基于Ti(IV)的IMAC富集,增强推定嗜碱性激酶基材的鉴定

  • 侯江周
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    生物分子质谱和蛋白质组学组,博莫特大学生物分子研究和乌得勒支研究所博物会研究所,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰。

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  • Teck Y. Low.
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    生物分子质谱和蛋白质组学组,博莫特大学生物分子研究和乌得勒支研究所博物会研究所,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰。

    荷兰蛋白质组学中心,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰
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  • Marco L. Hennrich.
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    生物分子质谱和蛋白质组学组,博莫特大学生物分子研究和乌得勒支研究所博物会研究所,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰。

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  • Henk Van der Toorn
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    生物分子质谱和蛋白质组学组,博莫特大学生物分子研究和乌得勒支研究所博物会研究所,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰。

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  • Thomas Schwend.
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    生物分子质谱和蛋白质组学组,博莫特大学生物分子研究和乌得勒支研究所博物会研究所,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰。

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  • 汉菲祖
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    分析化学分离科学的CAS重点实验室,国家色谱r&中国科学院大连化学物理研究所中心,大连116023中国
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  • 沙巴兹穆罕默德
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    生物分子质谱和蛋白质组学组,博莫特大学生物分子研究和乌得勒支研究所博物会研究所,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰。

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  • Albert J.r. Heck.
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    生物分子质谱和蛋白质组学组,博莫特大学生物分子研究和乌得勒支研究所博物会研究所,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰。

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  • 作者脚注
    *这项工作得到了Prime-XS项目的支持,由欧洲联盟第7框架计划提供资金的Prime-XS项目,授予协议编号262067;荷兰蛋白质组学中心,嵌入荷兰基因组学倡议,以及生物医学遗传学中心;荷兰科学研究组织(NWO),VIDI补助金(700.10.429)。
    本文包含补充图。S1和表S1至S8。
    1使用的缩写是:SCXStrong阳离子交换色谱法4+-imacimmobilizium钛(IV)离子亲和力层析HFP1,1,1,3,3,3-六氟异丙胺丙烷HB2,5-二羟基苯甲酸呋喃替洛替腊疣用补充活化液动能碰撞诱导的解离分散蛋白诱导解离PRECEDPSM肽以谱匹配/ MSTRADEM质谱。
      金属和金属氧化物螯合磷酸肽富集技术提供 用于磷蛋白蛋白酶的深入分析的强大工具。一个弱点固有 目前的富集策略含有多个磷酸肽的结合差 基本残留物。当使用强阳离子交换(SCX)时,问题会加剧 对于预分馏,如低pH SCX条件下磷酸化肽 用大量胰蛋白酶消化的多种基本残留物洗脱,因此需要 更严格的丰富。在这里,我们报告了对特征的系统评估 基于低pH SCX组合的新型磷酸富集方法 and Ti4+-imobilized金属离子亲和层析(IMAC)一对一比较 完善的低pH值SCX-TIO2 富集方法。我们还检查了1,1,1,3,3,3,3,3-六氟异丙醇的效果 (HFP),三氟乙酸(TFA),或2,5-二羟基苯甲酸(DHB)在装载中 缓冲剂,因为它已经假设高水平的TFA和全氟化 溶剂HFP改善了含有多个碱性残基的磷酸肽的富集。 We found that Ti4+-imac与TFA组合在加载缓冲区中,优于所有其他方法 测试,使鉴定约为5000个独特的磷酸肽 来自400μg的Hela细胞裂解物消化的多个基本残留物。相比之下,〜2000 可以通过Ti鉴定独特的磷酸肽4+-imac与HFP和TIO接近30002。我们通过基序分析确认,基本磷酸肽丰富了 推定的嗜碱性激酶基材。此外,我们进行了实验 the SCX/Ti4+-Imac方法与使用碰撞诱导的解离(CID),更高 能量碰撞诱导解离(HCD)和电子转移解离 补充激活(ETD)在相当复杂的样本上,包括 总共400μg标记的三重二甲基标记的MCF-7消化。这个分析导致了 鉴定超过9,000个独特的磷酸化位点。使用三种肽 激活方法证实,ETD最能够测序乘以充电 肽。集体,我们的数据显示SCX和TI的组合4+-imac对具有多种碱性残基的磷酸肽特别有利。

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