引值≤0.05。手动检查所有磷酸肽以验证大多数高丰度峰是Y或B序列离子,或Y - H.234 or b − H234 适当时的离子。手动执行磷化站点分配,以及使用单独研究中描述的Perl脚本自动计算。
      J.C.Trinidad,J. O. Snedecor和A. L. Burlingame,准备稿。

      结果

      使用两步蔗糖密度梯度离心方案从小鼠脑中分离PSD级分,其包括通过非离子洗涤剂的有限溶解 N - -辛基-β-D-吡喃吡喃糖苷。通过Western印迹分析评估整个纯化整个纯化的PSD蛋白的相对富集(Fig. 1)。谷氨酸受体亚基NR2A,NR2B,NR1和Glur1在最终的PSD样品中选择性地富集,以及其他已知的突触突触部,PSD-95和Syngap。相反,在PSD级分中未检测到位于突触前末端,即Sypaptophysin和α-突触核蛋白的两种蛋白质,证实我们的纯化方案不包括某些突触前组分。在整个制剂中,在馏分中检测到存在于神经元细胞质以及PSD中的神经元细胞质中的Camkiiα,因为它的主要(活化的)自磷酸化形式(p-CamkiiαThr-286)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1蛋白质印迹纯化PSD样品的质量控制。 探索 N - 甲基-D-天冬氨酸受体亚基NR2A,NR2B和NR1以及α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体亚官甲基GLUR1在最终的PSD级分中显示出它们的富集。还发现两种额外的突触蛋白,PSD-95和Syngap在PSD级分中富集。突触前蛋白突触蛋白和α-突触核蛋白存在于突触膜级分中,但在第二蔗糖梯度期间丧失。 Camkiiα亚基的探测揭示了它们在所有级分中的存在。检测自磷酸化的CAMKIIα(THR-286)证实通过对PSD磷蛋白质的质谱分析获得的结果。
      我们开发了一种自动化的工作流程,使我们旨在表征我们纯化的PSD样品的蛋白质成分以及鉴定这些蛋白质内的磷酸化位点(Fig. 2)。用胰蛋白酶,脱盐物消化PSD样品,并使用SCX色谱法分离成88个级分(图3A)。在QSTAR脉冲脉质谱仪上使用纳米反相LC-MS / MS进行分析各部分的等分试样。使用吉祥物的光谱解释导致17,391个阳性肽鉴定,其中9,236份是非冗余肽序列。认为蛋白质使用以下标准被认为是正鉴定的。如果仅使用一种肽用于蛋白质鉴定(214个实例),则当搜索到Uniprot啮齿动物数据库时,肽必须具有小于或等于0.001的吉祥物期望值。如果使用两种或更多种肽(1,050个实例)鉴定蛋白质,则最佳肽匹配必须具有小于或等于0.01的吉祥物期望值。通过这些标准,在PSD制剂中鉴定了1,264个蛋白质,中值序列覆盖率为17%(补充表S1)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2实验工作流程的示意图。 消化纯化的PSD级分,使用SCX色谱法分离胰蛋白酶肽。通过LC-MS / MS分析每个级分的等分试样。并行地,对每个级分的剩余材料进行IMAC进行磷肽富集,随后通过LC-MS / MS分析。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3纯化PSD样品蛋白质组分的鉴定。A,对胰蛋白酶肽进行SCX色谱法。用KCl梯度洗脱(所示的电导 棕色的)通过215nm的吸光度检测到(蓝色痕迹收集92个级分(红色酒吧)。 B,肽净电荷随SCX分数数的函数而变化。未经修改的胰蛋白酶肽被给予+2次电荷(质子化氨基 - 末端氨基和一个精氨酸或赖氨酸氨基侧链)。额外的精氨酸或赖氨酸残留(由于错过的胰蛋白酶切割)以及他的残留物导致净电荷的单位增加。蛋白质氨基末端乙酰化,肽氨基 - 末端焦霉素形成,磷酸化各自导致净电荷的单位降低。 ,毫米吸毒单位; 小姐,毫米员。
      带负电荷的磷酸盐基团的存在相对于类似组合物的非磷酸化肽减少了磷酸肽的净电荷,并使磷酸化肽在SCX梯度方面早先洗脱,而不是它们的非磷酸化对应物。因此,据报道,许多磷酸肽在SCX梯度的初始阶段中洗脱(
      • Ballif B.A.
      • Villen J.
      • Beausoleil S.A.
      • 施瓦茨D.
      • Gygi S.P.
      显影小鼠脑的磷肝蛋白酶分析。
      ,
      • Beausoleil S.A.
      • jedrychowski m.
      • 施瓦茨D.
      • eliasj.e.
      • Villen J.
      • 李杰。
      • COHN M.A.
      • 坎特利L.C.
      • Gygi S.P.
      Hela细胞核磷蛋白的大规模表征。
      )。为了确定净电荷影响我们系统中SCX洗脱行为的程度,我们计算了肽净电荷的分布作为SCX梯度跨越洗脱分数的函数(图3B.)。这些数据表明,尽管净电荷清楚地影响了肽洗脱行为,但这不是唯一的决定因素。例如,在馏分46中具有+ 3或+4净电荷的单个肽比从分数51的肽的肽的副肽的亚肽的子集中洗脱。一系列SCX分数 相对 PSD摘要的净电荷给出了0.87的相关系数(数据未显示)。重要的是,给定电荷的所有肽的相对大的洗脱窗是大量个体肽洗脱时间而不是单个肽的宽的洗脱宽度。个体肽的半宽度实际上比馏分体积小得多。使用相同的梯度条件运行αHS糖蛋白的胰蛋白酶摘要,并且降低的样品复合物使我们通过UV吸光度(数据未示出)测量单独的肽洗脱峰。与馏分尺寸为0.5ml的馏分尺寸,平均半宽的单个肽洗脱。在分析所有88个PSD SCX级分后,我们鉴定了总共311个磷酸化肽。虽然对磷酸化肽的早期洗脱时间有明显的偏见,但实际上通过大部分SCX色谱仪(Fig. 4, AB)。在级分19中观察到大量(135)份磷酸化肽,其对应于完全胰蛋白酶肽(IE。 没有错过的裂解)缺乏组织并含有单一磷酸盐(
      • Ballif B.A.
      • Villen J.
      • Beausoleil S.A.
      • 施瓦茨D.
      • Gygi S.P.
      显影小鼠脑的磷肝蛋白酶分析。
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      • Villen J.
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      • COHN M.A.
      • 坎特利L.C.
      • Gygi S.P.
      Hela细胞核磷蛋白的大规模表征。
      )。级分19中的这些磷酸肽在用净+2电荷的大部分肽之前洗脱两到三个级分。级分1-18含有大量具有+1净电荷的非磷酸化肽。绝大多数这些肽是衍生自的肽 N - 乙酰化蛋白质氨基末端,衍生自蛋白质羧基末端的肽,或在氨基末端的氨基末端的肽,其在氨基末端形成环化以形成吡葡劳汀(
      • Gruhler A.
      • 奥尔森J.V.
      • 穆罕默德S.
      • Mortensen P.
      • FAGERMEMAN N.J.
      • Jensen O.N.
      施加到酵母信息素信号传导途径的定量磷蛋白酶。
      )。这些肽的净+1电荷和总正电荷+1的总阳性电荷比级分19的磷酸肽预先洗脱,其具有净+ 1电荷和+ 2的总正电荷。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4通过IMAC富集改善磷酸肽的鉴定。A,直方图显示通过LC-MS / MS鉴定为SCX分数的肽的数量。 B,SCX分数中鉴定的磷酸化肽的子集 A 没有IMAC浓缩。 C,对SCX级分24-88进行IMac,然后是LC-MS / MS。 IMAC富集导致鉴定的磷酸肽总数增加〜3倍。 D,也观察到其非磷酸化对应物的磷酸肽的子集在增加第一磷酸化肽的增加顺序中绘制。这 尾巴箭头 对应于在特定级分中观察到的个体非磷肽。这 箭头 对应于观察到相应的磷酸化肽的特定级分,以及 长度 因此表明,磷酸盐的添加程度转移了洗脱行为。
      从大多数LC-MS / MS的情况下,MS测量扫描的手动检查表明,由于在上述MS / MS采集阈值上方的每种肽(并且因此磷肽)上未获得单个SCX分数的复杂性MS / MS序列。特别是对于级分24和更高(最初发现超过100种磷酸肽),清除这些级分不完全表征。通过LC-MS / MS分析每个SCX分数/ MS显示大多数 观察到的 在SCX梯度的早期洗脱磷酸肽(图4B.)与其他人的先前观察协议(
      • Ballif B.A.
      • Villen J.
      • Beausoleil S.A.
      • 施瓦茨D.
      • Gygi S.P.
      显影小鼠脑的磷肝蛋白酶分析。
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      • Beausoleil S.A.
      • jedrychowski m.
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      • Villen J.
      • 李杰。
      • COHN M.A.
      • 坎特利L.C.
      • Gygi S.P.
      Hela细胞核磷蛋白的大规模表征。
      )。然而,因为SCX色谱法在基于净电荷的大部分中分离,所以用净+1电荷的磷酸肽以分离选择性地富集,因此将以增加的速率检测。相反,磷酸肽与a >+1净电荷将在含有许多高丰度非磷酸肽的级分中洗脱,因此将以减少的速率检测磷酸肽的这种亚亚沉积。从SCX级分的分析中观察到的磷酸肽分布非常方向表示混合物中磷酸肽的总分布。因此,我们开发了一种基于自动化的HPLC的IMAC富集方案,以进一步富集磷酸肽的级分24-88(图5A)。显示了代表性IMAC富集运行的UV谱 图5B.。这种方法导致鉴定的磷酸肽总数增加(总共998)(图4C.)。重要的是SCX分数19,其中包含任何级分的最多磷酸肽, 只要 占我们鉴定的总磷酸肽的14%。在我们的分析中,我们确定了代表单磷酸化肽的105对肽及其相应的非磷酸化对应物。我们使用这些肽来确定在SCX梯度期间磷酸盐部分对肽洗脱的添加剂。 图4D 显示通过首先观察到非磷酸化肽的分数排序的这些数据。 箭头 显示观察到相应的磷肽的偏移的方向和幅度。 SCX梯度前面的中位数是11.4级分数或较早13%。我们对PSD的蛋白质组成的广泛表征使我们能够增加鉴定单个磷酸肽的置信水平。首先,所有MS / MS光谱都被搜索,具有高严格标准的Uniprot啮齿动物数据库,即给定磷酸肽的吉祥物期望值小于0.001,并鉴定了258种磷酸肽。重要的是,这些磷酸肽中只有七个来自未在非磷酸化的数据集中独立鉴定的蛋白质,令人信服的证据表明我们混合物中绝大多数磷酸肽(>97%)来自这套蛋白质。因此,我们检查了MS / MS光谱的收集,以鉴定使用预先确定的1,264个独特蛋白质的数据集鉴定磷酸肽。这里报道的998种磷酸肽(补充表S2)限于当搜索到受限制的PSD蛋白质数据集时鉴定的那些吉祥物期望值小于0.05。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5A,自动IMAC工作流程的示意图。 B,IMAC纯化的磷酸肽的代表性色谱图(显示出215nm吸光度 蓝色的;电导显示在 棕色的)。将馏分收集器收集在10-10ml之间的洗脱级分。这 红色垂直线路 代表各种解决方案的注射和收集时间点。 ,毫米吸毒单位。
      用于确认单个磷肽光谱的吉祥物期望值不直接解决肽内给定的丝氨酸,苏氨酸或酪氨酸残基的可能性是磷酸化位点(相对于肽上的任何其他丝氨酸,苏氨酸或酪氨酸)。如果磷肽具有多于一个潜在的修饰位点,并且使用吉祥物分析其谱,可以最好地比较与每个潜在部位的磷酸化相关的吉祥物肽评分以获得最有可能的氨基酸的一般意义是修改的。此外,吉祥物依赖于MS / MS光谱中的磷酸的中性损失(从改性氨基酸的损失,在MS / MS光谱中表示,以指定磷酸化的确切部位。由于三个原因,这种策略是非最佳的。首先,非磷酸化的肽片段可以失去H.2o,产生具有相同质量的片段离子作为损失的损失34 来自含有磷酸化丝氨酸或苏氨酸的肽片段离子。其次,在CID期间,改性丝氨酸或苏氨酸残留物上的磷酸基团并不总是经历H的完全中性损失34。保留磷酸基团的片段离子可以提供关于哪些氨基酸是修饰位点的有价值的信息(
      • Chalkley R.J.
      • 伯灵名A.L.
      二桥飞行时间质谱法鉴定血清响应因子O-N-乙酰甘黄素胺改性的新态遗传学。
      )。最后,而不是h的中性丧失34,磷酸化的丝氨酸和苏氨酸片段离子可以进行中性的HPO3。如果初始非磷酸化序列离子(因此来自肽的非磷酸化区域),这可能导致磷酸化位点的误诊。
      使用PSD磷酸化和非磷酸化肽的数据集,我们进行了从这两个群体观察到不同离子类型的统计分析。该分析的结果和我们开发的后续自动化Perl脚本将在其他地方讨论探讨磷酸肽光谱。2
      998个独特的磷酸肽的分析导致了621个实例的修饰现场分配(补充表S2)。对于在195年的现场分配模糊的306个单磷酸化光谱,在这些情况下,磷酸化部位可以限于两个可能的氨基酸。
      为了估算我们数据集中的新型磷酸化位点的百分比,我们将结果与两种公共数据库的蛋白质翻译后修饰,磷化物(www.phosphosite.org.)(
      • 哈贝克P.V.
      • Chabra I.
      • Kornhauser J.M.
      • Skrzypek E.
      • 张B.
      磷酸化合物:致力于生理蛋白质磷酸化的生物信息学资源。
      )和人类蛋白质参考数据库(www.hprd.org.)(
      • Peri S.
      • Navarro J.D.
      • Amanchy R.
      • Kristiansen T.Z.
      • jonnalagadda c.k.
      • Surendranath V.
      • 尼兰江州V.
      • Muthusamy B.
      • Gandhi T.K.
      • 格罗戈尔米
      • ibarrola n。
      • deshpande n。
      • Shanker K.
      • Shivashankar H.N.
      • Rashmi B.P.
      • ramya m.a.
      • 赵Z.
      • Chandrika K.N.
      • Padma N.
      • Harsha H.C.
      • yatish a.j.
      • kavitha m.p.
      • menezes m.
      • choudhury d.r.
      • 苏珊S.
      • Ghosh N.
      • Saravana R.
      • 克兰德兰州
      • 克里希纳S.
      • 欢乐M.
      • Anand S.K.
      • 麦兜V.
      • 约瑟夫A.
      • 黄G.W.
      • Schiemann W.P.
      • Constantinescu s.n.
      • 黄兰
      • Khosravi-FAR R.
      • 斯丁H.
      • Tewari M.
      • 渴哈鹦鹉
      • Blobe G.C.
      • 当C.V.
      • 加西亚J.G.
      • Pevsner J.
      • Jensen O.N.
      • Roepstorff P.
      • Deshpande K.S.
      • Chinnaiyan上午
      • HAMOSH A.
      • Chakravarti A.
      • Pandey A.
      人体蛋白质参考数据库的发展作为人类逼近系统生物学的初始平台。
      )。虽然没有详尽无遗,但这些数据库提供了在文献中报告的磷酸化位点相当综合的储存库。与这些数据库相比,我们识别的磷酸化位点的〜80%似乎是新颖的。

      讨论

      我们开发了一种强大的自动化工作流程,可以从复杂的蛋白质混合物中识别磷酸化的部位。将该方法应用于从PSD制剂中分离的蛋白质,我们鉴定了1,264个独特的蛋白质。磷酸化位点映射在这些蛋白质中的287个或总量的23%。这与一般蛋白质的预测值(33%)接近(
      • 约翰逊S.A.
      • 猎人T.
      KINOMICS:用于破译Kinome的方法。
      )。
      我们目前分析中鉴定的蛋白质的数量基本上超过了以前的质谱分析的可比PSD制剂(
      • 约旦B.A.
      • Fernholz B.D.
      • Boussac M.
      • 徐C.
      • 格里俄罗波尔G.
      • Ziff E.B.
      • neubert t.a.
      新型啮齿动物突触后密度蛋白的鉴定与验证。
      ,
      • 李克..
      • 犀牛M.P.
      • van der schors r.c ..
      • Watson R.
      • 塔特S.
      • Casetta B.
      • JIMENEZ C.R.
      • Gouwenberg Y.
      • 甘德福格·艾迪
      • 小k.h.
      • smit a.b.
      大鼠脑后密度的蛋白质组学分析。不同蛋白质官能团对突触生理学集成的影响。
      ,
      • 彭J.
      • kim m.j.
      • 诚变。
      • Duong D.M.
      • Gygi S.P.
      • 盛M.
      大鼠大鼠突触突破密度级分质谱法的半定位蛋白质组学分析。
      ,
      • Yoshimura Y.
      • Yamauchi Y.
      • Shinkawa T.
      • Taoka M.
      • Donai H.
      • Takahashi N.
      • isobe t.
      • Yamauchi T.
      蛋白质组学分析使用多维液相色谱 - 串联质谱揭示的突触后密度分数的分子量。
      )。这些早期的研究没有检测到已知的所有蛋白质在PSD中存在,并且重要的是,它们未能识别本研究中鉴定的许多谷氨酸受体亚基,表明我们对PSD样品组分的鉴定更广泛。然而,我们鉴定的每种蛋白质不太可能是一个真正的突触突触部分。例如,存在污染蛋白质的少量组分,这些蛋白质最有可能是核的。在以前的研究中也观察到制备方法的这种伪影。此外,蛋白质贝加松和微肠溶,已知的突触前部件在肽水平上呈重。这些蛋白质已在大多数蛋白质组学研究中被鉴定为PSD制剂的主要组分(
      • 约旦B.A.
      • Fernholz B.D.
      • Boussac M.
      • 徐C.
      • 格里俄罗波尔G.
      • Ziff E.B.
      • neubert t.a.
      新型啮齿动物突触后密度蛋白的鉴定与验证。
      ,
      • 彭J.
      • kim m.j.
      • 诚变。
      • Duong D.M.
      • Gygi S.P.
      • 盛M.
      大鼠大鼠突触突破密度级分质谱法的半定位蛋白质组学分析。
      ),可能是鲈鱼和Piccolo与跨突触因子相互作用的结果。相比之下,在我们的样品中,在样品中强烈降低其他突触前部件,例如Sypaptophysin和α-突触核蛋白(Fig. 1),并且未被MS分析识别(补充表S1)。这表明所选择的纯化方案导致含有常规,转型和突触前部件的定义复合物。这种级分的PSD的传统术语反映了许多突触蛋白的主要突出。重要的是要注意,中枢神经系统中的兴奋性突触本质上是非常异构的,我们的结果代表了作为整体突触中存在的可能蛋白质和磷酸化事件的综合图,而不是典型突触的组成。
      我们报告了SCX或SCX-IMAC富集的直接比较了SCX或SCX-IMAC富集,证明SCX与IMAC的组合单独提供SCX分馏的优异结果(图4A)。相对于直接通过LC-MS / MS的量,将每个SCX分数的较大百分率进行IMAC。然而,直接通过LC-MS / MS分析的每个SCX部分的量大于足以使电喷雾离子源饱和。因此,从每个SCX运行加载用于LC-MS / MS的额外材料不会显着增加磷酸肽鉴定的总数。与先前获得的数据相比,目前工作中的结果比较(
      • 特立尼达J.C.
      • Thalhammer A.
      • specht c.g.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      突触后密度蛋白的磷酸化状态。
      )表明,单独使用IMAC纯化产生较少鉴定的磷酸肽(共83个);然而,使用显着较少的PSD样品进行该研究。此外,在先前的研究中,我们使用了胰蛋白肽的甲基酯化,因为在没有酯化的情况下,我们已经观察到与树脂的高度非磷肽结合。然而,我们发现使用较低的pH IMAC洗涤溶液来帮助减少羧酸依赖性保留,导致鉴定与先前的研究中的相同数量的磷酸肽(使用IMAC而无需额外的SCX)而不使用酯化(数据未示出) 。此外,当在IMAC之前使用SCX色谱时,羧酸基结合的机会较少,因为在IMAC之前使用SCX色谱,因为每个SCX级分在复杂性中显着降低。
      在我们以前的研究中,尽管广泛努力将其推动至100%,但甲酯反应均仅在90至95%的效率之间。其他人也报告了这种观察(
      • Larsen M.R.
      • Thingholm T.e.
      • Jensen O.N.
      • Roepstorff P.
      • jorgensen t.j.
      使用二氧化钛微柱的肽混合物的高度选择性富集磷酸化肽。
      )。如果目标只是鉴定磷酸肽,则不完全酯化不一定是主要问题,并且实际上与IMac和SCX的甲基酯化组合比非酯化更好,特别是对于甚至更复杂的样品,例如全细胞或器官裂解物。我们的最终目标是将SCX-IMAC浓缩与基于同位素的量化方法相结合,因此只有在90%工作的化学物质将限制定量动态范围并降低信噪比。
      假设100%疗效,一个 在Silico. 在国家生物技术信息中心列出的人类蛋白质的胰蛋白酶摘要预测,68%的肽将净电荷+2,而不是计算翻译后修改的效果(
      • Beausoleil S.A.
      • jedrychowski m.
      • 施瓦茨D.
      • eliasj.e.
      • Villen J.
      • 李杰。
      • COHN M.A.
      • 坎特利L.C.
      • Gygi S.P.
      Hela细胞核磷蛋白的大规模表征。
      )。只有35%的肽在我们的SCX梯度中鉴定的肽具有此+2充电。剩余的更高电荷肽在SCX梯度后平均洗脱,并且它们的磷酸化对应物(如果存在)不太可能在梯度中早发。我们的消化是在1M盐酸胍中进行的,胍尼鎓离子可以作为胰蛋白酶的竞争抑制剂,降低其活性并导致比消化物使用尿素进行的消化所进行的更高水平的裂缝。变性剂。因此,难以将我们的方法与在消化期间可能没有胍可能没有使用的其他人进行比较。为了鉴定来自复杂混合物的最大数量的磷酸化肽,需要富含磷酸化的组分以及将这些磷酸肽分离成正交级分,以使得能够相对于单一磷酸肽分数的分析进行更多数量的MS / MS采集。 。在这项研究中,我们主要使用SCX来分馏我们的肽混合物。在尿素中进行的消化可能导致更完全的切割;然而,这将导致肽混合物的不太广泛的分馏,因为磷酸肽的更大百分比将在相同的级分中洗脱。无论复合混合物是否达到裂解程度,相对于非磷酸化对应物,磷酸盐在梯度方面较早地将肽洗脱达到10-15%,尽管这种效果的程度将是梯度依赖性的。因此,对于使用类似的SCX梯度分离的蛋白质消化,如果非磷酸化的肽在梯度的下半部分溶液,其相应的磷酸肽不太可能早早洗脱,以在磷酸肽池中被明显地发现+1收费。
      本文介绍的PSD制剂的磷脂蛋白酶主要透露磷素,较少的磷酸辛,并且很少是磷酸酪氨酸(图6A)。这些发现符合各种细胞类型的先前结果(
      • 柯林斯M.O.
      • yu l.
      • COBA M.P.
      • Husi H.
      • Campuzano I.
      • Blackstock W.P.
      • Choudhary J.s.
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      体内磷酸化突触蛋白的蛋白质组学分析。
      ,
      • Ballif B.A.
      • Villen J.
      • Beausoleil S.A.
      • 施瓦茨D.
      • Gygi S.P.
      显影小鼠脑的磷肝蛋白酶分析。
      )并表明我们的方法论方法不会区分特异性氨基酸残基修饰。我们在各种蛋白质类别上报告磷酸化的遗址:结构蛋白,支架蛋白,激酶和磷酸酶,膜神经递质受体和电压门控离子通道(图6B.)。从我们可以识别至少一个磷酸化位点的621个肽,我们能够确定723个精确的磷酸化位点(因为许多这些肽是多次磷酸化的)。当检查明显的磷酸化共识基序时,〜51%的鉴定位点拟合丝裂剂活化的蛋白激酶/细胞外信号调节激酶识别基序(S / T)P,而〜31%安装(R / K)X(S / T)CAMP依赖性蛋白激酶的主题。除了在Synapse的高水平磷酸化之外,该手稿的伴侣纸(Vosseller 等等。 (
      • Vosseller K.
      • 特立尼达J.C.
      • Chalkley R.J.
      • specht c.g.
      • Thalhammer A.
      • 林恩A.J.
      • Snedecor J.H.
      • 关斯。
      • Medzihradszky K.F.
      • maltby d.a.
      • Schoepfer R.
      • 伯灵名A.L.
      O - 链接 N - 使用凝集素弱亲和色谱法和质谱法的突触后密度制剂的乙酰甘氨酸胺蛋白质组学。
      ))发现了相对大量的 O- GLCNAC修改在Synapse,强调翻译后修改在调节突触功能方面发挥关键作用的理论。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6A,磷素的相对分布(PS.),磷酸辛(Pt.)和磷酸酪氨酸(PY)。大多数鉴定的位点是磷素(739),然后是磷酸辛(79),最后磷酸酪氨酸(三)。 B,作为蛋白质功能类的函数的独特磷酸化位点的数量。参与粘附/细胞骨架的蛋白质代表最普遍的阶级,然后是伴随适配器/分选功能的蛋白质。
      我们的研究没有解决与PSD磷酸磷糖胺或其他磷蛋白酶有关的许多问题。重要的是,我们现在不能解析PSD制剂中鉴定的磷酸化位点的化学计量,并且单个磷酸化位点的周转率是未知的。可以想到,许多鉴定的磷酸化位点,特别是具有低成交量的低化学计量的位点,可能在细胞内缺乏明显的生理功能。因此,细胞的磷脂体可以含有一定程度的“生物化学噪声”。
      总之,SCX与IMac的组合使我们能够获得突触后密度磷酸肽的综合数据集,其与998个独特的磷酸化肽映射到723个独特的位点,在1,264个独特的蛋白质的总磷蛋白组中。我们的研究结果表明PSD磷酸膜的大量报道。所获得的数据集将作为表征细胞内单磷酸化位点的生理意义的起点,这将不得不单独寻址。

      致谢

      我们感谢Aenoch Lynn,6月Snedecor和Peter Baker提供数据处理和Peter Giese,用于提供针对Camkii和P-Camkii的抗体。

      补充材料

      参考

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