心脏19S蛋白酶蛋白质组的蛋白质组动力学和蛋白质组功能*

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  • 作者脚注
    *这项工作得到了NHLBI蛋白质组学中心奖(HHSN268201000035C),R01 HL098954,以及在UCLA到Peipei Ping博士的Theodore C. Laubisch认可,以及R01 HL088640到Enrico Stefani博士。
    本文含有补充材料,图。 S1至S4和表S1和S2。
    1所用的缩写是:HSP90Heat休克蛋白9020sproteAme蛋白水解核颗粒19sProteAmene调节粒子2-D DIGETWO尺寸差分凝胶电泳剂LC-MS / MSLIQUIC色谱串联MS。
      心肌蛋白酶组成20S核心颗粒和19S调节颗粒,其共同执行心脏蛋白的靶向降解。 19S综合体在蛋白质群体的调节剂中是独一无二的,因为它会影响蛋白质降解的能力和特异性。然而,缺乏心脏19S络合物的全面分子表征。在这项研究中,我们量身定制了基于多维色谱的纯化策略,以分离来自小鼠心脏的结构性完整和功能可行的19S复合物。基于激活20S蛋白水解活性的(1)效力,使用免疫检测,二维差分凝胶电泳的组合和基于MS的方法,基于(1)分离出20S蛋白水解活性的两种不同的19S复合物的亚群。鉴定热休克蛋白90(HSP90)的特征为19s亚群I.通过多种方法证明HSP90与19S复合物的物理相互作用。使用Geldanamycin或BiiBO 21抑制HSP90活性,提出了亚胞胎心脏在鼠心脏中激活20s蛋白瘤的能力,从而证明了亚潜水病中的HSP90功能特异性。该研究通过鉴定分子和鉴定了对心脏蛋白酶的分子异质性的理解功能性不同的心脏19s复合物。 HSP90具有19S亚群的优先缔合C,我揭示了用于设计基于蛋白酶体的治疗性干预的新靶来对抗心脏病。
      蛋白酶体系治理蛋白质营业额,并调节心脏生物学中的必要信号级联(
      • 王X.
      • 苏H.
      • Ranek M.J.
      心肌细胞的蛋白质质量控​​制和降解。
      ,
      • 帕特森C.
      • IKE C.
      • 威利斯4th,p.w.
      • Stouffer G.A.
      • 威利斯M.S.
      苦涩的末端:泛素 - 蛋白酶体系和心脏功能障碍。
      )。尽管许多心脏病的不同病因,但蛋白质是心力衰竭期间心室重塑的最终效果(
      • 帕特森C.
      • IKE C.
      • 威利斯4th,p.w.
      • Stouffer G.A.
      • 威利斯M.S.
      苦涩的末端:泛素 - 蛋白酶体系和心脏功能障碍。
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      • 戈麦斯A.V.
      • 宗C.
      • Edmondson R.D.
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      • 王G.W.
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      • 张继夫
      • Vondriska下午
      • Whitelegge J.P.
      • 琼斯·罗克。
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      • Pantaleon D.
      • 乔J.
      • LOO J.
      • ping p.
      小鼠心脏26s蛋白酶:等待勘探的细胞器。
      )。用老化逐渐发生蛋白酶体功能的下降(
      • Bulteau A.L.
      • szweda l.i.
      • Friguet B.
      心脏蛋白酶体活性的年龄依赖性下降。
      )敏感缺血再灌注损伤(
      • Bulteau A.L.
      • Lundberg K.C.
      • Humphries K.M.
      • Sadek H.A.
      • szweda p.a.
      • Friguet B.
      • szweda l.i.
      冠状动脉闭塞/再灌注期间蛋白酶氧化改性和灭活。
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      • Das S.
      • 鲍威尔S.R.
      • 王P.
      • Divald A.
      • nesaretnam k。
      • Tosaki A.
      • Cordis G.A.
      • Maulik N.
      • DAS D.K.
      用棕榈tocotrienol的心脏印象:Tocotrienol的抗氧化活性与其稳定蛋白酶体的能力有关。
      )。相反,在嗜好的嗜好心中已经观察到升高的蛋白酶体功能(
      • 贬低C.
      • 王Q.
      • 燕L.
      • hedhli n。
      • 彼得P.
      • 陈L.
      • 洪C.
      • 斑点L.
      • Ghaleh B.
      • 萨文玛J.
      • vatner d.e.
      • vatner s.f.
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      在压力过载过程中激活心脏蛋白酶促进心室肥厚。
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      • hedhli n。
      • Lizano P.
      • 洪C.
      • Fritzky L.F.
      • Dhar S.K.
      • 刘H.
      • 田Y.
      • 高达
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      • vatner s.f.
      • 贬低C.
      蛋白酶体抑制在发起压力过载后降低心脏重塑。
      )萎缩,糖尿病心(
      • zu l.
      • Bedja D.
      • Fox-talbot K.
      • Gabrielson K.L.
      • van Kaer L.
      • Becker L.C.
      • Cai Z.P.
      免疫促蛋白酶在糖尿病小鼠中调节心肌肿块中的作用的证据。
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      • 胡锦涛
      • Klein J.D.
      • 杜杰克
      • 王X.H.
      糖尿病患者心肌蛋白分解代谢:胰岛素缺乏激活泛素蛋白酶体系。
      )。这些观察结果突出了心脏蛋白酶体调节的巨大复杂性。
      蛋白酶体的功能动态通过几种机制协调。掺入核心颗粒中的诱导亚基,20S蛋白酶体,导致蛋白水解功能的耐用改变(
      • Szalay G.
      • Meiners S.
      • voigt A.
      • Lauber J.
      • Spieth C.
      • Sper N.
      • 塞尔斯米
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      • Zell A.
      • Klingel K.
      • Stangl K.
      • Kandolf R.
      正在进行的Coxsackievirus心肌炎与心肌促蛋白酶的增加和活性增加有关。
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      • Marfella R.
      • Di Filippo C.
      • Portoghese M.
      • Siniscalchi M.
      • 马蒂斯S.
      • Ferraraccio F.
      • Guastafierro S.
      • 尼古拉特G.
      • Barbieri M.
      • Coppola A.
      • 罗西F.
      • Paolisso G.
      • D'Amico M.
      泛素 - 蛋白酶体系有助于缺血性糖尿病心肌的炎症损伤:血糖控制的作用。
      )。蛋白酶体亚基的翻译后修饰提供了对受体刺激或压力的蛋白酶体活性的瞬时适应(
      • asai m.
      • Tsukamoto O.
      • Minamino T.
      • asanuma h.
      • 富士塔M.
      • asanoy。
      • Takahama H.
      • Sasaki H.
      • HIGO S.
      • Asakura M.
      • Takashima S.
      • 霍利姆
      • Kitakaze M.
      PKA迅速增强蛋白酶体组装和体内犬心中的活性。
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      • Zachara N.E.
      • 哈特G.W.
      O-GlcNAC修饰:一种调节蛋白酶体功能的营养传感器。
      )。具有调节蛋白的蛋白质蛋白的动态缔合蛋白质称为关联伴侣,用作调节蛋白酶体活性的关键机制。此外,不同的蛋白酶体复合物的不同亚型对药理剂具有不同的敏感性,例如竞争性抑制剂(
      • kloss a。
      • Meiners S.
      • Ludwig A.
      • Dahlmann B.
      多个心脏蛋白酶体亚型对蛋白酶体抑制剂的敏感性不同。
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      • 巴士A.
      • Kraus M.
      • na i.k.
      • 丽埃斯A.
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      • Driessen C.
      • blau i.w.
      • 泰尔E.
      • Keilholz U.
      肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂的敏感性与蛋白酶体亚基的表达水平和组成有关。
      )。一起划合划分蛋白酶体复合物的异质性将具有深切的生物学和临床意义(
      • Husom A.D.
      • 彼得斯。
      • kolling e.a.
      • Fugere N.A.
      • 汤普森L.V.
      • Ferrington D.A.
      改变的蛋白酶体函数和亚单位组合物中的肌肉。
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      • Dahlmann B.
      • Ruppert T.
      • Kuehn L.
      • 弗洛略S.
      • kloetzel下午
      单个组织中的不同蛋白酶体亚型表现出不同的酶促性质。
      )。
      19S复合物,也称为调节粒子,是对20S蛋白酶体鉴定的第一种特定调节剂之一。通过控制底物募集和可达蛋白水解中心,19S复合着系带ubiquitination和蛋白水解。因此,19S复合物用作靶向蛋白质降解的重要调节剂(
      • Zachara N.E.
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      O-GlcNAC修饰:一种调节蛋白酶体功能的营养传感器。
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      • Verma R.
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      • deshaies r.j.
      多氢蛋白链受体在遍在蛋白 - 蛋白酶体系中定义了一层基材选择性。
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      • 缎k。
      • Sasajima H.
      • nyoumura k.i.
      • Yokosawa H.
      • Sawada H.
      通过P45 / RPT6 ATP酶亚基的磷酸化调节26s蛋白酶体的组装。
      )。然而,迄今为止,19S复合物的功能和结构动态仍然定义不足。目前的19S复杂生物学模型主要基于26S蛋白蛋白(
      • 戈麦斯A.V.
      • 宗C.
      • Edmondson R.D.
      • 李X.
      • Stefani E.
      • 张继夫
      • 琼斯·罗克。
      • Thyparambil S.
      • 王G.W.
      • 乔X.
      • Bardag-Gorce F.
      • ping p.
      映射小鼠心脏26s蛋白酶体复合物。
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      • 王X.
      • 陈C.f.
      • 贝克P.R.
      • 陈P.L.
      • Kaiser P.
      • 黄兰
      亲和纯化的人26s蛋白酶体复合物的质谱表征。
      ,
      • Verma R.
      • 陈S.
      • 费尔德曼R.
      • Schieltz D.
      • yates j。
      • 沃尔曼J.
      • deshaies r.j.
      蛋白质蛋白质组学:通过质谱分析亲和纯化蛋白酶体的核苷酸敏感蛋白酶体相互作用蛋白质的鉴定。
      ),升值有限,分辨率为19s复杂的异质性。
      我们以前鉴定了心脏20S蛋白酶蛋白酶的异质亚群,并发现它们表现出独特的功能能力和分子成分(
      • 劳动o.
      • Wildgruber R.
      • 宗C.
      • Sukop U.
      • NISSUM M.
      • 韦伯G.
      • 戈麦斯A.V.
      • ping p.
      哺乳动物蛋白酶体亚群,具有不同分子组合物和蛋白水解活性。
      )。这表明心肌细胞的蛋白质降解能力被专门调整,以通过蛋白酶体群体的专业化来满足生理需求。本研究通过确定19S调节颗粒是异质的,我们通过确定是否是异质的,引导我们进一步剖析心脏蛋白酶的多样性。然而,在分离19S复合物中,困难保留了内源性功能的主要障碍,因为19S复合物在自然界不稳定(
      • demartino g.n.
      PA700的纯化,19S的26s蛋白酶体的19S调节络合物。
      )。在心肌肌肉中,通过与19S络合物缔合的糖肌纤维结合蛋白的相对高表达水平进一步复杂(
      • 戈麦斯A.V.
      • 宗C.
      • Edmondson R.D.
      • 李X.
      • Stefani E.
      • 张继夫
      • 琼斯·罗克。
      • Thyparambil S.
      • 王G.W.
      • 乔X.
      • Bardag-Gorce F.
      • ping p.
      映射小鼠心脏26s蛋白酶体复合物。
      ,
      • 戈麦斯A.V.
      • 年轻的G.W.
      • 王Y.
      • 宗C.
      • eghbali M.
      • 劳动o.
      • lu h.
      • Stefani E.
      • ping p.
      哺乳动物组织中20S蛋白酶体复合物的对比蛋白质组生物学和功能异质性。
      )。
      在这项研究中,我们开发了净化策略(
      • demartino g.n.
      PA700的纯化,19S的26s蛋白酶体的19S调节络合物。
      )对于内源性心脏19S复合物来克服这些挑战。因此,从小鼠心脏组织获得了两个结构完整和功能性活性19s络合物(19s I和19s II)的两个不同的亚群。每种亚贫素在刺激20S蛋白酶体依赖性蛋白水解方面表现出不同的调节效力,19S I表现出低于19s II的效力。使用定量蛋白质组学工具询问这种功能性差异的分子基础(
      • Berhane B.T.
      • 宗C.
      • liem d.a.
      • 黄A.
      • Edmondson R.D.
      • 琼斯·罗克。
      • 乔X.
      • Whitelegge J.P.
      • ping p.
      • Vondriska下午
      通过Hupo血浆蛋白质组项目试验阶段,在人血浆中鉴定的心血管相关蛋白质。
      )探测19S复合物的调节剂。观察到19岁的独特分子特征是热休克蛋白90的具体募集(HSP90)
      使用的缩写是:
      Hsp90
      热休克蛋白90
      20S
      蛋白酶体蛋白水解核心颗粒
      19S
      蛋白酶体调节粒子
      2-D DIGE
      二维差分凝胶电泳
      LC-MS / MS
      液相色谱串联MS。
      随后用独立的免疫印迹测定和Nondenaturing的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳证实。药理抑制19s相关的HSP90显着提高了19s I的功能效力,从而将Hsp90鉴定为心脏中19s复合活性的重要调节剂。
      本文提出的研究在本文中提出的第一个报告的策略用于从鼠心中分离和纯化两个不同的19S复合物。通过功能性蛋白质组学方法,HSP90被发现与特定的19S亚群体唯一相关,重要的是,限制该群体在心脏中的调节效力。本研究中鉴定的19S复合物的异质性表明,19S复合物在功能上专注于满足心脏生物学的需求。本调查推进了我们对碱性蛋白酶体生物学的理解,并提供了向设计患者的新策略来设计途径。

      实验程序

      所有程序按照加州大学,洛杉矶和洛杉矶和洛杉矶和洛杉矶的动物研究委员会指南进行 实验动物的护理和使用指南,由国家卫生研究院出版。

       纯化小鼠心脏19s复合物

      协议(
      • demartino g.n.
      PA700的纯化,19S的26s蛋白酶体的19S调节络合物。
      )通过许多试点研究,有效地分离来自小鼠心肌的19S复合物。详细程序可以找到 补充材料 (补充图S2)。简而言之,300只鼠心(ICR染色,男性,8-9周龄)均匀化。通过离心收集细胞溶质级分,然后用DE52树脂(GE Healthcare)预先分支。用400米回收的分数m 将NaCl进一步富含硫酸铵沉淀(30-40%饱和)并在4℃下透析过夜。然后通过Sephacryl S-400凝胶过滤(GE Healthcare)除去低分子量蛋白质。将含有19S的级分汇集并用DEAE Sepharose快速流动色谱(GE Healthcare)分解。通过超滤除去过量的盐,然后使用单Q 5 / 50gL色谱(GE HealthCare)来获得纯化的19S络合物。
      通过使用免疫印迹监测19S复合物的富集(
      • raemmli u.k.
      在噬菌体T4头部组装过程中裂解结构蛋白。
      )。选择针对19S复合亚基RPT4,RPN7,RPN2(Biomol,Pa)和20S蛋白酶体α3的抗体以评估19s复合物的嵌入性,并区分来自26s蛋白质的19s络合物。

       高通量19S复杂功能测定

      通过测量19s复合物刺激20S蛋白酶体依赖性蛋白水解的效力来评估19S复合物的功能(
      • Leggett D.S.
      • Glickman M.H.
      • 芬利D.
      蛋白酶蛋白酶,蛋白酶体亚复合物和蛋白酶体相关蛋白质的纯化酵母。
      )。用缓冲液滴定鼠心脏19S络合物(20米m Tris, pH 7.6, 1 mm MgCl2,0.1米m EDTA, 0.5 mm 二苯二苯(DTT),10%甘油,50米m NaCl)然后在测定缓冲液中与纯化的小鼠心脏20S蛋白酶孵育(25米m Tris, 10 mm MgCl2,0.5米m DTT, 200 μm ATP,pH 8.0)在37℃下45分钟。随后施加荧光团标记的衬底(Suc-LLVY-AMC,BACHEM,CA)以发出信号蛋白水解活性;该反应在37℃下进行1小时。使用氟斯基康上升荧光计(Thermo Fischer)测量自由AMC组的释放(激发:390nm;排放:460nm)(
      • 宗C.
      • 戈麦斯A.V.
      • 劳动o.
      • 李X.
      • 年轻的G.W.
      • Berhane B.
      • 乔X.
      • 法国S.W.
      • Bardag-Gorce F.
      • ping p.
      小鼠心脏20S蛋白蛋白酶的调节:将合作伙伴的作用。
      )。蛋白酶体特异性抑制剂,ePoxomicin用于阴性对照。在用96孔微滴板的溶液中进行所有活性测定。在同一板上并行测量19S-Imborice 20S蛋白酶体活性,然后从19S刺激的蛋白水解活性中减去。

       心脏19S复合物的二维差分凝胶电泳(2-D DIGE)分析

      基于先前公布的协议进行了2-D DIGE(
      • Scruggs S.B.
      • Hinken A.C.
      • Thawornkaiwong A.
      • 罗宾斯J.
      • Walker L.A.
      • De Tombe P.P.
      • Geenen D.L.
      • 丁基下午
      • Solaro R.J.
      小鼠心室肌球蛋白调节轻链磷酸化的消融导致心脏功能障碍原位并影响邻近氰丝蛋白磷酸化。
      )。 19S I和19S II分别用Cy3和Cy5标记,并混合。将标记的蛋白质在350μLIPG条带补液缓冲液中稀释(6 m 尿素,2 m Thiourea,1%CHAPA,1%PMALLALY)。使用以下6步骤编程运行18厘米,pH 3-11nL IPG条(GE Healthcare):12h以30V(活性再水解),2小时,200 V,2小时,2小时,2000 v,2小时V ,从2000 v到8000 v的1小时梯度,并在8000 v,直到总VHR达到15,000。首先用1%DTT在平衡缓冲液中孵育IPG条状(50米 m TRIS,pH 8.8,2%SDS,6 m 尿素,30%甘油),然后用2.5%碘乙酰胺在平衡缓冲液中。对于第二尺寸,蛋白质在65V下通过12%SDS-PAGE分解15小时。使用台风9410成像仪(GE Healthcare)获得凝胶图像。进行了三个独立的分析。然后将凝胶染色,切除凝胶斑,用胰蛋白酶(1:50,酶:蛋白质; promega,Wi)消化,并萃取液相色谱串联MS(LC-MS / MS)分析。

       蛋白酶体复合物的二维裸生物天然页面/ SDS-PAGE

      将纯化的19S配合物与天然电泳样品加载缓冲液(20%甘油,0.2%溴酚蓝)混合,在4℃下孵育1小时,并在4℃下在40V下溶解在4℃下10小时°C(
      • Glickman M.H.
      • 鲁宾D.M.
      • 炒V.a.
      • 芬利D.
      酿酒酵母蛋白酶体的调节粒子。
      )。含有19S络合物的凝胶泳道被切除并在SDS-PAGE凝胶(4.0%T堆叠和10%T分辨)上铺设,用于在第二尺寸中变性电泳。将蛋白质转移到硝酸纤维素膜中并用RPN2,RPT4(Biomol)和Hsp90(resorgen,San Diego,Ca)探测。平行凝胶的银染色显示了蛋白质分离的整体模式。

       LC-MS / MS特征小鼠心脏19S复合物

      在LTQ-orbitrap和LTQ-XL(Thermo Fischer)质谱仪上进行LC-MS / MS,与C18,300A,5μMNAnolc柱(新目的,MA)集成。将5%缓冲液B至50%缓冲液B的线性梯度在180分钟内施加有效肽分离(缓冲液A:0.1%甲酸,2%乙腈(ACN);缓冲液B:0.1%甲酸,80%ACN) 。数据相关的采集被设置为一个全MS扫描,然后是MS2 五个最丰富的离子的破碎化。使用续集的IPI鼠标数据库(V.3.47,55,298条目)搜索光谱(BioWorks V.3.1用于。DTA生成,默认设置)。搜索参数设置为:胰蛋白酶消化:部分;错过了乳沟:2;前体耐受性:20ppm / orbitrap或2da / ltq;片段耐受性:0.5 AMU;固定MOD:C 57.0215 DA;可变MODS:M 15.9949 DA和N Terminus 210.1984 DA。过滤鉴定的肽:Xcorr>2.7(+2),3.5(+3),ΔCn> 0.1 (
      • 宗C.
      • 戈麦斯A.V.
      • 劳动o.
      • 李X.
      • 年轻的G.W.
      • Berhane B.
      • 乔X.
      • 法国S.W.
      • Bardag-Gorce F.
      • ping p.
      小鼠心脏20S蛋白蛋白酶的调节:将合作伙伴的作用。
      ,
      • lu h.
      • 宗C.
      • 王Y.
      • 年轻的G.W.
      • 邓恩。
      • Souda P.
      • 李X.
      • Whitelegge J.
      • 劳动o.
      • 杨p.Y.
      • ping p.
      揭示20S蛋白酶体磷蛋白蛋白酶组合的动力学:组合CID和电子转移解离方法。
      ),然后使用支架(V.2.0)确保报告的蛋白质被置信致密于大于或等于99%。

       18o标记辅助定量LC-MS / MS分析

      后期肽 18如前所述进行O标记程序(
      • 戈麦斯A.V.
      • 年轻的G.W.
      • 王Y.
      • 宗C.
      • eghbali M.
      • 劳动o.
      • lu h.
      • Stefani E.
      • ping p.
      哺乳动物组织中20S蛋白酶体复合物的对比蛋白质组生物学和功能异质性。
      )。简而言之,将固定的胰蛋白酶珠子(AB Sciex,Foster City,Ca)用水洗涤并与胰蛋白酶消化的肽混合。然后使用SpeedVac浓缩器(Thermo Fischer)干燥样品混合物。任何一个 18富含o富含水(95%,Sigma Aldrich)或常规 16将含有20%ACN的水加入到样品中,并在37℃下温和搅拌温育18小时。固定的胰蛋白酶珠粒的使用有助于去除胰蛋白酶后标签;因此,可以避免使用后标带的C末端氧原子的非特异性交换。用微磷脂柱达到固定的胰蛋白酶珠粒。这 16o或者 18然后将标记的样品组合在制备上进行LTQ-甲叠的分析。进行了三个独立的分析。

       统计分析

      所有数据都显示为平均值±S.E.学生们 t 测试用于未配对数据分析。 p <0.05被认为是统计学意义。

      结果

      分子表征19S络合物是一个具有挑战性的任务,特别是在哺乳动物中,主要是因为这些配合物的不稳定性。在这次调查中,我们实施了多维色谱平台,以从鼠心提取19S复合物。分离出19S络合物的异质亚群,各自表现出具有激活纯化的20S蛋白酶体的明显能力。 HSP90被确定为19世纪亚居民I的独特关联合作伙伴,我们进一步证明是19世纪我诱发20S激活的负调节器(补充图。S1)。

       小鼠心脏19S蛋白酶体复合物的纯化

      从小鼠心脏中提取结构性完整和功能可行的19S复合物(补充图S2)(
      • demartino g.n.
      PA700的纯化,19S的26s蛋白酶体的19S调节络合物。
      )。净化程序包括五个关键步骤。通过用DE52树脂的吸收和用硫酸铵的选择性沉淀,首先将心脏组织匀浆中的大部分蛋白质。在对应于30-40%硫酸铵饱和的级分中收集19S复合物。基于蛋白质分子量和表面对电荷比的进一步富集通过尺寸排阻色谱和DEAE Sepharose色谱法进行。高分辨率,分析级单声察离子交换层析构成了纯化小鼠心脏19s络合物的最终改进步骤(Fig. 1A)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1从鼠心脏纯化不同的19S亚群。控制板。 A,将单Q色谱法作为鼠19S复合纯化的最后步骤施用。含盐浓度的缓慢升高(以导电性的形式显示:MS / cm),收集了两个不同的19s络合物(19s和19s II)的不同亚群(UV280:mau)。 B,19S复合物的结构完整性用靶向来自“碱基”(RPN2,RPT4)和“盖子”(RPN7)的子结构靶向亚基的抗体面板。两种19S种都显示在结构上完整。密度测量测量显示了19S亚基的一致富集模式,用于支持UV280 NM吸收迹线(A)。 C,鼠心脏19S络合物的生物学功能被评价为刺激20S蛋白酶体依赖性蛋白水解的能力。通过ATP作为必要的辅助因子,测定所选分数(C5-C14)中的19S复合物的活性。这些分数之间的相对活动与UV280 NM型材(A)和密度测定痕迹(B)。所有分析均采用相等体积的来自每种色谱分数。
      从鼠心收集来自鼠心脏的两个可区分亚群,根据单声察色谱图(Fig. 1A)。首先用免疫印迹询问每种亚贫毛管中的19S络合物的分子标识和19S络合物的结构嵌体。每个亚群包含来自19S基础和盖子谱的组件,如RPN2,RPT4和RPN7的检测所证明的(Fig. 1B)。将26s蛋白酶组成的可能性由20S蛋白酶体亚基α3的平行免疫印迹(数据未显示)排出。因此,观察到的异质性归因于19S复合物的不同成分。通过图像密度测定后解压缩仔细评估各部分中的常规19S复合物的相对丰度。所有测试亚基,RPN2,RPT4和RPN7的富集概况与UV 280 NM轨迹一致(Fig. 1B),支持在小鼠心脏中存在两个不同的19s复合物亚群。通过分析四个独立的重复,19世纪I的相对丰度为19s I,为0.54±0.08(平均±标准偏差)。
      为了进一步验证19S络合物的结构性嵌体性,用LC-MS / MS进行不受限制的分子表征。使用这种方法鉴定的19S亚基与免疫印迹实验是互补的,其中包括19S基本亚基RPT6(补充图S3A)和19s盖子亚单位RPN12(补充图。S3B )。集体,在两种亚步骤中鉴定了心脏19S复合物的所有必需亚基(表I.)。此外,19s亚群的功能效力,定义为刺激20s蛋白酶体介导的蛋白水解的能力 体外,被评估(Fig. 1C)。单个分数之间的相对活动反映了Monoq UV 280nm迹线的谱(Fig. 1A)和免疫印迹(Fig. 1B),从而进一步支持鼠心脏19S络合物的两个不同和异质亚族的存在。
      表I.通过LC-MS / MS鉴定的心脏19S亚的常规亚基
      亚单位/基因Monoq Peak I.MonoQ峰II
      独特的肽覆盖范围独特的肽覆盖范围
      19S蛋白酶体ATPase监管亚基
       Rpt2/PSMC12649.3%1940.5%
       Rpt1/PSMC22451.7%3056.2%
       Rpt5/PSMC32159.8%1852.5%
       Rpt3/PSMC42651.7%1645.6%
       Rpt6/PSMC52952.5%1644.1%
       Rpt4/PSMC62454.5%1643.4%
      19s蛋白酶体非ATPAse监管亚基
       Rpn2/PSMD13146.8%2037.7%
       Rpn1/PSMD23146.5%2847.3%
       Rpn3/PSMD32134.4%1536.6%
       Rpn10/PSMD41844.3%1241.7%
       S5b/PSMD5926.6%1337.9%
       Rpn7/PSMD62152.7%1547.8%
       Rpn8/PSMD71236.8%940.2%
       Rpn12/PSMD8637.4%419.8%
       Rpn6/PSMD112137.4%1646.7%
       Rpn5/PSMD123143.1%1743.4%
       Rpn9/PSMD131939.6%1337.8%
       Rpn11/PSMD14531.3%740.3%
       Rpn13/ADRM113.9%28.8%

       19s亚群之间的功能方差的分子基础

      分别合并两个不同的19S复杂的亚步骤,并平行表征其功能性效力。每种亚群中的19S复合物的含量基于使用特异于19s亚群RPT4的抗体的定量免疫印迹的结果标准化(Fig. 2A)。建立标准曲线,其串联稀释19SI II以匹配19s I中的蛋白质复合物的丰富。分别用靶向RPT1,RPT2,RPN2和RPN7的额外抗体来验证归一化测定的准确性(Fig. 2B)。在两种亚步骤之间观察到这些亚基的组装化学计量没有显着差异。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2不同的19S亚群之间的功能动态的变化。 A,基于定量免疫印迹的结果标准化两个合并亚群中的19S复合物的含量。滴定19s II的含量以匹配19s I的含量。仔细规定蛋白质的正常化后,使所有后续的功能比较。 B后期正规,通过定量免疫印迹,用一块抗体(RPT1,RPT2,RPT3,RPT4,RPT5,RPN2和RPN7)验证了两个标准化池中的19S复合物的含量。 C,19S复合物的生物效力被评价为各自刺激20S蛋白酶体依赖性蛋白水解的能力。 19s II在19世纪I中显示出明显更高(高达40%)的活动。
      然而,19S复合物的两个亚群表现出明显的生物效力。后期大化,19秒II活化20s蛋白蛋白,高于19s的40%(Fig. 2C)。因此,用并联定量蛋白质组学平台-2-D DIGE和PATRIONATIONATIAL蛋白质组学平台研究了这种功能方差的分子基础 18在LC-MS / MS之前标记。 2-D DIGE方法显示亚群之间的常规19S亚基的类似分子化学测定物,但S5B(Fig. 3A)。在以前的报告中,已经建议S5B是一个互动伙伴,而不是19s复合体的亚基(
      • 戈麦斯A.V.
      • 宗C.
      • Edmondson R.D.
      • 李X.
      • Stefani E.
      • 张继夫
      • 琼斯·罗克。
      • Thyparambil S.
      • 王G.W.
      • 乔X.
      • Bardag-Gorce F.
      • ping p.
      映射小鼠心脏26s蛋白酶体复合物。
      ,
      • Guerrero C.
      • Tagwerker C.
      • Kaiser P.
      • 黄兰
      基于综合的质谱蛋白质组学方法:体内交联蛋白质复合物(Qtax)中串联纯化的定量分析以破译26s蛋白酶体相互作用网络。
      )。此外,HSP90在19世纪I显着富集,而EIF3亚基在19秒II中富集。基于LC-MS / MS的定量调查并行进行。在Nondenaturing天然页面凝胶上解析了来自每个亚群的完整19s复合物,并切除蛋白质组学分析。胰蛋白酶消化后,衍生自19s和19s II的肽是C末端标记的 16o或者 18o分别同位素,并使用LTQ-orbitrap组合用于定量LC-MS / MS(Fig. 3B)。与免疫印迹(Fig. 2B)和2-D DIGE(Fig. 3A),定量LC-MS / MS显示,S5B是两个亚步骤之间唯一不同的常规亚基(Fig. 3C)。提供了在两个亚步骤中一致鉴定的19s相关蛋白质的完整列表 补充表S2.
      图缩略图GR3.
      Fig. 3用定量蛋白质组学评价的19S亚群的分子组成。 A,将2-D DIGE应用于19S蛋白酶体异质性的定量分析。 19S我用Cy3(绿色)和19秒II标记为Cy5(红色)。通过LC-MS / MS获取每个斑点的分子标识。 HSP90丰富于19世纪我(绿色); S5B和EIF3亚基富集于19秒II(红色)。 B,鼠心脏19s复杂的亚级亚级和19s II通过Nondenaturing天然页面,胰蛋白酶消化和标记来显示 18o / 16o分别在他们的c termini。然后将标记的肽组合并通过LTQ-甲腈LC-MS / MS进行定量分析。 C,强度比(19S I超过19SI II)表明两种亚步骤之间的相对蛋白质丰富。 S5B是唯一的常规19S亚基,其两种亚群之间的丰富性显着不同,19世纪II的富集。

       HSP90是19S亚贫民的独特功能关联合作伙伴

      通过本机Page-LC-MS / MS被识别为HSP90为19S I的组件(Fig. 4A)。在小鼠心脏19s I中鉴定了衍生自HSP90的八种不同的肽,举例说明了与19S II相比,HSP90与19S I复合物的实质和优先性合作(补充图S4)。此外,免疫印迹分析证实了19s I的独特分子特征(Fig. 4B)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4HSP90的差异招募有助于心脏19s复杂的异质性。 A,在Nondenativing天然页面之后用LC-MS / MS确认19S相关HSP90的分子标识。 HSP90肽的光谱 292npdditqeeygefyk.306 显示了。 B,具有Hsp90特异性抗体的定量免疫印迹测定证明了Hsp90对亚泊素19s I独特。19s亚基RPT2,RPT4,RPN2和RPN7的相对含量也被探测为负载控制。 C,二维本机页面和SDS-PAGE于19世纪I执行,确认HSP90与19世纪I的交互在本地,不完整状态下。
      HSP90是已知的分子伴侣,其在组装或暴露于氧化应激期间与20S,26s和11S蛋白酶相互作用(
      • Imai J.
      • Maruya M.
      • YASHIRODA H.
      • Yahara I.
      • Tanaka K.
      分子伴侣HSP90在组装和维持26s蛋白酶体中起作用。
      ,
      • Conconi M.
      • Djavadi-Ohaniance L.
      • uerkvitz w.
      • Hendil K.B.
      • Friguet B.
      用单克隆抗体分析20S蛋白蛋白酶体的构象变化。
      ,
      • Whittier J.E.
      • 熊Y.
      • rechsteiner m.c.
      • Squier T.C.
      HSP90通过20S蛋白酶体增强氧化钙调蛋白的降解。
      )。然而,先前尚未报道HSP90与19S复合物的直接关联。使用与免疫印迹结合的2-D NondEnaturing Native-Page / SDS页面,我们在HSP90与来自小鼠心脏的19岁的特定相互作用( Fig. 4C)。
      研究了HSP90对活化20S蛋白酶20S蛋白酶的能力的功能影响 体外。由于HSP90的耗尽来自19世纪I的原生条件下不可行,我们使用具有不同结构,Biib021和Geldanamycin的HSP90的特异性抑制剂,以评估HSP90在19S I功能上的影响(图。 5.A5B)。 HSP90的抑制导致19S I激活电位20S的显着增强,因此将HSP90鉴定为心脏中19S的负调节器。 HSP90抑制剂都没有显着影响19s II的功能效力。此外,BiiB021和Gelddanamycin都没有显着影响20s活性(Fig. 5C)。先前已显示HSP90以与20S蛋白质相互作用;在该测定中,单独的HSP90没有显着影响20S蛋白水解活性(Fig. 5D);从而确认19S I复合物作为HSP90的特定调节目标。此外, 体外 治疗19世纪I或19S II,重组HSP90未仿死19S活动中的显着功能变化(Fig. 5E)。该观察结果建议19S I含有足够的内源性Hsp90和19s群II可以调整抑制Hsp90关联的构象。随着重组Hsp90的添加,19s和19s II的活性仍然明显。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5HSP90抑制了19S亚群的生物效力I. A,通过HSP90抑制剂BiiB021评价HSP90对19S复合物的功能影响。抑制19s相关的Hsp90显着提高了20s依赖性蛋白水解活性的19s I的活性效力,表明Hsp90是19s I的负调节器(n = 4). B,HSP90对19S复合物的功能影响用另一个HSP90抑制剂,Geldanamycin验证,支持Hsp90,为19s I的特定负调节器(n = 4). C,Biib021和Geldanamycin都没有显着影响20s活性(n = 3). D作为另一个阴性对照,检查HSP90对20S蛋白谱(没有19S)的功能影响。 20S蛋白酶的蛋白水解功能不受外源性Hsp90抑制,表明通过19s(以下)转导HSP90诱导的20S蛋白水解功能抑制(n = 4). E, 体外 用重组Hsp90治疗没有显着改变19s或19s II的功能(n = 4).

      讨论

      19S复合物是第一个识别的和最复杂的蛋白酶体系调节剂。 19s复合物的主要比例与20S蛋白瘤相互作用,用于募集和催化蛋白质基质曲目的靶向降解(
      • coux o.
      • Tanaka K.
      • Goldberg A.L.
      20S和26S蛋白质的结构和功能。
      )。此外,19S复合物独立于20S蛋白酶作为分子伴侣(
      • 刘C.W.
      • 斯特里克兰e.
      • demartino g.n.
      • 托马斯P.J.
      PA700的识别和加工被错误折叠的蛋白质,19S蛋白酶体的19S调节综合体。
      )或翻译后修改的监管机构(
      • Koues O.I.
      • 达德利r.k.
      • mehta n.t.
      • 格里尔S.F.
      19S蛋白酶体在细胞因子诱导基因下呈正调节组蛋白甲基化。
      )。我们目前对19S综合体的了解主要来自26s蛋白素的研究,这可能有限制我们对心脏细胞内的19S异质性和专业化的欣赏。

       纯化小鼠心脏19s复合物

      19s复合物的不稳定性质及其与丰富的肌原纤维蛋白质的关联(
      • 戈麦斯A.V.
      • 宗C.
      • Edmondson R.D.
      • 李X.
      • Stefani E.
      • 张继夫
      • 琼斯·罗克。
      • Thyparambil S.
      • 王G.W.
      • 乔X.
      • Bardag-Gorce F.
      • ping p.
      映射小鼠心脏26s蛋白酶体复合物。
      ,
      • 戈麦斯A.V.
      • 年轻的G.W.
      • 王Y.
      • 宗C.
      • eghbali M.
      • 劳动o.
      • lu h.
      • Stefani E.
      • ping p.
      哺乳动物组织中20S蛋白酶体复合物的对比蛋白质组生物学和功能异质性。
      )需要一个有效隔离的精细方案。在初步实验中投入的重大努力,我们调整了净化程序以适应心脏组织的独特特征(
      • demartino g.n.
      PA700的纯化,19S的26s蛋白酶体的19S调节络合物。
      ,
      • 楚平M.
      • vu J.H.
      • PROSKE R.J.
      • 屠宰C.A.
      • demartino g.n.
      高分子量,ATP依赖性活化剂(PA700)的鉴定,纯化和表征20 S蛋白酶体的鉴定。
      )。在盐沉淀步骤中,硫酸铵浓度的窗口缩小为0-40%至30-40%。与DE52树脂吸收一起,大部分污染物蛋白质从心脏组织匀浆中有效地除去。在隔离步骤之间加入ATP作为补充剂,导致不稳定的稳定性19s络合物稳定。施用高分辨率单Q离子交换色谱法将羟基己酯色谱替代为纯度细化的最终步骤(
      • demartino g.n.
      PA700的纯化,19S的26s蛋白酶体的19S调节络合物。
      )。 MonoQ色谱法表现出优异的敏感性,再现性和分辨率,用于纯化小鼠心脏19S络合物。可以通过额外的分馏技术来实现19s异质性的更深划分。
      19S复合体与两个子结构,“基础”和“盖子”共同配置(
      • coux o.
      • Tanaka K.
      • Goldberg A.L.
      20S和26S蛋白质的结构和功能。
      ,
      • Yoshimura T.
      • Kameyama K.
      • Takagi T.
      • Ikai A.
      • Tokunaga F.
      • Koide T.
      • Tanahashi N.
      • Tamura T.
      • Cejka Z.
      • Baumeister W.
      • 等等。
      大鼠肝脏“26s”蛋白酶体复合物的分子表征。
      )。特定于三个不同的19S亚基特异的抗体面板;从“基部”(RPN2和RPT4)和来自“盖子”(RPN7)的两个,被配制成沿纯化方法跟踪这些子结构之间的相关性。并联进行NondEnaturing天然电泳,LC-MS / MS和酶活性测定,以彻底地询问纯化的小鼠心脏19S络合物的嵌体性。

       小鼠心脏19s复合物的异质性

      通常,蛋白酶体复合物的功能动态因组织而异(
      • 戈麦斯A.V.
      • 年轻的G.W.
      • 王Y.
      • 宗C.
      • eghbali M.
      • 劳动o.
      • lu h.
      • Stefani E.
      • ping p.
      哺乳动物组织中20S蛋白酶体复合物的对比蛋白质组生物学和功能异质性。
      ,
      • raijmakers r.
      • Berkers C.R.
      • 德继东
      • OVAA H.
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      用于蛋白质定量的自动在线顺序同位素标记适用于蛋白酶体组织特异性多样性。
      )。在心脏中,存在一系列具有不同活动的异质蛋白酶体种类,其共同可以直接靶向蛋白质稳态(
      • kloss a。
      • Meiners S.
      • Ludwig A.
      • Dahlmann B.
      多个心脏蛋白酶体亚型对蛋白酶体抑制剂的敏感性不同。
      ,
      • 劳动o.
      • Wildgruber R.
      • 宗C.
      • Sukop U.
      • NISSUM M.
      • 韦伯G.
      • 戈麦斯A.V.
      • ping p.
      哺乳动物蛋白酶体亚群,具有不同分子组合物和蛋白水解活性。
      )。分子组件的变异导致生化活性的差异(
      • Zachara N.E.
      • 哈特G.W.
      O-GlcNAC修饰:一种调节蛋白酶体功能的营养传感器。
      ,
      • isasa m.
      • 凯茨e.j.
      • 金W.
      • yugo v.
      • Gonzálezs。
      • Kirkpatrick D.S.
      • 汤姆森下午
      • 芬利D.
      • Gygi S.P.
      • 克罗斯B.
      RPN10的单突调节底物募集蛋白酶体。
      )以及对氧化应激的易感性(
      • Gurusamy N.
      • Goswami S.
      • Malik G.
      • DAS D.K.
      氧化损伤诱导选择性而不是全局抑制蛋白酶体活性。
      )和抑制剂(
      • kloss a。
      • Meiners S.
      • Ludwig A.
      • Dahlmann B.
      多个心脏蛋白酶体亚型对蛋白酶体抑制剂的敏感性不同。
      )。然而,19S复合物的多样性及其分子基础,直到现在差不多。该研究报告了一种新颖的大规模色谱纯化的心脏19S络合物,其使分子和酶促表征以系统的方式实现。
      19S复合物的异质性首先从研究展示了19S亚基的翻译后修改(
      • 缎k。
      • Sasajima H.
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      )。此外,从牛红细胞的19S复合物与羟基磷灰石色谱分为两个亚群(
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      • demartino g.n.
      高分子量,ATP依赖性活化剂(PA700)的鉴定,纯化和表征20 S蛋白酶体的鉴定。
      )。来自第二种洗脱亚群的红细胞19S复合物表现出比第一个的生物活性更低;然而,不阐明这种差异的分子基础。在这次调查中,我们使用单Q色谱法从小鼠心脏中孤立两个不同的19S群。与红细胞19S复合物相反,心脏19S络合物(19SI II)的后续洗脱亚沉积显示出较高的活化能力。这种差异的一种可能原因是通过单Q色谱法的19S复合物的分离动力学与羟基磷灰石色谱法不同。另一种可行的情景是心脏19s复合物在红细胞的功能动力学或分子特征中表现出显着差异。
      在这项研究中,我们采用了一种功能性蛋白质组学方法来表征导致心脏中19S复合物的功能性异质性的分子特征。通过定量蛋白质组学方法观察独特的分子量。其中,HSP90被鉴定为19世纪I的功能相关伙伴,但不是19s II,鼠心脏复合物,并且活性HSP90的存在显着抑制了19s I的功能效力.Hsp90可以在许多方面影响19s的功能。它可以降低19s和20s蛋白瘤之间的结合亲和力或阻碍底物的通过朝向蛋白水解中心。 19SS复合物中的ATP酶活性也可能是监管目标。还发现真核引发因子3(EIF3)在2-D Dige分析中,19S亚群之间的显着不同。这可能反映了这种亚群的专业化蛋白翻译中的作用(
      • baugh 201.
      • pilipenko e.v.
      20S蛋白酶体差异地通过EIF4F和EIF3的切割而改变不同的mRNA的翻译。
      )。正在实施实验方案,进一步分析EIF3和其他独特的分子特征的作用,为心脏19S复合物的多样性提供额外的洞察。发现S5B与19s II占主导地位。 S5B先前已经显示为有助于19S组装,并且还与成熟的19S复合物进行功能性联系(
      • Le Tallec B.
      • Barraul M.B.
      • GuéroisR.
      • Carrét.
      • Peyroche A.
      HSM3 / S5B参与蛋白酶体19S调节粒子的组装途径。
      )。我们的数据支持C5B与心脏成熟蛋白酶体复合物相互作用的观点,因为19S II没有组装中间体构成。相反,定量测定表明19s和19s II具有匹配的亚基化学计量(图。 3.A3C)。此外,19世纪II具有全功能,进一步支持该人群本质上成熟。

       19S多重性在心血管生物学中的影响

      该蛋白酶仅仅是被动蛋白质降解机。在许多形式的心肌病,包括缺血再灌注损伤(
      • Bulteau A.L.
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      冠状动脉闭塞/再灌注期间蛋白酶氧化改性和灭活。
      ),肥大(
      • 贬低C.
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      • 彼得P.
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      在压力过载过程中激活心脏蛋白酶促进心室肥厚。
      ), 心肌炎 (
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      正在进行的Coxsackievirus心肌炎与心肌促蛋白酶的增加和活性增加有关。
      )和糖尿病心肌病(
      • 胡锦涛
      • Klein J.D.
      • 杜杰克
      • 王X.H.
      糖尿病患者心肌蛋白分解代谢:胰岛素缺乏激活泛素蛋白酶体系。
      )。药理试剂抑制的应用(
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      泛素蛋白酶体系抑制抑制心肌细胞肥大。
      )或保存蛋白酶体功能(
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      用棕榈油Tocotrienols心脏保护剂:不同异构体的比较。
      )在对抗心肌病方面表明了有希望的益处。然而,长剂量蛋白酶体抑制剂的延长施用也可能对心脏诱导有害副作用(
      • voortman J.
      • Giacconone G.
      Bortezomib治疗后严重可逆心衰竭结合非小细胞肺癌患者的化疗:案例报告。
      )。因此,重要的是工程师以精确的特异性设计有针对性的干预策略。
      蛋白酶体系中异质性的鉴定和表征提供了实现这种目标的知识。 19s复合物的不同群体赋予不同的功能状态;它们之间的动态平衡集体定义了蛋白质降解。在分子水平的这种多样性的表征可以促进有针对性的干预策略。各种种类的蛋白酶体复合物在功能性动态中表现出明显的性质(
      • Cai Z.P.
      • van Kaer L.
      • Becker L.C.
      缺血预处理诱导的心脏保护丢失在具有免疫促进次亚基低分子量多肽-2缺乏的小鼠中。
      ),抗氧化损伤(
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      氧化损伤诱导选择性而不是全局抑制蛋白酶体活性。
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      通过4-羟基-2-NONENAL灭活蛋白酶体是特异性的,依赖于20S蛋白酶体亚型。
      )对药理剂的易感性(
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      多个心脏蛋白酶体亚型对蛋白酶体抑制剂的敏感性不同。
      )。利用分子特性的区别,可行的发展靶向蛋白酶蛋白酶的特异性亚群的药剂是可行的(
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