深入定量心脏蛋白质组学将电子转移解离和金属胚肽酶Lys-N与硅酸鼠标合并

  • 阿尔杰斯斯普尔滕
    隶属关系
    生物分子质谱和蛋白质组学组,Bijvoet生物分子研究中心和乌得勒支大学制药科学研究所,Padualaan 8,3584Ch,Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,Padualaan 8,3584ch,荷兰乌得勒支
    搜索本作者的文章
  • 沙巴兹穆罕默德
    隶属关系
    生物分子质谱和蛋白质组学组,Bijvoet生物分子研究中心和乌得勒支大学制药科学研究所,Padualaan 8,3584Ch,Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,Padualaan 8,3584ch,荷兰乌得勒支
    搜索本作者的文章
  • Teck Y. Low.
    隶属关系
    生物分子质谱和蛋白质组学组,Bijvoet生物分子研究中心和乌得勒支大学制药科学研究所,Padualaan 8,3584Ch,Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,Padualaan 8,3584ch,荷兰乌得勒支
    搜索本作者的文章
  • Sara Zanivan.
    隶属关系
    德国MAX-PLANCK研究所,MAX-PLANCK-SICHINGS研究所,MARICERIED D-82152,Martinsried D-82152

    现任地址:Beatson癌症研究所(癌症研究英国),Garscube Estate,Switchback Road,Bearsden,Glasgow G61 1BD,英国
    搜索本作者的文章
  • Toon A.B.范维埃
    隶属关系
    医学生理系,心脏分工&肺部,大学医疗中心Utrecht,Yalelaan 50,3584厘米Utrecht,荷兰
    搜索本作者的文章
  • Bernard Delanghe.
    隶属关系
    Thermo Fisher Scientific(不来梅)GmbH,不来梅,德国
    搜索本作者的文章
  • Albert J.r. Heck.
    一致
    应如何解决谁:乌得勒支大学生物分子谱系和蛋白质组学集团,Padualaan 8,3584 Ch Utrecht,荷兰
    隶属关系
    生物分子质谱和蛋白质组学组,Bijvoet生物分子研究中心和乌得勒支大学制药科学研究所,Padualaan 8,3584Ch,Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,Padualaan 8,3584ch,荷兰乌得勒支
    搜索本作者的文章
  • 作者脚注
    *该研究是在CTMM的框架内进行的,转型分子医学中心(www.ctmm.nl.),项目循环细胞(授予01C-102),并由荷兰心脏基础(A.S.,A.J.R.H.)支持。嵌入式荷兰基因组学倡议的荷兰蛋白质组学中心被承认财务支持(A.J.R.H.,A...,S.M.)。乌得勒支大学的重点和马萨被承认进行财务支持(A.S.,T.A.v.)
    本文包含补充表S1和S2。
    1所用的缩写是:氨基酸在细胞培养物中氨基酸标记氨基酸标记FDRFALSE Discovery Railernational蛋白质指数液体Lys-Nlys-CendeNtrice酶Lys-Crfright VentricleScxstrong阳离子交换。
      在定量蛋白质组学中,稳定的同位素标记已经从培养的细胞朝向整个多细胞生物中的标记原子或氨基酸的总掺入。例如,最近介绍的13C6-Lysine标记的氧化硅胶鼠标允许准确比较蛋白质表达直接在组织中。在该模型中,只有赖氨酸,而不是精氨酸,残留物是同位素标记,因为后者可能会导致量化的并发症体内将精氨酸转化为脯氨酸。赖氨酸的唯一标记不鼓励使用胰蛋白酶,因为并非所有肽都将量化。因此,在初始工作中,Lys-C用于消化。在这里,我们证明赖氨酸定向蛋白酶金属膨胀酶Lys-N是优异的替代方案。由于赖氨酸定向肽通常产生更长且较高的带电肽,以及更传统的碰撞诱导的解离,我们在第一次使用细胞培养工作流中的氨基酸在定量稳定同位素标记中实施电子转移解离。通过研究小鼠心脏左侧和右心室之间的蛋白质表达的差异,突出了这两个互补方法的效用。使用Lys-N和电子转移解离产生覆盖率至3749个蛋白的深度,其与早期的研究相似,进入小鼠心脏蛋白质组。此外,该策略在单一强阳离子交换 - 液相色谱-SMS实验中产生了对〜2000蛋白蛋白的定量信息,并在单个强阳离子交换 - 液相色谱-SMS实验中覆盖了四种肽,揭示了左和右心室蛋白质蛋白质的定性和定量非常相似。
      将稳定同位素引入细胞具有显着高级的定量蛋白质组学(
      • Bantscheff M.
      • Schirle M.
      • 甜蜜曼G.
      • 瑞克J.
      • Kuster B.
      蛋白质组学中的定量质谱:批判性综述。
      ,
      • Heck A.J.
      • Krijgsveld J.
      基于质谱的基于质量的定量蛋白质组学。
      ,
      • ong s.e.
      基于质谱的蛋白质组学转变定量。
      )。该技术不能仅适用于培养中的细胞,而且仅适用于整个生物体(由Gouw审查) 等等。 (
      • gouw J.W.
      • Krijgsveld J.
      • Heck A.J.
      模型生物代谢标记的定量蛋白质组学。
      )))。这包括单细胞生物,例如 大肠杆菌 (
      • PASA-TOLIC L.
      • Jensen P.K.
      • 安德森G.A.
      • Lipton M.S.
      • 佩戴k.k.
      • 马提奈蒂科斯。
      • tolic n.
      • 布鲁斯J.E.
      • 史密斯r.d.
      高通量蛋白质组的蛋白质表达式使用质谱法测量。
      ) 和 Saccharomycis酿酒酵母 (
      • De Godoy L.M.
      • 奥尔森J.V.
      • de souza g.a.
      • 李G.
      • Mortensen P.
      质谱法分析完全蛋白质组分析的状态:硅胶标记为酵母作为模型系统。
      ),但也是更高阶的生物,如 果蝇黑胶基 (
      • Krijgsveld J.
      • Ketting R.F.
      • Mahmoudi T.
      • 约翰森J.
      • Artal-Sanz M.
      • Verrijzer C.P.
      • 普拉斯克R.H.
      • Heck A.J.
      C. elegans和D. melanogaster的代谢标记为定量蛋白质组学。
      ) 和 Caenorhabditis elegans. (
      • Krijgsveld J.
      • Ketting R.F.
      • Mahmoudi T.
      • 约翰森J.
      • Artal-Sanz M.
      • Verrijzer C.P.
      • 普拉斯克R.H.
      • Heck A.J.
      C. elegans和D. melanogaster的代谢标记为定量蛋白质组学。
      ,
      • 苏明。
      • 陈J.X.
      • Selbach M.
      氧化铝飞允许体内准确蛋白质定量。
      )。甚至哺乳动物的生物如老鼠(
      • 吴C.C.
      • maccoss m.j.
      • Howell K.E.
      • 马修D.E.
      • yates 3rd,J.R.
      具有稳定同位素的哺乳动物的代谢标记,用于定量蛋白质组学分析。
      )已经与蛋白质组学实验的稳定同位素进行了代谢标记。该曲目的最新延伸是稳定同位素标记与细胞培养中的氨基酸(Silac)
      使用的缩写是:
      萨拉克
      细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记
      ETD.
      电子转移解离
      FDR.
      假发现率
      IPI.
      国际蛋白质指数
      Lv.
      左心室
      Lys-N.
      金属膨胀酶酶Lys-n
      Lys-C.
      内皮蛋白酶Lys-C
      RV.
      右心室
      SCX.
      强阳离子交换。
      mouse (
      • KrügerM.
      • Moser M.
      • USSAR S.
      • Thievessen I.
      • Luber C.a.
      • Forner F.
      • 施密特S.
      • Zanivan S.
      • Fässlerr.
      用于定量蛋白质组学的氧化硅鼠揭开了Kindlin-3作为红细胞功能的必要因素。
      ),所有赖氨酸残留物被变型轴承六 13C-原子。没有双重标记的精氨酸和赖氨酸用于这种小鼠模型,以避免潜在的问题 体内 将精氨酸转化为脯氨酸(
      • 公园S.K.
      • Liao L.
      • Kim J.Y.
      • YALES 3RD。,J.R.
      校正定量蛋白质组学中的精氨酸 - 脯氨酸转化率的计算方法。
      ,
      • 范蹄D.
      • Pinkse M.W.
      • Oostwaard D.W.
      • 木乃伊C.L.
      • Heck A.J.
      • Krijgsveld J.
      基于硅酸硅酸盐的定量蛋白质组学精氨酸 - 脯氨酸转化伪影的实验校正。
      )。因此,为了定量所有消化的肽,硅胶鼠的分析有利于使用仅赖氨酸的定向蛋白酶。在硅胶小鼠的初始演示中,Lys-C用于蛋白质组学分析,但已经提出了与其他赖氨酸定向蛋白酶的延伸(
      • KrügerM.
      • Moser M.
      • USSAR S.
      • Thievessen I.
      • Luber C.a.
      • Forner F.
      • 施密特S.
      • Zanivan S.
      • Fässlerr.
      用于定量蛋白质组学的氧化硅鼠揭开了Kindlin-3作为红细胞功能的必要因素。
      )。我们以前探讨了另一种赖氨酸定向蛋白酶,Lys-N的用途,并在与胰蛋白酶和Lys-C相比(
      • Gauci S.
      • Helbig A.O.
      • Slijper M.
      • Krijgsveld J.
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      Lys-N.和胰蛋白酶在基于SCX的方法中以精制的SCX方法覆盖磷脂蛋白酶的互补部分。
      ,
      • Helbig A.O.
      • Gauci S.
      • raijmakers r.
      • van Breukelen B.
      • Slijper M.
      • 穆罕默德S.
      • Heck A.J.
      N-乙酰化蛋白末端的分析提供了对蛋白质组的N末端性质的深入洞察。
      )。此外,Lys-N也是使用电子转移解离(ETD)时测序的绝佳选择,因为肽使用仅通过C型离子产生简单的串联质谱(
      • taouatas n。
      • 博米姆。
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      使用Lys-N金属膨胀酶肽酶的肽的直接梯形序列。
      ),或者富裕的信息(
      • taouatas n。
      • Altelaar a.f.
      • 博米姆。
      • Helbig A.O.
      • 穆罕默德S.
      • Heck A.J.
      基于强的阳离子换碳的百分比肽的分馏促进了翻译后修饰的靶向分析。
      )。 ETD作为互补的肽片段化方法,特别是在更高的带电上表现良好(≥3+)肽(
      • 穆罕默德S.
      • Lorenzen K.
      • Kerkhoven R.
      • van Breukelen B.
      • Vannini A.
      • 克莱默P.
      • Heck A.J.
      酵母RNA聚合酶II和III的多路复用蛋白质组学映射允许接近完全的序列覆盖并揭示几个新的磷酸化位点。
      ,
      • Swaney D.L.
      • 温格C.D.
      • Coon J.J.
      使用多种蛋白酶对大规模质谱的蛋白质组学的价值。
      )。虽然ETD被证明对肽测序非常有能力,但直到现在没有注重无需在定量蛋白质组学工作流程中使用。
      心脏和其他肌肉类型,蛋白质谱难以调查,因为一种需要克服大动态的蛋白质表达。类似于血浆,心脏蛋白质组含有一小部分高丰富的肌肉蛋白质,其模糊较少丰富的蛋白质(
      • Aye T.T.
      • Spolten A.
      • taouatas n。
      • Varro A.
      • van veen t.a.
      • vos m.a.
      • Heck A.J.
      人体中的蛋白质组含蛋白质浓度。
      )。预测揭示心脏转录组在心脏组织中对〜9400蛋白的编码(
      • Jongeneel C.v.
      • Delorenzi M.
      • Iseli C.
      • 周D.
      • Haudenschild C.D.
      • Khrebtukova I.
      • Kuznetsov D.
      • 史蒂文森B.J.
      • Strausberg R.L.
      • SIMPSON A.J.
      • vasicek t.j.
      来自大规模平行签名测序(MPS)的人基因表达的图谱。
      )然而,最深入的蛋白质组学研究进入心脏蛋白质组的研究已经展示了大约一半的数量(表I.)大多数研究涵盖〜30%。因此,硅胶鼠标工具箱的延伸对于心脏蛋白质组学领域特别有趣。在这里,我们使用Lys-N和CID和ETD的组合呈现这样的延伸,以量化鼠标心脏的左(LV)和右(RV)心室之间的蛋白质组差异。我们涵盖了3749个独特的蛋白质,平均每种蛋白质(3-4个肽的中位数),表明我们的方法是硅胶小鼠工作流程的强力补充,以直接在小鼠组织中定量蛋白质表达。定量数据显示,LV和RV蛋白质部分之间的差异比预期更细微。
      表I.不同的心脏蛋白质组比较。使用定性和定量(氧化鼠标)工作流程,大规模蛋白质组的概述分析到小鼠和人组织的心脏蛋白质组中。如图所示,使用了不同的样品制剂:SCX + RP(肽的强阳离子交换分离,然后是在线反相LC-MS / MS),GELC-MS(SDS-PAGE分离蛋白质,然后凝胶消化和RP- LC-MS / MS),SAX(强阴离子交换),2D-GE(二维凝胶电泳,*描绘了凝胶斑的量,而不是肽鉴定的蛋白质的量),NA,不适用
      物种舱室鉴定了#蛋白质学习艺术方法蛋白酶乐器亚细胞分级参考,一年
      心室4906定性的SCX. + RP(Mudpit)胰蛋白酶线性离子阱(LTQ) +(4分数)(
      • 篮子N.
      • kislinger t.
      • Fong V.
      • Isserlin R.
      • Hewel J.A.
      • 埃米尔A.
      • Gramolini a.o.
      小鼠心脏蛋白质组的大规模特征及分析。
      ),2008年
      全心全意5736定性的SCX. + RP GELCMS IMAC胰蛋白酶LTQ-orbitrap.-(
      • Huttlin E.L.
      • Jedrychowski M.P.
      • eliasj.e.
      • Goswami T.
      • RAD R.
      • Beausoleil S.A.
      • VillénJ.
      • 哈斯W.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      小鼠蛋白磷酸化和表达的组织特异性地图。
      ),2010年
      全心全意2626定量老化(Silac老鼠)SAX + RP.Lys-C.LTQ-orbitrap.-(
      • Walther d.m.
      精确定量超过4,000只小鼠组织蛋白质揭示了在老化期间的最小蛋白质组变化。
      ),2008年
      心室3749定量LV / RV(Silac老鼠)SCX. + RP CID / ETDLys-N.LTQ-orbitrap-ETD-本研究,2011年
      人类左心室2663*定性的2D-GEN.A.N.A.-(
      • Westbrook J.A.
      • 惠勒J.X.
      • 等待R.
      • 威尔逊S.Y.
      • 邓恩米德。
      人体心脏蛋白质组:使用窄范围固定的pH梯度的二维图。
      ),2007年
      人类左心室3584定性的SCX. + RP.胰蛋白酶LTQ-orbitrap.-(
      • Aye T.T.
      • Spolten A.
      • taouatas n。
      • Varro A.
      • van veen t.a.
      • vos m.a.
      • Heck A.J.
      人体中的蛋白质组含蛋白质浓度。
      ),2010年
      GELC-MS.Lys-N.线性离子陷阱
      chymotrypsinLTQ-orbitrap-ETD

      实验步骤

       小鼠和心脏组织

      如前所述产生一只雌性,~1岁的硅酸鼠(
      • KrügerM.
      • Moser M.
      • USSAR S.
      • Thievessen I.
      • Luber C.a.
      • Forner F.
      • 施密特S.
      • Zanivan S.
      • Fässlerr.
      用于定量蛋白质组学的氧化硅鼠揭开了Kindlin-3作为红细胞功能的必要因素。
      )。两种匹配的雌性野生型小鼠(C57BL / 6)是从Harlan(Venray,荷兰)获得的。从硅胶鼠中,将心脏溶解掉,用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗并立即冷冻在液氮中并储存在-80℃直至使用。在裂解之前,小心地分离为整体(左心室(LV),右心室(RV)和隔膜)的心肌。对于野生型小鼠,处死动物并被隔离的心脏。在液氮中在-80℃下储存之前,将LV和RV与隔膜和Atria分离。动物实验是根据研究中的动物使用的制度指导进行进行的。

       样品制备

      从-80℃储存中取出组织样品并转移至液氮。随后,将冷冻组织粉碎于定制的预冷(液氮)钢砂浆中。苏打心肌溶于1ml裂解缓冲液(50米m 碳酸氢铵,8 m 尿素,完全小型蛋白酶EDTA自由抑制剂混合物(Roche,15mL缓冲液中的1片)和0.1%磷酸酶抑制剂混合物(Sigma))。野生型LV和RV分别占用500μL和250μL裂解缓冲液。在室温下以14,000rpm和4°C的桌面eppendorf离心机离心,将样品留在室温下5分钟。小心地收集上清液,并以相等的裂解缓冲液再次重悬了颗粒。旋转后,收集第二上清液,并将沉淀再悬浮在相等的体积中。超声处理用于提高蛋白质溶解度,第三个上清液与前两者合并。进行Bradford分析以建立蛋白质浓度。将样品等分并在-80℃下储存直至进一步使用。
      将野生型LV或RV与硅胶标记的心肌(各自250μg)混合。随后,用二硫代噻唑醇(DTT)降低混合裂解物(45米m,在50℃下15分钟)并用碘乙酰胺烷基化(110米m,15分钟,室温在黑暗中)。用金属丁基肽酶Lys-N消化(分离 Grifola Frondosa.,Seikagaku Corporation,东京,日本)在两个步骤中进行,4小时(W / W 1:85),在室温下再次过夜(W / W 1:100)。使用两个野生型小鼠和单一硅胶标记的小鼠作为内标进行分析两种生物重复,总共产生四个实验:LV1 / SILAC,RV1 / SILAC,LV2 / SILAC和RV2 / SILAC。

       强阳离子交换(SCX)的肽预选(
      • Gauci S.
      • Helbig A.O.
      • Slijper M.
      • Krijgsveld J.
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      Lys-N.和胰蛋白酶在基于SCX的方法中以精制的SCX方法覆盖磷脂蛋白酶的互补部分。
      ,
      • taouatas n。
      • Altelaar a.f.
      • 博米姆。
      • Helbig A.O.
      • 穆罕默德S.
      • Heck A.J.
      基于强的阳离子换碳的百分比肽的分馏促进了翻译后修饰的靶向分析。
      )

      使用Agilent 1100 HPLC系统将来自每种消化物(100μg总肽)的肽加载到两个C18盒上。使用水pH 2.7作为溶剂,施加的流速为100μl/ min。之后,用80%乙腈pH2.7从捕获筒中洗脱肽,以相同的流速将800×2.1mm柱(Polylc)中的多硫代乙基塔(Polylc)饱和10分钟。使用非线性65分钟梯度进行不同肽群的分离,0至10min 100%溶剂A(5米m KH24,30%乙腈,pH 2.7),10至15分钟,最多26%溶剂B(5米m KH24,30%乙腈,350米m KCl,pH 2.7),15至40分钟至35%溶剂B和40至45分钟至60%溶剂B.在49分钟时,溶剂B的浓度为100%。随后将该柱用高盐浓度洗涤6分钟,最后用100%溶剂A平衡9分钟。在SCX梯度期间施加的流速为200μL/ min。将级分以1分钟的间隔收集40分钟。在蒸发溶剂后,将分级肽重悬于10%甲酸中。

       质谱

      用于MS分析25-28 SCX分数,2+ 和 ∼5+ 选择并分析反相纳米LC耦合LTQ-orbitrap XL ETD(Thermo Fisher Scientific)。 Agilent 1200系列HPLC系统配备了20毫米Aqua C18(现象)捕获柱(内部包装,100μmid,5μm粒径)和400 mm Reprosil-pur 120 c10 c10-aq(Maisch GmbH博士)分析柱(内部包装,50μm,3μm粒径)。在5μL/ min溶剂C中进行诱捕(0.1 m 水中的乙酸)10分钟,梯度从10-30%(v / v)溶剂D(0.1 m 乙酸在4:1乙腈中:水)在110分钟内在溶剂C中,在30分钟内在溶剂C中的30至50%(v / v)溶剂D的梯度,然后梯度为50至100%( v / v)溶剂D在溶剂C中5分钟,最后100%溶剂d 2分钟。流速从0.35ml / min被动地分裂至50nl / min。使用远端涂覆的熔融二氧化硅发射器(360μmO.D.,20μm,10μm,10μm,10μm;新目的)实现纳米电喷雾。偏向1.7 kV。 LTQ-orbitrap ETD在数据相关模式下操作,自动在MS和MS / MS之间切换。调查全扫描MS光谱从M / Z 350到M / Z 1500获取,分辨率为60,000 m/z 在线性离子阱中累积到目标值500,000后的400。使用碰撞诱导的解离(CID)在线性离子阱中以30,000的靶值和电子转移解离(ETD)以50,000的额定活化(ETD)的静电解离(ETD),在线性离子捕集阈值下阈值分段。 ETD试剂靶值设定为100,000,反应时间为50ms。

       用蛋白质组发现者鉴定和定量

      将四种实验中的每一个(LV1 / SILAC,RV1 / SILAC,LV2 / SILAC和RV2 / SILAC)中的每一个的所有原始数据文件都进口到蛋白质组发现者V2.1.201(BETA-VIEWS)和组合峰值中。在数据库搜索之前,这四个实验中的每一个的列表都被分成CID和ETD数据。随后,针对国际蛋白质指数单独搜查CID和ETD峰值列表(IPI, http://www.ebi.ac.uk/ipi)包含小鼠序列和常见污染物如牛血清白蛋白和人角蛋白(IPI-小鼠V3.36; 51326序列; 23682061个残留物)通过直接连接到我们的内部吉祥物服务器(Mascot V2.2.04,Matrix Science,伦敦,英国)。使用以下设置:在半胱氨酸上的氨基甲酰化作为静态改性; 13C6甲硫氨酸氧化和氧化氧化剂作为可变修饰;在片段质量上为10ppm和0.5Da的前体大容差; 1允许错过乳沟。对于ETD-DATA处理前体,从MS中除去电荷降低的前体和从电荷降低的前体的窗口内的所有已知的中性损失2 光谱。酶被指定为Lys-n,并且根据搜索的片段离子光谱的类型,将片段离子型指定为电喷雾电离(ESI) - 陷阱或ETD-Trap。对于识别和定量,仅接受1%错误发现率(FDR)的得分限制的光谱,基于吉祥物得分阈值。这些是在每个数据集中独立计算的CID和ETD数据,使用蛋白质组发现者的内置FDR计算器,该数据集基于吉祥物的内置FDR计算。这 事件探测器前体离子量化 使用2ppm质量变异性和0.2分钟的保留时间耐受对前体离子对进行定量的蛋白质组发现的算法。定量基于在该特征的洗脱色谱峰之间的两个匹配同位素图案(一个特征)的总和区域的比率。使用相同数量的同位素计算肽比。蛋白质比率基于中值肽比。 LV / RV蛋白质比率基于在同一小鼠样品中观察LV / SILAC和RV / SILAC中的单一特征。夹杂物需要至少2个同位素峰,以及为每个数据集(LV1,RV1,LV2,RV2)的最小信号到3.对于每个数据集(LV1,RV1,LV2,RV2),通过中值比率朝向1.0校正比率。通过蛋白质组发现者在每只小鼠的水平下对蛋白质进行分组。使用Tableau软件包进一步分析来自蛋白质组发现者的肽和蛋白质清单( www.tableausoftware.com.),允许我们在独特的肽(序列+修饰的独特组合)和蛋白质水平之间互相关数据和序列+修饰的独特组合。 Spotfire(www.spotfire.tibco.com.)用于可视化。脚手架数据文件(www.proteomesoftware.com.)碎片谱在储存库支架中公开可用(//proteomecommons.org/)使用以下散列码:MWZCIQTGXAX + ZXVQP60FXFIASJCCUIPBIKUJZQX31PZTL94DEI4PIEBFN2J11BM / 2FJEE4W79MSMWZPAQ6GUHKHH5UMAAAAAAAADIA = =,密码:M8NNUK9YXJ9AAVQTZ1XN。

      结果

      与胰蛋白酶相比,赖氨酸定向蛋白酶的使用通常产生更长且潜在的更高的带电肽,导致我们研究ETD和Lys-N的潜在益处,进一步提高硅胶小鼠和其他基于氧化硅酸的适用性(Fig. 1A)。对此的说明,我们研究了孤立的小鼠LV和RV的差异蛋白质组。野生型LV和RV组织与源自全心脏(LV + RV +隔膜)单独混合 13C6-LYSINE标记氧化硅鼠组织(Fig. 1A)。在用Lys-N消化后,通过反相LC-MS / MS进行分析,使用SCX分离LV / SILAC和RV / SILAC样品。对每种选定的肽前体进行CID和ETD测序。所获取的蛋白质组学数据的概述显示在 表二补充表S1和S2.
      图缩略图GR1.
      Fig. 1使用的工作流程概述。 A,仔细解剖LV的蛋白质提取物(绿色)和RV(蓝色的)年龄和性别匹配野生型小鼠用全心混合1:1(一世。 E.。 LV,RV和隔膜) 13C6-Lysine Silac小鼠裂解物(红色的)用作内标。使用强阳离子交换(SCX)和LC-MS / MS分析在为串联MS选择的每个前体肽离子上施用CID和ETD,用Lys-N单独消化用Lys-N,用Lys-N单独消化用Lys-N。 B,鉴定的独特肽(黑色文本,独特的序列和修饰组合,为秩1,FDR 1%)和蛋白质(绿色斜体)在两只小鼠中(每只小鼠的2个实验,LV / SILAC和RV / SILAC)。 C,在整组实验中,CID和ETD的鉴定的独特肽(顶部)和蛋白质(底部)的总数。
      表二获取的蛋白质组学数据概述。每个SCX-LC-MS / MS实验呈现的定量数据的实验细节。在过滤到1%的错误发现率(FDR)之后,蛋白质和肽数基于包含的光谱。数字是冗余(R)或非还原(NR)
      Lv.-小鼠1 / SILACRV.-小鼠1 / SILACLv.-MOUSE 2 / SILACRV.-MOUSE 2 / SILAC
      分析的SCX分数数28252525
      MS / MS光谱335064269237524573453597
      FDR.吉祥物得分阈值CID23.824.426.927.6
      FDR.吉祥物得分阈值ETD23.623.923.725.7
      鉴定的光谱在1%fdr中(总共占总数的百分比)42975(13%)33944(13%)70354(13%)58716(13%)
      CID光谱(FDR1%)(R)24204186173348427338
      ETD.光谱(FDR1%)(R)18771153273687031378
      独特的肽(FDR 1%)(NR)14357114731494113754
      在所有4实验中鉴定的独特肽(R)28115
      独特的肽CID(FDR 1%)(NR)118399430102448758
      独特的肽ETD(FDR 1%)(NR)912876341163410680
      蛋白质确定2176182323242180
      在所有4实验中鉴定的蛋白质(NR)3749
      定量肽对(r)22849174003592830849
      定量蛋白(NR)1899161119711904
      所有4样品(NR)的定量蛋白3107
      平均(中位数)定量肽/蛋白质12 (3)11 (3)18 (4)16 (3)
      蛋白质在LV和RV中定量13031457
      在4个样品中的每一个中定量蛋白质906

       CID和ETD的互补性

      为了探讨ETD对氧化杀虫蛋白鉴定蛋白质的贡献,我们首先以定性评估数据。我们将每只鼠标(LV / SILAC + RV / SILAC)的数据组合在单鼠水平上评估CID和ETD的性能,从而导致鉴定11598和15607个独特的肽和2097和2594个独特的蛋白质之间,分别 ( Fig. 1B)。重复的鼠标2 / Silac实验产生了更多肽和蛋白质鉴定,其最有可能与稍微广泛的MS分析相关, IE。重复和最强烈的三倍体+ 和 2+ fractions were run (表二)。当两只小鼠的数据组合时(Fig. 1C),CID确定了20,966个对应于3174个蛋白的独特肽,而ETD递送了21,618个对应于3228蛋白的肽,加入3749个独特的蛋白质和28,115个独特的肽。在肽水平的CID和ETD之间的重叠是51%(14,469个肽),指示两种肽片段化技术的预期互补性。注意,数据相关的采集用于通过每个所选前体上的碎片技术进行排序事件。 ETD和CID的测序均产生〜25%(7149和6497肽)另外的独特肽(Fig. 1C)几乎1100个蛋白质被CID或ETD专门识别。 CID和ETD的性能也在肽电荷水平上评估,其显示出最近的文献预期的特征(
      • taouatas n。
      • Altelaar a.f.
      • 博米姆。
      • Helbig A.O.
      • 穆罕默德S.
      • Heck A.J.
      基于强的阳离子换碳的百分比肽的分馏促进了翻译后修饰的靶向分析。
      ,
      • Swaney D.L.
      • Mcalister G.C.
      • Coon J.J.
      霰弹枪蛋白质组学的决策树驱动串联质谱。
      ), IE。 ETD在更高的带电肽上表现更好,而CID占据了双重带电肽的占主导地位( 补充图。S1和补充结果)。如我们以前所示(
      • taouatas n。
      • 博米姆。
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      使用Lys-N金属膨胀酶肽酶的肽的直接梯形序列。
      )以定性的方法,使用Lys-N与ETD的使用进一步增强了2内的性能+ 通过产生C离子的肽分数,易于解释的串联MS-Spectra(补充图S2)。对CID和ETD之间的14469个常见鉴定的更深入分析显示ETD增加了大量更高的评分肽(补充图S3),还增加了我们整体分析中量化的蛋白质的量。

       定量数据分析

      接下来,我们通过与内部氧化铝小鼠完全的心室标准(LV + RV +隔膜)单独进行比较小鼠心脏LV和RV之间的氧化硅比量化(LV + RV +隔膜, Fig. 1A)。结果总结在 表二Fig. 2.
      图缩略图GR2.
      Fig. 2Lv.和RV蛋白质组的定量比较。 A,LV和RV实验中鉴定蛋白质的定性比较(两只小鼠)。 B,在Mouse1 + Silac中量化的蛋白质之间重叠(剩下)和mouse2 + silac(正确的)在整个实验(906蛋白)的四个运行中的每一个中量化的蛋白质。 C,观察到的蛋白质比率(RV / LV)的直方图显示出极少的蛋白质在单个实验中的LV和RV之间具有很大差异,以及小鼠1和小鼠2的组合906蛋白(另见 .
      Fig. 2A 描绘了在蛋白质水平的两种生物复制的总和求和之后的总蛋白质鉴定结果(其鉴定为3107的3749蛋白,在LV和RV之间〜60%重叠)。对于复杂蛋白质混合物的大规模分析,可以认为重叠水平典型。当以前大规模的大规模蛋白质组研究进入心脏时(表I.),我们的策略证实了Lys-N在定量蛋白质组学工作流程中的疗效(
      • Gauci S.
      • Helbig A.O.
      • Slijper M.
      • Krijgsveld J.
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      Lys-N.和胰蛋白酶在基于SCX的方法中以精制的SCX方法覆盖磷脂蛋白酶的互补部分。
      )。为了在单个小鼠中进行RV / LV定量,只能考虑在LV / SILAC和RV / SILAC分析中定量的蛋白质。我们发现小鼠1和2中发现1303(重叠59%)和1457蛋白(重叠60%)(Fig. 2B)。如果想要跨生物复制进行比较, IE。在所有四种分析中需要定量蛋白质,906个蛋白质留在数据集中。 Fig. 2C 揭示只有〜3%的蛋白质的RV / LV比率在双重或下变化外。如果比例对小鼠的平均值进行平均值,则显示出显着差异的蛋白质的数量降至低于1%。当在单个小鼠的结果更仔细观察时,显示在 补充图S4,数据始终显示,当硅酸/ rV比与硅酸/ LV比较比较时,野生型和硅酸鼠之间存在特异性差异。来自循环(血清,红细胞)的蛋白质在野生型样品中富集。由于在野生型和氧化硅样品之间观察到血液污染的预期变化。一种蛋白质在硅胶小鼠中更高度表达(烟酰胺核苷酸转氢酶, 右上)。当在此处呈现的内标在内标时,这些差异并不担心,因为特定的心室/氧化物比在LV和RV之间一致,因此在RV / LV比较中显示出不变。当检查数据的LV和RV之间的突出差异时,不能观察到具有较大差异的蛋白质(Fig. 3)。 Fig. 3A 显示在所有四个实验中针对每种蛋白质的量化肽对的量绘制的平均RV / LV比。用于平均比的相对标准偏差的颜色编码揭示了下部区域(较少量化的光谱)中的少数候选者在LV和RV之间具有潜在的差异,尽管具有约两倍的低比率。遵循这些蛋白质 Fig. 3B 表明只有五种蛋白质显示一致的比例,表明两只小鼠重复的显着变化。最终,数据表明LV和RV之间的差异非常微妙,并且LV和RV的蛋白质组在该深度水平上是相同的。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3Lv.和RV的详细定量比较。 A,来自两个小鼠的平均比例LV / RV绘制在定量肽对的量上仅显示在下端的LV和RV之间的边际差异。具有较大差异和许多光谱的蛋白质是由大型相对标准偏差(RSD)上的定量(红色数据点,颜色编码,参见图例)或血液成分污染的微小差异引起。 B与小鼠2比较小鼠1的定量结果显示出在不变的蛋白质中的高一致性,但是在LV和RV之间没有浓度差异的蛋白质(应散布 y = x 具有大的比例),除了一些突出的蛋白质,血压出素1和myotilin作为大多数突出的代表(两者在1.96 * SD高于1.96 * SD(标准偏差)中,两者和低RSD)。线代表通过平均比率±1.96标准偏差计算的95%置信区间。颜色在两个实验中代表LV / RV比上的相对标准偏差(RSD)(参见图例)。

      讨论

       工作流程

      ETD.的有益互补性在大规模定量蛋白质组学实验中完全被忽略了。在这里,我们首次展示ETD对识别件显着增加,但更重要的是也是定量数据。特别是在氧化渣鼠中,使用ETD证明是有价值的,因为所需的赖氨酸定向蛋白酶产生较长且更高的带电肽(
      • taouatas n。
      • Altelaar a.f.
      • 博米姆。
      • Helbig A.O.
      • 穆罕默德S.
      • Heck A.J.
      基于强的阳离子换碳的百分比肽的分馏促进了翻译后修饰的靶向分析。
      ,
      • Swaney D.L.
      • 温格C.D.
      • Coon J.J.
      使用多种蛋白酶对大规模质谱的蛋白质组学的价值。
      ,
      • 穆罕默德S.
      • HECK JR.,A.
      基于强阳离子交换(SCX)蛋白质翻译后修饰靶向分析的分析方法。
      )。我们所提出的方法也受益于使用Lys-N,我们证明了用于大规模定量霰弹枪蛋白质组学的合适蛋白酶。我们的目标不是在此处直接比较Lys-C和Lys-N,因为我们之前显示Lys-N可以在伴随胰蛋白酶和Lys-C伴随时产生大量的互补数据(
      • Gauci S.
      • Helbig A.O.
      • Slijper M.
      • Krijgsveld J.
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      Lys-N.和胰蛋白酶在基于SCX的方法中以精制的SCX方法覆盖磷脂蛋白酶的互补部分。
      )。这表明在一项研究中使用Lys-C和Lys-N作为这种工作流程的另一个潜在有趣的扩展。此外,Lys-N的ETD成功率为2+ 与Lys-C或胰蛋白酶相比增加肽(补充图S2)(
      • taouatas n。
      • 博米姆。
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      使用Lys-N金属膨胀酶肽酶的肽的直接梯形序列。
      )。这可能证明在进行定量磷蛋白蛋白酶的现场注释(
      • taouatas n。
      • Altelaar a.f.
      • 博米姆。
      • Helbig A.O.
      • 穆罕默德S.
      • Heck A.J.
      基于强的阳离子换碳的百分比肽的分馏促进了翻译后修饰的靶向分析。
      )。通过使用HCD可以实现进一步的膨胀,或者基于决策树的分析,其结合了多种碎片化技术,这些分段在最近证明的可能最适合的物种上(
      • 弗雷泽C.K.
      • Altelaar a.f.
      • Hennrich M.L.
      • 挖掘D.
      • Zeller M.
      • Griep-raming J.
      • Heck A.J.
      • 穆罕默德S.
      使用CID,HCD和ETD在LTQ-orbitrap Velos上改善靶向碎片的肽鉴定。
      )。

       Lv.与RV.

      卧室都具有非常不同的功能,薄壁的RV将血液引导氧气朝向肺部。 LV自由墙更厚,因为它必须实现更高的压力以维持到身体其余部分的血液流动。通常,大多数研究进入心脏病的焦点对劣化的LV。虽然长时间低估了,但最近的研究一直在展示RV功能障碍在各种获得和先天性心脏功能障碍的预后和结果中的重要作用(
      • Sheehan F.
      • 德林顿A.
      右心室:解剖学,生理学和临床影像。
      )。有趣的是,存在几种不对称的病理学,其中两个心室中的一种更受影响。因此,调查生理条件下的LV和RV如何对理解这些病理学的基础至关重要。到目前为止,蛋白质组学已被用于定性地应对几种心脏的(磷)蛋白质组(表I.)。然而,为了在分子水平上完全理解心脏功能,需要用相同或甚至更高的细节来研究心脏的不同部分之间的相互作用。为了启动这项努力,我们通过映射LV和RV蛋白质部分之间的差异来开始。 LV和RV之间的生理差异归因于差分解剖学。虽然统一和生理学上非常不同,但令人惊讶的是,令人惊讶的是,两种脑室主要由相同的细胞类型组成,心肌细胞代表最大的质量(〜80%)(
      • 雷丁顿A.N.
      • 骑士B.
      • oldershaw p.j.
      • ShineBourne E.A.
      • Rigby M.L.
      在Fontan操作前左心室左心室左心室:与tricuspid atresia比较。
      )。 LV和RV的可比较细胞组成表明,差异源于这些细胞内的分子和调节水平。尽管只检查了两只小鼠,但可以得出结论,LV和RV之间的蛋白质组差异非常微妙(IE。不到1%的蛋白质组揭示了一致的差异,这些差异相对较小(最佳〜倍))。通过该策略的更多小鼠的分析可以对LV和RV蛋白质群中存在的较小差异提供更多的置信度,但是所有分析中的量化蛋白质的量将降至其在此报告的906进一步下降,以及在分析时间方面的投资可能会产生不保证这种方法。
      Lv.和RV之间的有限差异可能是一个令人惊讶的是,也在研究小鼠心脏老龄化的研究一般,据报道,观察到的总体差异非常微妙(
      • Walther d.m.
      精确定量超过4,000只小鼠组织蛋白质揭示了在老化期间的最小蛋白质组变化。
      )。我们不能排除LV和RV蛋白质蛋白的差异确实存在,例如用于低丰富的蛋白质或在翻译后修饰水平。后一种假设通过MRNA水平的小规模研究强调(
      • Kaufman B.D.
      • Desai M.
      • 雷迪S.
      • Osorio J.C.
      • 陈准。
      • 莫斯卡R.S.
      • Ferrante A.W.
      • 生命科学研究
      先天性心脏病中左右心室肥厚的基因组分析。
      )。

      结论

      在这里,我们提出了一套强大的蛋白质组学工具,这些工具将目前使用的硅胶鼠标工作流程与ETD碎片和蛋白酶Lys-N一起补充。首次,ETD在定量大规模蛋白质组学分析中实现。使用这种增强策略提供了额外的和改善的肽和蛋白质标识,因此提供了重要的额外定量信息。该技术的应用揭示了鼠标的左右心室在核心蛋白质组中具有可忽略的差异。虽然这份手稿是新闻界的,但对兔心的左右心室的比较蛋白质组研究显示了类似的结果(
      • 菲利普斯D.
      • Aponte上午
      • Covian R.
      • Neufeld E.
      • yu z.x.
      • Balaban R.S.
      )。

      致谢

      Matthias Mann恳请提供硅胶鼠标材料并批判地阅读稿件。

      补充材料

      参考

        • Bantscheff M.
        • Schirle M.
        • 甜蜜曼G.
        • 瑞克J.
        • Kuster B.
        蛋白质组学中的定量质谱:批判性综述。
        肛门。生物丹纳尔。化学。 2007; 389: 1017-1031
        • Heck A.J.
        • Krijgsveld J.
        基于质谱的基于质量的定量蛋白质组学。
        专家Rev.蛋白质组学。 2004; 1: 317-326
        • ong s.e.
        基于质谱的蛋白质组学转变定量。
        NAT。化学。 BIOL。 2005; 1: 252-262
        • gouw J.W.
        • Krijgsveld J.
        • Heck A.J.
        模型生物代谢标记的定量蛋白质组学。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2010; 9: 11-24
        • PASA-TOLIC L.
        • Jensen P.K.
        • 安德森G.A.
        • Lipton M.S.
        • 佩戴k.k.
        • 马提奈蒂科斯。
        • tolic n.
        • 布鲁斯J.E.
        • 史密斯r.d.
        高通量蛋白质组的蛋白质表达式使用质谱法测量。
        J.IM。化学。 SOC。 1999; 121: 7949-7950
        • De Godoy L.M.
        • 奥尔森J.V.
        • de souza g.a.
        • 李G.
        • Mortensen P.
        质谱法分析完全蛋白质组分析的状态:硅胶标记为酵母作为模型系统。
        基因组Biol。 2006; 7: R50
        • Krijgsveld J.
        • Ketting R.F.
        • Mahmoudi T.
        • 约翰森J.
        • Artal-Sanz M.
        • Verrijzer C.P.
        • 普拉斯克R.H.
        • Heck A.J.
        C. elegans和D. melanogaster的代谢标记为定量蛋白质组学。
        NAT。 Biotechnol。 2003; 21: 927-931
        • 苏明。
        • 陈J.X.
        • Selbach M.
        氧化铝飞允许体内准确蛋白质定量。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2010; 9: 2173-2183
        • 吴C.C.
        • maccoss m.j.
        • Howell K.E.
        • 马修D.E.
        • yates 3rd,J.R.
        具有稳定同位素的哺乳动物的代谢标记,用于定量蛋白质组学分析。
        肛门。化学。 2004; 76: 4951-4959
        • KrügerM.
        • Moser M.
        • USSAR S.
        • Thievessen I.
        • Luber C.a.
        • Forner F.
        • 施密特S.
        • Zanivan S.
        • Fässlerr.
        用于定量蛋白质组学的氧化硅鼠揭开了Kindlin-3作为红细胞功能的必要因素。
        细胞。 2008; 134: 353-364
        • 公园S.K.
        • Liao L.
        • Kim J.Y.
        • YALES 3RD。,J.R.
        校正定量蛋白质组学中的精氨酸 - 脯氨酸转化率的计算方法。
        NAT。方法。 2009; 6: 184-185
        • 范蹄D.
        • Pinkse M.W.
        • Oostwaard D.W.
        • 木乃伊C.L.
        • Heck A.J.
        • Krijgsveld J.
        基于硅酸硅酸盐的定量蛋白质组学精氨酸 - 脯氨酸转化伪影的实验校正。
        NAT。方法。 2007; 4: 677-678
        • Gauci S.
        • Helbig A.O.
        • Slijper M.
        • Krijgsveld J.
        • Heck A.J.
        • 穆罕默德S.
        Lys-N.和胰蛋白酶在基于SCX的方法中以精制的SCX方法覆盖磷脂蛋白酶的互补部分。
        肛门。化学。 2009; 81: 4493-4501
        • Helbig A.O.
        • Gauci S.
        • raijmakers r.
        • van Breukelen B.
        • Slijper M.
        • 穆罕默德S.
        • Heck A.J.
        N-乙酰化蛋白末端的分析提供了对蛋白质组的N末端性质的深入洞察。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2010; 9: 928-939
        • taouatas n。
        • 博米姆。
        • Heck A.J.
        • 穆罕默德S.
        使用Lys-N金属膨胀酶肽酶的肽的直接梯形序列。
        NAT。方法。 2008; 5: 405-407
        • taouatas n。
        • Altelaar a.f.
        • 博米姆。
        • Helbig A.O.
        • 穆罕默德S.
        • Heck A.J.
        基于强的阳离子换碳的百分比肽的分馏促进了翻译后修饰的靶向分析。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2009; 8: 190-200
        • 穆罕默德S.
        • Lorenzen K.
        • Kerkhoven R.
        • van Breukelen B.
        • Vannini A.
        • 克莱默P.
        • Heck A.J.
        酵母RNA聚合酶II和III的多路复用蛋白质组学映射允许接近完全的序列覆盖并揭示几个新的磷酸化位点。
        肛门。化学。 2008; 80: 3584-3592
        • Swaney D.L.
        • 温格C.D.
        • Coon J.J.
        使用多种蛋白酶对大规模质谱的蛋白质组学的价值。
        J.蛋白质组。 2010; 9: 1323-1329
        • Aye T.T.
        • Spolten A.
        • taouatas n。
        • Varro A.
        • van veen t.a.
        • vos m.a.
        • Heck A.J.
        人体中的蛋白质组含蛋白质浓度。
        摩尔。 Biosyst。 2010; 6: 1917-1927
        • Jongeneel C.v.
        • Delorenzi M.
        • Iseli C.
        • 周D.
        • Haudenschild C.D.
        • Khrebtukova I.
        • Kuznetsov D.
        • 史蒂文森B.J.
        • Strausberg R.L.
        • SIMPSON A.J.
        • vasicek t.j.
        来自大规模平行签名测序(MPS)的人基因表达的图谱。
        Genome Res。 2005; 15: 1007-1014
        • 篮子N.
        • kislinger t.
        • Fong V.
        • Isserlin R.
        • Hewel J.A.
        • 埃米尔A.
        • Gramolini a.o.
        小鼠心脏蛋白质组的大规模特征及分析。
        J.蛋白质组。 2009; 8: 1887-1901
        • Huttlin E.L.
        • Jedrychowski M.P.
        • eliasj.e.
        • Goswami T.
        • RAD R.
        • Beausoleil S.A.
        • VillénJ.
        • 哈斯W.
        • Sowa M.E.
        • Gygi S.P.
        小鼠蛋白磷酸化和表达的组织特异性地图。
        细胞。 2010; 143: 1174-1189
        • Walther d.m.
        精确定量超过4,000只小鼠组织蛋白质揭示了在老化期间的最小蛋白质组变化。
        摩尔。细胞蛋白质组学。 2011; 10 (2月; M110.004523)
        • Westbrook J.A.
        • 惠勒J.X.
        • 等待R.
        • 威尔逊S.Y.
        • 邓恩米德。
        人体心脏蛋白质组:使用窄范围固定的pH梯度的二维图。
        电泳。 2006; 27: 1547-1555
        • Swaney D.L.
        • Mcalister G.C.
        • Coon J.J.
        霰弹枪蛋白质组学的决策树驱动串联质谱。
        NAT。方法。 2008; 5: 959-964
        • 穆罕默德S.
        • HECK JR.,A.
        基于强阳离子交换(SCX)蛋白质翻译后修饰靶向分析的分析方法。
        目前意见Biotechnol 2011年2月 2011; 22: 9-16
        • 弗雷泽C.K.
        • Altelaar a.f.
        • Hennrich M.L.
        • 挖掘D.
        • Zeller M.
        • Griep-raming J.
        • Heck A.J.
        • 穆罕默德S.
        使用CID,HCD和ETD在LTQ-orbitrap Velos上改善靶向碎片的肽鉴定。
        J.蛋白质组。 2011; 10: 2377-2388
        • Sheehan F.
        • 德林顿A.
        右心室:解剖学,生理学和临床影像。
        心。 2008; 94: 1510-1515
        • 雷丁顿A.N.
        • 骑士B.
        • oldershaw p.j.
        • ShineBourne E.A.
        • Rigby M.L.
        在Fontan操作前左心室左心室左心室:与tricuspid atresia比较。
        布尔。心J. 1988; 60: 324-331
        • Kaufman B.D.
        • Desai M.
        • 雷迪S.
        • Osorio J.C.
        • 陈准。
        • 莫斯卡R.S.
        • Ferrante A.W.
        • 生命科学研究
        先天性心脏病中左右心室肥厚的基因组分析。
        J.卡。失败。 2008; 14: 760-767
        • 菲利普斯D.
        • Aponte上午
        • Covian R.
        • Neufeld E.
        • yu z.x.
        • Balaban R.S.
        physiol基因组学。 2011年8月30日; ([epub前面打印] pmid:21878611)