人腹主动脉瘤中的细胞外基质组成和重塑:蛋白质组学方法*

      腹主动脉瘤(AAA)的特征在于主动脉细胞外基质(ECM)的病理重塑。然而,除了以良好特征的弹性溶解和胶原溶解,几乎是关于其他ECM蛋白的变化所知的。以前的蛋白质组学研究AAA专注于细胞变化而不重视ECM。在本研究中,使用基于溶解度的子分布方法从动脉瘤和控制主动脉选择性地萃取ECM蛋白及其降解产物,并通过凝胶 - 液相色谱 - 串联MS和无标记定量分析。蛋白质组学分析揭示了AAA的ECM的新改变,包括胶原蛋白XII,血小板素2,主动脉型羧肽酶,肝素,纤连蛋白和Tenascin的降解。蛋白质组学还证实了巨噬细胞茂细酶的积累(MMP-12)。用重组MMP-12孵育对照主动脉组织导致这些糖蛋白的大部分碎裂,其中大部分是MMP-12的新衬底。总之,我们的蛋白质组学方法论允许ECM在AAA中的第一次详细分析,并确定了与MMP-12活性相关的病理ECM重塑的标志物。
      腹主动脉瘤(AAA)
      使用的缩写是:
      AAA.
      腹主动脉瘤
      ACLP.
      主动脉羧肽酶样蛋白
      ECM.
      细胞外基质
      储存
      细胞外超氧化物歧化酶
      LTQ.
      线性陷阱四极轴
      MMP.
      基质金属蛋白酶
      TIMP.
      金属蛋白酶组织抑制剂
      LC.
      液相色谱法
      女士/女士
      串联MS。
      影响2-10%的老年人(
      • alcorn h.g.
      • Wolfson Jr.,S.K.
      • Sutton-Tyrrell K.
      • kuller l.h.
      • o'Leary D.
      患有心血管健康研究中老年人腹主动脉瘤的危险因素。
      ,
      • Baumgartner I.
      • Hirsch A.T.
      • Abola M.T.
      • Cacoub P.P.
      • Poldermans D.
      • STEG P.G.
      • Creacer M.A.
      • BHATT D.L.
      心血管风险和腹膜动脉瘤患者患者的患者患者患者患者患者:持续健康(REACH)登记处减少动脉粥样格管的数据。
      )并且是组织病理学,其特征在于主动脉细胞外基质(ECM)的广泛退化(ECM)(
      • Golledge J.
      • Tsao P.S.
      • Dalman R.L.
      • 诺曼P.E.
      腹主动脉瘤存在和进展的循环标记。
      )。结构蛋白质,特别是内侧弹性蛋白和胶原I和III的击穿,负责主动脉壁的无法能力,以承受血液动力力(
      • HELHENTHAL F.A.
      • 布鲁曼W.A.
      • Wodzig W.K.
      • Schurink G.W.
      AAA.进展的生物标志物。第1部分:细胞外基质变性。
      )。透射炎症浸润(
      • Shiraya S.
      • Miyake T.
      • Aoki M.
      • Yoshikazu F.
      • OHGI S.
      • Nishimura M.
      • ogihara t.
      • Morishita R.
      通过巨噬细胞迁移抑制阿托伐他汀对大鼠模型实验主动脉腹动脉瘤的抑制作用。
      )结合中间平滑肌细胞的数量的减少,通过未调节的蛋白酶活性引发主动脉结缔组织的破坏(
      • 莎娜尔。
      炎症,金属蛋白酶和增加的蛋白水解:主动脉瘤中的新出现病理生理范式。
      ,
      • Shimizu K.
      • Shichiri M.
      • 利比P.
      • Lee R.T.
      • 米切尔r.n.
      Th2-主要炎症和IFN-Gamma信号传导诱导分析主动脉中的动脉瘤。
      )。然而,除了良好的植物溶解和胶原溶解之外,关于ECM组成和AAA周转的其他变化很少。最近对动脉瘤的蛋白质组学研究已经使用了整个组织裂解物(
      • 廖米
      • 刘Z.
      • 宝J.
      • 赵Z.
      • 胡锦涛
      • 冯X.
      • 冯R.
      • 鲁Q.
      • 梅Z.
      • 刘Y.
      • 吴Q.
      • 荆Z.
      人胸主动脉分析中主动脉介质的蛋白质组学研究:氧化应激的含义。
      ,
      • Pilop C.
      • angger f.
      • Gorman R.C.
      • Brunisholz R.
      • Gerrits B.
      • SchaffnerT.
      • GORMAN第3次,J.H.
      • Matyas G.
      • Carrel T.
      • 弗雷下午
      Marfan综合征患者主动脉培养基中的蛋白质组学分析显示出在主动脉瘤中的CALPAIN 2的活性增加。
      )报告细胞蛋白质的显着变化,但为基质重塑提供了有限的见解。关于ECM这些方法有几个局限性:首先,整个组织裂解物富含细胞蛋白质,该细胞蛋白质掩盖了稀缺的细胞外组分,包括蛋白酶和蛋白酶抑制剂。其次,由于其独特的生化特性(聚集,交联和糖基化),ECM蛋白难以溶解和分析。第三,在病理过程中,如动脉瘤形成,ECM经历了广泛的营业额,具有连续降解以及新合成的基质蛋白的沉积。在整个组织裂解物分析中,从现有的基质蛋白易于辨别新合成的ECM蛋白,并且只检测到丰富的降解产物(
      • Pilop C.
      • angger f.
      • Gorman R.C.
      • Brunisholz R.
      • Gerrits B.
      • SchaffnerT.
      • GORMAN第3次,J.H.
      • Matyas G.
      • Carrel T.
      • 弗雷下午
      Marfan综合征患者主动脉培养基中的蛋白质组学分析显示出在主动脉瘤中的CALPAIN 2的活性增加。
      )。为了克服这些缺点,我们最近开发了一种基于溶解性的蛋白质亚分量过程,这有利于新合成的ECM蛋白和降解产物的选择性提取,减少了具有细胞蛋白质的污染,并确保了间质ECM及其相关蛋白的溶解从而提高了蛋白质组学的分析(
      • 迪兰罗斯A.
      • 尹X.
      • Mandal K.
      • Baumert M.
      • Jahangiri M.
      • 梅尔米
      人体主动脉细胞外空间成分的蛋白质组学。
      )。在这项研究中,我们将该子分量方法应用于AAA。我们的目标是表征ECM和相关蛋白质的变化,参与病理重塑过程。我们迄今为止达到了动脉瘤ECM的最详细的蛋白质组学表征,并揭示了健康和AAA组织之间的主要差异,包括胶原氧化物XII,血栓样蛋白2,主动脉型羧肽酶样蛋白(ACLP),PERIOSTIN和纤连蛋白的增加。此外,我们能够表明这些糖蛋白是MMP-12的新型蛋白水解靶标。因此,我们的蛋白质组学方法可以作为临床样本中病理重塑的候选标志物的平台(
      • 梅尔米
      • 张继夫
      • 绿色A.S.
      • Gutterman D.
      • Perloff J.
      • ping p.
      基于蛋白质组学的心血管疾病生物标志物的发展:机械,临床和治疗洞察。
      )。

      实验步骤

       组织来源

      本研究经伦敦国王学院和圣乔治医院伦敦的研究伦理委员会批准。所有患者都提供了书面知情同意。从四名男性患者中收集先进,无症状,Infraenal AAA标本>65年龄在开放的动脉瘤修复手术期间,基于直径超过5.5厘米的动脉瘤尺寸(代表性血毒素和艾辛染色部分显示 补充图。S1)。在无结缔组织疾病(20至55岁的一只雌性和三个雌性)的患者的四种对照样本在常规主动脉瓣膜置换的主动脉瓣从升高的主动脉的位置进行无宏观上明显的血管病理学(补充图。S1)。在临床样本中的取样过程中没有已知的潜在混杂剂,组织立即被冷冻冷冻并保持在液氮中以供以后使用。

       组织准备

      在提取之前,组织标本部分地解冻并称重。将每主动脉样品的大约150mg组织置于冰冷的磷酸盐缓冲盐水中以除去血浆污染物。缓冲液补充有1%的V / V蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich),其含有AeBSF,抑肽蛋白,Bestatin,E-64,Leupeptin和胃蛋白酶,具有宽特异性的丝氨酸,半胱氨酸和酸蛋白酶,以及氨肽酶和1%v / v磷酸酶抑制剂混合物(Sigma-Aldrich),其含有脱冬烷酸钠,天竺葵,咪唑和钙霉素A,以抑制广泛的磷酸酶。另外,25米m 加入EDTA以确保抑制金属蛋白酶。虽然将组织样品浸入冷盐水中,但它们用手术刀切成8-10个较小的片,以便于去除等离子体污染物和如下所述的细胞外蛋白的有效提取。

       三步提取方法

      对于蛋白质组学方法论,我们使用了三种健康主动脉标本(CON)和四个AAA样本。将切块样品在0.5中孵育 m NaCl, 10 mm Tris,pH 7.5缓冲液补充有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒,如上所述,25米m EDTA。缓冲液的体积调节至组织重量的10:1(IE。 100毫克1毫克)。在室温下温和地涡旋4小时。然后使用脱盐柱(Zeba旋转,皮尔斯生物技术,Cramlyton,Northumberland,UK)脱谷醇萃取物用离心萃取。将萃取液在-20℃下以100%丙酮(5:1体积比)混合16小时。用离心沉淀蛋白质(16,000× g 45分钟),将颗粒真空干燥并重新溶解在去糖基化缓冲液中(见下文)。随后,将主动脉样品与0.08%SDS(10:1缓冲体积与组织重量)一起温育,包括蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒和25米m EDTA。样品温和地涡旋,以最小化ECM的机械破坏,在室温下4小时。然后除去SDS溶液并储存冷冻以供以后使用。最后,将样品在4中孵育 m guanidine-HCl, 50 mm 乙酸钠pH 5.8缓冲液(5:1缓冲体积与组织重量),加上蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒和25米m EDTA。将pH调节至5.8以改善血管蛋白多糖的提取性(
      • 艾森斯坦R.
      • Larsson S.E.
      • Kuettner K.E.
      • Sorgente N.
      • HASCAL V.C.
      动脉墙的地面物质。第1部分。糖胺聚糖的提取性及来自牛主动脉的蛋白多糖的分离性。
      )。将样品在室温下温育48小时,并剧烈涡旋,以增强基质蛋白的机械破坏。通过在-20℃下将样品混合在-20℃下将样品混合在-20℃下将样品混合在变性的萃取胍后除去脱氨酸。然后用离心沉淀蛋白质(16,000× g 45分钟),用90%乙醇洗涤粒料,干燥,并在脱糖基化缓冲液中重新溶解。

       脱糖基化

      在150米中达到不同提取物的脱糖基化(除去糖胺聚糖侧链)的不同提取物m NaCl, 50 mm 乙酸钠pH 6.8缓冲液补充有蛋白酶抑制剂和10米m EDTA在37°C时16小时。脱糖基化酶(0.05 u)为:1)软骨素酶ABC Proteus Ventgaris. (催化除去含有1→4-β-的多糖去除d-Hexosaminyl和1→3-β-d-Glucuronosyl或1→3-α-l - 含有4-脱氧-β-的二糖的核苷酸键合 - d-Gluc-4- enuronosyl基团。它作用于软骨素4-硫酸盐,软骨素6-硫酸盐和皮下硫酸盐糖甘油蛋聚糖侧链)。一个单位将解放1.0μm 2- acetamido-2-脱氧-3-O - (β-d-Gluc-4-Ene-吡喃糖醇酸)-4-O - d - 来自硫酸软骨素A或1.0μ的糖糖m 2- acetamido-2-脱氧-3-O - (β-d-Gluc-4-Ene-吡喃糖醇脲酸)-6-O - d - 在37℃下在pH8.0下从pH8.0下硫酸软骨蛋白C硫酸盐C. 2)角蛋白酶来自 Bracteroides Fragillis. (切割内部1→4-β-半乳糖连杆,重复聚 - N - - 乙酰乳酸胺和角蛋白硫酸盐)。一个单位将释放1.0μm 在37°C和pH5.8的牛角膜巯基硫酸盐中还原每分钟的糖。 3)肝素酶II 黄酮橘子肝素 (切割硫酸乙酰肝素)。一个单位形式0.1μm 在37℃下在pH7.0时每小时每小时的不饱和尿酸。所有酶购自Sigma-Aldrich。之后,用离心澄清脱糖基化溶液(16.000× g 10分钟)以确保样品没有浊度,并且通过280nm的UV吸光度估计蛋白质浓度。由于在脱细胞化后保留在组织中的核酸的预期污染,在4中 m 胍提取物我们使用了Groves方程[(a280 × 1.55) – (A260 ×0.76)]考虑核酸干扰(
      • Groves W.E.
      • 戴维斯Jr.,F.C.
      • 卖b.h.
      分光光度法测定没有核酸干扰的微克数量蛋白质。
      )。

       一维电泳

      0.5 m NaCl和4. m 胍提取物在含100米的样品缓冲液中变性并降低m TRIS,pH 6.8,40%甘油,0.2%SDS,2%β-巯基乙醇和0.02%溴酚蓝,并在96℃下煮沸10分钟。每样品的三十五微克蛋白质在BIS-Tris不连续的4-12%聚丙烯酰胺梯度凝胶(NUPAGE,Invitrogen)上分离。蛋白质标准沿着样品沿着样品(珍张所有蓝色,精密加,Bio-Rad Laboratories,Cramlington,Northumberland,英国)。

       Nanoflow LC-MS / MS

      电泳后,使用该阳性银染色试剂盒(GE Healthcare)染色凝胶。银染料用于带染色,以避免与微弱凝胶带的交叉污染(
      • 尹X.
      • Cuello F.
      • Mayr U.
      • 昊Z.
      • 犀牛M.
      • Ehler E.
      • Avkiran M.
      • 梅尔米
      心脏染发剂亚甲基蛋白质组学分析揭示了磷酸酶亚单元分布的动态改变。
      )在通道上的相同平行位置切除所有凝胶带,并没有留下空凝胶片。随后,使用研究者PROGEST(基因组溶液)机器人消化系统对所有凝胶带进行凝胶胰蛋白酶消化。在纳米射线LC系统(Dionex Ultimate 3000,UK)上分离胰蛋白胨肽,并用10分钟的梯度(在35分钟内为10-25%B,在5分钟内25-40%B,10分钟,10分钟,在30分钟内2%B,其中A是2%乙腈,高效液相色谱(HPLC)H中的0.1%甲酸 2O和B是90%乙腈,HPLC H中的0.1%甲酸2o)。柱(Dionex Pepmap C18,25cm长,75μm内径,3μm粒径)使用重放(Expion)耦合到纳米Pray源(PicoView)。在直接液相色谱(LC)-MS运行之后,切换流程,并且存储在重放设备的毛细管中的部分重新分析(“重放运行”)(
      • Waanders L.F.
      • Almeida R.
      • Prosser S.
      • Cox J.
      • Eikel D.
      • 艾伦米
      • Schultz G.A.
      一种新型色谱法允许蛋白质组的在线再分析。
      )。通过在质量收费中使用全离子扫描模式从高质量精度分析仪(LTQ轨道XL,Thermofisher Scientific)中收集光谱(m / z.)范围450-1600。使用具有动态排除的数据相关的采集模式,在每个MS扫描中的前六个离子上执行串联MS(MS / MS)。 MS / MS PeakLists由Extract_MSN.exe生成并匹配使用续集V.28(Rev.13)(BioWorks Browser 3.3.1 SP1,Thermofisher Scientific),与人类数据库(UNIPROTKB / SWISS-PROFER 14.6,20333蛋白条目)匹配和x!串联,(版本2007.01.01.2)。选择半胱氨酸的羧酰胺甲基化作为甲硫氨酸的固定改性和氧化作为可变改性。将质量耐受性设定为前体离子的1.5 Amu,适用于碎片离子的1.0 amu。允许两个错过的乳沟。脚手架(2.0.6版,蛋白质组软件Inc.,Portland,Or)用于计算归一化的光谱计数,并验证肽和蛋白质标识(
      • 凯勒阿。
      • nesvizhskii a.i.
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      经验统计模型来估计MS / MS和数据库搜索的肽识别的准确性。
      ,
      • nesvizhskii a.i.
      • 凯勒阿。
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      用串联质谱法鉴定蛋白质的统计模型。
      )。根据脚手架软件中的默认值,如果可以以大于肽先知算法规定的概率大于95.0%的概率,则接受肽鉴定(
      • 凯勒阿。
      • nesvizhskii a.i.
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      经验统计模型来估计MS / MS和数据库搜索的肽识别的准确性。
      )。在分析中仅包括胰蛋白肽。如果可以以大于99.0%的概率建立,则接受蛋白质鉴定(
      • nesvizhskii a.i.
      • 凯勒阿。
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      用串联质谱法鉴定蛋白质的统计模型。
      具有至少两个独立的肽和前体离子的≤10ppm的质量精度。进一步研究了血管系统中第一次鉴定的ECM蛋白,以及具有低光谱计数的ECM蛋白质,以确保所识别的光谱的质量。

       Western Blotting.

      将脱酰胺和SDS提取物的等分试样与变性样品缓冲液混合并煮沸。加载30微克蛋白质,并在4-12%梯度凝胶上分离如上。然后将蛋白质转移在硝酸纤维素膜上。在PBS中的5%脂肪奶粉中封闭膜,并在4℃下用一抗探测16小时,给:CD68(SC-70761,Santa Cruz生物技术,Santa Cruz,CA)和平滑肌肌动蛋白(A5228,Sigma -aldrich)(0.08%SDS提取物)。胶原蛋白XII(SC-166020),血压素2(SC-12313),纤连蛋白(SC-56391),ACLP(SC-32919),PERIOSTIN(SC-67233),以及来自SANTA CRUZ的MMP-12(SC-133151) Biotechnology和Tenascin(AB6393)和TIMP-1(AB38978)来自Abcam(剑桥,英国)(0.5 m NaCl提取物)。 4. m 从胁迫(Victoria,BC,加拿大)的辅助素(SOD-105)免疫胍萃取物。在5%牛血清白蛋白中,所有抗体在1:500稀释中使用。将膜用适当的二级辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体(DAKO)处理在1:2000稀释。最后,使用增强的化学燃烧剂(ECL,GE Healthcare)和薄膜在Xographer处理器上进行了斑点。使用imagej软件(V1.42Q,NIH,USA)测量来自胶原氧化物XII,TenAscin,血小板2,纤连蛋白,纤维菌素,纤维菌素,纤维菌素,ACLP,PERIOSTIN,辅助素,MMP-12和TIMP-1的发发薄膜的密度测定。

       体外MMP消化测定

      在没有结缔组织障碍的患者中,在没有结缔组织障碍的患者那里染色的正常主动脉标本被解剖到相等的嵌段(≈40mg),并在冰冷的1×PBS中洗涤五次。然后将组织块与10体积的MMP反应缓冲液混合(10米m CaCl2,120米m NaCl, 50 mm Trizma碱基和0.05%w / v Brij-35,pH 7.5),其使用普通或补充人重组MMP-9或人重组MMP-12,均来自鼠骨髓瘤细胞系(R.&D Systems,Minneapolis,Mn)。通过与0.5米的孵育激活MMP-9m 在37℃下MMP反应缓冲液中的APMA(氨基烯基浆液)(Sigma-Aldrich)24小时,而根据制造商的说明,在37℃下在37℃下在MMP反应缓冲液中自动激活MMP-12。通过溶液通过Zeba旋转(Thermo Scientific)脱盐柱(MMP-12也通过脱盐柱进行比较而除去APMA。将混合物补充有蛋白酶抑制剂混合物以抑制非MMP蛋白酶活性。在用活化的MMP孵育主动脉组织后,将组织上清液脱糖基,然后使用抗体的抗体,血栓间素2,Tenascin,纤维蛋白ACLP和PERIOSTIN免疫抑制。活化的MMP-12也用于人重组肝炎蛋白和血压素2衍生自鼠骨髓瘤细胞系(R.&D Systems)和纯化的人纤连蛋白(Sigma-Aldrich)。将每种蛋白质的10微克在MMP反应缓冲液中孵育,在37℃下补充蛋白酶抑制剂混合物16小时,或没有MMP-12。

       组织化学

      来自AAA和对照主动脉样品的小代表片置于OCT化合物(BD Healthcare)中,并用于在Leica Cryostat上产生连续的7μm厚部分。将该部分风干(30分钟),固定在100%丙酮中20分钟。随后,将切片用苏木精和曙红染色(H.&e)或与一抗抗体孵育。在免疫组织化学之前,使用甲醇中的3%过氧化氢溶液淬灭内部过氧化物酶活性15分钟。从Santa cruz生物技术探测CD68(SC-70761),ACLP(SC-32919),MMP-12(SC-133151)的抗体探测截面。在2μg/ ml下使用初级抗体。使用适当的HRP缀合的二抗制备染色,与达科购买的二氨基苯胺开发。用小鼠和兔异型IgG抗体(Sigma-Aldrich,2μg/ ml)产生阴性对照。使用Mayer的血毒溶液(Sigma-Aldrich)进行5分钟,核是蓝色的蓝色。图像由Zeiss AxioPlan 2ie显微镜接口拍摄于AxioVision软件(3.0.6版)。

       统计分析

      对于每个临床样本(CON, n = 3和AAA, n = 4)和生物化学级分(0.5 m NaCl和4. m 胍),我们使用重放设备(Evention)获得了技术LC-MS / MS复制。作为每个蛋白质的光谱计数报告的值计算为平均±S.E。所有样品和技术复制(IE。 骗子 n = 6和AAA, n = 8)。所有蛋白质的所有分配的光谱都用于光谱计数。在统计分析之前,使用脚手架软件(2.0.6版,蛋白质组软件Inc.,Portland或)通过计算和平均每个样品中所识别的光谱的数量来标准化蛋白质光谱计数,然后将分配给每种蛋白质的识别数量乘以通过平均光谱计数和该样品中的总光谱的数量的比率。使用骨折软件和分配给多种蛋白质的肽的工具处理蛋白质模糊问题,突出显示 补充表S1。使用双尾,未配对计算对照和AAA之间的每个鉴定的细胞外蛋白质的标准化光谱计数的差异 t 测试(GraphPad Prism 5)。一种 p 值≤0.05被认为是显着的。仅包含用至少两个独特肽鉴定的蛋白质分析,并且没有除去异常值。蛋白质具有巨大差异的标准化光谱计数(p 对照和AAA样品之间≤0.05)逐渐连接到簇中。使用Pearson相关系数计算不同蛋白质(行)和不同样本(列)之间的光谱计数的成对相似性。使用GenePattern软件(3.2.3版)生产树木图和定量热图(
      • 雷神米
      • Liefeld T.
      • 古怪J.
      • Lerner J.
      • Tamayo P.
      • Mesirov J.P.
      Genepattern 2.0。
      )。归一化光谱计数的相对差异由颜色梯度表示。没有删除异常值。使用Spearman的等级相关系数(GraphPad Prism 5)计算光谱计数与免疫印迹的密度计值之间的相关性。一种 p 值≤0.05被认为是显着的。

      结果

       AAA.和ECM提取的表征

      在蛋白质组学之前,组织学检查所有组织标本。少数完整弹性薄层,炎性浸润(CD68染色表明)和平滑肌细胞(SMC)丧失的广泛的内侧变性是显而易见的。代表图像显示在 Fig. 1A-C.。在正常主动脉标本中未检测到巨噬细胞标记CD68(Fig. 1D)。 AAA中的CD68阳性与平滑肌肌动蛋白(SMA)染色相反(Fig. 1D)。从我们所建立的程序后的四个AAA和三种对照(CON)主动脉中提取ECM及其相关蛋白质(
      • 迪兰罗斯A.
      • 尹X.
      • Mandal K.
      • Baumert M.
      • Jahangiri M.
      • 梅尔米
      人体主动脉细胞外空间成分的蛋白质组学。
      )。综合蛋白质组学工作流程 Fig. 2。简而言之,在第一步中,0.5的离子强度 m NaCl缓冲液足以溶解与ECM弱结合的细胞外蛋白质(
      • Mason r.m.
      • 梅雷斯r.w.
      用无机盐溶液提取软骨蛋白 - 多糖。
      ),包括新合成的ECM蛋白(
      • 威尔逊R.
      • Diseberg A.F.
      • 戈登L.
      • Zivkovic S.
      • Tatarczuch L.
      • Mackie E.J.
      • Gorman J.J.
      • Bateman J.F.
      使用顺序提取和无标记定量蛋白质组学的软骨细胞外基质形成和成熟的综合性探讨。
      ),其不是细胞外空间中存在的严重交联,降解产物和其他蛋白质。在第二步骤中,使用0.08%SDS的样品脱细胞,以减少高丰富的细胞蛋白。最后,在第三步中,使用4,实现了成熟,重链和蛋白多糖,糖蛋白和胶原蛋白和胶原蛋白酶和胶原蛋白酶的提取 m 胍,一种强烈的变性剂。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1临床标本的特征。 AAA的代​​表部分(A)和控制主动脉(B)用苏木精染色&eosin以及针对单核细胞/巨噬细胞标志物CD68的抗体(C)。免疫反应性出现在棕色中,核与Mayer的苏木精染色。秤条,5倍:100μm和20x:25μm。 D在AAA的细胞提取物(0.08%SDS)中,平滑肌肌动蛋白(SMA)与CD68相反。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2蛋白质组学工作流程。 该方法基于血管蛋白质组的三步亚分焦室(A),其丰富ECM,其相关蛋白质和降解产物。首先,在0.5中提取样品 m NACL。该缓冲液溶解蛋白质或蛋白质片段,其弱与ECM弱结合,包括新合成的ECM蛋白和降解产物。此外,还提取了分泌的蛋白酶,例如MMP。其次,标本用0.08%SDS脱节化以消耗细胞蛋白。最后,使用4提取盐不溶性ECM蛋白 m 胍溶解紧密相互作用的交联基质。在第二阶段(B),通过用重组酶孵育健康组织进一步研究确定的MMP,以鉴定新的蛋白水解靶标并表征其疾病中的蛋白水解活性。

       0.5的蛋白质​​组学分析 m NaCl和4. m Guanidine Extracts

      在脱糖基化后,0.5中的蛋白质 m NaCl和4. m 胍提取物通过一维SDS-PAGE分离(补充图S2)经过凝胶胰蛋白酶消化,并通过LC-MS / MS使用高质量精度离子阱(LTQ-orbitrap XL,Thermo Fishicific)分析到重播装置(Affion),以获得每个的技术复制生物样本。整个MS / MS数据集已存放在骄傲中,是质谱数据的公共存储库(http://www.ebi.ac.uk/pride/,登录号:16940-17107)。仅列入蛋白质通过严格识别标准 补充表S2和S3 (0.5 m NaCl和4. m 胍提取物。根据基因病理学注释数据库,0.5中的80个非冗余蛋白 m NaCl (表I.4)和117个非冗余蛋白 m guanidine (表二)馏分是ECM蛋白(蛋白多糖蛋白,糖蛋白和胶原蛋白)或与ECM相关的蛋白质,例如分泌的蛋白酶,细胞外酶,生长因子,细胞因子和脂蛋白。在鉴定的细胞外蛋白中仅在0.5中发现 m NaCl提取物,而45种蛋白质是4 m guanidine extracts (Fig. 3A)。正如预期的那样,0.5中最独特的蛋白质 m NaCl提取物是分泌因子,如组织蛋白酶S,嗜酸性粒细胞阳离子蛋白,肝癌衍生的生长因子,白细胞弹性蛋白酶抑制剂和促蛋白多肽,而蛋白质是4 m 胍提取物主要是基质蛋白,如孢子素,软骨酸性蛋白质1,链接蛋白,proLargin,层状,基质Gla蛋白,菌丝蛋白和胶原蛋白V.有趣的是,ECM蛋白的光谱计数在盐溶性蛋白质部分中显着增加AAA(p < 0.0001, Fig. 3B)。相比之下,在4 m 胍提取ECM蛋白的光谱计数(Fig. 3C)以及0.5中的总光谱数量 m NaCl或4. m 对照和AAA之间的胍提取物(未显示的数据)没有显着差异。
      表I.蛋白质组学中的细胞外基质和相关蛋白质在0.5中鉴定 m NaCl提取物。 a用两个技术复制进行三种生物样品(n = 6)。 b用两个技术复制进行四种生物样品(n = 8)。 c表示血管系统中第一次鉴定的蛋白质。 nd:没有检测到
      蛋白质名称瑞士PROL加入MW(KDA)平均光谱±S.E。 cona平均光谱±S.E。 AAA.bp value (t-test)
      蛋白多糖和糖蛋白
       Thrombospondin-1tsp1_human.1298 ± 0238±13.0.0004
       FibronectinFinc_human.26326 ± 2144±4.≥0.0001.
       Lumicanlum_human.3855 ± 167 ± 10.1000
       主动脉羧肽酶样蛋白aebp1_human.13138 ± 153 ± 10.0500
       含EGF的纤维素样ECM蛋白1fbln3_human.5534 ± 150 ± 30.1200
       Tenascin-Xtenx_human.46447 ± 332 ± 10.1200
       Versicancspg2_human.37320 ± 120 ± 10.7600
       Tenascintena_human.2411 ± 024 ± 10.0004
       Mimecanmime_human.3419 ± 010 ± 00.0001
       Perlecanpgbm_human.46914 ± 38 ± 20.0840
       Thrombospondin-2tsp2_human.130n19 ± 10.0003
       Fibulin-1fbln1_human.779 ± 011 ± 00.4800
       Fibrillin-1FBN1_human.3125 ± 011 ± 20.4600
       Vitronectinvtnc_human.54n15 ± 10.0034
       Fibromodulinfmod_human.439 ± 17 ± 00.2300
       Decorinpgs2_human.402 ± 05 ± 00.0066
       Galectin-1leg1_human.155 ± 06 ± 00.3800
       TGFβ诱导的蛋白Ig-H3bgh3_human.75n5 ± 00.0019
       Podocanpodn_human.693 ± 02 ± 00.1700
       软骨寡聚基质蛋白质Comp_human.831 ± 03 ± 00.2500
       Biglycanpgs1_human.421 ± 02 ± 00.1600
       Fibulin-5fbln5_human.503 ± 01 ± 00.0620
       Aggrecanpgca_human.2502 ± 01 ± 00.0580
       Lactadherinmfgm_human.431 ± 02 ± 00.8300
       Galectin-3leg3_human.26n2 ± 00.2500
       微纤维相关的糖蛋白4mfap4_human.292 ± 01 ± 00.4600
       PeriostinPostn_human.93n2 ± 00.2300
       Adlicancmxra5_human.312n1 ± 00.0600
       Laminin亚基α-5喇嘛5_human.4001 ± 01 ± 00.7100
       Spondin-1spon1_human.912 ± 0n0.0390
       Nidogen-1nid1_human.1361 ± 01 ± 00.4100
       DermatopontinDerm_human.241 ± 01 ± 00.6300
      ECM.相关蛋白
       细胞外超氧化物歧化酶Sode_human.2660 ± 319 ± 20.0011
       血清淀粉样蛋白P-组分Samp_human.2514 ± 038 ± 20.0190
       颜料上皮衍生因子Pedf_human.4617 ± 029 ± 00.0003
       Apolipoprotein A-Iapoa1_human.317 ± 130 ± 10.0006
       Myeloperoxidaseperm_human.842 ± 025 ± 20.0045
       潜在转化的生长因子β结合蛋白2LTBP2_human.1959 ± 112 ± 10.1500
       Apolipoprotein Eapoe_human.363 ± 017 ± 10.0230
       Tetranectintetn_human.2310 ± 012 ± 00.3500
       Procollagen c- endepeptidase增强剂1pcoc1_human.488 ± 012 ± 10.1500
       Cathepsin Dcatd_human.455 ± 09 ± 10.4200
       Ceruloplasminceru_human.1222 ± 012 ± 10.0018
       Tryptase beta-1tryb1_human.317 ± 17 ± 10.8600
       Clusterinclus_human.522 ± 012 ± 10.0003
       胰岛素样生长因子结合蛋白7IBP7_human.2911 ± 04 ± 00.0004
       Apolipoprotein DApod_human.212 ± 09 ± 10.0270
       Protein S100-A8cs10a8_human.111 ± 09 ± 10.0110
       分泌的毛躁相关蛋白3sfrp3_human.366 ± 03 ± 00.1800
       Calreticulincalr_human.485 ± 05 ± 00.9300
       Protein S100-A9cs10a9_human.13n6 ± 10.0300
       Apolipoprotein A-IVapoa4_human.454 ± 04 ± 00.8900
       金属蛋白酶抑制剂1timp1_human.231 ± 04 ± 00.0019
       潜伏 - TGFβ结合蛋白,同种型1S LTB1S_HUMAN.1532 ± 03 ± 00.4800
       Cathepsin Gcatg_human.291 ± 02 ± 00.6500
       Apolipoprotein B-100apob_human.5161 ± 03 ± 00.0220
       白细胞弹性蛋白酶抑制剂Ileu_human.432 ± 02 ± 00.7900
       Target of Nesh-SH3tarsh_human.1192 ± 03 ± 00.4100
       羧肽酶样蛋白x2cpxm2_human.862 ± 01 ± 00.9700
       肝癌衍生的生长因子hdgf_human.272 ± 01 ± 00.0590
       巨噬细胞Metalloelastase.cmmp12_human.54n3 ± 00.0500
       Cathepsin ZCatz_human.343 ± 01 ± 00.0250
       促使多肽sap_human.583 ± 0n0.0067
       潜伏 - TGFβ结合蛋白4LTBP4_human.1732 ± 0n0.0600
       分泌的毛细胞相关的蛋白质1sfrp1_human.352 ± 0n0.0830
       Cathepsin Scats_human.37n1 ± 00.2300
       72型IV型胶原酶mmp2_human.741 ± 0n0.1300
       Glia-derived nexingdn_human.44n1 ± 00.2900
       Chymasecma1_human.27n1 ± 00.3000
       嗜酸性粒细胞阳离子蛋白cECP_HUMAN.18n1 ± 00.5300
      胶原蛋白
       胶原醛alpha-1(xiv)Coea1_human.19471 ± 150 ± 20.0009
       胶原醛alpha-1(xii)Coca1_human.33313 ± 181 ± 50.0014
       Collagen alpha-3(VI)CO6A3_HUMAN.34413 ± 136 ± 30.0430
       Collagen alpha-1(VI)CO6A1_HUMAN.1094 ± 08 ± 10.2000
       胶原醛alpha-1(xviii)Coia1_human.1785 ± 07 ± 00.1700
       Collagen alpha-2(VI)co6a2_human.1092 ± 03 ± 00.6100
       Collagen alpha-1(I)co1a1_human.1391 ± 03 ± 00.1900
       Collagen alpha-1(XV)cofa1_human.1422 ± 03 ± 00.5600
       Collagen alpha-2(I)co1a2_human.1291 ± 03 ± 00.0130
       胶原醛alpha-1(iii)co3a1_human.139n1 ± 00.3900
      表二蛋白质组学中的细胞外基质和相关蛋白质在4中鉴定 m 胍提取物。 a用两个技术复制进行三种生物样品(n = 6)。 b用两个技术复制进行四种生物样品(n = 8)。 c表示血管系统中第一次鉴定的蛋白质。 nd:没有检测到
      蛋白质名称瑞士PROL加入MW(KDA)平均光谱±S.E。 cona平均光谱±S.E。 AAA.bp value (t-test)
      蛋白多糖和糖蛋白
       FibronectinFinc_human.263210±15.336±16.≥0.0001.
       Perlecanpgbm_human.469323±13.176±43.0.0280
       Versicancspg2_human.373190±584±18.0.0010
       Aggrecanpgca_human.250154±23.28±11.0.0003
       Prolarginprelp_human.4476 ± 886 ± 80.3100
       Tenascintena_human.24111 ± 1144±21.≥0.0001.
       Biglycanpgs1_human.4274 ± 478±10.0.4400
       Vitronectinvtnc_human.5426 ± 2117±12.≥0.0001.
       Decorinpgs2_human.4035 ± 770±14.0.0430
       Clusterinclus_human.5234 ± 269 ± 7≥0.0001.
       PeriostinPostn_human.9356 ± 647 ± 60.6400
       Lactadherinmfgm_human.4360±12.39±11.0.2400
       Lumicanlum_human.3841 ± 251 ± 60.1400
       Thrombospondin-1tsp1_human.1292 ± 190±12.≥0.0001.
       Tenascin-Xtenx_human.46431 ± 139±10.0.3600
       Nidogen-1nid1_human.13629 ± 424 ± 70.6700
       主动脉羧肽酶样蛋白aebp1_human.13121 ± 228 ± 60.2900
       Laminin亚单位伽玛1lamc1_human.17826 ± 616 ± 60.3300
       Mimecanmime_human.3415 ± 223 ± 80.3200
       Laminin亚基Beta 2lamb2_human.19623 ± 412 ± 40.0960
       DermatopontinDerm_human.2417 ± 516 ± 30.8100
       Annexin A2安慰2_human.3913 ± 219 ± 50.2600
       透明质酸和蛋白质糖甘油链接蛋白1hpln1_human.4025 ± 96 ± 20.0510
       Fibrillin-1FBN1_human.3124 ± 126 ± 4≥0.0001.
       Laminin亚基α5喇嘛5_human.40019 ± 46 ± 20.0060
       Fibulin-5fbln5_human.5014 ± 33 ± 10.0110
       金属蛋白酶抑制剂3.timp3_human.243 ± 114 ± 30.0067
       Galectin-1leg1_human.159 ± 38 ± 20.9900
       Asporinaspn_human.432 ± 112 ± 50.0800
       EMILIN-1Emil1_human.1078 ± 33 ± 10.1700
       微纤维相关的糖蛋白4mfap4_human.299 ± 22 ± 10.0120
       Nidogen-2nid2_human.1512 ± 07 ± 30.0630
       Fibromodulinfmod_human.435 ± 23 ± 00.3700
       Fibulin-1fbln1_human.776 ± 21 ± 00.0110
       Agrin一咧嘴_human.2154 ± 23 ± 10.5700
       Thrombospondin-2tsp2_human.130n7 ± 1≥0.0001.
       Microfibrillar相关蛋白5mfap5_human.203 ± 13 ± 10.5400
       Glia-derived nexingdn_human.44n4 ± 10.0014
       Laminin亚基Beta 1lamb1_human.198n4 ± 10.0110
       RPE-spondinRpesp_human.304 ± 21 ± 10.0330
       Podocanpodn_human.69n3 ± 10.0700
       Matrix Gla proteincmgp_human.121 ± 01 ± 10.7500
       SclerostinSOST_HUMAN.241 ± 0n0.1800
       SPARC-like protein 1cSprl1_human.751 ± 1n0.1100
       软骨寡聚基质蛋白质Comp_human.831 ± 1n0.0930
       Matrilin-2matn2_human.1071 ± 01 ± 10.7900
       Galectin-3leg3_human.261 ± 1n0.2700
       Spondin-1spon1_human.911 ± 1n0.1300
       软骨酸性蛋白1cCrac1_human.71n1 ± 10.2100
       与SPARC相关的模块化钙结合蛋白2smoc2_human.501 ± 0n0.3200
       纤连蛋白型III型域蛋白1fndc1_human.2051 ± 0n0.2300
       Laminin亚基α4喇嘛4_human.2031 ± 0n0.3000
       Hemicentin-1hmcn1_human.613n1 ± 00.4100
      ECM.相关蛋白
       血清淀粉样蛋白P成分Samp_human.2539 ± 691±20.0.0220
       Apolipoprotein B-100apob_human.516n96±34.0.0470
       Apolipoprotein A-Iapoa1_human.31n50±16.0.0230
       丝氨酸蛋白酶HTRA1htra1_human.5116 ± 419 ± 70.7600
       TGF-β诱导蛋白Ig-H3bgh3_human.758 ± 327 ± 4≥0.0001.
       胰岛素样生长因子结合蛋白7IBP7_human.2920 ± 29 ± 30.0430
       含EGF的纤维素样细胞外基质1fbln3_human.5513 ± 212 ± 50.9900
       Cathepsin Dcatd_human.228 ± 214 ± 40.1090
       细胞外超氧化物歧化酶Sode_human.2618 ± 35 ± 20.0020
       Target of Nesh-SH3tarsh_human.11920 ± 43 ± 10.0002
       金属蛋白酶抑制剂3.timp3_human.243 ± 114 ± 30.0067
       Apolipoprotein Eapoe_human.36n15 ± 40.0180
       巨噬细胞Metalloelastase.cmmp12_human.54n15 ± 30.0033
       Apolipoprotein DApod_human.21n13 ± 20.0035
       潜在转化的生长因子β结合蛋白2LTBP2_human.1959 ± 24 ± 10.0570
       潜伏TGF-β结合蛋白,同种型1SLTB1S_HUMAN.1538 ± 24 ± 20.3000
       Ceruloplasminceru_human.122n12 ± 50.0650
       转化生长因子β-1诱导的转录物1蛋白tgfi1_human.5010 ± 21 ± 10.0003
       Cathepsin Gcatg_human.293 ± 27 ± 20.0450
       Chymasecma1_human.277 ± 13 ± 20.2700
       Myeloperoxidaseperm_human.84n10 ± 30.0210
       中性粒细胞防御素1def1_human.101 ± 19 ± 10.0003
       LIM和富含半胱氨酸的域蛋白1lmcd1_human.419 ± 2n0.0067
       溶酶氧化酶同源物1loxl1_human.635 ± 23 ± 10.2900
       Galectin-3结合蛋白lg3bp_human.656 ± 32 ± 00.1000
       Tryptase beta-1tryb1_human.314 ± 13 ± 20.9900
       金属蛋白酶抑制剂-3timp1_human.23n6 ± 20.0270
       颜料上皮衍生因子Pedf_human.462 ± 13 ± 10.6100
       羧肽酶样蛋白x2cpxm2_human.864 ± 2n0.1600
       Apolipoprotein A-IVapoa4_human.45n4 ± 30.1900
       磷脂酶A2,膜相关Pa2ga_human.162 ± 12 ± 10.9300
       Apolipoprotein L1Apol1_human.44n4 ± 20.1900
       Protein S100-A9cs10a9_human.13n4 ± 10.0290
       潜在转化的生长因子β结合蛋白4LTBP4_human.1733 ± 1n0.0550
       Procollagen c- endepeptidase增强剂1pcoc1_human.482 ± 1n0.1700
       KallistatinKain_human.49n2 ± 20.3300
       Properdinprop_human.511 ± 11 ± 00.7500
       Calreticulincalr_human.481 ± 11 ± 00.2900
       Antileukoproteinaseslpi_human.141 ± 0n0.0980
       Cathepsin ZCatz_human.341 ± 1n0.4800
       分泌的毛细胞相关的蛋白质1sfrp1_human.352 ± 1n0.1200
       SPARC-like protein 1Sprl1_human.751 ± 1n0.1100
       Protein S100-A8cs10a8_human.111 ± 01 ± 00.4200
       分泌的毛躁相关蛋白3sfrp3_human.361 ± 1n0.1400
       C型凝集素域系列11成员A.cclc11_human.361 ± 01 ± 00.9500
       Lipocalin 1clcn1_human.19n1 ± 00.1800
       分泌的磷蛋白24.spp24_human.24n1 ± 10.1600
       egf样重复和浮动素I形域 -
      含有蛋白质3.edil3_human.54n1 ± 10.2400
       胰岛素样生长因子结合蛋白质复合酸不稳定cals_human.66n1 ± 00.2900
      胶原蛋白
       Collagen alpha 3(VI)CO6A3_HUMAN.344194±35.343±37.0.0025
       Collagen alpha 1(VI)CO6A1_HUMAN.10974±10.95±16.0.1100
       胶原醛alpha 1(xiv)Coea1_human.194112±17.40 ± 90.0005
       胶原醛alpha 1(xviii)Coia1_human.17869 ± 613 ± 4≥0.0001.
       Collagen alpha 1(I)co1a1_human.13936 ± 541 ± 20.0580
       胶原素alpha 1(XII)Coca1_human.33317 ± 360±10.0.0006
       Collagen alpha 2(VI)co6a2_human.10935 ± 640 ± 70.2400
       Collagen alpha 2(I)co1a2_human.12934 ± 236 ± 20.0580
       Collagen alpha 2(IV)co4a2_human.16837 ± 631±12.0.7700
       Collagen alpha 1(XV)cofa1_human.14224 ± 617 ± 50.4300
       Collagen alpha 1(V)CO5A1_HUMAN.1848 ± 111 ± 20.0300
       胶原醛alpha 1(viii)co8a1_human.737 ± 29 ± 30.6200
       胶原醛alpha 2(viii)co8a2_human.672 ± 13 ± 10.3100
       Collagen alpha 1(IV)co4a1_human.1611 ± 12 ± 10.4700
       胶原醛alpha 1(xxi)Cola1_human.991 ± 02 ± 10.2100
       Collagen alpha 2(V)Co5a2_human.145n1 ± 00.0820
      图缩略图GR3.
      Fig. 3细胞外蛋白的差异溶解度。 A,Venn图显示用0.5提取的ECM和相关蛋白质的数量 m NaCl或4. m 胍。对每个提取物给出唯一鉴定的蛋白质的Swissprot进入码。列出了所有标识 表I., 表二. B,在0.5 m NaCl提取ECM蛋白的光谱计数与控制主动脉(CON)相比,AAA样品中的ECM蛋白显着增加。所识别的光谱总数是相似的。 C,在4 m 胍抑制ECM蛋白的光谱计数以及对照组和AAA之间的总光谱数量显着不同。值是平均值±S.E. *** p0.001. 使用2尾未配对进行统计分析 t test.

       ECM.和AAA中的相关蛋白

      使用归一化光谱计数估计对照(CON)和AAA之间相对蛋白质丰度的差异(表I., 表二)。没有删除异常值。详细信息可以找到 实验步骤。在NaCl和胍提取物中差异表达的细胞外蛋白的分层聚类清楚地分离了对照和AAA样品并突出了ECM组成的主要差异(Fig. 4)。在0.5中观察到增加胶原蛋白I和VI水平和原纤维相关胶原乳糖,纤连蛋白,VITRONECTIN,Tenascin(替代名称:TenAscin-C),血栓状素1和2和ACLP m AAA的NaCl提取物(图4A, 表I.)。这些蛋白质不包括ACLP,在4中也更加丰富 m AAA的胍提取物(Fig. 4B, 表二)表明它们是成熟,盐不溶性动脉瘤ECM的组分。我们还注意到AAA中大蛋白质面包蛋白聚集体,Versican和Perlecan的光谱计数减少(Fig. 4B, 表二),也许是因为在疾病的早期阶段的蛋白水解。佩雷康的减少可以解释细胞外超氧化物歧化酶的丧失(esod)(图4A4B, 表I. 并且II)因为该抗氧化酶在细胞外空间中附着于泊仑和其他硫酸乙酰肝素蛋白多糖(
      • Karlsson K.
      • SandströmJ.
      • Edlund A.
      • Marklund S.L.
      组织中细胞外超氧化物歧化酶的转化酶。
      )。另一种纤维相关胶原蛋白,XIV型和细胞外蛋白质,视网膜色素上皮掺杂蛋白(RPE-SH3),DYXIN和NESH-SH3的靶标,还存在较差的Fig. 4B, 表二)。此外,蛋白质组学鉴定了稀缺的细胞外蛋白,包括Calgranulins S100a8和A9(图。 4.A4B, 表I. 和II),参与巨噬细胞粘附和迁移的钙结合中性粒细胞蛋白(
      • Croce K.
      • 高H.
      • 王Y.
      • Mooroka T.
      • Sakuma M.
      • Shi C.
      • Sukhova G.K.
      • Packard R.R.
      • Hogg N.
      • 利比P.
      • 西蒙D.I.
      髓样相关的蛋白-8 / 14对于对血管损伤的生物反应至关重要。
      ),金属蛋白酶1(TIMP-1)和巨噬细胞金属蛋白酶蛋白酶,MMP-12(图。 4.A4B 表I., 表二)。从脉管系统中首次鉴定的细胞外蛋白质的代表性MS / MS光谱显示在脉管系统中 补充图S3.
      图缩略图GR4.
      Fig. 4细胞外蛋白的分层聚类。 Dendrograms在0.5中显示差异表达细胞外蛋白的分层聚类分析(Pearson相关系数) m NaCl extracts (A)在4 m guanidine extracts (B)。 “R”表示使用重放装置对每个临床样本获得的技术复制。光谱计数的差异如图所示的颜色编码。

       AAA.中的炎症标志物

      除了对照和AAA样本之间的明显区别外,分层聚类揭示了四个AAA样本中显着差异(图。 4.A4B)。参与炎症的蛋白质,例如载脂蛋白D,刺激素,髓藻氧化氢酶,S100a8和A9在样品1和3中更丰富,而ECM蛋白PERCENAN,ECRECCAN,VERSICAN,胶原氧化物和基质相关酶eSOD在样品中较高2和4(图。 4.A4B)。这些差异反映了SDS提取物中观察到的细胞组合物(Fig. 1D)。 AAA标本1和3具有更高的巨噬细胞含量,解释了炎症因子的丰度,而平滑肌细胞的损失与ECM组分的减少一致。

       蛋白质组学和ECM重塑的验证

      选择含有样品中检测到的蛋白质丰度的六种糖蛋白进行进一步验证。根据光谱计数,胶原蛋白XII,TenAscin,血压素素2,Fibronectin,ACLP和Periostin(Fig. 5, 剩下 面板在0.5中增加 m NaCl提取物的四个AAA样本。免疫印迹确认AAA中的更高水平(Fig. 5, 中间 面板)。通过免疫印迹还验证了辅助储存以及MMP-12和TIMP-1的积累。总的来说,有良好的相关性(Spearman相关, r ≥ 0.8, p ≤0.05)通过光谱计数和Western印迹估计的蛋白质丰度(Fig. 5, 正确的 面板)。对于PERIOSTIN和MMP-12,相关性不显着,因为当蛋白质水平低时,光谱计数较低(
      • 老为
      • Meyer-Arendt K.
      • Aveline-Wolf L.
      • 皮尔斯K.G.
      • 门多萨A.
      • 七夹J.R.
      • resing K.A.
      • ahn n.g.
      霰弹枪蛋白质组学定量人体蛋白质的无标记方法的比较。
      )。尽管如此,我们的方法允许检测复合临床样品中的基质大分子以及稀缺分泌蛋白质。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5ECM.改造标记的验证。 光谱计数(剩下 面板)对于胶原蛋白XII,Tenascin,血小板素2,纤维菌素和ACLP(替代名称:Adipocyte Enchancer结合蛋白1; AEBP-1)在0.5中显着高于0.5 m 与对照相比,AAA的NaCl提取物。值是平均值±S.E. *** p0.001,** p0.01,** p0.05,ns. 不重要。使用双尾,未配对进行统计分析 t 测试。免疫印迹(中间 面板)证实了AAA中这些ECM蛋白的水平增加以及碎片化。通过免疫印迹还验证了辅助储存和MMP-12和TIMP-1的积累。箭头表示全长蛋白质的预期分子量。除Periostin和MMP-12外,相关性高(Spearman相关性) r0.8, p0.05)通过光谱计数和Western印迹确定的蛋白质丰度(正确的 panels).

       ECM.改造和MMP-12的作用

      西方印迹呈现 Fig. 5 突出胶原蛋白XII,TenAscin,血小板素2,纤维连接蛋白,ACLP和PERIOSTIN在AAA样品中的破碎化。实际上,对凝胶-LC-MS / MS数据的详细检查显示,在低于这些蛋白质的预期分子量的凝胶区段中鉴定了大量MS / MS光谱(Fig. 6A)确认在动脉瘤组织中存在蛋白水解产物。虽然包括MMP-12的各种MMP,但在动脉瘤形成期间与基质蛋白水解有关(
      • Curci J.A.
      • 廖S.
      • 霍夫曼M.D.
      • 夏皮罗S.D.
      • 汤普森R.W.
      巨噬细胞弹性蛋白酶(基质金属蛋白酶-12)在腹主动脉瘤中的表达与定位。
      ,
      • 诺克斯J.B.
      • Sukhova G.K.
      • Whittemore A.D.
      • 利比P.
      基质金属蛋白酶酶与人主动脉疾病中抑制剂之间改变的证据。
      ,
      • πr.
      • 李杰尔。
      • Shipley J.m.
      • Curci J.A.
      • 毛泽东
      • Ziporin S.J.
      • ennis t.l.
      • 夏皮罗S.D.
      • 高级下午
      • 汤普森R.W.
      基质金属蛋白酶-9(明胶酶B)的靶向基因破坏抑制了实验腹主动脉瘤的发育。
      ),MMP-12是我们蛋白质组学分析中唯一明显增加的金属蛋白酶(Fig. 4)。为了探讨这些糖蛋白的观察到的破碎物和MMP-12的存在之间的可能关系,我们将宏观正常的人主动脉标本与重组MMP-12一起孵育 体外 (Fig. 6B)。 MMP-9,另一种金属蛋白酶涉及AAA病理学(
      • 纽曼西
      • ogata y.
      • 马龙上午
      • Irtizarry E.
      • 甘地r.h.
      • nagase H.
      • 蒂尔逊M.D.
      腹主动脉瘤中基质金属蛋白酶3(基质-1)和9(明胶酶B)的鉴定。
      ),作为额外的控制。 MMP-12诱导纤连蛋白和切割胶原蛋白XII,Tenascin和Periostin的广泛破碎。血压素2降解生产两种小型切割产品(kda)。与MMP-9相比,MMP-12对纤连蛋白,TenAscin,胶原蛋白XII和血小板复合素2的降解具有更明显的影响,而MMP-9诱导来自主动脉基质的全长肝蛋蛋白的释放,可能是通过有限的蛋白水解。有趣的是,用两种蛋白酶治疗导致ACLP免疫染色的几乎完全丧失。除纤连蛋白外(
      • 傅J.Y.
      • Lyga A.
      • 施H.
      • 蓝色M.L.
      • 迪克森B.
      • 陈德。
      大鼠MMP-12的克隆,表达,纯化和表征。
      ),所有其他糖蛋白是用于MMP-12的新型底物。蛋白酶有剂量(0-50 pm, 补充图S4)和时间依赖(2-16h, 补充图S5)对主动脉外植体的这些糖蛋白效应。重要的是,它对组织的蛋白水解作用几乎完全被废除了10米m EDTA (补充图S6)。此外,MMP-12能够切割人重组肝炎蛋白和血压素2 体外 (Fig. 6C)。使用人的纤连蛋白,一种已知的MMP-12底物作为阳性对照。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6新型MMP-12目标。 A,颜色编码的热图显示了0.5中的6个糖蛋白的鉴定光谱的数量 m NaCl在SDS-PAGE后的对照和AAA样品中提取物及其分子量分布。 B,将正常的主动脉标本分解成三个相等的嵌段并用50 p处理m MMP-9, 50 pm MMP-12,或在37℃下在MMP反应缓冲液中留下未处理的(CON)。通过针对胶原氧化物XII,Tenascin,血小板素2(Tsp2),纤维菌蛋白,ACLP和肝蛋白的免疫印迹分析所得上清液。箭头表示由MMP-12处理产生的蛋白水解片段。 C,在普通MMP反应缓冲液中,在37℃下将10μg人纯化的纤连蛋白和10μg人重组肝切蛋白和Tsp2在37℃下孵育16小时,或用50 p补充m MMP-12(+ MMP-12)。通过一维SDS-PAGE分离蛋白质混合物,并以0.05%w / v COOMASIE G-250,5%V / V冰醋酸溶液染色以监测底物降解。

       ACLP.和MMP-12

      MMP.-12对ACLP的蛋白水解作用非常明显,并考虑到该相关糖蛋白缺乏了知识(
      • Layne M.D.
      • neidege w.o.
      • jain m.k.。
      • 然而S.F.
      • hsieh c.m.
      • 下巴。
      • Perrella M.A.
      • Blanar M.A.
      • Haber E.
      • 李米。
      在血管平滑肌细胞分化期间,主动脉羧肽酶样蛋白,一种具有盘状蛋白和羧肽酶样域的新蛋白质。
      )在动脉瘤中,我们试图通过免疫组织化学来检查其本地化。在AAA中,在培养基的细胞间区域中存在细胞外ACLP染色( Fig. 7A),其中组织架构更完整地具有完整的弹性薄层,并且没有炎性浸润,并且在无定形的炎症区域中,有结缔组织损失是显而易见的(Fig. 7B)。在连续的序列部分中,MMP-12染色主要在炎症区(图。 7.C7D)在两种蛋白质的染色强度中,在组织中的ACLP上支持MMP-12的蛋白水解作用,存在反向相关性。阴性对照显示在 图。 7.E7F.
      图缩略图GR7.
      Fig. 7ACLP.和MMP-12的免疫组织化学染色。 将AAA组织的连续连续部分用抗体染色ACLP(AB)或MMP-12(CD)。 ACLP在具有剩余弹性薄片的短细胞区域中发现(A)在介质的无定形,炎症区域,具有结缔组织破坏的证据(B)。 MMP-12主要存在于炎症区(D)。用辣根过氧化物酶 - 缀合的二抗的二氨基苯胺(DAB)显影得到阳性免疫染色。将阴性对照与同种型对照抗体一起孵育(EF)。核用Mayer的苏木精染了核。 20x放大倍数。秤栏:25μm。

      讨论

      动脉瘤中主动脉结缔组织的破坏是由严重的炎症反应驱动,并且涉及主动脉ECM的过度降解。然而,主动脉中的细胞蛋白质和基质组分的生物化学性质的丰富具有迄今为止ECM在血管病理中的表征(
      • 梅尔米
      • Chung Y.L.
      • Mayr U.
      • 尹X.
      • LY L.
      • 特洛伊H.
      • 弗雷德里克斯S.
      • 胡Y.
      • Griffiths J.R.
      • 徐Q.
      来自载脂蛋白E缺乏小鼠的动脉粥样硬化血管的蛋白质组学和代谢组合揭示炎症,氧化应激和能量代谢的变化。
      )。在该研究中,我们使用了一种基于溶解性的蛋白质偶片方法,使ECM及其相关蛋白质的详细表征能够在AAA中进行详细表征。重要的是,这种方法向病理重塑过程提供了新的洞察力,使我们能够将某些ECM蛋白的营业额的变化与AAA中的MMP-12水平相关。

       AAA.细胞外蛋白质组的变化

      蛋白质组学显示对照和AAA标本之间的ECM组成显着差异(Fig. 4, Fig. 5)。由于病理重塑的结果,在ECM碎片产物中富集的动脉瘤的盐溶性蛋白质级分。在AAA中,尚未报道许多已鉴定的蛋白质变化,包括胶原蛋白XII,血压出素2,肝炎和ACLP。胶原蛋白XII是一种纤维相关的胶原蛋白,并在暴露于高拉力的组织中积累(
      • TrächslinJ.
      • koch m.
      • 剧温米
      拉伸应力变化的胶原XII表达的快速又可逆调节。
      )骨蛋白和血压素2是糖蛋白,涉及细胞粘附和展开(
      • 吉兰L.
      • Matei D.
      • Fishman D.A.
      • Gerbin C.S.
      • Karlan B.Y.
      • 张D.D.
      由上皮细胞卵巢癌分泌的骨蛋白是α(v)β(3)和α(v)β(5)整联蛋白的配体,并促进细胞活性。
      ,
      • 懒人N.
      • 格雷格D.
      • Vasudevan S.
      • Hassanain H.
      • goldschmidt-clermont p。
      • Kovacic H.
      血压素素2调节RAC1依赖性信号传导诱导的细胞增殖。
      )。 ACLP是一种细胞外糖蛋白,已知在与胶原纤维相关的ECM中积聚(
      • Layne M.D.
      • neidege w.o.
      • jain m.k.。
      • 然而S.F.
      • hsieh c.m.
      • 下巴。
      • Perrella M.A.
      • Blanar M.A.
      • Haber E.
      • 李米。
      在血管平滑肌细胞分化期间,主动脉羧肽酶样蛋白,一种具有盘状蛋白和羧肽酶样域的新蛋白质。
      ),但其功能尚不清楚。最近,席士斯 等等。,表明ACLP是受伤肺中纤维化的正稳压因子(
      • 梭勒S.L.
      • 邓莫尔斯。
      • 刘X.
      • 闪耀R.W.
      • Perrella M.A.
      • Layne M.D.
      主动脉羧肽酶样蛋白在纤维化的人肺中表达,并且其缺失可用于抗晶霉素诱导的肺纤维化。
      )。纤连蛋白是伤口愈合后造粒组织的主要成分(
      • Valenick L.V.
      • HSIA H.C.
      • Schwarzbauer J.E.
      纤连蛋白片段化促进抗纤维蛋白 - 纤维蛋白临时基质的α4Beta1整合蛋白介导的收缩。
      )这可以解释其在受伤的主动脉墙中的积累。先前在AAA中报道了增加的Tenascin mRNA表达,并与巨噬细胞的积累有关(
      • Satta J.
      • Soini Y.
      • Pöllänenr.
      • PääkkoP.
      • Juvonen T.
      塔斯卡林表达与腹主动脉瘤中的慢性炎症过程有关。
      )。我们的蛋白质组学数据还揭示了这些ECM蛋白的破碎化(Fig. 5)。降解产品反映了AAA中的病理重塑过程。
      在4. m AAA的胍提取物在三个主要蛋白质聚糖含有含有减少的三种主要蛋白质聚糖,PERCECAN和EGGRECAN,以及链接蛋白,糖蛋白将聚集蛋白多糖与透明质酸联系起来。虽然前一项研究表明,有动脉瘤(
      • Theocharis A.D.
      • Tsolakis I.
      • Hjerpe A.
      • karamanos n.k.
      人体腹主动脉瘤的特征在于浓度下降,并且特异性下调对同种型V(0)。
      ),对PERECAN和EGGRECAN对这种病理学的贡献并不多
      • 梅罗斯J.
      • whitelock J.
      • 徐Q.
      • Ghosh P.
      腹主动脉瘤的发病机制:平滑肌细胞差异生产蛋白多糖的可能作用。
      ,
      • baas a.f.
      • 军医J.
      • van'tlot r.
      • de Vries J.P.
      • 范萨比克M.R.
      • verhoeven e.l.
      • 棉铃B.P.
      • Grobbee D.E.
      • Wijmenga C.
      • Blankensteijn J.D.
      • ruigrour y.m.
      颅内动脉瘤敏感性基因HspG2和CSPG2与腹主动脉瘤无关。
      )。这些主要蛋白质面蛋糖的丧失可能对SMC附着,增殖和迁移产生重大影响,但它也会影响细胞外空间中各种调节分子的结合和储存,包括细胞外酶和生长因子(
      • 文森特T.
      • Hermansson M.
      • 博尔顿M.
      • 等待R.
      • Saklatvala J.
      基本FGF介导关节软骨响应机械损伤。
      )。例如,AAA中细胞外超氧化物歧化酶(eSOD)降低(Fig. 5)。这种有效的抗氧化酶位于血管细胞外空间,其与下属硫酸乙酰肝素硫酸盐蛋白多糖(如PERCEN)结合
      • Karlsson K.
      • SandströmJ.
      • Edlund A.
      • Marklund S.L.
      组织中细胞外超氧化物歧化酶的转化酶。
      )。这些蛋白转基因的损失可能导致储存和其他细胞外蛋白的保留降低,从而影响血管壁的整体完整性。

       MMP.-12在AAA中

      研究人体组织中蛋白水解活性的研究依赖于mRNA表达,免疫染色或酶谱系,并倾向于聚焦在单个蛋白酶及其抑制剂上。 MMP -1,-2,-3,-7,-9和-12先前在AAA的富可鼠丰富的区域中检测到,它们的蛋白水解活性已与动脉瘤形成有关(
      • Curci J.A.
      • 廖S.
      • 霍夫曼M.D.
      • 夏皮罗S.D.
      • 汤普森R.W.
      巨噬细胞弹性蛋白酶(基质金属蛋白酶-12)在腹主动脉瘤中的表达与定位。
      ,
      • 诺克斯J.B.
      • Sukhova G.K.
      • Whittemore A.D.
      • 利比P.
      基质金属蛋白酶酶与人主动脉疾病中抑制剂之间改变的证据。
      ,
      • πr.
      • 李杰尔。
      • Shipley J.m.
      • Curci J.A.
      • 毛泽东
      • Ziporin S.J.
      • ennis t.l.
      • 夏皮罗S.D.
      • 高级下午
      • 汤普森R.W.
      基质金属蛋白酶-9(明胶酶B)的靶向基因破坏抑制了实验腹主动脉瘤的发育。
      )。有趣的是,对AAA中的相对丰富几乎是众所周知的。基于抗体的检测的限制是染色强度不仅取决于蛋白质量,而且还依赖于抗体的结合亲和力和特异性。因此,不能直接比较用不同抗体染色。相反,蛋白质组学方法提供对患病组织中的蛋白酶和潜在降解产物的无偏见评估。而以前的蛋白质组学研究主要集中在细胞蛋白上,并且未能在AAA中鉴定MMPS(
      • 廖米
      • 刘Z.
      • 宝J.
      • 赵Z.
      • 胡锦涛
      • 冯X.
      • 冯R.
      • 鲁Q.
      • 梅Z.
      • 刘Y.
      • 吴Q.
      • 荆Z.
      人胸主动脉分析中主动脉介质的蛋白质组学研究:氧化应激的含义。
      ,
      • Pilop C.
      • angger f.
      • Gorman R.C.
      • Brunisholz R.
      • Gerrits B.
      • SchaffnerT.
      • GORMAN第3次,J.H.
      • Matyas G.
      • Carrel T.
      • 弗雷下午
      Marfan综合征患者主动脉培养基中的蛋白质组学分析显示出在主动脉瘤中的CALPAIN 2的活性增加。
      ),我们的子程度方法使能检测MMP-12。这并不排除其他MMP的存在,但表明MMP-12可能更丰富,并强调其在AAA的病理学中的作用(
      • Longo G.M.
      • 布达S.J.
      • Fiota N.
      • 熊W.
      • Giener T.
      • 夏皮罗S.
      • Baxter B.T.
      MMP.-12具有小鼠腹主动脉瘤的作用。
      ,
      • 王Y.
      • Ait-oufella H.
      • 草本o.
      • 靠背
      • Ramkhelawon B.
      • Taleb S.
      • 黄杰。
      • Offenstadt G.
      • CombadièreC.
      • RéniaL.
      • 约翰逊J.L.
      • tharaux p.l.
      • Tedgui A.
      • Mallat Z.
      TGF-β活性可防止血管紧张素II灌注小鼠的炎症主动脉瘤进展和并发症。
      )。 MMP-2,组织蛋白酶D,G,S和Z,以及肥大细胞蛋白酶抑制蛋白酶和胰蛋白酶β-1(表I., 表二),但在AAA中只有组织蛋白酶G显着增加(图4B.)。有趣的是,最近显示组织蛋白酶G在动脉瘤中降解腔内血栓(
      • dejouvencel t.
      • Férond。
      • rossignol p.
      • Sapoval M.
      • Kauffmann C.
      • 暴情毒病灌注点
      • Michel J.B.
      • 结果 - arnaudin I.
      • Meilhac O.
      血红素7反映了腹主动脉瘤中的血红蛋白蛋白溶解。
      )。

       主动脉组织中MMP-12的新靶点

      除了良好的弹性溶解和胶原溶解性(
      • Curci J.A.
      • 廖S.
      • 霍夫曼M.D.
      • 夏皮罗S.D.
      • 汤普森R.W.
      巨噬细胞弹性蛋白酶(基质金属蛋白酶-12)在腹主动脉瘤中的表达与定位。
      ),关于MMP-12降低主动脉中的其他基材的能力很少。到目前为止,已通过使用针对切割基板的新素抗体免疫染色的免疫染色来研究来自已知MMP靶标的蛋白水解产物的存在(
      • Sukhova G.K.
      • SchönbeckU.
      • rabkine。
      • Schoen F.J.
      • Poole A.R.
      • Billinghurst R.C.
      • 利比P.
      在脆弱的人类斑驳斑块中,间质胶原酶-1和-3增加了胶原溶解的证据。
      )。我们的子分量分解方法允许更全面地分析AAA中的ECM重塑。例如,在盐溶性蛋白质级分中,我们不仅观察到胶原氧化物XII,纤连蛋白,腺苷,血栓样蛋白2,ACLP和PELIOSTIN的部分降解。当与重组MMP-12一起温育健康主动脉组织时,蛋白酶能够切割这些基材。至少是它的效果 体外,比MMP-9更有效,表明MMP-12可能对AAA中这些蛋白质的降解负责。当然,MMP-12处理后的碎裂模式与0.5中观察到的梯子不相同 m NaCl提取物。这是预期的,因为组织中的蛋白水解活性是由MMP与TiMP和其他抑制剂的相互作用调节的高度动态过程。同意以前的研究(
      • 毛泽东
      • vanvickle s.j.
      • Curci J.A.
      • 汤普森R.W.
      基质金属蛋白酶酶的表达与人腹主动脉瘤中的表达。
      ),我们发现AAAS中Timp-1和-3显着增加(图。 4.A4B)表示补偿性的反对响应。 AAA中的一个碎片蛋白质是ACLP(Fig. 5)。 MMP-12能够降解它 体外 (Fig. 6B)。通过免疫组织化学进一步分析证实了ACLP和MMP-12在AAA的炎症区域中的染色强度的逆相关(图。 7.B7D),提供额外的证据表明蛋白酶可以靶向ACLP 体内.

       优势和局限性

      本研究中使用的基于凝胶的分离,保留了蛋白质的分子量,并允许评估患病组织中的蛋白水解降解。关于蛋白质碎裂的这种关键信息在常规的霰弹枪蛋白质组学中丧失。基于光谱计数的无标记量定量允许蛋白质丰度的相对估计(
      • 刘H.
      • Sadygov R.G.
      • yates 3rd,J.R.
      霰弹枪蛋白质组学中相对蛋白质丰度的随机抽样与估算模型。
      )和基于同位素标签的方法显示出良好的相关性(
      • Zybailov B.
      • 科尔曼M.K.
      • Florens L.
      • Washburn M.P.
      稳定同位素标记肽离子谱图衍生自肽离子色谱图和谱数定量蛋白质组学分析的相对丰度比的相关性。
      )和前体峰面积强度测量(
      • 老为
      • Meyer-Arendt K.
      • Aveline-Wolf L.
      • 皮尔斯K.G.
      • 门多萨A.
      • 七夹J.R.
      • resing K.A.
      • ahn n.g.
      霰弹枪蛋白质组学定量人体蛋白质的无标记方法的比较。
      )。然而,其精度仅限于具有合理丰富的巨大差异和蛋白质。因此,应注意解释适度变化和稀缺蛋白质的定量(
      • SIMPER D.
      • Mayr U.
      • URBICH C.
      • Zampetaki A.
      • Prokopi M.
      • 迪兰罗斯A.
      • Saje A.
      • 穆勒M.
      • Bbow U.
      • 纽约A.C.
      • APWEILER R.
      • 拉赫曼S.
      • Dimmeler S.
      • 徐Q.
      • 梅尔米
      比较蛋白质组学分析揭示了平滑肌祖细胞在细胞外基质生产中的作用。
      )。在本研究中,我们分析了简化的亚甲蛋白,通过Western Blotting验证了九个细胞外蛋白,以确保我们的蛋白质组学发现的准确性。尽管有较少数量的临床标本,但仍有缺乏可靠的结论,观察到的健康和动脉瘤组织之间的变化是可靠的结论。因为目前通过血管内支架而不是开放修复干预治疗AAA,因此外科标本越来越罕见。另外,植物控制组织只能从主动脉的胸部部分获得。

       结论

      本研究是第一个采用基于溶解度的提取方法,通过蛋白质组学研究人体AAA中的ECM组成。我们的方法导致了鉴定病理组织重塑的新候选标记,并确定了AAA中的关键蛋白酶之一的MMP-12的新蛋白水解靶标。

      补充材料

      参考

        • alcorn h.g.
        • Wolfson Jr.,S.K.
        • Sutton-Tyrrell K.
        • kuller l.h.
        • o'Leary D.
        患有心血管健康研究中老年人腹主动脉瘤的危险因素。
        动脉段。血栓。 VASC。 BIOL。 1996; 16: 963-970
        • Baumgartner I.
        • Hirsch A.T.
        • Abola M.T.
        • Cacoub P.P.
        • Poldermans D.
        • STEG P.G.
        • Creacer M.A.
        • BHATT D.L.
        心血管风险和腹膜动脉瘤患者患者的患者患者患者患者患者:持续健康(REACH)登记处减少动脉粥样格管的数据。
        J Vasc Surg。 2008; 48: 808-814
        • Golledge J.
        • Tsao P.S.
        • Dalman R.L.
        • 诺曼P.E.
        腹主动脉瘤存在和进展的循环标记。
        循环。 2008; 118: 2382-2392
        • HELHENTHAL F.A.
        • 布鲁曼W.A.
        • Wodzig W.K.
        • Schurink G.W.
        AAA.进展的生物标志物。第1部分:细胞外基质变性。
        NAT Rev Cardiol。 2009; 6: 464-474
        • Shiraya S.
        • Miyake T.
        • Aoki M.
        • Yoshikazu F.
        • OHGI S.
        • Nishimura M.
        • ogihara t.
        • Morishita R.
        通过巨噬细胞迁移抑制阿托伐他汀对大鼠模型实验主动脉腹动脉瘤的抑制作用。
        动脉粥样硬化。 2009; 202: 34-40
        • 莎娜尔。
        炎症,金属蛋白酶和增加的蛋白水解:主动脉瘤中的新出现病理生理范式。
        循环。 1997; 96: 2115-2117
        • Shimizu K.
        • Shichiri M.
        • 利比P.
        • Lee R.T.
        • 米切尔r.n.
        Th2-主要炎症和IFN-Gamma信号传导诱导分析主动脉中的动脉瘤。
        J. Clin。投资。 2004; 114: 300-308
        • 廖米
        • 刘Z.
        • 宝J.
        • 赵Z.
        • 胡锦涛
        • 冯X.
        • 冯R.
        • 鲁Q.
        • 梅Z.
        • 刘Y.
        • 吴Q.
        • 荆Z.
        人胸主动脉分析中主动脉介质的蛋白质组学研究:氧化应激的含义。
        J. Thorac。 Cardiovasc。 Surg。 2008; 136 (72,E61-63。): 65-72
        • Pilop C.
        • angger f.
        • Gorman R.C.
        • Brunisholz R.
        • Gerrits B.
        • SchaffnerT.
        • GORMAN第3次,J.H.
        • Matyas G.
        • Carrel T.
        • 弗雷下午
        Marfan综合征患者主动脉培养基中的蛋白质组学分析显示出在主动脉瘤中的CALPAIN 2的活性增加。
        循环。 2009; 120: 983-991
        • 迪兰罗斯A.
        • 尹X.
        • Mandal K.
        • Baumert M.
        • Jahangiri M.
        • 梅尔米
        人体主动脉细胞外空间成分的蛋白质组学。
        摩尔。细胞蛋白质组学。 2010; 9: 2048-2062
        • 梅尔米
        • 张继夫
        • 绿色A.S.
        • Gutterman D.
        • Perloff J.
        • ping p.
        基于蛋白质组学的心血管疾病生物标志物的发展:机械,临床和治疗洞察。
        摩尔。细胞蛋白质组学。 2006; 5: 1853-1864
        • 艾森斯坦R.
        • Larsson S.E.
        • Kuettner K.E.
        • Sorgente N.
        • HASCAL V.C.
        动脉墙的地面物质。第1部分。糖胺聚糖的提取性及来自牛主动脉的蛋白多糖的分离性。
        动脉粥样硬化。 1975; 22: 1-17
        • Groves W.E.
        • 戴维斯Jr.,F.C.
        • 卖b.h.
        分光光度法测定没有核酸干扰的微克数量蛋白质。
        肛门。生物学习。 1968; 22: 195-210
        • 尹X.
        • Cuello F.
        • Mayr U.
        • 昊Z.
        • 犀牛M.
        • Ehler E.
        • Avkiran M.
        • 梅尔米
        心脏染发剂亚甲基蛋白质组学分析揭示了磷酸酶亚单元分布的动态改变。
        摩尔。细胞蛋白质组学。 2010; 9: 497-509
        • Waanders L.F.
        • Almeida R.
        • Prosser S.
        • Cox J.
        • Eikel D.
        • 艾伦米
        • Schultz G.A.
        一种新型色谱法允许蛋白质组的在线再分析。
        摩尔。细胞蛋白质组学。 2008; 7: 1452-1459
        • 凯勒阿。
        • nesvizhskii a.i.
        • Kolker E.
        • Aeberberold R.
        经验统计模型来估计MS / MS和数据库搜索的肽识别的准确性。
        肛门。化学。 2002; 74: 5383-5392
        • nesvizhskii a.i.
        • 凯勒阿。
        • Kolker E.
        • Aeberberold R.
        用串联质谱法鉴定蛋白质的统计模型。
        肛门。化学。 2003; 75: 4646-4658
        • 雷神米
        • Liefeld T.
        • 古怪J.
        • Lerner J.
        • Tamayo P.
        • Mesirov J.P.
        Genepattern 2.0。
        NAT。遗传。 2006; 38: 500-501
        • Mason r.m.
        • 梅雷斯r.w.
        用无机盐溶液提取软骨蛋白 - 多糖。
        生物学习。 j。 1973; 131: 535-540
        • 威尔逊R.
        • Diseberg A.F.
        • 戈登L.
        • Zivkovic S.
        • Tatarczuch L.
        • Mackie E.J.
        • Gorman J.J.
        • Bateman J.F.
        使用顺序提取和无标记定量蛋白质组学的软骨细胞外基质形成和成熟的综合性探讨。
        摩尔。细胞蛋白质组学。 2010; 9: 1296-1313
        • Karlsson K.
        • SandströmJ.
        • Edlund A.
        • Marklund S.L.
        组织中细胞外超氧化物歧化酶的转化酶。
        实验室。投资。 1994; 70: 705-710
        • Croce K.
        • 高H.
        • 王Y.
        • Mooroka T.
        • Sakuma M.
        • Shi C.
        • Sukhova G.K.
        • Packard R.R.
        • Hogg N.
        • 利比P.
        • 西蒙D.I.
        髓样相关的蛋白-8 / 14对于对血管损伤的生物反应至关重要。
        循环。 2009; 120: 427-436
        • 老为
        • Meyer-Arendt K.
        • Aveline-Wolf L.
        • 皮尔斯K.G.
        • 门多萨A.
        • 七夹J.R.
        • resing K.A.
        • ahn n.g.
        霰弹枪蛋白质组学定量人体蛋白质的无标记方法的比较。
        摩尔。细胞蛋白质组学。 2005; 4: 1487-1502
        • Curci J.A.
        • 廖S.
        • 霍夫曼M.D.
        • 夏皮罗S.D.
        • 汤普森R.W.
        巨噬细胞弹性蛋白酶(基质金属蛋白酶-12)在腹主动脉瘤中的表达与定位。
        J. Clin。投资。 1998; 102: 1900-1910
        • 诺克斯J.B.
        • Sukhova G.K.
        • Whittemore A.D.
        • 利比P.
        基质金属蛋白酶酶与人主动脉疾病中抑制剂之间改变的证据。
        循环。 1997; 95: 205-212
        • πr.
        • 李杰尔。
        • Shipley J.m.
        • Curci J.A.
        • 毛泽东
        • Ziporin S.J.
        • ennis t.l.
        • 夏皮罗S.D.
        • 高级下午
        • 汤普森R.W.
        基质金属蛋白酶-9(明胶酶B)的靶向基因破坏抑制了实验腹主动脉瘤的发育。
        J. Clin。投资。 2000; 105: 1641-1649
        • 纽曼西
        • ogata y.
        • 马龙上午
        • Irtizarry E.
        • 甘地r.h.
        • nagase H.
        • 蒂尔逊M.D.
        腹主动脉瘤中基质金属蛋白酶3(基质-1)和9(明胶酶B)的鉴定。
        动脉段。血栓。 1994; 14: 1315-1320
        • 傅J.Y.
        • Lyga A.
        • 施H.
        • 蓝色M.L.
        • 迪克森B.
        • 陈德。
        大鼠MMP-12的克隆,表达,纯化和表征。
        蛋白质expr。 purif。 2001; 21: 268-274
        • Layne M.D.
        • neidege w.o.
        • jain m.k.。
        • 然而S.F.
        • hsieh c.m.
        • 下巴。
        • Perrella M.A.
        • Blanar M.A.
        • Haber E.
        • 李米。
        在血管平滑肌细胞分化期间,主动脉羧肽酶样蛋白,一种具有盘状蛋白和羧肽酶样域的新蛋白质。
        J. Biol。化学。 1998; 273: 15654-15660
        • 梅尔米
        • Chung Y.L.
        • Mayr U.
        • 尹X.
        • LY L.
        • 特洛伊H.
        • 弗雷德里克斯S.
        • 胡Y.
        • Griffiths J.R.
        • 徐Q.
        来自载脂蛋白E缺乏小鼠的动脉粥样硬化血管的蛋白质组学和代谢组合揭示炎症,氧化应激和能量代谢的变化。
        动脉段。血栓。 VASC。 BIOL。 2005; 25: 2135-2142
        • TrächslinJ.
        • koch m.
        • 剧温米
        拉伸应力变化的胶原XII表达的快速又可逆调节。
        Exp。细胞res。 1999; 247: 320-328
        • 吉兰L.
        • Matei D.
        • Fishman D.A.
        • Gerbin C.S.
        • Karlan B.Y.
        • 张D.D.
        由上皮细胞卵巢癌分泌的骨蛋白是α(v)β(3)和α(v)β(5)整联蛋白的配体,并促进细胞活性。
        癌症res。 2002; 62: 5358-5364
        • 懒人N.
        • 格雷格D.
        • Vasudevan S.
        • Hassanain H.
        • goldschmidt-clermont p。
        • Kovacic H.
        血压素素2调节RAC1依赖性信号传导诱导的细胞增殖。
        摩尔。细胞。 BIOL。 2003; 23: 5401-5408
        • 梭勒S.L.
        • 邓莫尔斯。
        • 刘X.
        • 闪耀R.W.
        • Perrella M.A.
        • Layne M.D.
        主动脉羧肽酶样蛋白在纤维化的人肺中表达,并且其缺失可用于抗晶霉素诱导的肺纤维化。
        是。 J. Pathol。 2009; 174: 818-828
        • Valenick L.V.
        • HSIA H.C.
        • Schwarzbauer J.E.
        纤连蛋白片段化促进抗纤维蛋白 - 纤维蛋白临时基质的α4Beta1整合蛋白介导的收缩。
        Exp。细胞res。 2005; 309: 48-55
        • Satta J.
        • Soini Y.
        • Pöllänenr.
        • PääkkoP.
        • Juvonen T.
        塔斯卡林表达与腹主动脉瘤中的慢性炎症过程有关。
        J. VASC。 Surg。 1997; 26: 670-675
        • Theocharis A.D.
        • Tsolakis I.
        • Hjerpe A.
        • karamanos n.k.
        人体腹主动脉瘤的特征在于浓度下降,并且特异性下调对同种型V(0)。
        动脉粥样硬化。 2001; 154: 367-376
        • 梅罗斯J.
        • whitelock J.
        • 徐Q.
        • Ghosh P.
        腹主动脉瘤的发病机制:平滑肌细胞差异生产蛋白多糖的可能作用。
        J. VASC。 Surg。 1998; 28: 676-686
        • baas a.f.
        • 军医J.
        • van'tlot r.
        • de Vries J.P.
        • 范萨比克M.R.
        • verhoeven e.l.
        • 棉铃B.P.
        • Grobbee D.E.
        • Wijmenga C.
        • Blankensteijn J.D.
        • ruigrour y.m.
        颅内动脉瘤敏感性基因HspG2和CSPG2与腹主动脉瘤无关。
        血液学。 2010; 61: 238-242
        • 文森特T.
        • Hermansson M.
        • 博尔顿M.
        • 等待R.
        • Saklatvala J.
        基本FGF介导关节软骨响应机械损伤。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2002; 99: 8259-8264
        • Longo G.M.
        • 布达S.J.
        • Fiota N.
        • 熊W.
        • Giener T.
        • 夏皮罗S.
        • Baxter B.T.
        MMP.-12具有小鼠腹主动脉瘤的作用。
        手术。 2005; 137: 457-462
        • 王Y.
        • Ait-oufella H.
        • 草本o.
        • 靠背
        • Ramkhelawon B.
        • Taleb S.
        • 黄杰。
        • Offenstadt G.
        • CombadièreC.
        • RéniaL.
        • 约翰逊J.L.
        • tharaux p.l.
        • Tedgui A.
        • Mallat Z.
        TGF-β活性可防止血管紧张素II灌注小鼠的炎症主动脉瘤进展和并发症。
        J. Clin。投资。 2010; 120: 422-432
        • dejouvencel t.
        • Férond。
        • rossignol p.
        • Sapoval M.
        • Kauffmann C.
        • 暴情毒病灌注点
        • Michel J.B.
        • 结果 - arnaudin I.
        • Meilhac O.
        血红素7反映了腹主动脉瘤中的血红蛋白蛋白溶解。
        动脉段。血栓。 VASC。 BIOL。 2010; 30: 269-275
        • Sukhova G.K.
        • SchönbeckU.
        • rabkine。
        • Schoen F.J.
        • Poole A.R.
        • Billinghurst R.C.
        • 利比P.
        在脆弱的人类斑驳斑块中,间质胶原酶-1和-3增加了胶原溶解的证据。
        循环。 1999; 99: 2503-2509
        • 毛泽东
        • vanvickle s.j.
        • Curci J.A.
        • 汤普森R.W.
        基质金属蛋白酶酶的表达与人腹主动脉瘤中的表达。
        安。 VASC。 Surg。 1999; 13: 236-237
        • 刘H.
        • Sadygov R.G.
        • yates 3rd,J.R.
        霰弹枪蛋白质组学中相对蛋白质丰度的随机抽样与估算模型。
        肛门。化学。 2004; 76: 4193-4201
        • Zybailov B.
        • 科尔曼M.K.
        • Florens L.
        • Washburn M.P.
        稳定同位素标记肽离子谱图衍生自肽离子色谱图和谱数定量蛋白质组学分析的相对丰度比的相关性。
        肛门。化学。 2005; 77: 6218-6224
        • SIMPER D.
        • Mayr U.
        • URBICH C.
        • Zampetaki A.
        • Prokopi M.
        • 迪兰罗斯A.
        • Saje A.
        • 穆勒M.
        • Bbow U.
        • 纽约A.C.
        • APWEILER R.
        • 拉赫曼S.
        • Dimmeler S.
        • 徐Q.
        • 梅尔米
        比较蛋白质组学分析揭示了平滑肌祖细胞在细胞外基质生产中的作用。
        动脉段。血栓。 VASC。 BIOL。 2010; 30: 1325-1332