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管凝胶消化

  • 小林鲁
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    肯塔基州肯塔基州大学分子与细胞生物化学系,肯塔基州肯塔基州40536
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  • 海宁朱
    一致
    应解决谁的通信:肯塔基州大学医学院分子和细胞生物化学部门,741 S.Ilextone,Lexington,Ky 40536。电话。:859-323-3643;传真:859-257-2283
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    肯塔基州肯塔基州大学分子与细胞生物化学系,肯塔基州肯塔基州40536
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      该研究描述了一种新的蛋白质消化方案,其中各种洗涤剂可用于溶解膜蛋白并促进胰蛋白酶消化以更高的效率。在该方案中,蛋白质溶解在含有各种洗涤剂的溶液中并直接掺入聚丙烯酰胺凝胶基质中而不电泳。随后从凝胶基质中除去洗涤剂,而蛋白质仍然固定在凝胶基质中。在凝胶中消化蛋白质后,LC-MS / MS用于分析提取的肽用于蛋白质鉴定。该方案的独特性是它允许在起始溶液中使用各种洗涤剂而不干扰LC-MS / MS分析。我们在此证明了不同的洗涤剂,包括离子SDS,非离子Triton X-100和n-octylβ-d - 凝集葡萄氨酸和两性离子乳液可用于实现膜蛋白的最大溶解,对LC-MS / MS分析进行最小的干扰。增强的消化, IE。还对检测到的肽的数量和强度进行了描述的消化蛋白质,例如肌红蛋白,泛素和细菌的消化蛋白质。管凝胶消化方案的额外优点是,即使没有电泳分离,它也允许在与LC-MS / MS偶联时复合蛋白质混合物的高通量分析。该方案用于分析由前列腺癌细胞制备的复杂膜蛋白混合物。该方案仅涉及单一消化和2.5小时的LC-MS / MS分析,并确定了178个膜蛋白。相比之下,通过SDS-PAGE分解相同的膜级分,切除20个凝胶切片并通过LC-MS / MS分别消化和分析。更精细的努力要求LC-MS / MS分析超过50小时,并确定了268例蛋白。新型管凝胶消化方案是膜蛋白的高通量分析的替代方法。
      膜蛋白参与许多重要的生物过程,包括细胞粘附,信号转导,营养吸收,运输和内吞作用(
      • Schwartz M.A.
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      整合素:发出信号转导的范式。
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      • Meredith Jr.,J.E.
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      整联蛋白,粘附和凋亡。
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      Integrin Connections地图:到无限远。
      )。对膜蛋白的综合和高通量分析存在越来越大的兴趣(
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      膜蛋白的蛋白质组学。
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      将质谱整合到膜蛋白药物发现中。
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      内在膜蛋白的HPLC和质谱。
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      脑质膜蛋白的蛋白质组学映射。
      )。近年来,基于MS的蛋白质组学迅速发展成为蛋白质大规模鉴定和表征的强大方法。常用的自下而上的蛋白质组学方法涉及蛋白质蛋白质对肽的消化,然后质谱测量肽质量和序列(
      • 舍甫琴科A.
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      通过质谱将基因组和蛋白质组连接:来自二维凝胶的大规模鉴定酵母蛋白。
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      蛋白质组学中的质谱。
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      研究基因和基因组的蛋白质组学。
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      质谱。从基因组学到蛋白质组学。
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      斧头检测 体内 小鼠苯蛋白靶标:高反应性代谢物的证据。
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      • 张Q.F.
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      肽和蛋白质的质谱。
      )。随后对MS和串联MS数据进行数据库搜索,以鉴定未知蛋白质和蛋白质的翻译后修改。蛋白质鉴定的置信度高度依赖于来自每种蛋白质的肽的数量,这通过蛋白水解消解的效率确定以及随后的质谱分析的覆盖率和准确性来确定。然而,在分析膜蛋白时,与两个步骤相关的具有实质性的技术困难。膜蛋白的蛋白水解消解通常导致低序列覆盖率,因为它们的溶解度和高疏水性低,这使得蛋白水解剂可脱离的切割位点。洗涤剂和有机溶剂可用于改善膜蛋白的溶解度,但它们干扰随后的MS测量,特别是LC-MS / MS分析,并产生差的MS数据。
      据报道了膜蛋白的溶解和消化综述了几种方法。布朗德 等等。 (
      • Blonder J.
      • Conrads T.P.
      • yu l.r.
      • Terunuma A.
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      • Vogel J.C.
      • veenstra t.d.
      一种可整体膜蛋白质组学的洗涤剂和氰基溴化物方法:在哈氏杆菌紫膜和人表皮膜蛋白质组中的应用。
      )使用高百分比( 例如 60%)甲醇用于溶解的溶解 哈杆菌 紫色膜。胰蛋白酶是蛋白质组学中常用的蛋白质水解酶,在60%甲醇中保留〜20%活性,并据报道能够有效地消化紫膜的主要组分之一。沃德劳伦斯 等等。 (
      • Washburn M.P.
      • 擦拭。
      • yates j.r.
      多维蛋白质识别技术大规模分析酵母蛋白质组。
      )测试了90%甲酸和氰基溴化物的组合,一种化合物,该化合物在蛋白质中甲硫氨酸残留物切割并在酸性pH下保持活性。该方法用于分析酵母中分离的膜馏分,并确定1,484蛋白,其中131个是膜蛋白。上述方法的担忧是有毒试剂以及有机溶剂中的受损蛋白水解酶活性。
      洗涤剂已广泛用于溶解膜蛋白。使用洗涤剂的临界缺点是,即使在低水平的低水平,它们显着降低了蛋白水解酶的活性,干扰HPLC分离,并产生强MS背景掩蔽肽信号。在胰蛋白酶消化和LC-MS / MS分析之前,在含有高洗涤剂浓度的缓冲液中最初溶解蛋白质在含有高洗涤剂浓度的缓冲液中,洗涤剂稀释至低浓度(通常小于0.05%)。稀释的低浓度的洗涤剂在LC-MS分析中引入了一些但可管理的背景。韩 等等。 (
      • 韩D.K.
      • ENG J.
      • 周H.L.
      • Aeberberold R.
      使用同位素编码的亲和标签和质谱法定量分析分化诱导的微粒体蛋白。
      )溶解的微粒体蛋白,Tris缓冲液含有0.5%SDS,并在稀释SDS至0.05%后进行胰蛋白酶消化。在反相HPLC MS分析之前,对胰蛋白酶肽进行阳离子交换色谱法以除去干扰SDS。目前尚不清楚作者如何消除SDS。最近据报道酸不稳定洗涤剂能够帮助溶解膜蛋白,然后在样品酸化时自发降解(
      • 加工P.
      • Bierczynska A.
      • KONIG S.
      • 丝坯J.
      酸性不稳定表面活性剂有助于溶液耐抑制酶侵蚀的蛋白质。
      )。酸性不稳定洗涤剂的有用性仍有进一步评估。
      通过SDS-PAGE解决蛋白质()后常用凝胶消化。
      • 舍甫琴科A.
      • Jensen O.N.
      • podtelejnikov a.v.
      • Sagliocco F.
      • 威尔m。
      • vorm o.
      • Mortensen P.
      • Boucherie H.
      通过质谱将基因组和蛋白质组连接:来自二维凝胶的大规模鉴定酵母蛋白。
      )。已被证明该方案与蛋白质样品中的洗涤剂的使用相容。通常,膜蛋白质溶解含有1%SDS的加载缓冲液,并通过SDS-PAGE分离成多条带,其运行缓冲液含有0.1%SDS。蛋白质带染色几个小时或更长时间,可视化,并从凝胶切成多个凝胶块。随后通过乙腈彻底洗涤凝胶切片以除去可能干扰随后的方法的SDS和其他洗涤剂或化合物。随后使用胰蛋白酶进行凝胶切片,并萃取所得的胰蛋白酶,并进行LC-MS / MS分析。在凝胶中消化通常给出清洁的LC-MS / MS基线,因为在洗涤步骤期间有效地去除干扰物质,例如SDS。这种方法对可溶性蛋白有效,并且被广泛使用。然而,当应用于分析膜蛋白时,它具有几个限制。首先,它限于相对低的SDS浓度(高达1%),因为其他洗涤剂或更高浓度的洗涤剂扭曲电泳分离。这限制了可用于最佳溶解膜蛋白的洗涤剂的类型和浓度。其次,从SDS-PAGE生成多个蛋白质条带,并且必须单独分析,从而需要显着更长的分析时间和更低的吞吐量。或者,据报道,通过停止电泳,将蛋白质浓缩到堆叠和分离凝胶之间的带(
      • Ferro M.
      • 萨尔普D.
      • Brugiere S.
      • 米拉斯S.
      • Kowalski S.
      • Louwagie M.
      • 加入J.
      • Joyard J.
      • rolland n.
      叶绿体包膜膜的蛋白质组学 拟南芥蒂利亚纳.
      ,
      • 马尔巴尼A.
      • Rouet M.-a.
      • Ferro M.
      • rolland n.
      • Alcon C.
      • Joyard J.
      • 加入J.
      • Barbier-Brygoo H.
      • Ephritikhine G.
      鉴定新的内在蛋白质 拟南芥 血浆膜蛋白质组。
      )。该方法可以避免使用多个凝胶带,但它仍然具有可以使用的洗涤剂的限制。
      在这项工作中,我们开发了一种新的消化方案,其中膜蛋白在没有电泳的情况下直接掺入聚丙烯酰胺凝胶中。这使我们可以在高浓度下使用各种类型的洗涤剂,以有效溶解膜蛋白。高浓度的洗涤剂也有效地使膜蛋白质变性并使得更加酶促切割位点可获得,从而增加蛋白质消化效率并提高序列覆盖率和敏感性。在蛋白质消化之前除去洗涤剂,并且不会干扰随后的反相或二维LC-MS / MS分析。该协议通过传统SDS-PAGE和凝胶中消化方法的另一个优点是它需要显着较少的LC-MS / MS分析时间,从而允许高通量蛋白质组学研究。阐述了新协议的工作流程命名为管凝胶消解 方案1 .
      图缩略图GR8.
      方案1 管凝胶消化协议的工作流程。 AP ,过硫酸铵。

      实验步骤

       材料-

      单体丙烯酰胺溶液(40%,29:1)购自Bio-rad。蛋白质标准包括BSA(99%),泛素(来自牛红细胞,90%)和肌球蛋白(来自马骨骼肌,95-100%)是从Sigma获得的。纯度75%的细菌 哈杆菌 halobium. 由Fluka(密尔沃基,Wi)提供。从Promega(麦迪逊,Wi)购买胰蛋白酶(修改的排序等级)。 Chaps,Triton X-100, n-octylβ-d-Glucopyranoside(NOG)
      使用的缩写是:nog, n-octylβ-d - 葡萄糖; Ambic,碳酸氢铵; HFBA,庚二氟丁酸;变焦, N,N,N ', N' - 甲基乙二胺; IAA,碘乙酰胺。
      (>98%),碳酸氢铵(Ambic),DTT和蛋白酶抑制剂混合物也来自Sigma。甲酸(>98%)由Merck Kgaa制成。 SDS(​​电泳等级),庚络氟丁酸(HFBA),TFA,水和ACN以及其他常见试剂均可从渔业获得。

       蛋白质样品制备 -

      BSA,泛素和肌红蛋白在25米中单独溶解m AMBIC(pH8.0)以1μg/μl的浓度并用作库存溶液。细菌孢子不能溶解在25米中m AMBIC但被悬浮的浓度为1μg/μl,从而可以精确地控制该研究中的蛋白质量。用于实验的蛋白质样品通过用25米稀释储备溶液/悬浮液至所需的浓度来制备。m 在存在或没有洗涤剂的情况下的Ambic。如下所述或其他消化方法对蛋白质样品进行新的管凝胶消化方案。

       管凝胶蛋白质消化 -

      如下面的蛋白质溶液或从PC3细胞分离的细胞培养中分离的膜馏分掺入聚丙烯酰胺凝胶基质中而没有电泳。聚合凝胶基质的形状是小型化管,因此命名为“管凝胶”,本研究中描述的蛋白质消化方案称为“管凝胶消化”。通常如下所述制备20μl聚丙烯酰胺凝胶。将14μl蛋白质溶液,5μl丙烯酰胺(40%,29:1)溶液,0.7μl1%过硫酸铵,并混合0.3μLTEMED,并立即转移到具有1- - 的内径为1-的小玻璃管。 2毫米(Fisher)。聚合反应在室温下进行30分钟。在玻璃管中形成的20μl凝胶混合物的凝胶条,通常为6-10mm,在玻璃管中形成,并且〜1μl液体保持在凝胶条的顶部。通过SDS-PAGE分析1μl液体以评估未掺入凝胶基质中的蛋白质的量。除去凝胶条,切成小块,用25米洗净m AMBIC(pH8.0)含有50%ACN的50%,涡旋三次15分钟。使用SpeedVac干燥后,如前所述对凝胶片进行标准的凝胶消化方案(
      • Fukada K.
      • 张F.
      • Vien A.
      • Cashman N.R.
      • 朱H.
      家族性肌营养侧面硬化剂细胞系模型的线粒体蛋白质组学分析。
      )具有微小的修改。蛋白质减少10米m DTT在60℃下30分钟并烷基化55米m 碘乙酰胺(IAA)在黑暗中在室温下30分钟。用25米洗涤凝胶片m Ambic,用ACN脱水,并使用SpeedVac干燥。用10 ng /μl胰蛋白酶溶解在25米中进行蛋白水解消解m Ambic并在37℃下孵育过夜。或者,在25℃下孵育4小时,将胰凝乳素消化孵育4小时。使用50μl25μm从凝胶中萃取肽m Ambic,100μl0.02%HFBA在水中,150μl0.02%HFBA,50%ACN,50μl100%ACN。将四个步骤中提取的肽组合在一起,通过SpeedVac浓缩至所需体积(〜20μl),并进行LC-MS / MS分析。

       蛋白质溶液消化 -

      在溶液中可选地消化蛋白质以比较消化效率。将蛋白质溶于25米m 没有洗涤剂的Ambic,减少5米m DTT在60℃下30分钟,并用25米烷基化m IAA在室温下在黑暗中30分钟。在37℃下以20:1的蛋白质/胰蛋白酶比在37℃下进行胰蛋白酶消化过夜。将蛋白质消化浓缩至〜20μl。

       来自PC3细胞的膜蛋白分离 -

      通过差动离心从PC3细胞,前列腺癌细胞系中分离膜蛋白。在肯塔基州大学泌尿科泌尿外科博士中,PC3细胞慷慨地提供,最初从ATCC获得。在RPMI 1640培养基中培养PC3细胞直至接近90%汇合。用含有1米的冰冷PBS洗涤后m MgCl2,通过轻轻刮削盘并随后以400×离心来收获细胞 g 使用EPPendorf 5810R冷藏离心机5分钟。在冰上孵育细胞在冰水缓冲液中孵育15分钟(10米m HEPES(pH 7.5),1.5米m MgCl2, 10 mm KCl,1×蛋白酶抑制剂混合物,1米m NaF, and 1 mm Na3 vo. 4)使用Dounce均化器30分钟裂解。将裂解物以1000×以1.5ml管离心。 g 5分钟去除颗粒核馏分。将核核上清液转移到4ml超速离心管中并以100,000×以10,000×离心 g 使用TL-100超速离心机(Beckman)20分钟,具有TLA-100.3固定角转子(
      • 赵玉。
      • 张W.
      • Kho Y.
      整体质膜蛋白蛋白质组学分析。
      )。弃去上清液,将颗粒微粒部分重新悬浮在0.1中 m Na2 CO. 3 (pH 11.5)并在冰上保持1小时(
      • 尼尔森P.A.
      • 奥尔森J.V.
      • podtelejnikov a.v.
      • 安德森J.R.
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      脑质膜蛋白的蛋白质组学映射。
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      • maccoss m.j.
      • Howell K.E.
      • YALES III,J.R.
      一种膜蛋白综合蛋白质组学分析的方法。
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      • 藤木y.
      • Hubbard A.L.
      • 福勒S.
      • Lazarow P.B.
      通过碳酸钠处理分离细胞内膜:在内质网的应用。
      )。悬浮液以100,000×再次超速离心 g 35分钟颗粒膜。丢弃上清液,通过用冰冷的Na脱液,轻轻洗涤沉淀(膜)2 CO. 3 几次。将膜用2%SDS在25米中溶解m 如上所述,Ambic(pH8.0)并经受管凝胶消化。使用595nm波长的Bradford试剂测定蛋白质浓度。从10皿(10cm)的PC3细胞一致地获得约500μg膜蛋白。

        NA. no-LC-MS / MS和数据分析 -

      使用毛细管HPLC系统(LC Packings,Amsterdam,Netherlands)与QSTAR XL四重飞行时间质谱仪(ABI / MDS SCIEX)通过纳米电池支散电离源( protana)。分析师QS软件用于系统控制和数据收集。通过自动进样器注射所需体积的蛋白质溶液,并在C上脱盐18 在流速10μL/ min的流速下捕获塔(300μm×1mm,lc填料)6分钟。随后将样品用C分离18 以220nl / min的流速,反相柱(75μm×15cm,vydac,哥伦比亚,md)。流动相由0.1%甲酸(A)和90%乙腈的水组成,分别为0.1%甲酸(B)。通常使用从5至50%B的90分钟的线性梯度。在LC分离后,通过适于纳米电子泵源(Protana)的10μm二氧化硅尖(新目的)将样品引入质谱仪中。在信息相关的采集模式下获取数据。每个循环通常由400到1600的1-S TOF MS调查组成(m/z)和两个2-S MS / MS扫描,质量范围为65-1600(m/z )。
      PC3单元的膜分数的LC-MS / MS数据被提交到用于MS / MS离子搜索的本地吉祥物服务器。来自LC-MS / MS光谱的峰值列表由嵌入在分析器QS软件中的吉祥物脚本使用以下参数:没有平滑,从MS扫描确定的充电状态,2+和3+的前体离子充电状态,质心MS / MS数据,高度百分比为50%,合并距离为0.02 da。吉祥物MS / MS离子搜索中使用的典型参数是: HOMO SAPIENS.,最多两种胰蛋白酶白蛋白,半胱氨酸氨基甲酰化,甲硫氨酸氧化,最大100ppm MS误差容差,最大为0.15 -DA / MS误差容差。鉴于潜在的含糊不清蛋白质识别结果,根据公布的指南使用严格的识别标准(
      • 卡车。
      • Aeberberold R.
      • Baldwin M.
      • 伯灵名A.
      • 克劳瑟K.
      • Nesvizhskii A.
      肽和蛋白质鉴定数据的出版指南的需要。肽和蛋白质识别数据的出版指南工作组。
      )。对于MS / MS离子搜索,具有两个或更多个肽的蛋白质和每种肽的分数高于30的蛋白质被认为是明确的识别,而无需手动检查。用一个肽鉴定的蛋白质,可手动检查得分高于45分。具有低于45分的一个肽的蛋白质被认为是模糊和丢弃的。对于ChymotryPSIN消化实验,酶特异性在局部造型服务器中定义为切割PRO,PHE,TYR,LEU或满足的C Termini。

      结果和讨论

       蛋白质掺入管凝胶中 -

      将蛋白质溶液与丙烯酰胺单体溶液混合,并在聚合过程中掺入聚丙烯酰胺凝胶基质(管凝胶)中而没有电泳。有必要评估蛋白质掺入效率。使用毛细管玻璃管(内径,〜2mm)限制凝胶缩合,从而最小化从凝胶基质中排除的溶液体积。将5μgBSA(66kDa),肌球蛋白(17kDa)和泛素(8.6kDa)共孵育,共20μl丙烯酰胺混合物。在凝胶聚合之后,观察到〜1μl液体在凝胶基质的顶部。除去液体并进行SDS-PAGE分析。如图所示 Fig. 1,从三个独立实验中从凝胶基质中排除的蛋白质(车道3-5 )少于混合物中每种蛋白质的原始量的10%(lane 2)。排除蛋白质的量与蛋白质的大小无关。总之,超过90%的蛋白质可以掺入20-μl管凝胶中。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1蛋白质掺入管凝胶中的效率。 如“实验过程”下所述,将BSA,肌葡萄球菌和泛素中的每一个掺入管凝胶中,并通过SDS-PAGE检查从凝胶基质中排除的蛋白质的微小部分。 Lane 1 每种蛋白质为5μg,和 lane 2 每种蛋白质为0.5μg(10%的蛋白质量 lane 1 )。 车道3-5 是在三个独立实验中从20μl管凝胶中排除的蛋白质。 6-8 在三个独立实验中,是否从100μl管凝胶中排除的蛋白质。每个乐队的强度 车道3-5 不到那些 lane 2。每个乐队的强度 6-8 略大于那些 lane 2.
      应注意,管凝胶制剂可以缩放以适应较大的蛋白质。使用0.6ml Eppendorf管测试高达100μl的蛋白质/丙烯酰胺混合物。从凝胶基质中排除的蛋白质略高于丙烯酰胺混合物中蛋白质原始量的10%(6-8)。凝胶密度分析估计从凝胶基质中排除的蛋白质为原始蛋白质的约15-20%;因此,超过80%的蛋白质可以掺入较大(100μl)管凝胶中。
      管凝胶消化方案的最佳蛋白质量取决于管凝胶的体积和胰蛋白酶的浓度。对于通常使用的20μl管凝胶和胰蛋白酶浓度为10ng /μl,通常在本研究中使用,总蛋白质量应为〜20μg。这将保持〜100:1的蛋白质/胰蛋白酶比率。然而,如果蛋白质的量大于20μg,则可以通过增加管凝胶基质和/或胰蛋白酶浓度的体积来容易地缩放该方案。

       用LC-MS / MS的管凝胶消化协议使用的洗涤剂的兼容性

      管凝胶消化方案的显着优点是它是耐受各种清洁剂,盐或小分子量的其他干扰物质(<1000 da)。在蛋白质掺入管凝胶中后,通过大量洗涤消除洗涤剂和其他干扰物质。我们测试了四种不同的洗涤剂,SDS(离子),NOG(非离子),TRITON X-100(非离子),以及在起始BSA溶液中的各种浓度(0.1-2%)。 1.3μgbsa(〜20pmol)25米m 将含有2%的四种洗涤剂中的2%的Ambic进行了管凝胶消化。通过LC-MS / MS分析含有200种肽的产量的胰蛋白酶肽的等分试样。 Fig. 2 显示在2%洗涤剂存在下BSA的胰蛋白酶肽的基峰HPLC色谱图。 表I. 总结通过管凝胶消化BSA的肽和序列覆盖的数量在缺乏和存在下的洗涤剂存在下。从结果显然是显而易见的,即有效去除洗涤剂并且不干扰HPLC分离和MS / MS测量。因此,在初始蛋白样品制备中使用洗涤剂与管凝胶消化方案完全相容。相比之下,当10米m Nog存在于BSA内胰蛋白酶消化样品中,洗涤剂在样品直接注入质谱仪(未示出)时将质谱信号占主导地位。此外,洗涤剂干扰HPLC分离;因此,不对洗涤剂的样品进行LC-MS分析。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2在2%SDS存在下使用管凝胶消化的BSA胰蛋白酶肽的基础色谱法(A ), n-octylβ-d-Glucopyranoside(B),chaps(C)和triton x-100(D )。 1.3μgbsa(69kda,〜20 pmol)25米m 含有2%的四种洗涤剂中的2%的Ambic受管凝胶消化。含有含有200毫升产量的胰蛋白酶肽的等分试样进行LC-MS / MS分析。尽管起始样品中的洗涤剂2%,但在LC-MS / MS中没有观察到洗涤剂信号,并且BSA胰蛋白肽的基峰在HPLC中很好地分离。 CPS. ,每秒计数。
      T 有能力的 I在LC-MS / MS分析中观察到在2%不同洗涤剂的BSA的LC-MS / MS分析中观察到的胰蛋白酶肽分析
      消化条件检测到的肽数序列覆盖范围
      %
      没有洗涤剂3666
      2% SDS4674
      2%的CHAPE 4269
      2%triton x-1003973
      2% NOG4374
      此外,最多5%的SDS用于溶解膜蛋白,膜蛋白有七个跨膜结构域。三种代表性胰蛋白肽的强度(m/z 在含有不同浓度SDS的管凝胶消化样品的LC-MS / MS分析中,494.31(2+),726.85(2+)和959.92(2+)的值被绘制 Fig. 3。在没有SDS的情况下,无可检测到这三种肽。在0.1%SDS的存在下,记录了三种肽中的每一个的显着强度。当向Bacteriorhodopsin样品中加入2%SDS时,观察到肽的最大强度。起始蛋白样品中较高浓度的SDS高达5%的SDS未改善管凝胶消化或细菌磷脂的LC-MS / MS。更重要的是,起始样品中的5%SDS仍然耐受并与管凝胶消化协议和随后的质谱分析相容。高浓度洗涤剂的耐受性对需要这种条件的应用至关重要。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3由含有不同浓度SDS的含有不同SDS的菌牙龈消化的管凝胶消化制备的三种代表性胰蛋白酶肽的质谱强度。 在起始的BacteriorHodopsin样品中加入高达5%的SDS,然后进行管凝胶消化。在每个实验中对所产生的肽的相等量(700 fmol)进行LC-MS / MS分析。在该图中示出了来自含有不同SDS浓度的起始样品的三种代表性肽的强度。 A,aesmrpevastfk,2+, m/z = 726.85; B,vgfglillr,2+, m/z = 494.31; C,aifgeaepepsagdgaaats,2+, m/z = 959.92.
      应注意,在使用管凝胶方案的上述实验中,在上述实验中,在氨基甲酰基形式中鉴定了BSA中的所有35个半胱氨酸残基,表明DTT还原和IAA烷基化步骤在管凝胶方案中非常有效。重要的是以均匀的形式维持半胱氨酸残基,以便实现更好的样品均匀性,并且将改善整体分析的敏感性。

       使用管凝胶协议中的洗涤剂增强消化效率 -

      为了测试管凝胶方案中使用的洗涤剂是否可以显着提高蛋白水解消化效率,对三种不同的消化方案和随后的LC-MS / MS分析进行三种标准蛋白质。在该研究中选择了肌球蛋白,泛素和细菌肽,因为它们据报道它们适度或对胰蛋白酶消化(
      • 加工P.
      • Bierczynska A.
      • KONIG S.
      • 丝坯J.
      酸性不稳定表面活性剂有助于溶液耐抑制酶侵蚀的蛋白质。
      )。在没有SDS的情况下,在SDS的存在下,在SDS的存在下进行管凝胶消化,或用SDS的溶液消化。使用相同的LC和MS参数通过LC-MS / MS分析所得到的胰蛋白酶肽。
      标准蛋白首先在25米中制备m AMAG(pH8.0)为1μg/μl作为股票。将每种单独的蛋白质股票分为两部分:用2%SDS稀释25米m AMBIC,另一个被稀释至25米的相同浓度m 没有SDS的AMBIC。应该注意的是,细菌磷酸肽在25米中不溶于溶解m 稀释前1分钟涡旋,股票在涡旋中涡旋;因此,蛋白质股票样品是均匀的,稀释率是准确的,并且在不同的等分试样中一致。在SDS存在下,在不存在SDS的情况下,使用管凝胶方案,在不存在SDS的情况下,使用管凝胶方案,管凝胶方案或在不存在SDS的情况下,使用管凝胶方案进行等量的蛋白质。使用大致相同的蛋白质/胰蛋白酶比(50:1)在37℃下在37℃下进行所有反应。通过如“实验程序”下所述,平行萃取胰蛋白酶肽,并使用相同的LC和MS / MS参数对随后的LC-MS / MS分析进行随后的LC-MS / MS分析。
      表二 总结了从三种不同消化方法获得的蛋白质序列覆盖结果。显然显而易见的是,与另外两个方案相比,洗涤剂在管凝胶消化方案中的用法大大提高了消化效率,从而导致更高观察到的肽和更高的序列覆盖。肌红蛋白的序列覆盖率从〜50%(无SDS)改善为84%(用SDS)。此外,使用具有SDS的管凝胶的检测到的胰蛋白肽的强度比使用没有SDS的方案的相应肽的至少4倍。数据如图4所示。S1在补充结果中。
      T 有能力的 II使用不同消化方案的蛋白质序列的比较
      蛋白质 用2%SDS消化管凝胶消化没有SDS的管凝胶消化没有SDS的溶液消化
      细菌孢子素
      a 通过LC-MS / MS分析了含有烧蚀的细菌(28kDa),400 ng,其中400ng,其中20ng(〜700 fmol)。
      5肽/ 21%0肽/ 0%0肽/ 0%
      泛素
      b 通过LC-MS / MS对其消化的泛素(8.6kDa),130ng消化,其中2.6ng(〜300 fmol)。
      10肽/ 86%0肽/ 0%0肽/ 0%
      myoglobin.
      c 用LC-MS / MS分析13μg(17kDa),1.3μg的13μg(〜700 fmol)。
      12肽/ 84%6肽/ 52%7肽/ 50%
      a 通过LC-MS / MS分析了含有烧蚀的细菌(28kDa),400 ng,其中400ng,其中20ng(〜700 fmol)。
      b 通过LC-MS / MS对其消化的泛素(8.6kDa),130ng消化,其中2.6ng(〜300 fmol)。
      c 用LC-MS / MS分析13μg(17kDa),1.3μg的13μg(〜700 fmol)。
      泛素和细菌磷酸素实现了最显着的改进。当未使用SDS时,对于任一种蛋白质没有检测肽。相比之下,当在2%SDS存在下,分别为泛素和细菌磷酸分别完成86%(10个肽)和21%(五种肽)序列覆盖。
      使用上述三种协议遍布泛素胰蛋白酶消化的LC-MS / MS结果 Fig. 4。当未使用SDS时,在LC-MS / MS分析中检测来自遍突蛋白的肽,当未使用SDS时,在300 fmol泛素(Fig. 4, BC)。当在蛋白质溶解步骤中使用2%SDS时,随后的管凝胶消化和LC-MS / MS分析产生了10个肽,其中TOF MS扫描中具有强烈的肽信号( 图4A )MS / MS扫描中的高质量MS / MS光谱。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4用2%SDS用管凝胶消化制备的泛素胰蛋白酶肽肽基峰色谱法的比较(A),管凝胶消化没有SDS(B)和没有SDS的溶液消化(C )。 使用三种不同方案对胰蛋白酶进行胰蛋白酶进行等量的胰蛋白酶,对不同量的消化产物进行进一步的LC-MS / MS分析。使用该方法检测来自泛素的胰蛋白酶肽肽 B 或者 C。在2%SDS存在下,使用管凝胶消化观察来自遍在蛋白的10个独特的胰蛋白酶肽。它们如下: 1,EgippDQQR(m/z 520.26,2+); 2,iqdkegippdqqr(m/z 508.58,3+); 3,tlsdyniqk(m/z 541.27,2+); 4,wqifvk(m/z 410.71,2+); 5,estlhlvlr(m/z 534.29,2+); 6,titlevepsdtienvkak(m/z 663.01,3+); 7,titlevepsdtienvk(m/z 894.45,2+); 8,tltgktitlevepsdtienvk(m/z 763.38,3+); 9,tlsdyniqkestlhlvlr(m/z 533.28,4+; m/z 710.70,3+); 10,qledgrtlsdyniqkestlhlvlr(m/z 707.85,4+; m/z 566.47,5+)。 CPS. ,每秒计数。
      细菌是一种膜蛋白,具有七个跨膜结构域(
      • Subramaniam S.
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      细菌磷素矢量质子易位的分子机制。
      )。它不溶于25米m 没有SDS或其他洗涤剂的AMBIC。无论如何消化细菌磷脂蛋白悬浮液,都不检测肽并不令人惊讶。当2%SDS用于溶解杀虫剂时,随后的管凝胶消化和LC-MS / MS分析产生5种具有高质量MS / MS光谱的肽(参见 图。S2 在补充结果中)。虽然序列覆盖率为21%相对较低,但与未检测到肽的其他两种方法相比,这是显着的改进。相对低的序列覆盖可能是由于蛋白质序列中存在的有限数量的胰蛋白酶裂解位点(赖氨酸和精氨酸残基),导致适合于从凝胶基质中提取的少量胰蛋白酶肽并通过LC-MS / MS。其他蛋白水解酶如Chymotrypsin可用于解决该问题,这将在下一节中描述。
      上述实验表明,在管凝胶消化方案中包含洗涤剂显着提高了蛋白水解消化效率,从而改善了分析的蛋白质的序列覆盖率。管凝胶消化协议的独特特征是其与高浓度的洗涤剂相容性;例如,在上述实验中使用2%SDS。洗涤剂在该方案中有两种功能:改善疏水性蛋白质和变性蛋白质的溶解度。更大的溶解度将导致掺入凝胶基质中的较大量的蛋白质并进行消化。更变性的蛋白质将产生更高的蛋白质结构中的裂解位点的可用性。两者的组合将显着提高使用新的管凝胶消化方案来提高蛋白水解消化的效率。

       用胰凝乳蛋白酶蛋白的管凝胶消解 -

      为了改善管凝胶消化的序列覆盖和随后的菌毛肽的分析,使用Chymotrypsin来产生更多的蛋白水解肽。 Chymotrypsin是一种蛋白水解酶,其在TRP,PHE和Tyr的C末端优先切割位点。溶质溶质在25米中溶解m 含有2%SDS的Ambic,并在37℃下使用胰凝胶消化,在37℃下进行4小时。对于胰蛋白酶消化中使用的相同数量的细菌磷酸(700 fmol,20ng),在LC-MS / MS分析中检测到42种蛋白水解肽,覆盖了83%的BacteriorHodopsin序列。 Fig. 5 显示胰蛋白酶素管凝胶消化的LC-MS / MS分析的基峰色谱图和分析的序列覆盖。结果表明,胰凝乳素适合消化膜蛋白,因为它可以更完全地消化高度疏水的蛋白质,产生更多数量的蛋白水解肽。它还证明了管凝胶消化方案是通用的,并且可以在该方法中使用不同的蛋白水解酶。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5使用管凝胶方案在2%SDS存在下使用管凝胶方案消化细菌磷脂。A,LC-MS / MS的基峰色谱。 B,由LC-MS / MS检测的胰蛋白酶蛋白肽的序列覆盖。 20ng(700 fmol)的细菌磷酸肽的消化和分析产生42例观察到的胰凝乳蛋白肽(下划线)83%的序列覆盖率。跨膜域是 阴影 并且显然,所有七个跨膜结构域都表示在鉴定的胰凝乳肽中。 C,管凝胶胰蛋白酶消化的跨膜结构域的序列覆盖。 CPS. ,每秒计数; TMD. ,跨膜结构域。
      更有趣的是,总共24个鉴定的胰蛋白肽的26个含有来自所有七个跨膜结构域的氨基酸残基。跨膜域通过 阴影 in Fig. 5B,而且 阴影 序列明显与之重叠 下划线 序列。显示在LC-MS / MS分析中鉴定的每种跨膜结构域的酸残基的数量显示在胰凝乳肽的分析中 图5C. 。总体而言,七个跨膜结构域的序列覆盖率为82.5%。结果表明,管凝胶是分析膜蛋白的有效方法,具有显着覆盖跨膜结构域。
      为了检查管凝胶消化方案的效率和敏感性,使用如上所述的管凝胶方案消化了较低量的含有400,120,40,10和4个Fmol的细菌磷素,并通过LC-MS /小姐。当对400种FMOL的细菌膦酰上进行消化时,在随后的LC-MS / MS分析中观察到相同数量的肽(42个肽,83%序列覆盖)。观察到120和40氟摩尔的细菌磷脂分别观察到22肽(61%覆盖率)和16个肽(46%覆盖率)。在10个fmol或更低的情况下鉴定肽。应当注意,检测到的肽数和序列覆盖也通过LC-MS的检测限和数据库搜索算法的性能来确定。通过我们的系统,QSTAR XL和吉祥物数据库搜索算法,标准肽的检测限如[glu1] - 纤维蛋白肽B(EGVNDNEEGFFSAR)通常为10 fmol。管凝胶胰凝乳素消化的细菌磷脂的结果接近该研究中使用的LC-MS / MS系统的检测极限;因此,管凝胶消化方案高效。

       管凝胶消化方案在分析前列腺细胞膜蛋白的应用 -

      将管凝胶消化方案和随后的LC-MS / MS分析应用于特征从PC3细胞(前列腺癌细胞系)分离的膜蛋白。膜级分由100,000×制备 g 离心后核上清液。用0.1进一步处理颗粒 m Na2 CO. 3 (pH 11.5)在冰上为1小时。这种隔离方法可以产生高度富集的膜馏分(
      • 尼尔森P.A.
      • 奥尔森J.V.
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      通过碳酸钠处理分离细胞内膜:在内质网的应用。
      ),包括通常难以溶解和消化的蛋白质。将膜沉淀溶于25米m 含有2%SDS的Ambic(pH8.0),直至在温和混合后观察到颗粒。将溶解的膜蛋白质受到15,000× g 离心20分钟,没有观察到颗粒状物体。使用Bradford测定估计蛋白质量。将大约20μg的膜蛋白掺入20μl管凝胶中并如上所述对胰蛋白酶消化进行。提取胰蛋白酶肽并进行反向相LC-MS / MS分析。
      代表性LC-MS / MS色谱图和MS和MS / MS光谱显示在 Fig. 6。在该2.5-H LC-MS / MS实验中,获得了2757ms / MS光谱。使用LC-MS / MS数据和吉祥物MS / MS离子搜索鉴定了总量的178个蛋白质。其中,96个蛋白质(54%)具有至少一个由TMHMM服务器评估的跨膜结构域(蛋白质中的跨膜螺旋预测)(
      • 莫尔斯。
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      膜跨越区域预测方法的评价。
      )。在含有至少一种跨膜结构域的96个蛋白质中,用大于20个具有大于20的三种独特的肽鉴定出83(86%)蛋白质,特别是,对于溶质载体家庭,实现了54%的序列覆盖率25 ,成员5(NCBINR登录号GI | 33525218),一种具有两个跨膜结构域的蛋白质。结果表明,管凝胶方案非常适合于消化复合膜蛋白,并且该方案与LC-MS / MS的组合可以产生膜蛋白复杂混合物的高通量分析。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6代表性LC-MS / MS的管凝胶消化产物与前列腺癌细胞中分离的膜级分。A,总离子计数色谱。 B,基峰色谱法。 C是102.3分钟的代表性TOF MS调查扫描。 D,所选离子873.45(2+)的代表性MS / MS光谱。该特定肽的序列是Safsnlfggeplsytr,并且蛋白质被鉴定为转移素受体(Ncbinr登录号Gi | 4507457)。如“实验程序”下所述,对从前列腺癌细胞制备的约20μg膜蛋白质进行管凝胶消化方案。通过LC-MS / MS分析管凝胶消化产物(~10μg)的一半。 HPLC梯度在100分钟内从5-40%B(0.1%甲酸)线性,120分钟进一步增加至80%。信息依赖性采集实验由1-S TOF MS测量和三个2-S MS / MS实验组成。 CPS. ,每秒计数。
      相比之下,使用8.3×7.3mc的聚丙烯酰胺凝胶对相同的量(20μg)膜分离进行SDS-PAGE分离,切割20℃的20毫升切片并进行凝胶消化通过胰蛋白酶。提取来自20凝胶切片的胰蛋白酶肽,并使用相同的仪器设置对它们中的每一个进行LC-MS / MS分析。实验在50小时内完成了自动模式下的自动进样器。汇集了来自20LC-MS / MS实验的数据,并进行吉祥物MS / MS离子搜索。从更广泛的努力,鉴定了268例蛋白。 Fig. 7 总结使用这两种方法鉴定的蛋白质的数量:管凝胶消解,然后是一个LC-MS / MS分析和SDS-PAGE,然后是20LC-MS / MS分析。所有两种方法中鉴定的所有蛋白质都列入 补充表S1。两种方法通常鉴定115个蛋白质。还比较了115个常识蛋白的序列覆盖范围 补充表S1。管凝胶协议产生稍微更好的序列覆盖率,即使它是一个更简单的方法,需要更少的分析时间。确实,SDS-PAGE和20LC-MS / MS分析确定了蛋白质的〜50%。然而,在其他方法的情况下,单个LC-MS / MS运行的管凝胶消解随后是单个LC-MS / MS运行。因此,管凝胶消化方案提供了膜蛋白蛋白质组学表征的显着更好的高通量方法。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7两种不同方法鉴定的蛋白质概述。A,管凝胶消化,然后仅进行一种管 - 凝胶/ LC-MS / MS分析。 B,SDS-PAGE后跟20 LC-MS / MS分析。在每种方法中鉴定了178和268个蛋白质,其中115分别是两种方法中常用的蛋白质。
      应注意,可以对所得的蛋白水解肽进行不同类型的LC分离和质谱分析。反相LC-MS / MS主要用于本研究,但是可以根据需要容易地使用其他分离和质谱策略。例如,MALDI质谱法可用于分析含有膜蛋白的相对简单的样品。或者,如果样品是高度复杂的,则可以使用更复杂的分离,例如二维HPLC,并与串联MS一起使用,以实现复杂样品的综合表征。

       结论-

      在该研究中开发了一种新型管凝胶消化方案,以允许在不同浓度下使用各种洗涤剂,以协助膜蛋白的表征。在LC-MS / MS分析中,在高达5%的浓度下测试四种洗涤剂(SDS,NOG,CHAP和TRITON X-100),在LC-MS / MS分析中没有观察干扰。除了溶解膜蛋白外,在方案中将洗涤剂含有显着提高了蛋白水解消化效率,因此分析的序列覆盖。不同的蛋白水解酶可用于管凝胶消化方案。可以对所得的蛋白水解肽进行不同的分离和质谱法,允许柔韧性进行进一步分析。在本研究中使用反相LC-MS / MS,如果需要,可以使用二维LC-MS / MS分析。此外,在分析复杂混合物时,与传统的SDS-PAGE分离和多个LC-MS / MS分析相比,这种新颖的协议提供了显着更高的吞吐量。该管凝胶消化提供了一种新的膜蛋白的高通量蛋白质组学研究方法。

      致谢

      感谢刘立,福建张,博士博士在培养前列腺癌细胞和讨论方面的技术援助。我们感谢Alexis Vien和Renee Kilty阅读和编辑手稿。

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