神经变性诱导的显微胶质激活

      被微胶质激活介导的神经炎炎症似乎在帕金森病的发病机制中起重要作用;然而,未充分理解微胶质细胞的机制。因此,我们首先评估了两种帕金森毒物,锰乙烯双硫代氨基甲酰胺(MN-EBDC)和1-甲基-4-苯基吡啶的影响(MPP+),关于小细胞培养系统中的小胶质加热以及相关的多巴胺能(Danergic)神经毒性。结果证明,当大鼠初级患神神经元或神经元微胶质细胞混合培养物在2-8μm时用Mn-EBDC处理时m or MPP+ at 0.25–5 μm分别持续7天,毒物两种毒物都能够通过继发于晚期神经变性的机制诱导果冻神经变性以及激活微胶质细胞。此外,活化的微胶质胶质随后增强了Mn-EBDC或MPP诱导的晚期性神经毒性+。详细的神经元微胶质细胞相互作用鉴定了衍生自含有Mn-EBDC或MPP处理的后加理细胞系的条件培养基的分数+那种易激活的小胶质细胞。为了进一步定义导致神经变性的微胶质激活的潜在介质,我们利用了定量蛋白质组学技术称为氧化硅酸(用于通过细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记)以比较MPP的蛋白质谱+ - 与对照相比,介导的微胶质活化的细胞级分。该搜索揭示了许多新型蛋白质,其在神经变性介导的微胶质激活中可能具有重要意义,该过程认为在帕金森病进展中至关重要。
      MICRIGLIA,中枢神经系统的常驻免疫细胞,已被表明在许多神经变性障碍中起始和/或加重中的核心作用,包括帕金森病(PD)
      使用的缩写是:Pd,帕金森病;达,多巴胺; Danergic,多巴胺能; DAPI,4',6-二氨基-2-苯基吲哚; GABA,γ-氨基丁酸; GFAP,胶质纤维酸性蛋白质;红外,免疫反应; MES,中脑神经元细胞系MES 23.5; Mn-EBDC,锰乙烯双偶氮酸盐; MPP.+,1-甲基-4-苯基吡啶; MPTP,1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶; Neun,神经元特异性核蛋白质; p2,前列腺素E.2;硅酸盐,细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记; Th,酪氨酸羟化酶; UPS,泛素蛋白酶体系统。
      1使用的缩写是:Pd,帕金森病;达,多巴胺; Danergic,多巴胺能; DAPI,4',6-二氨基-2-苯基吲哚; GABA,γ-氨基丁酸; GFAP,胶质纤维酸性蛋白质;红外,免疫反应; MES,中脑神经元细胞系MES 23.5; Mn-EBDC,锰乙烯双偶氮酸盐; MPP.+,1-甲基-4-苯基吡啶; MPTP,1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶; Neun,神经元特异性核蛋白质; p2,前列腺素E.2;硅酸盐,细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记; Th,酪氨酸羟化酶; UPS,泛素蛋白酶体系统。
      (
      • 刘B.
      • 洪J.s.
      小胶鸡在炎症介导的神经变性疾病中的作用:治疗干预的机制与策略。
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      • Mcgeer P.L.
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      神经退行性疾病中的胶质细胞反应:病理生理学和治疗干预措施。
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      帕金森病的炎症综述。
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      • 刘B.
      • 洪J.s.
      帕金森病和暴露于传染病和杀虫剂以及脑损伤的发生:神经引发的作用。
      )。然而,仍然确定Pd和其他神经变性疾病中的微胶质激活是什么。
      通常接受微胶质细胞可以通过微生物产品直接激活(
      • Bronstein d.m.
      • Perez-Otano I.
      • 太阳五。
      • Mullis Sawin S.B.
      • Chan J.
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      • 哈德森下午
      • 孔L.Y.
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      胶林依赖性神经毒性和中脑血症培养中的神经保护作用。
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      • 江j。
      • 威尔逊B.
      • 张W.
      • 洪J.s.
      • 刘B.
      小胶质激活介导的大鼠二硫代多巴胺能神经元的延迟和进行性退化:与帕金森病的相关性。
      ),环境毒物(
      • 洪J.s.
      • 张W.
      • 刘B.
      旋转龙诱导的多巴胺能神经元的微胶质胶质细胞的不同作用。
      )和蛋白质聚集物如淀粉样蛋白β聚集体(
      • 秦立
      • 刘Y.
      • 库珀C.
      • 刘B.
      • 威尔逊B.
      • 洪J.s.
      • 威尔逊B.C.
      • 一个L.
      通过产生活性氧物质,微胶质细胞增强皮质和脑脑神经元中的β-淀粉样蛋白肽诱导的毒性。
      )或在诱导神经变性后间接(
      • Cicchetti F.
      • Brownell A.L.
      • 威廉姆斯K.
      • 陈y.i.
      • Livni E.
      • Isacson O.
      在免疫组织化学和宠物成像监测大鼠的逐步6-OHDA多巴胺变性期间Nigrostriatal途径的神经炎症。
      )。 Carvey. 等等。 (
      • Carvey下午
      • 张问:
      • Lipton J.W.
      • 凌Z.
      产前暴露于嗜血虫脂多糖导致后代多巴胺神经元的长期损失:潜在的帕金森病的新模式。
      )已经证明,在早期生命期间暴露于脂多糖,细菌壁的主要成分可以构成导致多巴胺能(DARIGIC)细胞死亡和随后的PD发育的潜在机制。另一方面,由洪领导的研究组提出,帕金森毒剂可分为三大类关于小胶质激活和晚期神经变性的主要类别:1)激活微胶质的那些直接诱导神经毒性,2)活化微毒性的那些。损坏神经元,3)激活微胶质细胞的那些,并同时引起神经变性(
      • 刘B.
      • 洪J.s.
      小胶鸡在炎症介导的神经变性疾病中的作用:治疗干预的机制与策略。
      )。这些毒物的相应原型是脂多糖,1-甲基-4-苯基吡啶(MPP +),分别为1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)和旋转龙的活性代谢物(
      • 刘B.
      • 洪J.s.
      小胶鸡在炎症介导的神经变性疾病中的作用:治疗干预的机制与策略。
      )。
      与PD发育有关的其他环保毒物包括百草枯和乙烯二碳酸二碳酸酯(MN-EBDC)(
      • Ferraz H.B.
      • Bertolucci P.H.
      • Pereira J.s.
      • Lima J.G.
      • 和 rade l.a.
      慢性接触杀菌剂Manebab可能会产生CNS锰中毒的症状和迹象。
      ,
      • Meco G.
      • Bonifati V.
      • 瓦卡尔N.
      • Fabrizio E.
      慢性暴露于杀真菌剂(锰乙烯 - 双二硫酸酯)后帕金森。
      ,
      • Thiruchelvam M.
      • 布罗克尔B.J.
      • 里奇菲尔德e.k.
      • 袋子R.B.
      • cory-slechta d.a.
      组合百草枯和MANEB在尼替代多巴胺系统中的增强和优先效应:帕金森病的环境风险因素?
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      • 张继夫
      • Fitsanakis V.
      • 顾G.
      • 静D.
      • AO M.
      • Amarnath V.
      • 蒙丁T.
      大鼠中乙烯 - 双二硫代氨基甲酸和选择性多巴胺能神经变性:通过线粒体功能障碍的联系。
      )。包括美国在内的几个群体证明了Mn-EBDC诱导选择性晚期神经变性 体内体外。此外,发病机制似乎涉及线粒体和蛋白酶体功能障碍,氧化应激增加(
      • Ferraz H.B.
      • Bertolucci P.H.
      • Pereira J.s.
      • Lima J.G.
      • 和 rade l.a.
      慢性接触杀菌剂Manebab可能会产生CNS锰中毒的症状和迹象。
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      • Meco G.
      • Bonifati V.
      • 瓦卡尔N.
      • Fabrizio E.
      慢性暴露于杀真菌剂(锰乙烯 - 双二硫酸酯)后帕金森。
      ,
      • 张继夫
      • Fitsanakis V.
      • 顾G.
      • 静D.
      • AO M.
      • Amarnath V.
      • 蒙丁T.
      大鼠中乙烯 - 双二硫代氨基甲酸和选择性多巴胺能神经变性:通过线粒体功能障碍的联系。
      ,
      • 周Y.
      • 谢芬斯。
      • Piccardo P.
      • 蒙丁T.J.
      • 张继夫
      乙烯 - 双二硫代氨基甲酸盐诱导的蛋白酶体抑制:与帕金森病的相关性。
      )。然而,目前尚不清楚,无论是Mn-EBDC,广泛使用的杀菌剂的活性成分(
      • Ferraz H.B.
      • Bertolucci P.H.
      • Pereira J.s.
      • Lima J.G.
      • 和 rade l.a.
      慢性接触杀菌剂Manebab可能会产生CNS锰中毒的症状和迹象。
      ,
      • Meco G.
      • Bonifati V.
      • 瓦卡尔N.
      • Fabrizio E.
      慢性暴露于杀真菌剂(锰乙烯 - 双二硫酸酯)后帕金森。
      ),可以通过微胶质激活产生晚期神经毒性。
      仍有待研究的其他主要问题是Daneric神经变性的机制,无论病因如何激活小胶质细胞,从而导致进行性神经变性和疾病进展。在最近的一项研究中,我们已经证明,聚集的α-突触核蛋白通过涉及MicroGlia的聚集α-突触核蛋白的吞噬作用(
      • 张W.
      • 王T.
      • PEI Z.
      • 孟Y.
      • 吴X.
      • 贝琳达W.
      • 洪J.
      • 张继夫
      α-突触核蛋白激活微胶质细胞:一种导致帕金森病中疾病进展的过程。
      )。这种观察结果与聚集淀粉样蛋白β引起的更有效(
      • 秦立
      • 刘Y.
      • 库珀C.
      • 刘B.
      • 威尔逊B.
      • 洪J.s.
      • 威尔逊B.C.
      • 一个L.
      通过产生活性氧物质,微胶质细胞增强皮质和脑脑神经元中的β-淀粉样蛋白肽诱导的毒性。
      )。可能导致PD中神经变性后的微胶质激活的第二个潜在罪魁祸首是从受损神经元(
      • Wilms H.
      • 罗森斯蒂尔P.
      • Sievers J.
      • Deuschl G.
      • Zecca L.
      • Lucius R.
      人类神经胶酶的激活是NF-κB依赖性的,涉及P38丝裂原激活的蛋白激酶:对帕金森病的影响。
      )但直接的尾注注射人类神经蛋白蛋白在大鼠中未能产生这种影响(
      • Aimi Y.
      • Mcgeer P.L.
      缺乏人类神经元蛋白对大鼠脑多巴胺能神经元的毒性。
      )。微胶质激活的其他潜在内源性介质包括组织型纤溶酶原激活剂和基质金属蛋白酶(
      • Cuzner M.L.
      • g
      • 股线C.
      • loughlin a.j.
      • Paemen L.
      • Opdenakker G.
      • Newcombe J.
      多发性硬化中枢神经系统中组织型纤溶酶原激活剂,基质金属蛋白酶和内源抑制剂的表达:病变进化中阶段的比较。
      ),尽管PD中的角色在很大程度上是未开发的。
      因此,在目前的研究中,通过各种定义的培养系统,我们试图解决两个问题:1)帕金森毒药MN-EBDC介导的后果神经变性还涉及小胶质激活和2)介导神经变性介导的微胶质活化的潜在机制是什么。

      实验步骤

       原发性神经元富集和小胶囊培养 -

      所有与动物有关的实验是符合华盛顿大学机构动物护理和使用委员会批准的议定书。
      通过遵循先前公布的方案,制备原发性大鼠腹部患神血清富集培养物(
      • 张W.
      • 王T.
      • PEI Z.
      • 孟Y.
      • 吴X.
      • 贝琳达W.
      • 洪J.
      • 张继夫
      α-突触核蛋白激活微胶质细胞:一种导致帕金森病中疾病进展的过程。
      )。从胚胎第13/14天(Charles River,Wilmington,MA)中,将腹部患神组织短暂解剖,然后用木瓜(15个单位/ ml,Worthington Biochemical Corp.,Lakewood,NJ)治疗。通过移液机械研磨后,将细胞接种至24孔(5×105/孔)培养板预先用 - d-Lysine(20ng / ml)和层粘连蛋白(协作生物医学产品,Bedford,MA)并保持在0.5ml /孔的神经缺卵培养基(Invitrogen),补充有1%B27,4米m l - 谷氨酰胺,50个单位/ ml青霉素和50μg/ ml链霉素。培养物在37℃下保持在5%CO的潮湿气氛中2,95%的空气。胞嘧啶β-d-ArabinofuranoSide(2.5μm在接种后第2天的培养物中加入Sigma以抑制胶质细胞的增殖。 3天后培养物将恢复到新鲜培养基。通过计数用各种抗体染色的细胞来评估神经元的纯度(
      • 张W.
      • 王T.
      • PEI Z.
      • 孟Y.
      • 吴X.
      • 贝琳达W.
      • 洪J.
      • 张继夫
      α-突触核蛋白激活微胶质细胞:一种导致帕金森病中疾病进展的过程。
      ,
      • 谢芬斯。
      • Neely M.D.
      • Maezawa I.
      • 吴H.
      • 奥尔森S.J.
      • Jurgens G.
      • Montine K.S.
      • 蒙丁T.J.
      氧化低密度脂蛋白存在于周围脑梗死的星形胶质细胞中,并刺激星形胶质细胞白细胞介素-6分泌。
      ) 如下。 1)用单克隆抗神经元特异性核蛋白(Neun)(Chemicon,Temecula,CA)染色神经元。 2)用多克隆兔抗酪氨酸羟化酶(TH)检测到后静脉神经元(Chemicon,Temecula,Ca)。 3)用多克隆胶质纤维酸性蛋白(GFAP)(Dako,Carpinteria,Ca)认识到星形胶质细胞。 4)用针对CD11b / c补体受体(OX-42)(BD Pharmingen)的单克隆抗体检测微胶质细胞。
      为了进行免疫组织化学,将4%甲醛固定细胞封闭并在4℃下在4℃下孵育过夜,用抗体稀释剂(抗NeUN,1:200;抗TH,1:2,500;抗牛-22,5 μg/ ml;或抗GFAP,1:1000),然后是荧光标记的二抗, IE。 交叉吸收的山羊抗小鼠(Alexa Fluor 488,分子探针,丁烯,或)和驴抗兔(Alexa Flul 568,分子探针)。细胞核被DAPI染色。使用倒荧光显微镜(Nikon Te200,Meridian仪器有限公司,Kent,WA)记录图像,带有电荷耦合器件摄像头和Metamorph软件(万能成像系统,West Chester,PA)。对于培养物中免疫染色细胞的视觉枚举,计算每孔的10个代表性区域。特别是只有含有含有的培养物<0.1% microglia and <8%的星形胶质细胞用于实验。总神经元,3.0-4.5%是晚期神经元。
      如前所述,从1-3天老Sprague-Dawley大鼠的全大脑中制备微胶质细胞,如前所述(
      • 刘B.
      • 秦立
      • 杨某。
      • 威尔逊B.C.
      • 刘Y.
      • 洪J.s.
      七胞嘧啶的紫荆丝浓度保护大鼠脑脑多巴胺能神经元免受炎症损伤。
      )。简而言之,脑组织,缺乏脑膜和血管,与木瓜蛋白酶(10个单位/ mL)和DNA酶I(0.01%,值得生物化学公司)处理分离,然后进行温和的机械研磨。分离的细胞(5×107)被播种成175厘米2 高级Dulbecco改良鹰培养基(Invitrogen)中的文化烧瓶含有10%胎牛血清,2米m l - 谷氨酰胺,50个单位/ ml青霉素和50μg/ ml链霉素。将培养物在37℃下保持在5%CO的潮湿气氛中2,95%的空气,培养基分别在1和4天后改变。在达到汇合(10-14天)上,通过摇动烧瓶与星形胶质细胞分离微胶质细胞。富集的小胶质细胞是>通过计数OX-42-免疫反应(IR),GFAP-IR和Neun-IR细胞来确定98%纯度。

       神经元微胶质细胞相互作用 -

      为了研究微胶质细胞与晚期神经元的相互作用,小胶质细胞和初级患神富含富集的培养物在24孔培养板中通过微孔膜(聚酯Transwell插入物;孔径,0.4μm;康宁,康宁,康宁,ny)。简而言之,将纯化的微胶质细胞覆盖成7天初的初级思科神经元富集培养物,加入微胶质细胞后4小时开始治疗。用不同浓度的Mn-EBDC或MPP处理共培养物+ (Sigma)在补充有1%B27,4米的神经缺卵培养基中7天m l - 在37℃下为50μg/ ml青霉素和50μg/ ml链霉素。如前所述合成Mn-EBDC(
      • 张继夫
      • Fitsanakis V.
      • 顾G.
      • 静D.
      • AO M.
      • Amarnath V.
      • 蒙丁T.
      大鼠中乙烯 - 双二硫代氨基甲酸和选择性多巴胺能神经变性:通过线粒体功能障碍的联系。
      ,
      • 周Y.
      • 顾G.
      • Goodlett D.R.
      • 张T.
      • 锅C.
      • 蒙丁T.J.
      • Montine K.S.
      • Aeberberold R.H.
      • 张继夫
      用定量蛋白质组学分析α-突触核蛋白相关蛋白质。
      ),等分,并在氮气下保持直至使用。库存溶液在我身上准备2 所以。
      为了研究微胶质细胞与永生化的后性神经元的相互作用,啮齿动物的脑脑神经元细胞系,MES 23.5(MES),具有许多天使神经元的特征(
      • 周Y.
      • 谢芬斯。
      • Piccardo P.
      • 蒙丁T.J.
      • 张继夫
      乙烯 - 双二硫代氨基甲酸盐诱导的蛋白酶体抑制:与帕金森病的相关性。
      ,
      • Crawford G.C.
      • 史密斯r.g.
      • 谢W.J.
      • Stefani E.
      • Appel S.H.
      一种新的N18TG2X模拟蛋白细胞杂交表达了表明Implia NIGRA的多巴胺能细胞系的性质。
      )在Dulbecco的改性Eagle的培养基/ F-12培养基中培养,含有1%N-2补充剂,2%胎牛血清和50单位/ ml青霉素和37℃的甲基霉素,在5%CO中2 潮湿的孵化器。将细胞覆盖到0.005%的聚 - d-Lysine-Encoated的96孔板或100毫米菜(两者均为1.56×10的细胞密度 4 /厘米 2)24小时治疗前。

       评估神经毒性 -

      评价原发性培养的后果神经元的活力,[3h] da和[3H]如前所述进行GABA吸收测定(
      • 刘Y.
      • 秦立
      • 威尔逊B.C.
      • 一个L.
      • 洪J.s.
      • 刘B.
      β-淀粉样肽肽(1-42)抑制β-淀粉样肽(1-42)诱导的微血花植物中的超氧化物产生和皮质和脑脑性神经元的退化。
      )。 [ 3h] da(43.0 ci / mmol)和[3H]从PerkinElmer Life Sciences获得GABA(90ci / mmol)。用含有16米的克雷斯林氏蛋白酶洗涤培养物两次m NaH24,119米m NaCl, 4.7 mm KCl, 1.8 mm CaCl2,1.2米m MgSO4,1.3米m EDTA, and 5.6 mm 葡萄糖(pH7.4)。为了 [3h] da和[3H]将培养物在37℃下将培养物在37℃下孵育15分钟m [3h] da(总共1μm DA) and 100 nm [3h] gaba(共5μm GABA)分别在克雷斯林氏缓冲液中。用冰冷的克雷斯林氏蛋白缓冲液洗涤三次后,将细胞收集在0.4ml 1中 n NaOH和放射性与液体闪烁计数器(LS6500多功能闪烁计数器,Beckman Coulter)计数。在接收氚化示踪剂和10μ的平行孔中确定非特异性摄取。m mazindol for [3h]达到吸收或10μm NO-711 and 1 mm β-alanine for [3h] gaba吸收(
      • Suzdak P.D.
      • Frederiksen K.
      • 安德森K.E.
      • sorensen p.o.
      • Knutsen L.J.
      • Nielsen E.B.
      NNC-711,一种新型有效和选择性γ-氨基丁酸摄取抑制剂:药理学表征。
      ,
      • mabjeesh n.j.
      • 弗雷泽姆
      • Rauen T.
      • 杰尔希尔
      • Kanner B.I.
      神经元和胶质γ-氨基丁酸+转运蛋白是不同的蛋白质。
      )。
      通过膜完整性的两个荧光指示剂的活死测定(分子探针)评估MES细胞的Danergic神经毒性(
      • mabjeesh n.j.
      • 弗雷泽姆
      • Rauen T.
      • 杰尔希尔
      • Kanner B.I.
      神经元和胶质γ-氨基丁酸+转运蛋白是不同的蛋白质。
      )。用Mn-EBDC或MPP处理后+ 持续3天,施用MES细胞含有碱素乙酰氧基甲基酯的溶液(4μm)和乙酸乙锭-1(1μm)并在37℃下在综外流光学荧光素(Calcein)和Rhodamine(乙酸酯-1)过滤器(激发/发射485nm / 530nm和530nm / 645nm,在37℃下孵育45分钟。Spectra Max Gemini ,分子器件Inc.,Sunnyvale,CA)。除了活死测定外,还可以手动计算剩余的活细胞以与具有活死测定获得的结果相关联。

       条件媒体的生化分级 -

      将MES细胞接种到0.005%的聚 - d-Lysine-预涂的100毫米菜(细胞密度,1.56×104 /厘米 2)24小时在4μmMN-EBDC处理之前m or MPP+ at 25 μm 3天。将条件介质仔细收集并以260×离心 g 在4℃下12分钟浓缩细胞碎片和非常大的聚集体。接下来将上清液再次以4000×离心 g 在4℃下30分钟获得第二颗粒和残留上清液。将两个颗粒重新悬浮在培养基中。然后在评价微胶质激活程度之前,将三个级分(在收获时的相等细胞数标准化为相等的细胞数)在评价微胶质激活程度之前,孵育24小时。

       微胶质激活的测定 -

      细胞外前列腺素e2 (PGE2)测量水平作为微胶质激活的指标。 p2 单克隆酶免疫测定试剂盒是从Cayman Chemical Co.(Ann Arbor,MI)获得的。在制造商的规范之后进行测定。还通过在用Ox-42抗体后检查免疫组织化学染色后的微胶质形态来评估小胶质激活。

       蛋白质组学分析 -

      寻找MN-EBDC-或MPP诱导的微胶质激活的潜在介质+ - 诱导的神经毒性,使用新开发的定量蛋白质组学技术称为氧化硅酸(用于稳定同位素标记用细胞培养中的氨基酸)(
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
      )。在除了一个必要的氨基酸外,基本上两组MES细胞在相同的培养基中生长, l-arginine:第一个媒体包含“光”(l - [ 12C6] arg同位素),另一个包含“重”形式(l - [ 13C6] arg同位素;剑桥同位素实验室,和索弗,MA)。培养至少五代后(实现近100%的精氨酸(
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
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      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
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      • Kratchmarova I.
      属性 13C-稳定同位素稳定同位素标记的C-取代的精氨酸(Silac)中氨基酸标记。
      )), l - [ 13C6] arg-和 l - [ 12C6]用25μm处理arg标记的MES细胞m MPP+ 或盐水,另外3天。从260×中分离的150微秒的膜蛋白 g 从每组细胞中取出分数(
      • Rowe D.
      • 谢W.
      • ortiz我
      • 嘿。
      • Appel S.H.
      小胶质激活和多巴胺能细胞损伤:一个 体外与帕金森病相关的模型。
      ),合并,并由8-16%SDS-PAGE解决。电泳后,Coomassie辉煌的蓝色染色蛋白条带被切割和凝胶胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)--digested(
      • 周Y.
      • 顾G.
      • Goodlett D.R.
      • 张T.
      • 锅C.
      • 蒙丁T.J.
      • Montine K.S.
      • Aeberberold R.H.
      • 张继夫
      用定量蛋白质组学分析α-突触核蛋白相关蛋白质。
      ,
      • 张继夫
      • Goodlett D.R.
      • peskind e.r.
      • Quinn J.f.
      • 周Y.
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      • yi E.
      • ENG J.
      • Aeberberold R.H.
      • 蒙丁T.J.
      人脑脊髓液年龄相关变化的定量蛋白质组学分析。
      )。用LC分离蛋白质/肽,然后使用蛋白质组学系统(LCQ Deca XP Plus,ThermoOlectron,San Jose,Ca)用MS / MS进行鉴定。使用续集(热电子)对小鼠+大鼠蛋白IPI(适用于国际蛋白质指数)数据库3.01来完成数据搜索。任何蛋白质鉴定需要至少两种肽。肽前容和蛋白质不良软件用于通过计算可能被正确鉴定的蛋白质的概率来增强蛋白质鉴定的准确性;该过程还考虑了特定蛋白质的肽覆盖率的百分比。使用算法计算实验组之间的相对蛋白质丰度,称为蛋白质丰富率的自动统计分析。所有这些方法通常在我们的实验室中使用(
      • 周Y.
      • 顾G.
      • Goodlett D.R.
      • 张T.
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      用定量蛋白质组学分析α-突触核蛋白相关蛋白质。
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      • Aeberberold R.H.
      • 蒙丁T.J.
      人脑脊髓液年龄相关变化的定量蛋白质组学分析。
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      • 金杰。
      • Meredith G.
      • 陈L.
      • 周Y.
      • 徐J.
      • 谢F.
      • 洛克哈特P.
      • 张继夫
      线粒体蛋白的定量蛋白质组学分析:与石油体形成和帕金森病的相关性。
      )。

       统计数据-

      使用商业上可用的计算机软件程序(Prism 3.0,GraphPad,San Diego,CA)单向分析,通过单向分析和Newman-Keuls测试来评估所获得的数据。在所有实验中至少三次进行重复措施。 p <0.05被认为是显着的。

      结果

      我们开始调查MN-EBDC的毒性作用,广泛使用的农药MANEB的活性成分和MPP+,古典帕金森毒性MPTP的活性成分,在晚期神经元(Fig. 1)。将大鼠原发性脑神经元神经元富含富含富集的培养物用2-8μm处理7天m Mn-EBDC or 0.25–5 μm MPP+, 分别。 [3测量达格吸收和TH-IR神经元的数量,以评估到晚期神经元的神经毒性。如图所示 Fig. 1, AB,MN-EBDC和MPP+ 在剩余的后神经元的表观形态改变中诱发原发性神经元富集培养物中的显着癌症神经毒性,包括神经遗株的数量和长度的丧失以及神经遗物的其余部分的缺失的免疫反应性。此外,MN-EBDC-和MPP+ - 介导的神经毒性似乎是剂量依赖性的(Fig. 1, CD)与ec50 约为3.0和0.5μm for Mn-EBDC and MPP+, 分别。特别是MN-EBDC和MPP+ - 介导的神经毒性表现出对晚期神经元的相对选择性作为[3H] GABA吸收在两种培养物中都在很大程度上保存,特别是在较低浓度下(<4 μm 和 1 μm for Mn-EBDC and MPP+, 分别)。通过计数Mn-EBDC-或MPP中存活的TH-IR和NEUN-IR神经元的数量进一步证实了这种相对的晚期选择性+-Treated培养物(数据未显示)。应该指出的是,我们的MPP结果+ 在很大程度上与Gao制造的观察结果一致 等等。 previously (
      • 洪J.s.
      • 张W.
      • 刘B.
      旋转龙诱导的多巴胺能神经元的微胶质胶质细胞的不同作用。
      )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1MN-EBDC和MPP+ 诱导大鼠原发性脑神经元富集培养物中的晚期神经毒性。 MN-EBDC和MPP的毒性作用+ 在晚期神经元产生明显的形态改变;用MN-EBDC治疗的代表性培养物 B 与...相比 A 在培养培养的情况下,用载体控制治疗,证明TH-IR神经元( 红色的 )有许多神经疾病。 Gabaergic神经元( 绿色 )相对保存。用两种化合物介导的选择性天刺激神经毒性3 h] da 相对 [3h] gaba(CD ), IE。 both Mn-EBDC and MPP+ 优先杀死的后果神经元。每个 观点 表示平均值±s.e.至少四个独立的测量。 *, p < 0.05; **, p <0.01与相应的车辆处理的对照培养物相比。彩色代码 AB 是: 红色的 ,Th-IR神经元; 绿色 ,Neun-IR Neuron; 蓝色的 ,dapi染色的核。
      接下来我们研究了小胶质细胞是否会影响MN-EBDC-或MPP+ - 介导的晚期毒性。在该研究中,将一系列初级显微胶质细胞在其百分比中加入到用2μm的核心神经元富集的培养物中加入到核心神经元富集的培养物中m Mn-EBDC or 0.5 μm MPP+ 7天。选择这些浓度,以确保所用的剂量特异于晚期神经元(Fig. 1)。如图所示 Fig. 2,添加微胶质细胞显着提高了Daneric神经元对Mn-EBDC-和MPP的敏感性+引起的神经毒性;与富含神经元富集的微胶质植物的百分比呈阳性相关的敏感性的增加。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2添加微胶质细胞显着逐渐增强了Dairic神经元对Mn-EBDC和MPP的敏感性+ - 介导的神经毒性。 将纯化的微胶质细胞覆含为7天母初级脑脑神经元富含富集的培养物,其串行密度为5×104/阱到1×105/嗯,然后用2μm处理共培养物m Mn-EBDC or 0.5 μm MPP+ 分别在37°C时7天。通过[南部)测定Joderic神经元细胞活力。3h]达到摄取。每个 观点 表示平均值±s.e.至少四个独立的实验。 *, p < 0.05; **, p <0.01与Mn-EBDC处理的神经元仅培养相比。
      值得注意的是,神经元 - 胶质胶质植物中的活性微胶质植物似乎是在退化的晚期神经元周围聚类,尤其是退化神经癖或轴突(图3A)。这种现象与早期观念一致的,即退化神经元可以是微胶质激活的触发(
      • 刘B.
      • 张W.
      • 洪J.s.
      微胶质型NADPH氧化酶衍生自由基的关键作用 体外MPTP帕金森病模型。
      )。为了进一步研究次级胶囊激活的潜在介质,中继到神经变性,我们在以下三种条件下重复了实验:1)无微胶质的神经元富集培养物,2)直接混合20%微胶质的神经元富含培养物,并混合Neuron-Microglia培养物与微胶囊和神经元分离,用微孔膜(孔径,0.4μm)分离。所有培养物在2μmn-EBDC处理所有培养物m or MPP+ at 0.5 μm 7天通过确定[的晚期毒性3h]达到摄取。如所示 图3B.,显而易见的是Mn-EBDC-或MPP+ - 多孔膜显着且充分减弱毒性。从这些结果中,得出结论是微胶质激活,然后加长Mn-EBDC或MPP诱导的晚期神经毒性+ 需要通过高分子量分子和聚集体直接接触神经元或中介。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3Mn-EBDC或MPP诱导的DAIRIC神经毒性的微胶质+ 似乎需要通过高分子量分子与微胶质细胞的神经元直接接触神经元或中介。A,在退化Da神经元周围的活性微胶质聚类(箭头)直接混合的共培养物。 红色的 ,Th-IR神经元; 绿色 ,活化的微胶质细胞(Ox42-IR); 蓝色的 ,dapi染色的核。 B,富含核心神经元富集的培养物直接混合20%的小胶质细胞(1.0×105 细胞)或用与多孔膜(Transwell)相同的微胶质细胞(Transwell)共培养,防止这两种细胞的直接接触。所有培养物都用2μ治疗m Mn-EBDC or 0.5 μm MPP+ 在37°C下7天,然后通过[综述Jaingeergic神经毒性的评估3h] da uptake测定(B)或剩余的TH-IR神经元(数据未显示)。每个 观点 表示平均值±s.e.至少三个实验。 *, p <与神经元富集的培养物相比0.05。
      为了进一步缩小帕金森毒物诱导的微胶质激活的潜在介质,我们将我们的系统切换成永生化的后果MES细胞,因为初级思科肾性培养物中的晚期神经元的百分比通常太低(通常是<占全神经元的5%),用于更明确的机制研究。在本研究中,MES细胞在4μmn-EBDC处理MES细胞m or MPP+ at 25 μm 通过离心将条件介质分为三个部分前3天:260× g 颗粒,4000× g 颗粒,4000× g 上清液。如图所示 Fig. 4,治疗Mn-EBDC或MPP+ 3天产生了实质性神经毒性(图4A)。值得注意的是,这些结果与我们以前观察到的结果非常相似(
      • 周Y.
      • 谢芬斯。
      • Piccardo P.
      • 蒙丁T.J.
      • 张继夫
      乙烯 - 双二硫代氨基甲酸盐诱导的蛋白酶体抑制:与帕金森病的相关性。
      )。接下来将所有三种级分应用于24小时和PGE的富集富集的富集培养物中2 在调节培养基中测量浓度,作为微胶质激活程度的指标。值得注意的是260× g 颗粒级分在介导的微胶质细胞活化方面是最有效的(图4B.),再次表明,直接细胞接触或非常大的聚集体,包括细胞碎片,主要负责神经元死亡介导的小胶质细胞活化。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4分级调节培养基激活微胶质细胞。A,MES细胞以1.56×10的密度镀在100毫米的菜肴中4 /厘米 2 并暴露于4μm的Mn-EBDCm or MPP+ at 25 μm 3天;毒物两种毒物都产生了大量的神经毒性。数据表示为使用实时死导的五次独立测量的控制的百分比。 B,MES细胞在4μmN-EBDC处理。m or MPP+ at 25 μm 3天,然后将条件介质分馏成260× g 颗粒,4000× g 颗粒,4000× g supernatant ( 极好的 分数。将每个级分(在收获的相同细胞数归一化)应用于24小时的大鼠原发性微胶质细胞培养物;通过PGE进行显微胶质激活程度2 测定。每个 时间点 表示平均值±s.e.至少五个独立的测量。 **, p <0.01与载体培养物相比。
      探讨培养帕金森毒物如MN-EBDC和MPP诱导的微胶质激活的潜在候选者+,我们终于使用了非偏析的蛋白质组学技术来确定260×膜分数中的蛋白质谱 g 用MPP处理MES细胞后的颗粒+。这种方法是为了以下两个原因。 1)与MPP不同+,Mn-EBDC还直接被激活的微胶质细胞,特别是在高浓度(数据未示出),这将在数据解释中引入模糊性,该方法是对微胶质细胞被激活的机制的数据解释。 2)神经元的蛋白质组非常复杂,所有电流MS技术都偏向丰富的蛋白质;因此,只关注一个分数将增强我们发现低丰度但更有趣的蛋白质的能力。
      为了进行蛋白质组学实验,在用MPP处理前,分别在轻质和重质氧化溶剂试剂中培养MES细胞3天+ at 25 μm 另外3天。然后从260×中分离膜级分 g 来自控制和MPP的条件介质的颗粒+-Treated MES细胞,组合在一起,然后使用SDS-PAGE方法进行进一步的分馏。 LC-MS / MS分析10页级分在膜蛋白级分中鉴定了总共621个蛋白质。在补充附录I中提供了详细的蛋白质清单,并且在饼图中示出了蛋白质的功能类别(Fig. 5)。特别是这些蛋白质的重要​​部分(约17%)没有已知的功能, IE。 他们是新颖的。然而,应该强调的是,因为没有一种生化方法可以获得绝对纯的膜质派系,因此这些蛋白质中的一些可能与细胞膜实际上不具有缔合。因此,260×分馏的更逼真的优点 g 颗粒是我们可以丰富丰富低的蛋白质,从而允许我们发现新的蛋白质在丰度低,但在两个实验条件之间表现出显着的变化。在这方面,我们的方法确定了38个蛋白质,其在MPP中增加或减少超过100%+与对照相比 - 治疗细胞。另外26个蛋白质改变了>50% but <100%与对照相比(表I. )。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5从260×中膜馏分中鉴定的蛋白质的分类 g pellet. 使用所有识别的蛋白质产生此图表,其中约17%没有已知功能。请注意,当可以将蛋白质分配给多个函数时,它被分配给最着名的函数。
      T 有能力的 I260×g颗粒中的相对蛋白质丰度
      I.在MPP中减少+ vs. vehicle >100%
      1类似于黄体酮诱导的阻塞因子1(IPI00373533)
      2假设锌指(IPI226875和IPI222566)
      3类似于26秒的蛋白酶体非ATPASE调节亚基11(IPI00370382和IPI00222515)
      4类似于KiaA0788蛋白质(IPI00373118)
      5类似于Ninein(IPI00365822)
      6ADP-核糖基化因子1(IPI00221613,IPI00221614,IPI00331953和IPI00231674)
      7B细胞刺激因子3,类似于神经营养蛋白-1 / B细胞刺激因子-3(IPI00317193和IPI00361232)
      8前列腺酸性磷酸酶前体(IPI00394000,IPI00201376,IPI00135015和IPI00394635)
      9非常大的诱导GTPase-1(IPI00227871)
      10血晶定义的结肠癌抗原1同种型A(IPI00227669)
      11类似于KiaA0266基因产品(IPI00370044)
      12Riken cDNA 1110007C09(IPI00315974)
      13mkiaa1824蛋白质(IPI00340504)
      14假设的GRPE蛋白质同源物(IPI00205598和IPI00117083)
      152400001E08RIK蛋白质(IPI00315187)
      16UPF0120蛋白DKFZP564C186同源物(IPI00125382)
      17GAG-POL Polyprotein(IPI224370和IPI00108206)
      18蛋白酶体亚基α型6(IPI00191501和IPI00131845)
      19Ensembl_locations(CHR-BP):17-90853438(IPI00285170)
      20Ensembl_locations(CHR-BP):10-88200227(IPI00190407和IPI00390786)
      II。在MPP中减少+ vs. 。车辆>50% but <100%
      21发展和分化增强因子2(IPI00365595和IPI00355808)
      22Ensembl_locations(CHR-BP):3-97389423,嗅觉受体MOR245-8(IPI00210799和IPI00312426)
      23真空ATP合成酶亚单位F(IPI00198291,IPI0038886和IPI00365861)
      24硫昔单蛋白蛋白2(IPI00315550,IPI00408359和IPI00403100)
      25Clathrin Coat组装蛋白AP17(IPI00118022和IPI00198371)
      26CD36抗原(IPI00127447)
      27RIKEN cDNA 2810036L13(IPI00121760,IPI00360055和IPI00264565)
      28Aldolase A(IPI00231734和IPI00221402)
      292210415M14RIK蛋白(IPI001323470)
      30类似于磷素磷酸酶(IPI00188112和IPI1117146)
      31蛋白酶体亚基,α型2(IPI00231757,IPI00404117和IPI00318970)
      32类似于ALY,Q9JJW6的剪接同种型2(IPI00370401,IPI00377350,IPI0031103,IPI00311103和IPI00122339)
      III。在MPP中增加+ vs. vehicle >100%
      33含毒素样,肝癌相关蛋白(IPI00318203和IPI00266281)
      34含有非普通结构域,八寡型结合蛋白(IPI00205912和IPI00320016)
      35假设蛋白质(IPI00123129)
      36囊泡相关膜蛋白3(IPI132276和IPI00210971)
      37类似于COP9复杂子单元4(IPI00193349和IPI00131871)
      38类似于cDNA序列BC014795(IPI00363369)
      39NHP2样蛋白1(IPI00227896)
      40肿瘤相关蛋白质(IPI00126635)
      41Hermansky-Pudlak综合征1同源物(IPI00198036)
      42类似于四肽重复蛋白6(IPI00346906)
      43电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1(IPI00230540,IPI00210000和IPI001225490
      44Ensembl_locations(CHR-BP):3-33476486(IPI00390891)
      45假设蛋白质XP_287402(IPI00351413)
      46假设蛋白质(IPI00356018)
      47含有Brix域的蛋白质1(IPI00121159,IPI00371948和IPI00341085)
      48标题(IPI00373635)
      49Ensembl_locations(CHR-BP):9-109825491(IPI00284075)
      50Ensembl_locations(Chr-BP):3-59624032(IPI00389116)
      51类似于KiaA1210蛋白质(IPI00355984)
      IV。在MPP中增加+ vs. vehicle >50% but <100%
      52泛素激活酶E1 1(IPI00123313)
      53外围(IPI230444,IPI00129527,IPI00326582,IPI00230445和IPI00204217)
      54组织相容性13(IPI00364738,IPI00192553,IPI00408103,IPI00228575,IPI00228576和IPI00112072)
      55假设蛋白质(IPI1373680)
      56GTP环氢化酶I前兆(IPI00205214和IPI00114691)
      57Vimentin(IPI00227299)
      58ATP绑定盒子类E成员1(IPI00193816和IPI00322869)
      592500002N19RIK蛋白,0610016L08RIK蛋白(IPI00110885和IPI00121079)
      60假设蛋白质(IPI153660)
      61ATP绑定盒,亚家族F,成员2(IPI00116825和IPI00213162)
      624F2细胞表面抗原重链(IPI00114641)
      63类似于TXNDC1蛋白(IPI00365626)

      讨论

      使用各种明确的培养系统,我们证明了小胶质细胞积极参与MN-EBDC-和MPP+ - 诱导的选择性晚期神经变性。此外,我们展示了Mn-EBDC或MPP诱导的次级诱导的Danighic神经变性的微胶质激活+ 至少部分地由直接细胞接触或具有高分子量的因素介导的。最后使用定量蛋白质组学,我们确定了许多候选蛋白质,其可能有助于神经变性诱导的微胶质激活。
      与我们和其他人,MN-EBDC和MPP制作的先前观察结果一致+ 在原发性脑脑培养以及永生化的MES细胞中产生了显着的晚期选择性神经毒性(
      • 周Y.
      • 谢芬斯。
      • Piccardo P.
      • 蒙丁T.J.
      • 张继夫
      乙烯 - 双二硫代氨基甲酸盐诱导的蛋白酶体抑制:与帕金森病的相关性。
      ,
      • 刘B.
      • 张W.
      • 洪J.s.
      微胶质型NADPH氧化酶衍生自由基的关键作用 体外MPTP帕金森病模型。
      ,
      • 刘B.
      • 张W.
      • 洪J.s.
      SPTP和炎炎素糖的协同多巴胺能神经毒性:与帕金森病的病因相关。
      ,
      • Barlow B.K.
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      • cory-slechta d.a.
      • Opanashuk L.A.
      多巴胺能细胞环境农药MANEB对抗氧化防御系统的调节。
      )。更重要的是,MN-EBDC-和MPP+介导的神经毒性通过向培养物添加微胶质毒性而增强,同时调节小胶质激活直接通过冒犯因子或继发于神经细胞死亡引发的显微激活可能有助于进一步的神经变性。关于直接激活微胶质细胞,释放各种神经毒性促炎介质的各种环境毒物和传染病已经假设在几个帕金森模型中触发或加剧PD中的神经变性(
      • Castano A.
      • Herrera a.j.
      • Cano J.
      • Machado A.
      通过地塞米松预防单一肿瘤内注射LPS对多巴胺能系统的退行性效果,不受RH-TNF-α,IL-1β和IFN-γ模拟的。
      ,
      • 凌Z.D.
      • 张问:
      • Lipton J.W.
      • 桐C.W.
      • 陆地兰德。
      • Carvey下午
      产前细菌内毒素暴露和产后6-羟基多胺在成年大鼠中脑中的综合毒性。
      ,
      • 洪J.s.
      • 张W.
      • 刘B.
      杀虫剂旋转酮的协同多巴胺能神经毒性和炎症脂多糖:与帕金森病的病因相关。
      )。还有流行病学证据来支持这一假设(
      • 玛蒂拉·罗杰。
      • rinne u.k.
      帕金森病的残疾和进展。
      ),虽然仍有待涉及传染性药剂的直接证据仍有待建立(
      • 施瓦茨J.
      • Elizan T.S.
      搜索特性帕金森病脑材料中的病毒颗粒和特异性产品。
      )。
      虽然各种药剂的直接微胶质激活值得追求,但目前的研究更为集中于中学到神经元死亡的微胶质激活,这是与疾病进展的潜在机制直接相关的问题。已经提出了许多因素来介导在Pd中的神经细胞死亡后的显微胶质激活,包括神经元蛋白(
      • Wilms H.
      • 罗森斯蒂尔P.
      • Sievers J.
      • Deuschl G.
      • Zecca L.
      • Lucius R.
      人类神经胶酶的激活是NF-κB依赖性的,涉及P38丝裂原激活的蛋白激酶:对帕金森病的影响。
      )和聚集的α-突触核蛋白(
      • 张W.
      • 王T.
      • PEI Z.
      • 孟Y.
      • 吴X.
      • 贝琳达W.
      • 洪J.
      • 张继夫
      α-突触核蛋白激活微胶质细胞:一种导致帕金森病中疾病进展的过程。
      )。然而,在本研究中,从条件介质中分离的细胞级分( IE。 260× g 与对照相比,颗粒状的颗粒状例如,具有效果活性的微胶质蛋白没有增加聚集的α-突触核蛋白(未示出的Western Blot数据)。要搜索潜在的调解员来指导我们在未来的研究中,我们使用了定量蛋白质组学方法,比较了260×的膜状部分 g 从MPP之间的条件媒体隔离的颗粒+ - 治疗的MES细胞和对照组。这种方法在该级分中鉴定了600多种蛋白质,其可以分为几种主要类别,包括与细胞骨架,信号转导,代谢和泛素蛋白酶体系(UPS)相关的功能。值得注意的是,没有已知功能的重要部分蛋白质(Fig. 5)。应该强调的是,尽管可以以某种方式与膜连接,但是,鉴于敏感的MS技术可以检测到痕量的蛋白质,不能排除来自其他细胞室的污染物。与蛋白质组学相关的另一种警告是由于目前的不完全数据库,蛋白质可能被错误识别;因此,在追求广泛的生物实验之前,需要对感兴趣的蛋白质进行验证。
      与目录蛋白质相反,定量蛋白质组学有利的是,它鉴定了具有生物学上更有趣的相对丰度的变化的蛋白质。在鉴定的621个蛋白质中,其中63个在用MPP处理的MES细胞中的相对丰度显着差异+ 与载体处理的对照相比(表I.)。虽然没有已知功能的蛋白质仍有很大一部分的蛋白质,但相当多的蛋白质是吸引人的, 例如 与UPS,细胞质膜蛋白有关的那些,可参与细胞 - 细胞接触,或分子量运输和与信号转导/调节细胞氧化还原阶段相关的那些。
      与UPS相关的蛋白质包括蛋白酶体亚基F,α2和泛素活化酶E1 1.在PD患者以及PARINSONIAN动物中证明UPS功能障碍。虽然可以捕获这些蛋白质刚刚捕获最终激活的微胶质细胞的蛋白质聚集体,但它们在微胶质细胞直接激活中的潜在作用可能会使进一步的追求。事实上,积累的证据表明UPS在微胶质功能中起着关键作用(
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      非常低密度脂蛋白受体(VLDL-R),载脂蛋白-E受体,中枢神经系统和阿尔茨海默病的表达。
      )。有趣的蛋白质的第二种主要类别, 例如 Clathrin Coat组装蛋白AP17与细胞质膜蛋白或脂质贩运有关。尽管仍有待定义的详细机制,但克拉林介导的内吞作用明显涉及在许多环境中的显微胶质激活,包括阿尔茨海默病(
      • 克里斯蒂·罗克夫。
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      • strickland d.
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      非常低密度脂蛋白受体(VLDL-R),载脂蛋白-E受体,中枢神经系统和阿尔茨海默病的表达。
      )。最后一类有趣的蛋白质, 例如 硫昔林样蛋白2,与细胞氧化还原态的调节有关。众所周知,硫昔林对氧化应激的细胞保护作用作用,并减轻了MPTP介导的神经毒性(
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      )。在用MPP处理的MES细胞衍生的调节培养基中,该蛋白质的水平降低+ 符合此观察。最后,还需要进一步研究其在微胶质激活中的作用。
      总之,我们已经证明了小胶质细胞积极参与MN-EBDC-和MPP+ - 诱导的选择性晚期神经变性。另外,通过非偏见的蛋白质组学研究,我们已经鉴定了许多可能参与继发性神经变性的小胶质激活的新型蛋白质。

      致谢

      我们欣赏Shao-en Ong博士(南丹麦大学南丹麦大学实验生物信息学中心),建议建立我们的Silac实验和Leo Chen进行努力准备稿件。

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