HSV-1 CGAL+ 感染促进Quaking RNA结合蛋白质的产生,并诱导人肝癌细胞中Quaking I-5同种型的核 - 细胞质血管*

  • 弗吉尼亚州Sánchez-Quiles
    隶属关系
    肝脏学和基因治疗,蛋白质组学和生物信息学单位,应用医学研究中心(CIMA),纳瓦拉大学,31008潘普洛纳,西班牙
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  • Maríai.Mora.
    隶属关系
    肝脏学和基因治疗,蛋白质组学和生物信息学单位,应用医学研究中心(CIMA),纳瓦拉大学,31008潘普洛纳,西班牙
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  • Victor Segura.
    隶属关系
    肝脏学和基因治疗,蛋白质组学和生物信息学单位,应用医学研究中心(CIMA),纳瓦拉大学,31008潘普洛纳,西班牙
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  • Anna Greco.
    隶属关系
    De LyonUniversitéducb-lyon 1,里昂,F-69003,法国

    CNRS,UMR5534,CenterdeGénétiqueMoléculaireetCellulaire,16 rue Dubois,Villeurbanne,F-69622,法国
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  • Alberto L. Epstein
    隶属关系
    De LyonUniversitéducb-lyon 1,里昂,F-69003,法国

    CNRS,UMR5534,CenterdeGénétiqueMoléculaireetCellulaire,16 rue Dubois,Villeurbanne,F-69622,法国
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  • Maria Giovanna Foschini
    隶属关系
    实验和诊断科学系 - 法拉拉大学微生物学区,通过Luigi Borsari 46,44100 Ferrara,意大利
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  • Loïc日常
    隶属关系
    结构生物学和生物信息学,生物医学蛋白质组学集团,日内瓦大学,日内瓦4,日内瓦1211,瑞士
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  • Jean-Charles Sanchez
    隶属关系
    结构生物学和生物信息学,生物医学蛋白质组学集团,日内瓦大学,日内瓦4,日内瓦1211,瑞士
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  • jesús普里托
    隶属关系
    肝脏学和基因治疗,蛋白质组学和生物信息学单位,应用医学研究中心(CIMA),纳瓦拉大学,31008潘普洛纳,西班牙
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  • Fernando J. Rollales.
    脚注
    隶属关系
    肝脏学和基因治疗,蛋白质组学和生物信息学单位,应用医学研究中心(CIMA),纳瓦拉大学,31008潘普洛纳,西班牙
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  • enriquesantamaría.
    一致
    应如何解决对应的通信:肝脏和基因治疗的分裂。 Cima,医学院,纳瓦拉大学,31008潘普洛纳,西班牙。电话:34-948-194700;传真:34-948-194717.
    脚注
    隶属关系
    肝脏学和基因治疗,蛋白质组学和生物信息学单位,应用医学研究中心(CIMA),纳瓦拉大学,31008潘普洛纳,西班牙
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了支持:FIMA与“UTE项目CIMA”之间的协议;授予Ministerio de Ciencia eInvinación至FJC的Prants Nacional I + D + I Saf2008-0154; Grant Strep FP6-2004-LifeScihealth-5 018649(Thovlen)从UE的第6框架计划到FJC; ISCIII-RETIC RD06 / 0020至MAA和FJC。 VSQ有来自FIMA和Boehringer Ingelheim的奖学金。 CIMA的蛋白质组学核心设施是普及的国家蛋白质组学设施研究所成员。
    本文含有补充材料。
    1所用的缩写是:HSV-1HERPES单纯X病毒型-1HCchepocellular癌动力倍增性,感染PFuplaque的形成单位感染肌电聚焦Qkiprotein Quakingliquid色谱段Qkiprotein Quakingliquid色谱验电剂离子化分析仪/ mstandem质谱凝胶电泳瘤型肌肉尺寸差异凝胶电泳术仪。
    ¶作者的股份高级作者。
      基于钙菌载体的Herpesvirus类型1(HSV-1)是作为包括肝细胞癌,包括肝细胞癌的有希望的治疗替代方案。然而,介导宿主细胞对这种处理的响应的机制不是完全已知的。 HSV-1感染很好地确定了宿主细胞核中的功能和结构改变。在目前的工作中,我们使用了凝胶和霰弹枪蛋白质组学策略来阐明在HSV-1 CGAL上的人肝癌细胞(HUH7)中损害的信号通路+感染。两种方法允许鉴定差异蛋白质,表明宿主病毒相互作用诸如转录调节,mRNA处理和mRNA剪接的许多方面涉及细胞功能的损害。基于我们的蛋白质组学数据和额外的功能研究,当也可以检测到诸如ICP4和ICP27等病毒立即早期基因时,细胞蛋白质Quoting含量(QKI)增加4小时。通过小干扰RNA耗尽QKI表达导致病毒立即早期蛋白质水平降低,随后的早期病毒蛋白质含量降低,以及病毒产量的降低,表明QKI直接干扰病毒复制。特别是HSV-1 CGAL+诱导淬火I-5同种型(QKI-5)水平的瞬态增加,并行于P27的增强KIP1蛋白质含量。此外,免疫荧光显微镜显示QKI-5的早期核再分布,从细胞核从细胞核中穿梭,并在细胞中与124 HPI的细胞接触区域中的凝集蛋白粘接到细胞接触区域。这证据揭示了介导肝癌细胞对HSV-1载体响应的机制阐明了QKI作为中央分子介质的机制。
      Herpesvirus类型1(HSV-1)
      使用的缩写是:
      HSV-1
      单纯疱疹病毒类型-1
      HCC.
      肝细胞癌
      moi.
      多种感染
      PFU.
      斑块形成单位
      HPI.
      感染后的小时数
      IEF.
      等电聚焦
      QKI.
      蛋白质燃烧
      LC.
      液相色谱法
      ESI
      电喷雾电离
      女士/女士
      串联质谱
      二维数字
      二维差异凝胶电泳
      TM值T.
      串联大规模标签
      LTQ.
      线性离子阱。
      是一种大,双链DNA病毒,具有153kbp的基因组,编码至少89个蛋白质。 HSV-1在宿主细胞的核中重复,其基因表达遵循包括三个阶段的时间模式:立即(即),早期(E)和晚期(L)基因(
      • Clement J.B.
      • Watson R.J.
      • Wilkie n.m.
      疱疹病毒类型1转录的时间调节:病毒基因组上的转录物的位置。
      )。通过滚动圆机构复制HSV基因组。它在3-4小时内开始发布(HPI)达到8-16 HPI之间的最高效率(
      • Phelan A.
      • 巴克利
      • Clement J.
      用HSV-1感染细胞的核内的功能域。
      )从病毒进入中取出一轮裂解复制,在允许组织培养细胞中释放〜16-20小时(
      • Antrobus R.
      • 格兰特K.
      • Gangadharan B.
      • Chittenden D.
      • 埃弗雷特R.D.
      • Zitzmann N.
      • Boutell C.
      单纯疱疹病毒类型1感染的早期细胞蛋白质组学分析揭示了宿主细胞蛋白质组的广泛变化。
      )。当病毒粒子在宿主细胞表面上结合存在的硫酸乙酰肝素部分时,感染过程开始。在感染的前30分钟内,初始附着触发涉及多种病毒和宿主细胞蛋白和受体的级联分子相互作用,导致病毒核衣壳和Tegument蛋白渗透到细胞质中(
      • döhnerk.
      • Radtke K.
      • 施密特S.
      • Sodeik B.
      Eclipse疱疹疱疹病毒型1型感染:高效的Dynin介导的衣壳输送,没有小衣壳蛋白VP26。
      )。渗透后,病毒衣壳和相关的Tegument蛋白与Dynein相互作用,并使用微管网将细胞溶溶胶转移到核封套,在那里它们与核孔停靠,并在核心中释放其未涂覆的基因组以进行病毒转录和复制。病毒基因表达的时间程序是高度调节的(
      • Heess R.W.
      • Roizman B.
      调节疱疹病毒高分子合成。 I.级联调节三组病毒蛋白的合成。
      ,
      • Heess R.W.
      • Roizman B.
      Herpesvirus大分子合成的调节:多肽合成的连续转变需要功能性病毒性多肽。
      )。在病毒感染期间转录的第一个基因是作为E基因转移剂的IE基因。 E蛋白质包括试病毒基因组的复制所需的酶。 HSV-1基因表达的时间程序以L基因的出现结束,其构成病毒的结构蛋白。所有病毒编码蛋白质的合成需要功能性IE蛋白质(
      • 泰勒T.J.
      • 布罗克曼M.A.
      • McNamee E.E.
      • 捏合下午。
      单纯疱疹病毒。
      )。同时,病毒通过称为Virion Host Shutoff的机制来抑制宿主细胞RNA代谢(
      • kwong a.d.
      • Kruper J.A.
      • Frenkel N.
      疱疹病毒病毒群岛主机关闭功能。
      ),导致MRNA和细胞中的稳定化和细胞多泡体(
      • sydiskis r.j.
      • Roizman B.
      患有单纯疱疹病毒的宿主中的宿主性多蛋白酶的分解。
      )。通过立即抑制宿主细胞蛋白质合成和由立即早期的HSV-1 ICP27蛋白介导的宿主蛋白质合成和RNA剪接后,在感染后不再补充病毒士宿主关闭。
      • HARDY W.R.
      • Sandri-goldin r.m.
      单纯疱疹病毒抑制宿主细胞剪接,并且需要调节蛋白质ICP27的这种效果。
      )。这些改变细胞转录和RNA处理因子,例如聚腺苷酸化因子和RNA聚合酶II的磷酸化状态(
      • 米饭S.A.
      • 长M.C.
      • 林V.
      • 斯宾塞C.A.
      在单纯疱疹病毒感染后,RNA聚合酶II被异常磷酸化并局限于病毒复制室。
      )以牺牲其宿主细胞的牺牲作递减病毒基因组。虽然在感染过程中逐渐抑制了大多数细胞蛋白的合成,但即使在晚期期间,一些特定的细胞蛋白也继续有效地合成(
      • CalléA。
      • Ugrinova I.
      • 爱普斯坦A.L.
      • 灌木丛
      • Diaz J.J.
      • Greco A.
      核仁患者是一种有效的疱疹病毒类型1感染所需的。
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      • Greco A.
      • 生物方武器W.
      • 桑切斯J.C.
      • kinditer k。
      • Hochstrasser D.
      • Madjar J.J.
      • Diaz J.J.
      用疱疹病毒1型感染过程中核糖体相关病毒和细胞碱性蛋白的鉴定。
      )。最近的研究使用了不同的蛋白质分离方法和相对量化的策略来研究对不同病毒感染的细胞反应(
      • Viswanathan K.
      • Frühk。
      病毒蛋白质组学:对病毒的全球评估及其与主体的互动。
      )。基于2-DE的组合具有质谱(MS)的对比蛋白质组学已经用于描述HSV-1感染细胞的蛋白质谱(
      • Antrobus R.
      • 格兰特K.
      • Gangadharan B.
      • Chittenden D.
      • 埃弗雷特R.D.
      • Zitzmann N.
      • Boutell C.
      单纯疱疹病毒类型1感染的早期细胞蛋白质组学分析揭示了宿主细胞蛋白质组的广泛变化。
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      • 圣玛丽亚E.
      • mora m.i.
      • Carro-Roldan E.
      • 莫里娜M.
      • Fernández-Irigoyen J.
      • Marconi P.
      • Manservigi R.
      • Greco A.
      • 爱普斯坦A.L.
      • 普罗佐J.
      • Hernández-alcoceba R.
      • Rucales F.J.
      鉴别人肝癌异血移植小鼠模型中的复制竞争力HSV-1 CGAL +菌株靶标。
      ,
      • 圣玛丽亚E.
      • mora m.i.
      • Potel C.
      • Fernández-Irigoyen J.
      • Carro-Roldáne.
      • Hernandez-Alcoceba R.
      • 普罗佐J.
      • 爱普斯坦A.L.
      • Rucales F.J.
      函数细胞器蛋白质组学,鉴定鉴定态竞争力的HSV-1 CGAL +应变信号靶标。
      )。在靶向蛋白质组学研究中,已经描述了HSV-1 VP19C和VP26蛋白在HeLa细胞中缔纳于核糖体(
      • Greco A.
      • 生物方武器W.
      • 桑切斯J.C.
      • kinditer k。
      • Hochstrasser D.
      • Madjar J.J.
      • Diaz J.J.
      用疱疹病毒1型感染过程中核糖体相关病毒和细胞碱性蛋白的鉴定。
      )和HSV-1 ICP8和ICP27直接与涉及细胞翻译,复制和染色质重塑的大细胞复合物的成员,表明新见解进入病毒复制机制(
      • Fontaine-Rodriguez e.c.
      • 泰勒T.J.
      • olesky m.
      • 捏合下午。
      单纯疱疹病毒感染细胞蛋白27的蛋白质组学:与翻译引发因子相关联。
      ,
      • 泰勒T.J.
      • 捏合下午。
      单纯疱疹病毒复制隔间的蛋白质组学:细胞DNA复制,修复,重组和染色质与ICP8重塑蛋白质的关联。
      )。
      肝细胞癌(HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,全球年发病率近100万件案件(
      • el-serag h.b.
      • 鲁道夫K.L.
      肝细胞癌:流行病学和分子致癌作用。
      )每年估计60,000人死亡(
      • Parkin D.M.
      • 布雷德F.
      • Ferlay J.
      • Pisani P.
      全球癌症统计,2002年。
      )。虽然鉴定了危险的主要风险因素和常规筛查风险的人口可能导致HCC的早期诊断,但预后差主要是由于诊断时病变的侵略性以及缺乏有效的侵略性疗法。基于HSV-1的溶血性载体的发展(
      • Mullen J.T.
      • Tanabe K.K.
      恶性肝肿瘤的病毒溶解。
      )通过诱导肉藻凋亡(

      Blaho,J.A.,oncoapodeasis:一种新的癌症治疗分子治疗。 Iubmb Life 62,87-91

      ,
      • Nguyen M.L.
      • Blaho J.A.
      单纯疱疹病毒感染期间的细胞凋亡。
      ),是一个有前途的研究方法,可专门和有效地人类癌细胞(
      • Nguyen M.L.
      • Blaho J.A.
      单纯疱疹病毒感染期间的细胞凋亡。
      ,
      • 沉Y.
      • nemunaitis J.
      单纯疱疹病毒1(HSV-1)用于癌症治疗。
      )。因为癌细胞对由改性的HSV-1菌株诱导的凋亡特别敏感(
      • Nguyen M.L.
      • Blaho J.A.
      单纯疱疹病毒感染期间的细胞凋亡。
      ,
      • Aubert M.
      • Blaho J.A.
      人肿瘤细胞病毒型凋亡。
      ,
      • Nguyen M.L.
      • 牛皮纸下午
      • Blaho J.A.
      癌细胞对单纯疱疹病毒依赖性细胞凋亡的易感性。
      ),对鉴定宿主肿瘤细胞反应的细胞中间体对HSV-1菌株的鉴定越来越令人兴趣,以促进更有效和特异性载体的发育。通过对比细胞溶质和微粒体蛋白质组分析,我们先前鉴定了ERLIN-2,BIF-1,RuvB样2和PP2A作为新型HSV-1 CGAL+ 参与调节人肝癌细胞死亡的目标。 RAF / MAP激酶和FAK / PI3K / AKT生存途径的放松管制与涉及BCL2家族的激活和失活的线粒体凋亡途径以及患有Caspase 3的激活(24 HPI)的激活,在至少部分地,负责Huh7细胞死亡的效应工艺(
      • 圣玛丽亚E.
      • mora m.i.
      • Potel C.
      • Fernández-Irigoyen J.
      • Carro-Roldáne.
      • Hernandez-Alcoceba R.
      • 普罗佐J.
      • 爱普斯坦A.L.
      • Rucales F.J.
      函数细胞器蛋白质组学,鉴定鉴定态竞争力的HSV-1 CGAL +应变信号靶标。
      )。获得对HSV-1 CGAL协调HUH7细胞响应的机制的洞察力+ 在激活凋亡途径之前感染,我们已经分析了HSV-1 Cgal诱导的Huh7核蛋白质组改变+ 在8 HPI,使用具有LTQ-轨道仪器的二维 - Dige和串联质量标记(TMT)异质标记定量质谱。我们提供62个核蛋白质核蛋白质组的核蛋白质组分,其可以调节宿主病毒相互作用,细胞周期调节和RNA稳态,突出显示QKI作为最佳HSV-1 Cgal所需的细胞因子+ replication.

      实验步骤

       材料

      使用以下试剂和材料:抗QKI-5被DRA提供。 K. Artzt(德克萨斯州德克萨斯大学,德克萨斯州德克萨斯州),抗QKI-PAN克隆N147 / 6(UC DAVIS / NIH NIH NEUROMAB设施),反US11(
      • Diaz J.J.
      • Simonin D.
      • Masse T.
      • 泄漏者P.
      • kinditer k。
      • Denoroy L.
      • Madjar J.J.
      单纯疱疹病毒类型1 US11基因产物是磷酸化蛋白,发现与核糖体亚基有关。
      ),抗kdel,抗ICP4,抗ICP27和抗β-肌动蛋白(ABCAM,Cambridge,MA),抗组蛋白H4(Millipore,Billerica,MA),抗P27KIP1,抗P57Kip2 (细胞信号,Danvers,MA),抗正态-1,抗HDAC-1,抗HNFα和防ICP0(Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)。 Anti-UL42被H. Marsden博士(
      • Sinclair M.C.
      • Mclauchlan J.
      • Marsden H.
      • 棕色三
      疱疹病毒型1型缺失变体(1703)的表征,其在立即产生VMW63期间的感染。
      )。从Promega(麦迪逊,Wi)的GE Healthcare和胰蛋白酶购买电泳试剂。

       病毒生产

      Vero细胞用于HSV-1 Cgal的繁殖和滴定+。 HSV-1 CGAL+ 是衍生自CGALδ3的复制竞争力的HSV-1菌株,其通过HSV -117Syn +与ICP4缺失的两份拷贝和从非基因区Igr54插入LacZ基因。 HSV-1 CGAL+ 通过修复ICP4的两份(
      • 约翰逊P.A.
      • 最好的m.g.
      • Friedmann T.
      • Parris D.S.
      分离单纯疱疹病毒型1突变体删除基本UL42基因和其零表型的表征。
      )。将细胞保持在单层中,用含有5-10%胎牛血清和青霉素和链霉素的Dulbecco的改性鹰蛋白培养基(DMEM)。

       人肝癌细胞的培养和治疗

      Huh7细胞(JCRB Genebank,Japan)在补充10%胎牛血清的DMEM中培养, l-Glutamine和青霉素和链霉素。 Huh7细胞(1×106 or 5 × 106 细胞/盘用于分析和蛋白质组学实验)被HSV-1 CGAL感染+ 在5个斑块形成单元(PFU)/细胞的多种感染(MOI)中。在37℃温育1小时后,洗涤细胞并在表明时间段内在相同条件下与新鲜培养基一起温育。对照HuH7细胞和嘲弄的HUH7细胞之间没有统计学上显着的差异(与最小量的未染色的Vero细胞上清液孵育)。用嘲弄的HuH7细胞用作参考样品。对于QKI沉默,使用了特定的小干扰RNA(siRNA)。根据制造商的说明,使用Dharmafect试剂(Dharmafect 4转染试剂T-2004-03; Dharmacon Research)进行转染。 SiRNA针对QKI(SIQKI:5'-GGCACCUACAGAGAUGCCAACAU-3')和控制(SIGL:5'-CGUACGCGGAUCUCGAUU-3')来自Dharmacon Research。转染后36小时,用HSV-1 Cgal提到的细胞感染细胞+ 在5个PFU / Cell的MOI下为指定的时间段,然后处理适当的分析。

       二维数字,成像和质谱

      在8小时后除去培养基,用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞三次。使用来自QIAGEN的Q丙片组细胞室套件进行亚细胞分级。根据制造商的建议,通过差分离心分离核级分。丙酮沉淀后,蛋白质样品在二维数字样品缓冲液中溶解:7 m 尿素,2 m 硫脲,4%3 - [(3-胆氨基丙基)二甲基胺] -1-丙磺酸(CHAPS),30米m Tris,缓冲至pH8.使用Bradford的测定(Bio-rad)测定蛋白质浓度。然后用400pmol Cydye Dige Flum Minimal染料(GE Healthcare)标记50μg蛋白质,并根据制造商的说明书(Cy3,Cy5为样品和Cy2组成的混合物组成的内部控制,在黑暗中孵育30分钟30分钟。通过所有样品的等量蛋白质)。配对样品被反向标记以防止潜在的染料标记偏压。通过加入1μl10μm停止反应物m 赖氨酸并在冰上孵育10分钟。根据制造商的建议,将样品升高到IPG条带上,24cm,pH 3-11nL(GE Healthcare),并在IPGphor™IEF系统(GE Healthcare)中进行等电聚焦(IEF)。在IEF上,在平衡缓冲器中孵育条状(50米m Tris-HCl,pH 8.8,6 m 尿素,30%甘油,2%SDS,溴酚蓝色痕量,含有0.5%二苯二酚15分钟,然后在与4.5%碘乙酰胺相同的缓冲液中15分钟。对于第二尺寸,将条带装载在12.5%聚丙烯酰胺凝胶(21×24cm)的顶部并运行(1w /凝胶)12-14小时,直到溴酚蓝染料达到凝胶底端。随后,使用台风扫描二维凝胶TM值 TRIO成像仪(GE Healthcare)分辨率为100微米的分辨率,分别具有488 / 520,532 / 580和633/670nm的λex/λem,分别用于Cy2,Cy3和Cy5。将光电倍增管设置为确保最大像素强度在90,000到99,000像素之间。使用Defyder 6.5软件(GE HealthCare)进行图像分析,如用户手册中所述。进行了三个独立的实验。简而言之,差动内凝胶分析模块用于不同凝胶中不同样品的点检测,点量量化和体积比标准化。然后,生物变异分析模块用于匹配不同凝胶之间的蛋白质斑点,并鉴定表现出显着差异的蛋白质点。在生物变化分析模块中进行手动编辑,以确保斑点在不同凝胶之间正确匹配,并摆脱条纹和斑点。当折叠变化大于1.2时,考虑了MS分析的差异表达斑点 p 价值之后 t 测试低于0.05。在上述相同程序之后,用350μg蛋白质进行制备凝胶。通过用Sypro Ruby蛋白质凝胶染色(Bio-rad)染色而可视化蛋白质,并用台风获得图像TM值 使用λex/λem为532/560 nm的三重奏。差异代表的斑点是手动切除的,并且如别处所述用肌浸料站(水)处理凝胶样本(
      • 圣玛丽亚E.
      • Avila M.A.
      • Latasa M.U.
      • Rubio A.
      • 马丁 - Duce A.
      • Lu S.C.
      • Mato J.m.
      • Rucales F.J.
      非酒精性脱脂性的功能蛋白质组学:线粒体蛋白作为S-腺苷甲基硫氨酸的靶标。
      )。用12.5ng /μl胰蛋白酶在50米中进行凝胶胰蛋白酶消化m 在37℃下碳酸氢铵12小时。用5%甲酸(Fa),50%乙腈(ACN)萃取所得肽。然后在MS分析之前以速度-AC浓缩样品。如前所述进行Nanolc-ESI-MS / MS分析(
      • 圣玛丽亚E.
      • mora m.i.
      • Potel C.
      • Fernández-Irigoyen J.
      • Carro-Roldáne.
      • Hernandez-Alcoceba R.
      • 普罗佐J.
      • 爱普斯坦A.L.
      • Rucales F.J.
      函数细胞器蛋白质组学,鉴定鉴定态竞争力的HSV-1 CGAL +应变信号靶标。
      )。使用MassLynx 4.0进行数据处理。数据库搜索是用三个独立的搜索引擎完成:蛋白蛋白,全球服务器2.3(Waters),Phenyx 2.6(Genebio)和吉祥物服务器2.2(矩阵科学),与Uniprotkb / Swiss-prot 51.6有257964条参赛作品(人类分类:15720条目) 。吉祥物搜索中使用的参数是:酶,胰蛋白酶;可变修饰,半胱氨酸的氨基甲酰化,甲硫氨酸氧化;最多错过的裂缝,1;肽质量耐受设置/窗户为50 ppm;产品质量耐受,0.1 da。可能性 p 随机匹配设置为默认值为0.05。

       用6-plex tmt还原,烷基化,消化和标记

      来自嘲笑和HSV-1 Cgal的30微克核蛋白质提取物+ - 将Huh7细胞溶解在300μl三乙基碳酸氢铵缓冲液(Temb)0.1中 m 调整为pH8(Fluka)。加入SDS(Fluka)1%在水(W:W)中以获得所有样品中的最终0.1%SDS。两个微升50米m 加入三(2-羧乙基) - 盐酸盐(TCEP-HCL)(SIGMA)。将反应在60℃下进行1小时。 400米的一μl碘乙酰胺(sigma)m 然后加入,在室温下将混合物在黑暗中反应30分钟。在茶叶中为0.2μg/μl浓度的10μl新鲜制备的胰蛋白酶的量(0.1 m) 加入。消化在37℃下进行过夜。在室温下在室温下实现TMT标记,在40.3μLAcN(Sigma-Aldrich)中加入6-Plex TMT试剂(0.83mg)。来自模拟感染细胞的核提取物(三份子酸酯)被TMT与记者标记 m / z. = 126.1,127.1和128.1和来自HSV-1 CGAL的核提取物+-huh7通过TMT与记者感染的细胞 m / z. = 129.1,130.1和131.1。在1小时后,在每个管中加入8μl5%羟胺(Sigma)(W / V)并混合15分钟。将六个样品合并在新管中,并在-20℃下储存时在储泊中干燥。汇集的TMT标记的样品在1毫升水中进行ressuspended:ACN(95:5)0.1%三氟乙酸(Fluka,Buchs,Switzerland)和使用Oasis®HLB1 CC(30mg)墨盒清洁(水域,Milford,MA )根据制造商的指示连接到真空系统,略有修改。

       汇集TMT标记样品的脱胶分离,LC-ESI LTQ-ORBITRAP MS / MS分析和数据库搜索

      干燥后,将合并的TMT标记的样品溶解在1616.4μLH中2O具有172.8μL甘油50%(安捷伦技术,Santa Clara,Ca)和10.8μl载体两种载体Ampholytes IPG缓冲液pH 3-10(GE Healthcare)。使用3100个整体分馏器(Agilent Technologies)进行肽等电聚焦分离。 IPG条带(pH 3-10,13cm)(GE Healthcare)在脱凝胶托盘上组装并再水合30分钟,溶液为89.8%H.2O,9.6%甘油50%,0.6%的载体两种。将样品加载到12个凝胶阱中。在将电压保持至500V之前,通过50μA的限制电流实现等电焦点,其限制电流为50μA的电流和20kV·H的极限。收集级分,并测量它们的pH(从Metrohm的744 pH计和生物转发)。将级分干燥,根据制造商的说明用C18超薄螺旋柱(哈佛装置,Holiston,MA)清洗,细微修饰并再次干燥。在配备有纳米核系统(水)的LTQ orbitrap XL(Thermo电子)上进行Nanolc-ESI-MS / MS。肽被捕获在自制5μm200Åmarg(michrom)0.1mm×20mm的预柱上,并在自制5μm100Åmaryc18aq(michrom)用重力拉出的发射器上分开。使用水/ FA 99.9%/ 0.1%和ACN / FA 99.9%/ 0.1%的梯度运行85分钟的85分钟(
      • 天顿L.
      • Hainard A.
      • Licker V.
      • Turck N.
      • Kuhn K.
      • Hochstrasser d.f.
      • Burkhard P.R.
      • 桑切斯J.C.
      MS / MS使用6-Plex Isobaric标签的人脑脊液中蛋白质的相对定量。
      )以220nl·min的流速−1。对于MS调查扫描,侧面分辨率设定为60,000,而离子群为5×105m / z. 窗口从400〜2000.在LTQ和更高能量C-TRAP解离(HCD)中,最多选择三个前体用于碰撞诱导 - 解离(CID),在壁球上分析。对于LTQ中的MS / MS,离子群为1×104 (隔离宽度为2 m / z.),而在围灰侧的MS / MS检测中,它是2×105 (隔离宽度为4 m / z.),分辨率为7500,第一次质量 m / z. = 100,最大喷射时间为750毫秒。 CID的正常化碰撞能量为35%,HCD为50%。动态时间排除为60秒。使用内部写入的Perl脚本生成峰值列表。 CID和HCD光谱使用定制程序合并(
      • 天顿L.
      • Hainard A.
      • Licker V.
      • Turck N.
      • Kuhn K.
      • Hochstrasser d.f.
      • Burkhard P.R.
      • 桑切斯J.C.
      MS / MS使用6-Plex Isobaric标签的人脑脊液中蛋白质的相对定量。
      )。使用Phenyx的Uniprot-Swiss-Prot数据库(57.4的57.4,57.4,565634条目)的纳米-ESI-MS / MS / MS分析的组合MGF文件进行了研究。 HOMO SAPIENS. 分类法(40335条目)已指定。可变氨基酸修饰氧化甲硫氨酸。将6-Plex TMT标记的肽氨基末端和赖氨酸(+229.1629Da)和半胱氨酸氨基甲酰化被设定为固定修饰。胰蛋白酶被选为酶,一个潜在的裂解。只有一个搜索轮,选择了“涡轮增压”得分。肽 p value was 1 × 10−3。蛋白质和肽评分设定为5.0,提供2%的假肽发现率。母离子耐受性为20ppm。对于所有分析,选择蛋白质匹配两种不同的肽序列。使用专用的Phenyx出口从峰列表中提取报告 - 离子强度。根据制造商提供的报告离子的同位素纯度纠正了记者离子强度。

       生物信息分析

      使用用于微阵列数据的线性模型进行TMT数据处理(
      • Smyth G.K.
      用于评估微阵列实验中差异表达的线性模型和经验贝叶斯方法。
      )找出在两种实验条件之间显示出显着差异表达的肽。对于给定的蛋白质的分数, p,被计算出了 p 其相应鉴定肽的值 S:
      p=-i=1|S|日志2(p-valuei)|S|
      (eq.1)


      要丢弃不一致,我们定义了一致性分数, s,对于给定蛋白质量化的肽作为所有可能的肽对的平均表达相似性。两种肽之间的相似性 PI.PJ. 被计算为对数的 p 使用Spearman等级相关性获得的值 PCOR.:
      p=-i=1|S|i=c+1|S|日志2(pcor(pi,pj))|S|(|S|-1)/2
      (eq。2)


      由此产生的分数(ps)组合在独特的指标中,以获得有趣的蛋白质的排名列表。差异表达蛋白质的选择是基于该得分的分布。所有分析都使用R(www.r-project.org.)和生物导体(www.biocondion.org.)(
      • 绅士五。
      • Carey V.
      • Dudoit S.
      • Irtizarry R.
      • Huber W.
      使用R和Biocumons的生物信息学和计算生物学解决方案。
      )。通过使用巧妙的途径分析进行生物学知识提取(ingenuity系统, www.ingenity.com.),数据库包括从文献源导出的手动策划和完全可追踪的数据。

       免疫素分析

      在12.5%SDS-PAGE凝胶中溶解等量的蛋白质(15μg)。将蛋白质电流转移到硝酸纤维素膜上,在120V中以120V在120V中将45分钟电。在5%牛血清白蛋白(BSA)或5%非乳乳中,用一抗膜探测膜,这取决于所用的一抗。与合适的辣根过氧化物酶 - 缀合的二抗(1:5000)孵育后,通过增强的化学机构(Perkin Elmer)可视化免疫反应性。通过Ponceau染色和用β-肌动蛋白特异性抗体(ABCAM)杂交来评估等于凝胶的等同凝胶。

       斑块测定

      为了测量抑制QKI表达后的病毒生产,用对照(GL)或QKI SIRNA治疗HUH7细胞36小时。然后用HSV-1 Cgal感染细胞单层+ (Moi = 1pfu / cell)。收集细胞和细胞培养物上清液在16和24 HPI。六孔板中的Huh7细胞用连续的10倍稀释的后代病毒接种。在37℃的1小时吸附时段后,除去接种物,然后用补充有1%甲基纤维素的DMEM覆盖。在用PBS洗涤两次洗涤后,通过在水中用0.5%晶体紫色固定和染色细胞,在72 HPI下计算并可视化斑块。

       免疫荧光显微镜

      HSV-1 CGAL+ - 在腔室滑动中生长在腔室载玻片中,用PBS洗涤两次,用PBS洗涤两次,在3.7-4%甲醛中固定10分钟,并通过Triton-X100 5%制成30分钟。在室温下封闭TBS-0.05%Tween 20(TBS-T)中的2%BSA后,将细胞与一抗抗体(兔抗QKI5,稀释1:1000或小鼠抗正键-1孵育,稀释1:100)在4℃下过夜。洗涤TBS-T,二级抗体,Alexa Fluor 488山羊抗兔(A11008,分子探针,丁烯,或;稀释1:200)或Alexa Fluor 568山羊抗小鼠(A11004,分子探针;稀释1:200 )在室温下施加60分钟。用4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(40009,Biotium)染色核。尼康Eclipse E800显微镜上拍摄了图片,配备了ePifloescesce光学。对指定的时间段进行了三个独立的实验。免疫荧光数字是在每组条件下观察到的整体效果的代表性。

      结果

       病毒感染核的二维数字分析

      HSV-1 CGAL的感染和复制能力+ 在huh7细胞之前,预先ed 体外 和HCC异种移植鼠模型(
      • 圣玛丽亚E.
      • mora m.i.
      • Carro-Roldan E.
      • 莫里娜M.
      • Fernández-Irigoyen J.
      • Marconi P.
      • Manservigi R.
      • Greco A.
      • 爱普斯坦A.L.
      • 普罗佐J.
      • Hernández-alcoceba R.
      • Rucales F.J.
      鉴别人肝癌异血移植小鼠模型中的复制竞争力HSV-1 CGAL +菌株靶标。
      ,
      • 圣玛丽亚E.
      • mora m.i.
      • Potel C.
      • Fernández-Irigoyen J.
      • Carro-Roldáne.
      • Hernandez-Alcoceba R.
      • 普罗佐J.
      • 爱普斯坦A.L.
      • Rucales F.J.
      函数细胞器蛋白质组学,鉴定鉴定态竞争力的HSV-1 CGAL +应变信号靶标。
      )。在8 HPI中检查核蛋白质,当大多数细胞中,感染90%的细胞显示最小的形态变化(
      • 圣玛丽亚E.
      • mora m.i.
      • Potel C.
      • Fernández-Irigoyen J.
      • Carro-Roldáne.
      • Hernandez-Alcoceba R.
      • 普罗佐J.
      • 爱普斯坦A.L.
      • Rucales F.J.
      函数细胞器蛋白质组学,鉴定鉴定态竞争力的HSV-1 CGAL +应变信号靶标。
      )。在核提取物中除了主要组蛋白脱乙酰酶1(HDAC-1)除了核提取物中,检测组胞质术中的内质网状标记物(KDEL)的检测与组胞蛋白H4,肝细胞核因子1α(HNF-1α)的检测表明富集程序的效率(Fig. 1 支持信息)。来自核级分的蛋白质混合物从模拟和HSV-1 Cgal提取的核级分+通过Dige分析,交替Cy3和Cy5标记进行了-HuH7感染的细胞(8hPI),以补偿由荧光染料的化学产生的任何差异观察。解冻剂分析允许检测和定量核分数中的2539点(Fig. 1)。接受了差异 t test <0.05和折叠变化>1.2 (Fig. 2 支持信息)。在制备凝胶上定位差分斑点,并在凝胶胰蛋白酶消化中通过纳米-SI-MS / MS鉴定(见 补充材料 用于技术细节)。从所产生的胰蛋白酶消化中,32种蛋白质(16个蛋白质(16种核心核分数占HSV-1 Cgal的16个下调+-huh7感染的细胞)对应于24个蛋白质的毫不用鉴定(表I.)。一些差异表达的蛋白质涉及前mRNA剪接。蛋白质种类来自含有非POU结构域的八寡蛋白结合蛋白,焦油DNA结合蛋白43,HNRNPC,HNRNPA2 / B1,HNRNPH3,肽基 - 脯氨酰CIS-反式异构酶E和前mRNA剪接因子SPF27被下调在HSV-1 CGAL的核级分中+ - 感染Huh7细胞。相反,来自HNRNPQ和剪接因子精氨酸/富含精氨酸/丝氨酸的蛋白质的蛋白质在HUH7感染细胞的核中上调。通过RT-PCR在HSV-1中通过RT-PCR测量含非POU结构域八羟肽结合蛋白,焦油DNA结合蛋白43,前mRNA剪接因子SPF27和剪接因子精氨酸/丝氨酸的1基因的表达水平CGAL.+-huh7感染细胞。这些剪接因子的mRNA水平在8 HPI(未显示的数据)下不变,表明在蛋白质水平处检测到的变化可能是因为翻译后事件。经常出现在基于二维凝胶的研究中,将几种不同的斑点鉴定为同一基因的产物。特别地,从具有不同PI的六个不同斑点鉴定出血压A-C,其中5个在Huh7感染细胞中被下调。这些观察结果表明,在HSV-1 CGAL的过程中,这种蛋白质的不同同种型或翻译后修饰可能会在不同的角色中起不同的作用+ 如前所述的感染(
      • 谅解备忘录
      • 森林T.
      • 贝恩斯J.D.
      疱疹病毒类型1的US3编码一种混杂的蛋白激酶,其磷酸化并改变受感染细胞的Lamin A / C的定位。
      )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1来自模拟和HSV-1 Cgal的核蛋白质的代表性二维图像+ - 摄染HUH7细胞(8HPI)。 白色圆圈表示在Huh7感染的核中检测到的那些差异斑点,随后被纳米-ESI-MS / MS鉴定。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2分配和量化肽的簇。 报告离子的强度值被标准化为平均强度。绿色和红色颜色表示分别低于平均强度值的值。离子126,127,128对应于模拟感染和129,130​​和131至HSV-1 Cgal+ - 活化的细胞。只有对应于差分蛋白质的独特肽。
      表I.感染核中Dige差分蛋白质物种的MS / MS鉴定
      蛋白质名称C与8HPI.
      acc。数字代码T-Test.AV。比率生物过程
      富含感染核的蛋白质物种
      1236Lamin A-CP02545lmna.0,00931,979 (6)核包封发展
      1246异质核核糖核糖蛋白QO60506HNRPQ.0,0171,525 (3)宿主病毒相互作用,mRNA处理,mRNA拼接
      1494管蛋白B链5P07437TBB50,00651,5422(16)细胞部件运动
      1525vacuolar ATP Syntase亚基B,脑同种型P21281VATB20,0441,3313(12)ATP综合
      1645静止11.Q9NVA2SEPT110,0261,338 (6)细胞周期,细胞分裂
      1679肌动蛋白相关蛋白3P61158ARP30,0251,2616(12)细胞部件运动
      1860α-centractinP61163actz.0,0371,216 (5)囊泡介导的运输
      1958Twinfilin-1Q12792TWF10,00431,375 (4)细胞部件运动
      2198Annexin A2P07355ANXA20,0131,584 (3)细胞骨骼部件运动
      2234Annexin A2P07355ANXA20,00271,6313 (8)细胞骨骼部件运动
      2273拼接因子,精氨酸/丝氨酸1Q07955SFRS10,00261,493 (2)mRNA procesing,mRNA拼接
      2385含有含有含域域的蛋白质D2(Swiprosin 1)Q96C19EFHD20,0251,384 (3)钙离子结合
      2395含有含有含域域的蛋白质D2(Swiprosin 1)Q96C19EFHD20,00611,4811 (7)钙离子结合
      2430微管相关的prot。 RP / EB家庭成员1Q15691MARE10,00911,429 (7)细胞周期,细胞分裂
      2979cofilin1.P23528COF10,00481,3511 (8)反应病毒,抗细胞凋亡
      3022肌动蛋白相关蛋白2/3复杂亚基5O15511ARPC50,0141,593 (2)细胞部件运动
      在感染的细胞核中耗尽的蛋白质物种
      1101Lamin A-CP02545lmna.0,045−1,4521(16)核包封发展
      1107Lamin A-CP02545lmna.0,014−1,9517(15)核包封发展
      1296Lamin A-CP02545lmna.0,031−1,5711 (7)核包封发展
      1299Lamin A-CP02545lmna.0,047−1,348 (4)核包封发展
      1300Lamin A-CP02545lmna.0,049−1,3714 (9)核包封发展
      1394T-复合蛋白1亚单位P50990TCPQ.0,015−1,2816(14)蛋白质折叠
      1413含有非POU结构域的八铬蛋白Q15233不,不0,0033−1,2221(14)转录调节,mRNA处理,mRNA剪接
      1443T-复合蛋白1亚单位ETAQ99832TCPH.0,039−1,3111 (6)蛋白质折叠
      1610Ruvb喜欢2.Q9Y230RUVB20,047−1,2523(18)DNA重组,转录调控
      1836BRG1相关因子47Q12824SNF50,01−1,224 (3)宿主病毒互动,转录规则
      1837焦油DNA结合蛋白43Q13148蝌蚪0,0077−1,2214(10)转录调节,mRNA处理,mRNA剪接
      2074Hetergog。核核糖核蛋白C.P07910HNRPC.0,019−1,382 (2)mRNA处理,mRNA拼接
      2096Hetergog。核核糖核蛋白A2 / B1P22626ROA20,02−1,212 (2)mRNA处理,mRNA拼接
      2173异质核核糖核糖蛋白H3P31942HNRH30,0024−1,262 (2)mRNA处理
      2317肽基 - 脯氨酰CIS-TRANS异构酶E.Q9UNP9PPIE.0,0022−1,215 (3)mRNA procesing,mRNA拼接
      2678前mRNA剪接因子SPF27O75934SPF270,031−1,295 (3)mRNA procesing,mRNA拼接

       病毒感染细胞核的TMT分析

      通过TMT分析将至少两种肽鉴定并定量394个蛋白质,并通过TMT分析将病毒感染的宿主细胞核与未感染的细胞核进行比较(见 补充材料)。亚细胞定位分析用巧妙的途径分析软件和人蛋白参考数据库进行(www.hprd.org.)显示,72.7%的量化蛋白质是核蛋白质,表明富集程序的效率(Fig. 3 补充材料)。从两个分数组合生成的排名列表(ps),仅考虑较高20百分位数进行进一步分析。此外,基于亚细胞位置的生物学标准用于过滤非核蛋白。最后,38种蛋白质显示出显着的变化(32次上调,六个下调在HSV-1 Cgal的核级分 +-huh7感染细胞)(表二)。获得每种蛋白质的折叠变化的估计如下:计算每种肽定量的平均值,用于模拟和HSV-1cgal+ 使适应;然后计算每个记者的比率,并且这些比例的中值的LOG2被认为是蛋白质折叠变化。显示出不同一组生物重复和与差异表达蛋白质对应的独特肽之间的相干性之间的肽标记性 Fig. 2。上调蛋白质中的三分之一对应于40s和60s的组分和60s核糖体亚基和其他蛋白质中涉及不同转化步骤的蛋白质。附膜蛋白A2是由Dige和TMT分析鉴定的独特的Deriogulated蛋白。然而,两种策略提供的差异蛋白显示功能互补性,因为透露了类似的生物过程中的改变,包括宿主病毒相互作用,转录调节,mRNA处理和mRNA剪接,允许更全面的HSV-1 CGAL分析 + - 感染细胞核。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3MRNA在HSV-1 CGAL期间结合QKI蛋白质含量+ infection. 细胞QKI蛋白质和病毒立即早期蛋白ICP4和ICP27的稳态水平在模拟和HSV-1 CGAL中+ - 在4,8,16和24 HPI中摄取Huh7细胞。使用针对β-肌动蛋白的抗体来证明等同的蛋白质载荷。对所有实验条件进行三个独立实验。显示了代表性墨迹。
      表二感染核中TMT差异蛋白的MS / MS鉴定。 pvalscore:基于其肽的差异表达的每种蛋白质的总结P值。 Coscore,将每种蛋白质的相关P值概括为肽相干性的测量。 SUMSCORE,PVALSCORE和COSCORE的总和。 FC,折叠变化
      蛋白质名称acc。数字代码pvalscore.克斯莫尔SUMSCORE.FC. 生物过程
      富含感染的核的蛋白质
      过氧杂志1Q06830PRDX116,03997,174323,21421,74643过氧化物酶活性
      事实复杂亚基SSRP1Q08945SSRP112,01008,199420,20941,55543DNA复制,转录规则
      vP08670v10,16397,768517,93240,64972宿主病毒相互作用,蜂窝元件运动
      神经细胞分化相关蛋白AhnakQ09666Ahnk.11,92235,867017,78931,21224细胞分化
      甘氨酸N-四癸酰酰转移酶1P30419NMT17,20509,491916,69690,40032代谢
      胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2Q9Y6M1IF2B28,91907,768516,68760,99583翻译调节
      聚亚苯基结合蛋白1P11940PABP19,61846,645116,26341,167010mRNA处理,mRNA拼接
      Annexin A2P07355ANXA28,91647,096516,01290,78524钙离子结合
      事实复杂亚基SPT16Q9Y5B9SP1610,14724,961215,10840,59623DNA复制,转录规则
      聚亚苯基酸酯结合蛋白4Q13310PABP48,68135,928414,60971,03416RNA处理
      Plectin-1Q15149PLEC18,77065,649214,41981,074021血液模拟
      蛋白质淬火,同种型7(***)Q96PU8QKI.6,54997,100913,65080,66953mRNA处理,mRNA剪接,mRNA翻译
      60S核糖体蛋白L35P42766RL356,61026,906913,51710,26872翻译伸长
      40s核糖体蛋白S3P23396RS33,85468,435212,28980,46326翻译伸长
      有丝分裂检查点蛋白BUB3O43684BUB32,74639,491912,23810,19912细胞周期,细胞分裂
      脆弱的X心理延迟1蛋白Q06787FMR18,60193,151011,75290,47863MRNA运输
      40s核糖体蛋白S16P62249RS163,23068,457911,68850,44402翻译伸长
      40s核糖体蛋白S18P62269RS183,96756,914710,88220,54402翻译伸长
      脆弱的X心理迟滞综合征相关蛋白2P51116FXR27,67013,089910,7600.0,44863MRNA运输
      40s核糖体蛋白S25P62851RS253,72306,735310,45830,47463翻译伸长
      60S核糖体蛋白L10AP62906RL10A7,56822,829210,39740,09164RNA处理
      40s核糖体蛋白S2P15880RS23,74546,503210,24860,48444翻译伸长
      ATP依赖性RNA Helicase DDX3xO00571DDX3X3,83056,06749,89790,31525宿主病毒互动
      60S核糖体蛋白L13P26373RL133,18086,57369,75440,37183翻译伸长
      管蛋白β-2C链P68371TBB2C4,32274,95909,28170,540111细胞部件运动
      肽基 - 脯氨酰顺式反式异构酶G.Q13427ppig2,29716,90699,20400,44122RNA剪接,蛋白质折叠
      60S核糖体蛋白L6Q02878RL61,34997,76859,11840,17173转录规则,翻译伸长
      60S核糖体蛋白L11P62913RL113,50675,55919,06580,25632翻译伸长率,rRNA加工
      管蛋白β链子P07437TBB53,94145,06289,00420,365711细胞部件运动
      60S核糖体蛋白L26P61254RL262,99845,81998,81830,25113翻译伸长
      Integrator Complex亚基5Q6P9B9INT56,05012,75048,80050,55862小核RNA(SNRNA)U1和U2转录
      菲拉莫-AP21333Flna.2,06896,90698,97580,24582肌动蛋白细胞骨架重组
      蛋白质在感染的细胞核中耗尽
      组蛋白H1.0.P07305H100,55599,491910,0478-0,0634.2核心组装
      核糖体生物发生调节蛋白质同源物Q15050RRS10,42269,49199,9144-0,17032核糖体生物发生
      10 KDA热休克蛋白P61604CH100,39559,49199,8874-0,2388.2蛋白质折叠
      切割和聚腺苷酸化特异性因子亚基2Q9P2I0CPSF20,17659,49199,6683-0,22102mRNA处理
      RNA 3'-末端磷酸环酶样蛋白质Q9Y2P8RCL10,11949,49199,6113-0,1564.2核糖体生物发生
      角蛋白,I型细胞骨骼9P35527K1C92,71566,28398,9996-0,07435中间丝伸长

       HSV-1 CGAL期间Quaking RNA结合蛋白的增加+ Infection

      QKI.是HSV-1 CGAL诱导的最有趣的核变化之一+ TMT分析显示的感染。 QKI参与通过与Quaking响应元件的相互作用来调节mRNA稳定性,核保留,RNA运输和平移调节(
      • Galarneau A.
      • 理查德S.
      靶向RNA基序和蒸发星蛋白的靶标mRNA。
      )。虽然传统的数据处理建议QKI-7作为修改的同种型(表二),用于蛋白质鉴定和定量的三种对应肽(来自残留物26至44; 85-102; 177-192)属于QKI的明星(信号转导激活剂)结构域,其在不同之间保守或者接头变体 QKI.. 基因。为了验证感染HUH7细胞中QKI蛋白质含量的潜在上调,我们使用了抗QKI-PAN抗体,可承认三个主要的QKI同种型(QKI-5,QKI-6和QKI-7)。如图所示 Fig. 3,模拟感染的HUH7细胞表达低水平的QKI,该QKI在4 HPI时峰值导致感染期间的时间依赖性降低。有趣的是,当QKI蛋白峰值4HPI时,转换病毒立即早期基因如ICP4和ICP27(Fig. 3)。

       抑制QKI表达导致Huh7细胞中病毒蛋白质含量和病毒产量的降低

      基于QKI的上调与Huh7感染细胞中病毒立即早期蛋白质的表达的相关性,我们假设QKI蛋白可以是在病毒复制中发挥直接作用的细胞蛋白之一。为了测试这种可能性,我们使用siRNA策略进行了实验以击倒QKI表达。在对照Sig1细胞中,观察到QKI蛋白水平的50%的QKI蛋白水平降低了36小时(补充材料; Fig. 4)在不观察Huh7细胞形态和细胞活力的任何改变,直至转染72小时。为了确定QKI耗尽是否会影响病毒复制的效率,将Huh7细胞提交给HSV-1 Cgal+ 感染(MOI = 5 PFU / CELL)36小时与SIRNA转染后。首先,我们监测了HSV-1 CGAL的感染能力+ 在Sigl和Siqki Huh7细胞(转染后36小时)通过X-Gal染色在4和8 HPI,如前所述(
      • 圣玛丽亚E.
      • mora m.i.
      • Potel C.
      • Fernández-Irigoyen J.
      • Carro-Roldáne.
      • Hernandez-Alcoceba R.
      • 普罗佐J.
      • 爱普斯坦A.L.
      • Rucales F.J.
      函数细胞器蛋白质组学,鉴定鉴定态竞争力的HSV-1 CGAL +应变信号靶标。
      )。在Sig1和Siqki感染 - Huh7细胞中观察到β-半乳糖苷酶转基因表达的差异(补充材料; Fig. 5)。这些数据指出HSV-1 CGAL+ 感染性不会阻碍QKI表达被抑制的细胞,也表明QKI对病毒进入至关重要。使用特异性抗体对直接早期病毒蛋白的特异性抗体来确定对病毒复制的影响4,8和16 HPI。如图所示 Fig. 4,QKI蛋白表达在Sig1感染的细胞中瞬时增加4-8HPI,表明用非特异性siRNA转染对感染时对QKI表达模式没有显着的结果。我们观察到,在用4和8hPI的QKI siRNA转染的细胞中,ICP27和ICP4蛋白的水平降低,相对于Sigl Huh7感染细胞。虽然ICP4水平仍然在SIQKI HUH7感染细胞中仍然失败,但在16 HPI的条件下,ICP27水平不会显着修饰(Fig. 4A)。此外,ICP0蛋白也在8和16 HPI中下调,在Siqki Huh7感染细胞中(Fig. 4A)。这些结果表明,即时性的早期病毒功能在QKI表达被下调的细胞中部分延迟。为了确定观察到的QKI依赖性改变是否具体是即时性的疾病因素的特异性,通过Western印迹分析跟踪了一些早期和晚期病毒蛋白的量。聚合酶辅助病毒蛋白UL42(早期基因)和Tegument蛋白US11(晚期基因)的表达也在Siqki Huh7感染的细胞中受到阻碍于8 HPI(Fig. 4B)。进行后续实验以分析QKI表达对HuH7细胞中产生的后代病毒量的抑制效果16和24小时。虽然在SIGL感染细胞中,病毒产量从16 HPI显着增加到24hPI,但在感染期间在SIQKI感染细胞中产生病毒颗粒的嵌段(Fig. 4C)。虽然在16 HPI的Sig1和Siqki细胞之间没有检测到差异,但在感染HSV-1 Cgal的Siqki细胞中检测到病毒产量的40%降低+ (Moi = 1 pfu / ml)与24 hpi的Sigl感染细胞相比(Fig. 4C)。所有这些数据都证明了QKI在调节HSV-1 CGAL早期阶段表达的调节中的枢转作用+ replication.
      图缩略图GR4.
      Fig. 4QKI.的沉默减缓了病毒蛋白表达。 在36小时内用对照Sig1或Siqki转染Huh7细胞并与HSV-1 Cgal同步感染+。收获细胞裂解物并分析为4,8和16 HPI的病毒蛋白的表达。 A,Sig1和Siqki细胞中稳态早期病毒蛋白ICP4,ICP27和ICP0的稳态水平。 B,早期(UL42)和晚期(US11)病毒蛋白的稳态水平。斑点是在3个独立实验中获得的结果。 C,估计Sig1和Siqki感染细胞的后代病毒的量和在37℃下在16℃或24hpi之后收获的细胞培养上清液如所示。每种条件的三份酸盐进行斑块测定。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5QKI.-5和细胞周期调节剂HUH7细胞中HSV-1 CGAL的蛋白质水平+ infection. HSV-1 Cgal+ 与其目标P27的目标平行诱导QKI-5水平的瞬态增加 KIP1。相比之下,p57Kip2 在感染后期保持水平。显示了来自三个独立实验的代表性蛋白质印迹。使用针对β-肌动蛋白的抗体确保等同的蛋白质加载。

       HSV-1 CGAL+ 增加人肝癌细胞中的QKI-5同种型水平

      随着基于TMT的分析检测到Huh7感染细胞核中QKI同种型的增加,QKI-5同种型(QKI-5)呈现核定位信号(
      • 吴j.
      • 周L.
      • Tonissen K.
      • TEE R.
      • Artzt K.
      Quaking I-5蛋白(QKI-5)具有新颖的核定位信号和核心与细胞质之间的梭。
      ),使用来自QKI-5的C末端肽的特异性抗体,进行随后的实验以检查Huh7感染细胞中的QKI-5的稳态蛋白水平。通过Western印迹和免疫荧光分析评估QKI-5抗体的特异性(补充材料; Fig. 6)。 QKI-5蛋白含量增加,直至4 HPI保持其水平直至感染人肝癌细胞感染后期减少8 HPI(Fig. 5)。在功能水平,QKI同种型染色并稳定编码细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的mRNA-inchibitor p27KIP1,导致蛋白质积累增加(
      • Larocque D.
      • Galarneau A.
      • 刘H.N.
      • 斯科特米
      • Almazan G.
      • 理查德S.
      通过判断RNA结合蛋白保护P27(KIP1)mRNA促进少突胶质细胞分化。
      ,

      杨,G.,Fu,H.,张,J.,Lu,X.,Yu,F.,Jin,L.,Bai,L.,Huang,B.,Shen,L.,Feng,Y.,姚,L.,Lu,Z.,RNA结合蛋白Quaking,结肠上皮分化的临界调节剂和结肠癌的抑制剂。胃肠学138,231-240,E231-235

      )。为了评估QKI蛋白是否在感染期间保持其众所周知的功能,进行额外的实验以研究其目标的一个目标P27KIP1。如图所示 Fig. 5, p27KIP1 在病毒感染期间展示瞬态增加,与QKI-5表达平行,表明其MRNA可以在感染期间通过QKI-5稳定。 G1-S相转变的另一个负调节器,其在功能上和结构上与P27相关KIP1 is p57Kip2 (
      • Susaki E.
      • Nakayama K.
      • Yamasaki L.
      • Nakayama K. I.
      相关的CDK抑制剂P27和P57的常见和特异性作用由敲击小鼠模型揭示。
      )。如图所示 Fig. 5, p57Kip2 在8 HPI上保持高水平的感染后,瞬态增加。 P27的瞬态增加KIP1 和 p57Kip2 levels (Fig. 5)指出HSV-1 CGAL中细胞周期的部分堵塞+ - 4-8 HPI的摄取HUH7细胞。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6HSV-1 CGAL期间人肝癌细胞QKI-5的定位+ infection. QKI-5在对照模拟的HUH7细胞中的细胞分布(上部面板),并且在细胞中感染4-8 hpi(中间伙计)和16-24 HPI(较低的面板通过免疫荧光显微镜分析研究了HUH7感染的细胞。初始漫射核分布显示2-3骨料结构将4-8 HPI切换到虚线核图案并显示胞质位置16-24 HPI。显示代表性图像。

       在HSV-1 Cgal期间,QKI-5同种型定位在不同的细胞内隔室中+ Infection

      作为QKI-5已被描述为核细胞质梭蛋白(
      • 吴j.
      • 周L.
      • Tonissen K.
      • TEE R.
      • Artzt K.
      Quaking I-5蛋白(QKI-5)具有新颖的核定位信号和核心与细胞质之间的梭。
      ,
      • 哈迪r.j.
      QKI.表达在神经元 - 胶质细胞命运决策期间受到调节。
      ),进行额外的实验,以研究HSV-1 Cgal期间QKI-5的亚细胞定位+ 使用上述相同抗体感染。模拟感染HUH7细胞的免疫荧光染色显示,QKI-5在胚胎核水平中形成2-3个聚集结构的核心(不包括核仁)的弥漫性染色在模拟感染的HUH7细胞中(Fig. 6, 上部面板可能暗示与核机构联系的可能性,这仍然仍然难以实现。在4到8HPI之间,虽然仍然是核,但在整个细胞核中在更多皮肤点处分散并重新分配聚集结构(Fig. 6, 中间伙计)。 ×16-24 HPI,QKI-5在形成粒度型图案的细胞质中定位,核荧光水平低(Fig. 6, 较低的面板),表明QKI-5响应于HSV-1 CGAL的Huh7细胞中的细胞核酶+ 感染。在16-24HPI的几个细胞对细胞接触区域中也观察到强线性染色(Fig. 6, 较低的面板)。由于Nectin-1是用于HSV-1的特定细胞受体,其定位在感染细胞的细胞接触区域(
      • Krummenacher C.
      • Baribaud I.
      • 艾森伯格r.j.
      • 科恩G.H.
      疱疹病毒感染期间Nectin-1和糖蛋白D细胞定位。
      ),进行分层化实验。 Nectin-1分布显示了感染 - HUH7细胞16和24 HPI的细胞表面的虚线图案( Fig. 7)。有趣的是,Nectin-1染色与QKI-5的QKI-5染色在一些受感染细胞的细胞 - 细胞接触区域中(Fig. 7),表明QKI-5可以参与HSV-1 CGAL诱导的细胞融合现象+ infection.
      图缩略图GR7.
      Fig. 7用HSV-Cgal感染人肝癌细胞的Nectin-1和QKI-5的共同定位+ vector. 通过对照模拟感染的HuH7细胞的免疫荧光分析Nectin-1和QKI-5的细胞分布(上部面板),并且在感染16小时的细胞中(中间伙计)和24小时(较低的面板)。 Nectin-1染色显示了可能与血浆膜(星号)相关联的虚线图案,用QKI-5在细胞中与细胞接触区域的QKI-5分解(箭头)。显示代表性图像。如图所示,向nectin-1的抗体显示出与细胞核的一些非特异性交叉反应性。

      讨论

      HSV-1是可以靶向,繁殖in和根除肝癌细胞的溶解,繁殖和消除肝癌细胞的最有前途的病毒平台之一
      • Foka P.
      • Pourchet A.
      • Hernandez-Alcoceba R.
      • Doumba P.P.
      • PISSAS G.
      • Kouvatsis V.
      • Dalagiorgou G.
      • 哈萨志D.
      • Marconi P.
      • Foschini M.
      • Manservigi R.
      • konstadoulakis m.m.
      • Koskinas J.
      • 爱普斯坦A.L.
      • mavromara p.
      单纯疱疹病毒载体的新型肿瘤特异性启动子用于肝细胞癌的转录靶向。
      ),但介导介质肿瘤细胞反应的中间体必须阐明,以促进更有效和选择性HSV-1的载体的发育。通过对比细胞溶质和微粒体蛋白质组蛋白质分析,我们先前已经确定了通过HSV-1 CGAL靶向的中间体的放松管制+ 导致人肝癌细胞中凋亡和细胞存活途径的损害(
      • 圣玛丽亚E.
      • mora m.i.
      • Potel C.
      • Fernández-Irigoyen J.
      • Carro-Roldáne.
      • Hernandez-Alcoceba R.
      • 普罗佐J.
      • 爱普斯坦A.L.
      • Rucales F.J.
      函数细胞器蛋白质组学,鉴定鉴定态竞争力的HSV-1 CGAL +应变信号靶标。
      )。在本报告中,我们应用了两种不同的标签蛋白质组学方法,二维数字和TMT,以分析在Caspase活化之前在感染 - 人肝癌细胞中产生的核蛋白质组组合物的变化(
      • 圣玛丽亚E.
      • mora m.i.
      • Potel C.
      • Fernández-Irigoyen J.
      • Carro-Roldáne.
      • Hernandez-Alcoceba R.
      • 普罗佐J.
      • 爱普斯坦A.L.
      • Rucales F.J.
      函数细胞器蛋白质组学,鉴定鉴定态竞争力的HSV-1 CGAL +应变信号靶标。
      )。两个不同蛋白质组学策略的应用在获得互补信息方面特别有用;因此,发现只有一种蛋白质对两种实验方法常见。互补数据是由两种蛋白质组工作流来使用的样品制备和分析方法的差异产生的。二维Dige是一种基于凝胶的方法,其在蛋白质水平上标记样品(
      • Tannu N.S.
      • Hemby S.E.
      比较蛋白质组学分析的二维荧光差凝胶电泳。
      )和TMT是一种基于液体的方法,其在肽水平下标记样品(
      • 天顿L.
      • Hainard A.
      • Licker V.
      • Turck N.
      • Kuhn K.
      • Hochstrasser d.f.
      • Burkhard P.R.
      • 桑切斯J.C.
      MS / MS使用6-Plex Isobaric标签的人脑脊液中蛋白质的相对定量。
      )。尽管Dige仅将包括在3至11的pH范围内的可溶性蛋白质分离,并且测定的分子量,TMT可以鉴定这些范围外的蛋白质。此外,Dige能够通过在不同P处分斑点来检测翻译后修饰的蛋白质和蛋白质的不同同种型的差异表达I 和分子量。然而,这些同种型可以与TMT方法区分开,因为在肽水平上完成标记,并且大多数肽序列在一组同种型之间是相同的。另外,具有极端等电点,大分子量,低​​溶解度(疏水蛋白)和低拷贝数在二维数字实验中的蛋白质在二维实验中差。另一方面,由于用于蛋白质还原的TCEP,TMT技术可能导致肽损失(
      • 刘P.
      • O'Mara B.W.
      • WARRACK B.M.
      • 吴W.
      • 黄扬
      • 张Y.
      • 赵立
      • 林米
      • Ackerman M.S.
      • Hocknell P.K.
      • 陈G.
      • 陶l.
      • r
      • 王J.
      • 王 - 艾尔森D.B.
      • Tymiak A.A.
      • 格蕾丝M.J.
      • 罗素r.j.
      三(2-羧乙基)膦(TCEP)在含半胱氨酸的蛋白质上的切割。
      ,
      • 王Z.
      • Rejtar T.
      • 周Z.S.
      • karger b.l.
      含半胱氨酸肽的脱硫,由样品制备得到蛋白质表征的质谱法。
      ),在凝胶电泳期间肽和凝胶基质之间的相互作用,以及肽标记(
      • Tiberti N.
      • Hainard A.
      • Lejon V.
      • 罗宾X.
      • Mumba Ngoyi D.
      • Turck N.
      • Matovu E.
      • enyaru J.
      • mathu ndung u.j.
      • Scherl A.
      • 天顿L.
      • 桑切斯J.C.
      骨桥蛋白和β-2微胶蛋白的发现与验证作为用于分期的人类非洲锥虫病的有前途标志物。
      )。通过两种方法显示的差分蛋白似乎在HSV-1 CGAL中的平行生物学功能中互补+ - 感染的人肝癌细胞(Fig. 8),例如宿主病毒相互作用,细胞周期调节,转录调节,mRNA处理和mRNA剪接。尽管众所周知的蛋白质合成关闭固有的HSV-1感染,但该研究报告的大多数差异表达的蛋白质被上调。由于已经假设,那些在HSV-1感染后继续合成的那些蛋白质可能在确定感染结果方面发挥重要作用(
      • CalléA。
      • Ugrinova I.
      • 爱普斯坦A.L.
      • 灌木丛
      • Diaz J.J.
      • Greco A.
      核仁患者是一种有效的疱疹病毒类型1感染所需的。
      )。
      图缩略图GR8.
      Fig. 8差异表达核蛋白在HSV-1 CGAL中的功能聚类+ - 摄染HUH7细胞(8HPI)。 蛋白质组学和功能数据根据熟人的相互作用参数进行分组。根据其功能分类,所选蛋白质由不同的符号(红色和绿色分别在感染的Huh7细胞中上调)(参见传说)。列出了完整的蛋白质名称 表I., 表二。使用代表蛋白质的功能类的各种形状显示节点:同心圆代表组或复合物;双圆圈代表转录调节器;螺旋形状代表酶;圈子代表其他演员。根据节点之间的交互类型,节点由特定连接器链接。实线表示节点之间的直接相互作用和虚线表示间接相互作用(A,激活/去激活; RB,结合调节; PR,蛋白-mRNA结合; PP,蛋白质结合; B,结合; e,表达; e,表达;我,抑制; L,蛋白水解; m,生化修饰; p,磷酸化/检测; t,转录; lo,本地化)。
      QKI.参与调节mRNA稳定性,核保留,RNA运输和转化调节,通过与靶MRNA的UTR的Quaking响应元件相互作用(
      • Larocque D.
      • 理查德S.
      将KH域蛋白蒸煮为胶质细胞命运和髓鞘的调节剂。
      )。 QKI同种型在几种细胞过程中调节RNA代谢的方面,包括髓鞘,细胞命运测定,胚胎发生,细胞凋亡和蛋白翻译(
      • ChénardC.A.
      • 理查德S.
      对人类疾病中Quaking RNA结合蛋白的新影响。
      )。通过其不同细胞类型的广泛表达进一步提出了QKI在细胞生物学中的基本功能(
      • 吴j.
      • 周L.
      • Tonissen K.
      • TEE R.
      • Artzt K.
      Quaking I-5蛋白(QKI-5)具有新颖的核定位信号和核心与细胞质之间的梭。
      ,

      杨,G.,Fu,H.,张,J.,Lu,X.,Yu,F.,Jin,L.,Bai,L.,Huang,B.,Shen,L.,Feng,Y.,姚,L.,Lu,Z.,RNA结合蛋白Quaking,结肠上皮分化的临界调节剂和结肠癌的抑制剂。胃肠学138,231-240,E231-235

      ,
      • ChénardC.A.
      • 理查德S.
      对人类疾病中Quaking RNA结合蛋白的新影响。
      )并通过发现QKI在小鼠中的总消融导致早期的胚胎杀伤性(
      • 李Z.
      • takakura n。
      • Oike Y.
      • imanaka t.
      • Araki K.
      • 苏达T.
      • 卡美岛T.
      • Kondo T.
      • 阿布克。
      • yamamura k。
      QKI.缺陷小鼠的平滑肌发育有缺陷。
      )。此外,癌组织中QKI表达改变的证据(

      杨,G.,Fu,H.,张,J.,Lu,X.,Yu,F.,Jin,L.,Bai,L.,Huang,B.,Shen,L.,Feng,Y.,姚,L.,Lu,Z.,RNA结合蛋白Quaking,结肠上皮分化的临界调节剂和结肠癌的抑制剂。胃肠学138,231-240,E231-235

      ,
      • ChénardC.A.
      • 理查德S.
      对人类疾病中Quaking RNA结合蛋白的新影响。
      )与P27的临界调节器一起KIP1,表明该蛋白质的异常水平可能有助于对细胞生长的放松管制。我们已经表明,QKI蛋白及其靶系依赖性激酶抑制剂P27KIP1 (CDKN1B) (
      • Larocque D.
      • Galarneau A.
      • 刘H.N.
      • 斯科特米
      • Almazan G.
      • 理查德S.
      通过判断RNA结合蛋白保护P27(KIP1)mRNA促进少突胶质细胞分化。
      ,

      杨,G.,Fu,H.,张,J.,Lu,X.,Yu,F.,Jin,L.,Bai,L.,Huang,B.,Shen,L.,Feng,Y.,姚,L.,Lu,Z.,RNA结合蛋白Quaking,结肠上皮分化的临界调节剂和结肠癌的抑制剂。胃肠学138,231-240,E231-235

      )在HSV-1 CGAL的早期以平行方式瞬时增加其水平+ 感染,可能阻断细胞周期的G1-S期转变。这些观察结果与当QKI过度表达时发生的增殖堵塞和肿瘤发生能力抑制(

      杨,G.,Fu,H.,张,J.,Lu,X.,Yu,F.,Jin,L.,Bai,L.,Huang,B.,Shen,L.,Feng,Y.,姚,L.,Lu,Z.,RNA结合蛋白Quaking,结肠上皮分化的临界调节剂和结肠癌的抑制剂。胃肠学138,231-240,E231-235

      ,
      • Larocque D.
      • Fragoso G.
      • 黄杰。
      • mushynski w.e.
      • Loignon M.
      • 理查德S.
      • Almazan G.
      QKI.-6和QKI-7 RNA结合蛋白质阻断增殖和促进施万细胞髓鞘。
      )。但是,在P27下降了KIP1 感染 - 人肝癌细胞中的蛋白质水平可能由HSV-1病毒群岛宿主关闭导致(
      • kwong a.d.
      • Kruper J.A.
      • Frenkel N.
      疱疹病毒病毒群岛主机关闭功能。
      )。相比之下,细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂P57Kip2 (CDKN1C)在感染后期的感染人肝癌细胞中保持其水平。 P57.Kip2 通过用Caspase 3激活癌细胞的线粒体凋亡途径促进细胞死亡(
      • Vlachos P.
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      • Hajji N.
      • 约瑟夫B.
      细胞周期抑制剂P57(KIP2)通过线粒体凋亡途径促进细胞死亡。
      )建议p57Kip2 可以调解先前在HSV-1 CGAL中描述的促凋亡因子的多因素障碍+ - 感染的人肝癌细胞(
      • 圣玛丽亚E.
      • mora m.i.
      • Potel C.
      • Fernández-Irigoyen J.
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      • 爱普斯坦A.L.
      • Rucales F.J.
      函数细胞器蛋白质组学,鉴定鉴定态竞争力的HSV-1 CGAL +应变信号靶标。
      )。在人肝癌细胞HSV-1感染的直接初期发生QKI上调。 QKI的消耗并未损害HSV-1病毒病毒虫的入口和复制,如报告基因β-半乳糖苷酶的表达所证明的。然而,分析代表三个主要动力学类别(即,e和L基因)中的每一个的病毒蛋白的稳态水平表明QKI倒闭诱导病毒蛋白合成的透明延迟。除了关于细胞内定位的IE蛋白质之间的现有合作(
      • 朱诗。
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      单纯疱疹病毒的合作型1型立即预期调节蛋白:ICP4和ICP27影响ICP0的细胞内定位。
      )和组装成病毒颗粒的相互依存(
      • Sedlackova L.
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      单纯疱疹病毒类型1即时早期的蛋白ICP27是有效地将ICP0和ICP4掺入病毒粒子。
      ),即连续地需要蛋白质来合成所有病毒编码的蛋白质。 ICP0充当所有类别的HSV-1基因的反辐期剂(
      • Cai W.
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      单纯疱疹病毒类型1 ICP0调节高效性细胞中立即早期,早期和晚期基因的表达。
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      在编码ICP0的基因中具有突变的单纯疱疹病毒在基因表达中有缺陷。
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      从异疱疹病毒鉴定异步的早期基因,其转移病毒胸苷激酶基因。
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      • 捏合下午。
      用两种病毒功能刺激疱疹病毒DNA结合蛋白的表达。
      )。由于其作为早期和晚期的转录激活剂的作用,ICP4绝对需要进行进展超出基因表达的直接阶段(
      • deluca n.a.
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      通过温度敏感和野生型形式的疱疹病毒类型1蛋白ICP4激活即时,早期和晚期启动子。
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      • deluca n.a.
      ICP4,TATA结合蛋白和RNA聚合酶II的结合在病毒感染细胞中立即提前,早期和晚期启动子患者患有单纯疱疹病毒。
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      ICP4早期(TK)和晚期(GC)启动子激活疱疹病毒的差异细胞要求。
      )。 IE蛋白ICP27还需要早期DNA复制基因,例如UL42(
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      调节单纯疱疹病毒多(a)现场使用以及早期早期开关中立即早期蛋白IE63的作用。
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      • 捏合下午。
      单纯疱疹ICP27突变病毒表现出特定DNA复制基因的表达减少。
      )并且还用于转录病毒晚期基因(
      • McGregor F.
      • Phelan A.
      • 邓禄普J.
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      调节单纯疱疹病毒多(a)现场使用以及早期早期开关中立即早期蛋白IE63的作用。
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      单纯疱疹病毒1 ICP27是在感染细胞中转录的两个病毒晚期(γ2)基因的转录所必需的。
      )。鉴于我们的结果,QKI是最佳HSV-1 CGAL所需的蜂窝机械的一部分+ 对人类免疫缺陷病毒(艾滋病毒)的情况也是如此
      • reddy t.r.
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      KH结构域蛋白(SAM68样哺乳动物蛋白质和Quaking蛋白)在艾滋病毒复制后调节中的作用。
      )。
      哺乳动物 QKI.. 基因经历复杂的替代剪接模式,并产生至少三个主要的转录物5,6和7kb,对应于QKI-5,QKI-6和QKI-7同种型(
      • ChénardC.A.
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      对人类疾病中Quaking RNA结合蛋白的新影响。
      )。 QKI-6和QKI-7主要是细胞质同种型,而位于QKI-5同种型的C末端的独特序列具有非甘露透露的核定位信号(
      • ChénardC.A.
      • 理查德S.
      对人类疾病中Quaking RNA结合蛋白的新影响。
      )。此外,RNA结合结构域对于核状QKI-5的定位是重要的(
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      • TEE R.
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      Quaking I-5蛋白(QKI-5)具有新颖的核定位信号和核心与细胞质之间的梭。
      )。通过免疫荧光显微镜分析,QKI-5在神经元和上皮HeLa细胞中报道的整个细胞核中散射染色(
      • 吴j.
      • 周L.
      • Tonissen K.
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      Quaking I-5蛋白(QKI-5)具有新颖的核定位信号和核心与细胞质之间的梭。
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      • ChénardC.A.
      • 理查德S.
      对人类疾病中Quaking RNA结合蛋白的新影响。
      )。与HeLa细胞相比,QKI-5在人肝癌细胞中形成2-3个聚集结构。此外,我们展示了HSV-1 CGAL+ 感染诱导QKI-5早期核传播,形成可点缀结构,其可以是早期的幼胞白血病蛋白质或病毒诱导的伴侣富集的结构域,以前与HSV-1复制有关(
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      在感染的早期形成单纯疱疹病毒患者患者的核心灶:本地化,动态,ICP27的招募,以及Novo诱导ND10样复合物的证据。
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      病毒诱导的伴侣源浓缩(副)域在HSV-1感染期间用作核蛋白质质量控​​制中心。
      )。 16 HPI后,HSV-1 CGAL+ 诱导QKI-5核 - 细胞质穿梭,前面在正常胚胎神经元细胞命运决策期间显示的事件(
      • 哈迪r.j.
      QKI.表达在神经元 - 胶质细胞命运决策期间受到调节。
      )。这种核 - 细胞质穿梭可以通过翻译后修饰介导的,已经针对该蛋白质(例如磷酸化)(
      • 张Y.
      • 卢Z.
      • KU L.
      • 陈Y.
      • 王H.
      • 冯Y.
      QKI.的酪氨酸磷酸化介导发育信号来调节mRNA代谢。
      )或精氨酸甲基化(
      • CôteJ.
      • Boisvert F.M.
      • 巴兰德米
      • Bedford M.T.
      • 理查德S.
      SAM68 RNA结合蛋白是蛋白质精氨酸N-甲基转移酶1的体内底物。
      )如前所述,SAM68的SAM68,星形家族的成员分享异质核糖核蛋白K同源域(KH) 领域)与qki-5(
      • CôteJ.
      • Boisvert F.M.
      • 巴兰德米
      • Bedford M.T.
      • 理查德S.
      SAM68 RNA结合蛋白是蛋白质精氨酸N-甲基转移酶1的体内底物。
      )。促进QKI-5穿梭的机制和其细胞质定位的生物学意义仍然尚不清楚。关于第一个问题,RNA聚合酶II介导的活性转录是核保留QKI-5的必要条件(
      • 吴j.
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      Quaking I-5蛋白(QKI-5)具有新颖的核定位信号和核心与细胞质之间的梭。
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      • PI.ñol-roma s。
      • 德雷福斯G.
      转录依赖性和转录的HNRNP蛋白核传输。
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      • PI.ñol-roma s。
      • 德雷福斯G.
      在细胞核和细胞质之间穿梭前mRNA结合蛋白。
      )。根据该机制,QKI-5穿梭可能是在HSV-1感染期间发生的RNA聚合酶II的激活状态变化的结果(
      • 巴斯蒂安T.W.
      • 米饭S.A.
      鉴定疱疹病毒类型1 ICP22的序列,影响RNA聚合酶II改性和病毒晚期基因表达。
      )。细胞溶质QKI-5的功能可能与特定细胞RNA的运输和加工有关(
      • Galarneau A.
      • 理查德S.
      靶向RNA基序和蒸发星蛋白的靶标mRNA。
      )在整合其他QKI同种型的过程中(
      • 吴j.
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      Quaking I-5蛋白(QKI-5)具有新颖的核定位信号和核心与细胞质之间的梭。
      )。在感染后期,QKI-5被引导到细胞表面,其中在一些受感染的细胞中用Nectin-1中的Nectin-1结合到细胞 - 1中。 Nectin-1在HSV-1感染的黑色素瘤细胞中以前报道的16和24 HPI在16和24hPI的细胞表面上显示着虚线分布(
      • Krummenacher C.
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      • 艾森伯格r.j.
      • 科恩G.H.
      疱疹病毒感染期间Nectin-1和糖蛋白D细胞定位。
      )。 nectin-1属于CA2+ - 免疫球蛋白超家族的依赖性细胞粘附蛋白(
      • Marozin S.
      • 恶作剧你
      • Sodeik B.
      单纯疱疹病毒1型偏振上皮细胞感染需要微管,并进入在细胞 - 细胞接触位点存在的受体。
      )在粘附的交叉点发现(
      • Krummenacher C.
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      • 艾森伯格r.j.
      单纯疱疹病毒对Nectin-1 / HVEC结构和功能的影响。
      )。虽然Nectin-1被认为是HSV-1条目最重要的受体(
      • Geraghty r.j.
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      • 科恩G.H.
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      • 矛P.G.
      脊髓灰质炎受体相关蛋白1和Poliovirus受体介导的alphaherpesviruses的入口。
      ),它还用作HSV-1的细胞 - 细胞扩散介质(
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      用AFADIN与AFADIN疱疹病毒类型1的高效细胞 - 细胞扩散的蛋白-1Alpha / HVEC相互作用。
      )。当细胞相关病毒通过不完全已知的分子事件的细胞接触区域传播到相邻细胞时,发生细胞 - 细胞扩散。
      • 甚至是D.L.
      • 亨利上午
      • Geraghty r.j.
      单纯疱疹病毒的要求1型细胞 - 细胞通过Nectin-1平行扩展,平行于病毒进入。
      )。我们的共同定位研究表明,在细胞 - 细胞扩散过程中,QKI-5可以参与在质膜处发生的Nectin-1依赖事件。总之,我们对HSV-1 CGAL核蛋白质的核蛋白质提供了广泛的分析+ 使用两个不同的蛋白质组学策略感染。生成互补数据集并集成在单一的功能解释上,以发现HSV-1 CGAL触发的新型响应机制+ 在人肝癌细胞的染料。我们已经证明,在人肝癌细胞中最佳病毒蛋白翻译是必要的QKI蛋白质上调的。此外,Huh7感染细胞中特异性QKI-5同种型的时间依赖性重新分布可以参与观察到感染后观察到的细胞融合事件。

      致谢

      Carmen Miqueo,Manuela Molina和Coline Biollay的技术援助得到了承认。我们感谢CIMA的形态核心设施进行免疫荧光分析。我们还感谢蛋白质组科学PLC提供TMT试剂。

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