线粒体氧化磷酸化复合物调节NLRP3炎症组活化,并预测鼻咽癌患者存活*

  • I-Che Chung
    隶属关系
    台湾桃园医学学院生物医学研究生院

    横源大学分子医学研究中心,台湾桃园
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  • 陈志阳陈
    隶属关系
    台湾新台北市麦凯医学院医学系252
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  • 曾荫权
    隶属关系
    台湾桃园岭龙纪念医院放射肿瘤科

    台湾桃园中医药科,桃园
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  • 文宇庄
    隶属关系
    台湾桃园省昌涌纪念医院病理科,兼昌涌大学医学院
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  • Tzu-chieh liao
    隶属关系
    台湾省桃园延云大学生物医学科学系
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  • 袁宁元
    隶属关系
    横源大学分子医学研究中心,台湾桃园
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  • 春楠欧阳
    隶属关系
    横源大学分子医学研究中心,台湾桃园
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  • David M. Ojcius.
    隶属关系
    太平洋大学生物医学科学系,旧金山,加利福尼亚州94103

    台湾桃园张涌大学分子和临床免疫学中心

    昌肾免疫学联盟,昌涌纪念医院,台湾桃园岭纪念医院
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  • 吴ch
    一致
    可以解决对应的通信:医学生物技术和实验室科学,医学院,常Gung大学,文华第一rd。,Guishan Dist。,台湾桃园市333号。电话:886-3-2118800 ext 5093。
    隶属关系
    台湾桃园医学学院生物医学研究生院

    台湾桃园医学院医学生物技术与实验室科学科学

    横源大学医学院新出现的病毒感染研究中心,台湾桃园市333

    耳鼻喉科 - 头部&颈部外科,昌涌纪念医院,台湾桃园市
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  • Yu-Sun Chang
    一致
    可以解决谁的通信:横涌大学生物医学研究所,桂花第1次康华第259号。,桂山区,台湾桃园市333号。电话:886-3-2118800 ext 5131
    隶属关系
    台湾桃园医学学院生物医学研究生院

    横源大学分子医学研究中心,台湾桃园

    耳鼻喉科 - 头部&颈部外科,昌涌纪念医院,台湾桃园市
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了Y.S.C的补助金。来自科技部(MOST),台湾(大多数105-2320-B-182-034-MY3,105-2811-B-182-029,106-2811-B-182-015和107-2811 -b-182-521)和张涌纪念医院(CGMH),台湾(CMRPD1D0101-103和BMRP021),到LCC从大多数,台湾(大多数105-2628-B-715-002-My3),Mackay Medical College,台湾(1061B25和1071B26)和Mackay Memorial医院,台湾(MMH-MM-10702),以及C.C.W.从大多数,台湾(大多数107-2320-B-182-009)和CGMH,台湾(CLRPD190018和BMRPC77),授予教育部,台湾到昌涌大学(EMRPD1G0031)。该工作也得到了横涌大学的新兴病毒感染研究中心,横来大学的分子医学研究中心的资助,由教育部和部门的高等教育新芽项目框架内的特色区域研究中心计划中科技,台湾(大多数107-3017-F-182-001)。提交人声明他们没有对本文内容的利益冲突。
    本文含有补充材料。
      我们之前据报道,肿瘤发炎物在肿瘤对照中发挥关键作用,并在鼻咽癌(NPC)中起到有利的预后标志物。活化的炎性炎症经常形成可区分的样品并控制IL-1β的细胞分泌。然而,我们对具有和不具有含有含有胱天冬酶 - 募集结构域(ASC)斑块的细胞凋亡相关的斑点蛋白质之间的细胞之间的生物和生化差异。在这项研究中,我们使用蛋白质组学ITRAQ分析分析了在顺铂治疗时分析其ASC Speck形成的NPC细胞的蛋白质体。我们鉴定了用斑点细胞差异过度表达的蛋白质,发现它们落入了两个基因本体(GO)途径:线粒体氧化磷酸化(毒物)和泛醌代谢。我们观察到奥帕洛斯机械的各种组分的上调(包括NDUFB3,NDUFB8和ATP5B),随后发现这些变化导致线粒体ROS(MTROS)生产,这促进了NLRP3炎性炎症和随后的γ凋亡的形成和激活。在NPC患者中,更好的局部复发存活与NDUFB8的高水平表达显着相关(p = 0.037) and ATP5B (p = 0.029),使用免疫组织化学检查。然而,NDUFB8和ATP5B的表达与NPC患者总存活的表达之间没有显着的关联。我们的结果表明,上调的线粒体毒药组分与NPC中的NLRP3炎性激活强烈相关。我们的发现进一步表明,毒物组分的高水平表达可以是NPC患者局部复发和/或承诺治疗靶标的标志物。

      图形概要

      炎症在不同肿瘤发生阶段起着重要的作用。驱动急性和慢性炎症的关键信号由煽动性控制,炎症是一种可诱导的细胞质多蛋白复合物,其用作感测肿瘤微环境中的危险信号的平台(
      • 他问:
      • 傅y.
      • 田D.
      • 燕W.
      炎症在癌症中的对比作用。
      ,
      • Moossavi M.
      • Parsamanesh N.
      • Bahrami A.
      • 在kin s.l.
      • Sahebkar A.
      NLRP3炎症在癌症中的作用。
      )。已经鉴定了各种炎性炎症。一些包括细胞内图案识别受体,例如点状的受体和Aim2样受体,其可以通过病原体相关的分子模式和损伤相关的分子图案来激活(
      • Awad F.
      • Assrawi E.
      • Louvrier C.
      • jumeau c.
      • Georgin-Lavialle S.
      • 格拉托G.
      • Amselem S.
      • Giurgea I.
      • Karabina S.A.
      炎症生物学,分子病理学和治疗意义。
      )。含有Caspase-Recuitment结构域的凋亡相关的斑点蛋白质(ASC)
      使用的缩写是:
      ASC.
      含有Caspase-Recuitment结构域的凋亡相关的斑点蛋白质
      c
      碰撞诱导的解离
      EB1
      结束蛋白1
      EBV.
      Epstein-Barr病毒
      等等
      电子传输链
      Flica.
      Caspase-1的荧光染料标记抑制剂
      基因本体论
      HCD.
      更高能量的碰撞诱导的解离
      IHC.
      免疫组织化学
      IRB.
      机构审查委员会
      LDH.
      乳酸脱氢酶
      LMP1
      潜在膜蛋白1
      线粒体抗病毒信号蛋白
      Mfn2
      Mitofusin 2.
      MTDNA.
      线粒体DNA
      mtΔψ.
      线粒体膜潜力
      MTROS.
      线粒体反应性氧物种
      NPC.
      鼻咽癌
      汤鸦
      氧化磷酸化
      PI.
      碘化丙烯酸铅
      Pycard.
      PYD和卡域包含
      SD.
      标准偏差
      茶科
      三乙基碳酸氢铵
      TFA.
      三氟乙酸。
      1使用的缩写是:ASC.
      含有Caspase-Recuitment结构域的凋亡相关的斑点蛋白质
      c
      碰撞诱导的解离
      EB1
      结束蛋白1
      EBV.
      Epstein-Barr病毒
      等等
      电子传输链
      Flica.
      Caspase-1的荧光染料标记抑制剂
      基因本体论
      HCD.
      更高能量的碰撞诱导的解离
      IHC.
      免疫组织化学
      IRB.
      机构审查委员会
      LDH.
      乳酸脱氢酶
      LMP1
      潜在膜蛋白1
      线粒体抗病毒信号蛋白
      Mfn2
      Mitofusin 2.
      MTDNA.
      线粒体DNA
      mtΔψ.
      线粒体膜潜力
      MTROS.
      线粒体反应性氧物种
      NPC.
      鼻咽癌
      汤鸦
      氧化磷酸化
      PI.
      碘化丙烯酸铅
      Pycard.
      PYD和卡域包含
      SD.
      标准偏差
      茶科
      三乙基碳酸氢铵
      TFA.
      三氟乙酸。
      蛋白质,也称为Pyd和含有(Pycard)的卡片结构域,由人的Pycard基因编码,并且是所有已知的炎症的关键组分。在开始炎症体激活后,所有炎症瘤募集到称为ASC斑点的大螺旋原纤维(
      • Hoss F.
      • Rodriguez-Alcazar J.f.
      • 拉茨e.
      ASC.斑点的组装和调节。
      )。 ASC Speck用作Caspase-1的信号平台,导致Caspase-1的激活,促炎细胞因子的成熟(例如 IL-1β)以及称为γ唑的程序性细胞死亡的裂变形式的启动(
      • Kovacs S.B.
      • 苗e.a.
      瓦丁姆斯:糊化瘤的作用。
      )。
      鼻咽癌(NPC)是在台湾人口突出的癌症。它与Epstein-Barr病毒(EBV)感染密切相关。在肿瘤细胞中,EBV编码的潜膜蛋白1(LMP1)通过NF-κB信号传导介导PRO-IL-1β基因表达(
      • Chen L.C.
      • 王L.J.
      • 曾地下
      • Ojcius下午。
      • 陈C.C.
      • 欧阳C.N.
      • Hsueh C.
      • 梁Y.
      • chang k.p.
      • 陈C.C.
      • 常年。
      肿瘤炎症衍生的IL-1BETA新核酸中性粒细胞,并改善了EBV诱导的鼻咽癌中的局部复发存活。
      )。在NPC肿瘤肿瘤或肿瘤微环境中,促炎细胞因子(包括IL-1β)的水平升高(
      • 黄玉。
      • Sheen T.S.
      • Chen C.L.
      • 卢杰。
      • 常年
      • 陈俊。
      • Tsai C.H.
      鼻咽癌中细胞因子表达的概况:肿瘤和CD4 + T细胞中白细胞素1的明显表达。
      )。实际上,据报道,IL-1β和NLRP3,AIM2和RIG-I炎症的升高为预后生物标志物,用于预测随着当前方案治疗的NPC患者的更好的无复发存活率(
      • Chen L.C.
      • 王L.J.
      • 曾地下
      • Ojcius下午。
      • 陈C.C.
      • 欧阳C.N.
      • Hsueh C.
      • 梁Y.
      • chang k.p.
      • 陈C.C.
      • 常年。
      肿瘤炎症衍生的IL-1BETA新核酸中性粒细胞,并改善了EBV诱导的鼻咽癌中的局部复发存活。
      )。据报道,调节微管聚合的端结合蛋白1(EB1),以通过NPC细胞中的NLRP3,AIM2和RIG-I发炎物的ASC免疫沉淀,并被发现响应AIM2炎性的斑点形成激活(
      • 王L.J.
      • HSU C.W.
      • 陈C.C.
      • 梁Y.
      • Chen L.C.
      • Ojcius下午。
      • 曾地下
      • Hsueh C.
      • 吴C.C.
      • 常年。
      互蛋白微内的分析将末端结合蛋白1识别为黑色素瘤2(Aim2)炎症中活化不存在的斑点颗粒形成的关键组分。
      )。 EB1还被证明介导IL-1β的自噬依赖性分泌,并且发现EB1介导的自噬和炎症诱导的IL-1β的分泌是由5'活化的蛋白激酶调节(
      • 王L.J.
      • 黄鹤。
      • 黄梅皮。
      • 刘德
      • 张爱力。
      • 吴C.C.
      • Ojcius下午。
      • 常年。
      微管相关蛋白EB1将Aim2炎症与自噬依赖性分泌联系起来。
      )。其他研究发现,NLRP3炎性炎症由EBV-LMP1和化学治疗剂,顺铂,在NLRP3敲低NPC细胞中激活(
      • Chen L.C.
      • 王L.J.
      • 曾地下
      • Ojcius下午。
      • 陈C.C.
      • 欧阳C.N.
      • Hsueh C.
      • 梁Y.
      • chang k.p.
      • 陈C.C.
      • 常年。
      肿瘤炎症衍生的IL-1BETA新核酸中性粒细胞,并改善了EBV诱导的鼻咽癌中的局部复发存活。
      ,
      • cai t.t.
      • 叶S.B.
      • 刘Y.N.
      • 他J.
      • 陈Q.Y.
      • Mai H.Q.
      • 张c.x.
      • 崔J.
      • 张X.S.
      • Busson P.
      • 曾y.x.
      • 李杰。
      LMP1介导的糖酵解诱导鼻咽癌中的骨髓衍生的抑制细胞膨胀。
      )。然而,我们对激活的炎性炎症的其他细胞成分的变化相对较少。
      出现的证据表明,线粒体不仅作为细胞的能量动力,它们也可以作为能够激活信号途径来调节先天和自适应免疫力的信令细胞器(
      • Weinberg S.E.
      • Sena L.A.
      • 枝形苔醛N.S.
      线粒体在规定先天和自适应免疫力。
      )。最近的研究表明,线粒体功能障碍可能是至关重要调节NLRP3炎症组的活化(
      • 刘Q.
      • 张D.
      • 胡d.
      • 周X.
      • 周Y.
      线粒体在NLRP3炎症活化中的作用。
      )。 NLRP3炎症组活化涉及可以在线粒体功能障碍(例如线粒体膜电位(MTδ1)下改变的各种参数(
      • 钟Z.
      • UMEMURA A.
      • Sanchez-Lopez E.
      • 梁S.
      • Shalapour S.
      • Wong J.
      • Boassa D.
      • Perkins G.
      • 阿里S.R.
      • 麦格纳姆M.D.
      • Ellisman M.H.
      • Seki E.
      • Gustafsson A.B.
      • Hoffman H.M.
      • Diaz-Meco M.T.
      • Moscat J.
      • 卡琳米
      NF-Kappab通过消除受损的线粒体来限制炎症体活化。
      ),线粒体外膜透化(
      • 霍恩特T.
      NLRP3炎症触发中的钙信号和线粒体稳定化。
      )和线粒体衍生分子的水平[(例如 线粒体ROS(MTROS)(
      • 周R.
      • yazdi a。
      • 菜单P.
      • Tschopp J.
      线粒体在NLRP3炎症体激活中的作用。
      ),释放线粒体DNA(MTDNA)(
      • 钟Z.
      • 梁S.
      • Sanchez-Lopez E.
      • Shalapour S.
      • 林X.J.
      • Wong J.
      • 丁S.
      • Seki E.
      • Schnabl B.
      • Hevener A.L.
      • 格林伯格H.B.
      • Kisseleva T.
      • 卡琳米
      新的线粒体DNA合成使NLRP3炎症组活化能够。
      )和cardiolipin(
      • IYER S.S.
      • 他问:
      • Janczy J.R.
      • Elliott E.I.
      • 钟Z.
      • Olivier A.K.
      • Sadler J.J.
      • Knepper-Adrian V.
      • 韩兰。
      • 乔L.
      • 艾森巴特斯S.C.
      • nauseef w.m.
      • 卡塞尔S.L.
      • Sutterwala F.S.
      NLRP3炎症组活化需要线粒体心脂。
      )]和线粒体 - 驻留分子[(例如 线粒体抗病毒信号蛋白(MAVS)(
      • Subramanian N.
      • Natarajan K.
      • Clatworthy M.R.
      • 王Z.
      • 梅花r.n.
      适配器MAVS促进NLRP3线粒体定位和炎症活化。
      )和mitofusin 2(mfn2)(
      • Ichinohe T.
      • Yamazaki T.
      • Koshiba T.
      • yanagi y。
      在RNA病毒感染后NLRP3炎性组织活化需要线粒体蛋白质mitofusin 2。
      )]。值得注意的是,MAVS和MFN2有助于重新分配细胞溶质NLRP3至线粒体外膜,并增强NLRP3炎症组活化。此外,MTROS可以氧化MTDNA,导致进一步的NLRP3炎症组活化。
      电子传输链(ETC)位于线粒体内膜中。它是氧化磷酸化(毒物)的主要来源,并且参与能量的产生:氧气作为电子受体,并且来自糖酵解产生的NADH和FADH2的电子和TCA循环用于产生ATP。通过等,质子在线粒体的内膜上运输以产生mtδψ。机械地,线粒体潜力的丧失与MTROS的生产有关(
      • 周R.
      • yazdi a。
      • 菜单P.
      • Tschopp J.
      线粒体在NLRP3炎症体激活中的作用。
      )和蜂窝CA的变化2+ (
      • TriantaFilou K.
      • 休斯。
      • Triantafilou M.
      • 摩根B.P.
      补体膜攻击复合物触发细胞内Ca2 +通量导致NLRP3炎症组活化。
      )在NLRP3炎症体激活的背景下。此外,线粒体是细胞ROS的主要来源(
      • 磨坊E.L.
      • 凯莉B.
      • o'neill l.a.j.
      线粒体是免疫力的动力。
      )。几种证据支持MTROS激活NLRP3炎症组形成和激活的观念。例如,毒物抑制剂触发MTROS生产,这可能导致NLRP3炎症组(
      • 周R.
      • yazdi a。
      • 菜单P.
      • Tschopp J.
      线粒体在NLRP3炎症体激活中的作用。
      )。同时,我们以前表明E3泛素连接酶CBL,通过抑制NLRP3炎症组活化来减少MTROS生产(
      • Chung i.C.
      • 袁S.N.
      • 欧阳C.N.
      • 林H.C.
      • 黄克.Y.
      • 陈Y.J.
      • Chung A.K.
      • Chu C.L.
      • Ojcius下午。
      • 常年。
      • Chen L.C.
      SRC-Family激酶-CBL轴负调节NLRP3炎症组活化。
      )。在一起,前面的结果表明,MTROS可以是NLRP3炎性激活的上游稳压因子。
      在此,我们报告说,线粒体毒液组分富集在ASC斑阳性NPC细胞中,并且可能参与NLRP3炎症组活化和细胞γ胃凋亡。此外,毒物细胞中高度表达的毒物组分,并与NPC患者的更好后治疗生存显着相关。我们的研究结果进一步阐明了线粒体介导的NLRP3炎症组活化的分子机制,并表明过表达的羟氏蛋白可以证明是NPC患者局部复发的有利标志物。

      实验步骤

       细胞培养

      EBV.阳性NPC细胞系NPC-HK1-EBV和EBV阴性NPC细胞系NPC-HK1由S. W. Tsao博士(香港大学,SAR,中国)和如前所述培养(
      • Chen L.C.
      • 王L.J.
      • 曾地下
      • Ojcius下午。
      • 陈C.C.
      • 欧阳C.N.
      • Hsueh C.
      • 梁Y.
      • chang k.p.
      • 陈C.C.
      • 常年。
      肿瘤炎症衍生的IL-1BETA新核酸中性粒细胞,并改善了EBV诱导的鼻咽癌中的局部复发存活。
      ,
      • 罗A.K.
      • LO K.W.
      • Tsao S.W.
      • Wong H.L.
      • 惠J.W.
      • k.f.
      • 海沃德D.S.
      • Chui Y.L.
      • LAU Y.L.
      • 高田K.
      • 黄D.P.
      Epstein-Barr病毒感染改变人鼻咽上皮细胞中的细胞信号级联。
      )。 NPC-BM1细胞系是从雌性台湾患者的骨髓活检建立的NPC并如前所述培养(
      • 廖S.K.
      • Perng Y.P.
      • 沉Y.C.
      • 钟P.J.
      • 常年。
      • 王C.H.
      衍生自骨髓转移性病变的新鼻咽癌细胞系(NPC-BM1)的染色体异常。
      )。对于NPC-HK1-ASC-GFP和NPC-BM1-ASC-GFP细胞,使用商业慢病毒转导方案(Sigma-)用含有ASC-GFP质粒的慢病毒颗粒转导NPC-HK1和NPC-BM1细胞aldrich,圣路易斯,mo)。对于炎症体活化,用40μm处理细胞m 顺铂(猫#P4393; Sigma-Aldrich),10μm nigericin(猫#n7143;西格玛 - aldrich),5米m ATP(猫#A7699; Sigma-Aldrich),200μm 单钠(MSU)晶体(CAT#TLRL-MSU; INVIVOLON,SAN DIEGO,CA)或200μm alum(猫#tlrl-alk; Invivogen)。对于MTROS清除剂治疗,将细胞用MITOTEMPO(CAT#SML0737; Sigma-Aldrich)预孵育1小时。

       ASC.-GFP斑块细胞的产生和流式细胞术分离

      用40μm处理NPC-HK1-ASC-GFP和NPC-BM1-ASC-GFP细胞m 24小时的顺铂(NPC-HK1-ASC-GFP)或30小时(NPC-BM1-ASC-GFP)和ASC斑点(+) 和 speck( - ) 如前所述,通过流式细胞术分离细胞(
      • Chung i.C.
      • 袁S.N.
      • 欧阳C.N.
      • 林H.C.
      • 黄克.Y.
      • 陈Y.J.
      • Chung A.K.
      • Chu C.L.
      • Ojcius下午。
      • 常年。
      • Chen L.C.
      SRC-Family激酶-CBL轴负调节NLRP3炎症组活化。
      ,
      • 肉体D.P.
      • Thygesen S.J.
      • SAGULENKO V.
      • vajjhala p.r.
      • Cridland J.A.
      • Vitak N.
      • 陈K.W.
      • 奥斯本G.W.
      • 施罗德K.
      • Stacey K.J.
      一种评估炎性组织形成的新型流式细胞术方法。
      )。简而言之,通过在炎症激活后的发射荧光的减小的脉冲宽度(W)来检测ASC-GFP蛋白的转运,并且每种细胞染色的ASC-GFP总量较高用ASC斑点的细胞。因此,脉冲区域简档的低脉冲宽度(ASC-W:ASC-A配置文件)被视为表示ASC Speck(+) 细胞 and ASC speck( - ) 细胞分别)。然后我们通过流式细胞术方法对ASC-GFP斑点进行分类或不存在。

       胰蛋白酶消化和ITRAQ标签的样品制备

      通过流式细胞术分离NPC-HK1-ASC-GFP和NPC-BM1-ASC-GFP细胞,并在含有100米的缓冲液中裂解m 三乙基铵碳酸氢铵(Teabc; Sigma-Aldrich)和0.1%RapigestTM值 SF(Waters Corporation,Milford,MA)冰上15分钟。收集细胞裂解物,在冰上超声处理并以10,000×离心 g 在4°C下25分钟。将所得上清液用作细胞提取物。使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)测定蛋白质浓度。对于溶液内消化,用4.8米降低每个样品的20μg蛋白质m Tris-(2-羧乙基) - 膦(Sigma-Aldrich)和260米m 茶杯在60℃下1小时,然后用9.6米烷基化m 室温下甲基甲基磺酸甲酯(Sigma-Aldrich)30分钟。使用胰蛋白酶与蛋白质比为1:1(w / w),在37℃下在37℃下消化蛋白质过夜过夜。根据制造商的议定书,用Itraq试剂(AB Sciex,Foster City,CA)标记胰蛋白酶消化的肽。来自ASC斑点的肽( - ) 和 speck(+) 用ITRAQ 114和115标签标记细胞。对于生物重复,ITRAQ 116和117标签与从不同批次的ASC斑点获得的肽样品一起温育( - ) 和 speck(+) 细胞。在室温下孵育1小时后,使用蛋白质组学中心entivap浓缩器系统(Labconco,堪萨斯城,Mo)将四个标记的样品合并,冷冻并冻干至干燥。
      使用与树脂-c包装的Ziptip(Merck Millipore,Billerica,MA)脱谷肽18 (GE Healthcare,英国)。简而言之,足够体积的树脂-c18 (将10μl蛋白质为10μl蛋白质)填充到Ziptip中。激活树脂-c18,以75%,40和3%在1%三氟乙酸(TFA)的浓度下依次加载Ziptip,以200μl乙腈(Mallinckrodt Baker,Ireland),然后以300rpm离心30秒。该步骤重复三次以确保完全激活。将干燥的ITRAQ标记的肽样品重构为0.1%TFA至最终蛋白质浓度为1μg/μl。将重构的肽装入Ziptip中,以300rpm离心30 s,并用3%乙腈洗涤1%TFA。最后,将标记标记的肽样品从ZIPTIP洗脱,以1%TFA的30%,50%和70%乙腈洗脱,并通过真空离心干燥。

       肽分馏和LC-MS / MS分析

      使用在线2D-HPLC系统(Dionex Ultimate 3000,Thermo Fisher Sciencific)和如前所述分析(
      • 林M.H.
      • 李C.C.
      • 舒准。
      • 楚H.W.
      • 刘C.C.
      • 吴C.C.
      外蛋白酶谱揭示重组PRSA参与在细胞表面性质和金黄色葡萄球菌的发病机制中。
      )。简而言之,将肽(20μg)重悬于0.1%甲酸(20μl)中,并使用与C的Ziptip填充物脱落18 树脂(5-20​​μm,lichroprep rp-18;默克,台北,台湾)。将所得样品真空干燥,在50μl缓冲液A(0.1%甲酸和30%乙腈)中重构,并以5的流速将其装载到自制柱(Luna Scx,5μm,0.5×180mm)上μl/ min 30分钟。然后用0-100%的缓冲液B梯度洗脱肽(0.5 m 氯化铵,30%乙腈和0.1%甲酸)。在被捕获到Zorbax 300sb-C上之前,将得到的44个肽级分在线稀释18 柱(0.3×5 mm;安捷伦技术,威尔明顿,de)。然后使用缓冲液C(含有0.1%甲酸的乙腈)在自制塔(Hydrodorp2.5μm,75μm,75μm内径和20cm长度)上分离每个级分。缓冲液C的直线梯度(328%37分钟,28-50%,2分钟,50-95%2分钟,5分钟为95%,9分钟为3%) 0.3μl/ min。
      LC设备连接到LTQ-orbitrap Elite质谱仪(Thermo Fisher Scientific),其使用Xcalibur软件(2.2版,Thermo Fisher Scientific)进行操作。全扫描MS在斜面上进行,范围为400到2000 DA,分辨率为60,000 m/z 400.(SI(CH)的离子信号3)2o)6H+m/z 445.120025,462.146574和536.165365用于锁定质量和内部校准。六个碰撞诱导的解离(CID)和六个更高能量碰撞诱导的解离(HCD)的每12个数据相关的MS / MS扫描事件随后是预览MS扫描中的六个最丰富离子的一个MS扫描。这 m/z 为MS选择的值2 用1.5 da的相对质量窗口动态排除40秒。将电喷雾电压设定为1.8kV,毛细管的温度设定为220℃。应用自动增益控制以排除离子阱的过度填充,1000 ms / 2×106 ions, 150 ms/5 × 103 离子和300 ms / 3×104 将离子设置为全扫描,CID和HCD的最大累积时间/离子。

       序列数据库搜索和定量数据分析

      使用Proteome Discoverer软件(Thermo Fisher Scientific)进行蛋白质数据库搜索与ITRAQ数据分析的报告离子量点节点进行。使用吉祥物搜索引擎搜索MS / MS Spectra以针对瑞士 - Prot人的序列数据库(2018/03释放,选择为同性恋者; 20,198个条目)(2.2.0版;矩阵科学,伦敦,英国)。对于肽鉴定,允许一种缺少的胰蛋白酶切割。对于完整的肽质量,CID片段离子和HCD片段离子,允许10ppm,0.5da和0.05da的大规模公差。氧化甲硫氨酸(+ 16Da)被认为是潜在的可变改性,ITRAQ(N-末端,+ 144Da),ITRAQ(K,+ 144Da)和甲基甲基磺酸甲酯(C,+ 46Da)被认为是固定的修饰。在蛋白质组发现者中过滤搜索结果(肽谱匹配)以获得高度自信的肽鉴定,以确保整体错误发现率小于0.01。排除了上皮角蛋白的鉴定。除去具有单肽命中的蛋白质。每种定量蛋白质含有至少两个可量化的光谱。定量数据从蛋白质组发现者出口并手动归一化,使得日志2 蛋白质比对于每种蛋白质中的所有肽显示出零的中值值。这是在整个标记实验中进行的,以校正蛋白质丰度的任何变化。根据同一ASC斑点之间的蛋白质水平的比较选择用于确定是否考虑蛋白质的蛋白质的截止值( - ) 在两种不同的批次中的样品。 LOM2比率大于平均比例加上一个标准偏差(S.D.)的蛋白质和LOM2比例小于平均值的标准比。分别过表达和曝光过度表达。

       RNA干扰

      ndufb3(感测5'-uggcu uugca aagag uguuu c-3',5'- ccgca augaa gcuug gcuug gcau a-3'),ndufb8(感测5'-ccaaag cagua Uccuu acaau-3',5'-ccugg Cuuuc Augau Auuca U -3'),NDUFB5(感测5'- Gucaa Gcuga Acuag Cagaa A-3',5'-Cgaaa Gcaac Uccug Acaau U-3'),MT-Co2 (感测5'-ccauc Auccu Agucc ucau-3',5'-gaucc cucccuacc Aucaa a-3',5'-gcaau ucccg gacu cuaa-3'),ATP5B(感测5'-Gcaca Guaag Gacua Uugcu A-3 ',5'-gcguu ucuug ucuca gccau u-3'),ATP5h(Sense 5'- CccGu Gccag Aggau Aaaua U-3',5'-CCauu GCuag UCCCCCCCCCCCCCCCUCCCUCCCC和ATP5J(Sense 5'-Gaucc Uauac Agaaa Cucuu U-3',5'-Gagga CCugu Ugaug Cuagu U-3')Sirnas购自MDBIO(台北,台湾)。负对照siRNA购自Invitrogen(Carlsbad,CA)。用50 n转染细胞m 根据制造商的说明,使用Jetprime(Polyplus Transfection,New York,NY)的DSRNA双工。孵育4小时后,除去DSRNA复合物,将细胞在5ml新鲜培养基中重新镀。

       Western Blotting.

      如前所述进行蛋白质印迹分析(
      • Chung i.C.
      • 袁S.N.
      • 欧阳C.N.
      • 林H.C.
      • 黄克.Y.
      • 陈Y.J.
      • Chung A.K.
      • Chu C.L.
      • Ojcius下午。
      • 常年。
      • Chen L.C.
      SRC-Family激酶-CBL轴负调节NLRP3炎症组活化。
      )。简而言之,在含有蛋白酶抑制剂混合物(猫咪#04693116001;冰上的RIPa缓冲液中裂解细胞30分钟,然后离心(在4°C下12,000rpm 10分钟)。通过SDS-PAGE进一步解决蛋白质裂解物并转移到硝酸纤维素膜(英国Amersham Biosciences)。将膜与初级抗人抗体抵抗NDUFB8(1:1000;猫#HPA003886; Sigma-Aldrich),ATP5D(1:2000;猫#A9929; Abclonal,Woburn,MA),ATP5J(1:2000;猫#A3751; ATP5H(1:2000;猫#A4425; Abclonal),NDUFB3(1:500; Cat#SC-393351; Santa Cruz Biotechnology,Santa Cruz,CA),DNUFB5(1:1000;猫#SC -514245;圣克鲁斯生物技术),ATP5B(1:1000;猫#SC-55597; Santa Cruz Biotechnology),ATP5F1(1:500; Cat#SC-514419; Santa Cruz Biotechnology),GAPDH(1:2000;猫# SC-32233; Santa Cruz Biotechnology),actin(1:3000;猫#mab1501; merck millipore),或mt-co2 (1:2000;猫#A6404; Invitrogen)。将印迹与HRP缀合的二抗(1:5000; Sigma-Aldrich)反应,并用工具极端ECL-HRP衬底检测免疫反应带(猫#TU-ECL03; Biotools,台湾)。

       IL-1βELISA

      根据制造商的说明,使用人IL-1βELISA成熟套件(猫咪#88-7261; eBioscience,San Diego,CA)检测人体IL-1β。

       MTROS测量

      根据制造商的协议,如前所述使用Mitosox(Cat#M36008,Invitrogen)测量MTROS(
      • Chung i.C.
      • 袁S.N.
      • 欧阳C.N.
      • 林H.C.
      • 黄克.Y.
      • 陈Y.J.
      • Chung A.K.
      • Chu C.L.
      • Ojcius下午。
      • 常年。
      • Chen L.C.
      SRC-Family激酶-CBL轴负调节NLRP3炎症组活化。
      )。将NPC细胞与Mitosox一起温育(5μm)在37℃下20分钟,然后通过流式细胞术分析。

       乳酸脱氢酶(LDH)释放测定

      根据制造商的指示,使用LDH细胞毒性检测试剂盒(Takara Bio Inc.,Shiga,Shiga,日本)在培养上清液中检测到LDH水平。如前所述(
      • Chung i.C.
      • 欧阳C.N.
      • 袁S.N.
      • 李H.P.
      • 陈军。
      • Shieh H.R.
      • 陈Y.J.
      • Ojcius下午。
      • Chu C.L.
      • yu J.s.
      • 常年。
      • Chen L.C.
      PyK2通过直接磷酸化ASC激活NLRP3炎性炎症,并有助于抑制炎症凋亡的腹膜炎。
      )。简而言之,收集每种培养上清液,在4℃下以1200rpm以1200rpm离心5分钟并与底物温育。使用Spectramax M2微孔板读取器(Molecular Devices,San Jose,CA),在490nm下测量红色甲藻产物的吸光度。用于计算LDH释放百分比的公式如下:[(LDH样品) - (LDH阴性对照)] / [(LDH阳性对照) - (LDH阴性对照)]。 LDH从未处理的细胞自发地释放用作LDH阴性对照,而从2%Triton-X-100处理的细胞释放的最大LDH作为LDH阳性对照。

       Caspase-1活性和糊化细胞死亡的测定

      根据制造商的说明,使用Caspase-1(Flica,Fam-YVAD-FMK)试剂(免疫化技术,Bloomington,Mn)的荧光染料标记抑制剂检测活性Caspase-1。通过使用FlICA和碘化丙锭(PI)进行双染料来评估糊化细胞死亡,然后进行流式细胞术。

       患者特征

      本研究根据赫尔辛基宣言所示的原则进行,并经由长涌医疗基金会的机构审查委员会(IRB)审查和批准,台湾桃园。从2003年到2013年,从张涌纪念医院观看的78名NPC患者收获了免疫组织化学的标本。在样本收集之前,每个参与者签署了IRB批准的知情同意书。诊断的中位年龄为49.7岁(范围,25.5-78.8),雄性与女性比例为2.4:1。临床阶段是根据第7版美国癌症(AJCC)分期手册第7版修订的癌症分期系统。所有注册患者都完成了放疗治疗。其中,74名患者接受了额外的化疗。主要部位发生的任何复发是局部复发。根据原发性放射治疗到死亡日期或最后一次随访的时间计算出局部复发存活和整体存活。患者特征和临床特征如图所示 Fig. 5A。如前所述进行的患者的检查和注册(
      • HSU C.W.
      • 陈Y.T.
      • Hsieh Y.J.
      • chang k.p.
      • hsueh p.c.
      • 陈T.W.
      • yu J.s.
      • 常年。
      • Li L.
      • 吴C.C.
      利用代谢物和转录组织的集成分析显示口腔鳞状细胞癌中多胺途径的扰动。
      )。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5NDUFB8和ATP5B在NPC患者中具有更高存活的关联。 A,NPC患者的临床病理参数。 BNPC.肿瘤细胞中NDUFB8和ATPT5B蛋白的表达水平。细胞与蛋白质特异性抗体免疫组织化学染色,并在400倍放大率下证明结果。 C,Kaplan-Meier对NPC患者NDUFB8表达(左侧面板)或ATP5B表达(右侧面板)的局部复发存活曲线的存活分析。 D,NPC组织中NDUFB8表达与ATP5B表达的相关性。 EKaplan-Meier对NPC患者的局部复发存活曲线对NDUFB8和ATP5B的表达的局部复发存活曲线的存活分析。符号:*p < 0.05; **p < 0.01.

       免疫组织化学(IHC)

      如前所述进行IHC分析(
      • Chen L.C.
      • 王L.J.
      • 曾地下
      • Ojcius下午。
      • 陈C.C.
      • 欧阳C.N.
      • Hsueh C.
      • 梁Y.
      • chang k.p.
      • 陈C.C.
      • 常年。
      肿瘤炎症衍生的IL-1BETA新核酸中性粒细胞,并改善了EBV诱导的鼻咽癌中的局部复发存活。
      )。我们使用针对NDUFB8的一抗(1:150;猫#HPA003886; Sigma-Aldrich)和ATP5B(1:100;猫#SC-55597; Santa Cruz Biotechnology)。染色强度被归类为0(阴性),1(弱),2(中等)或3(强)。 H分数与组合染色强度和阳性细胞的比例反射蛋白表达,并用于将试样/患者分为两类:“高级”表达(NDUFB8分数≥100和/或ATP5B分数≥130)和“低-level“表达式(NDUFB8分数<100和/或ATP5B分数<130)。所有案件都被经验丰富的病理学家评分。

       实验设计与统计理由

      为了研究NLRP3炎症组活化,用NLRP3激活刺激处理NPC细胞,包括顺铂,Nigericin,ATP,MSU或明矾。对于基于ITRAQ的LC-MS / MS分析,ASC斑点( - ) 和 speck(+) 在两个独立的生物重复中分析NPC-HK1-ASC-GFP细胞。根据同一ASC斑点之间的蛋白质水平的比较选择用于确定是否考虑蛋白质的蛋白质的截止值( - ) 在两种不同的批次中的样品。 LOG2比率大于平均比例加上一个S.D的蛋白质。并且LOG2比率小于平均值减去一个S.D。分别过表达和曝光过度表达。通过计算富集的Metacore途径分析包或David生物信息学资源,预测了所鉴定蛋白的功能性富集分析。 p 不同类型基因集中的值。我们选择了ITRAQ比率的蛋白质(ASC Speck(+) 细胞 相对 ASC. speck( - ) 细胞在两个生物重复酸盐中的平均值上以上至少2SD,并使它们进一步使用Western印迹进行验证。另外,NPC-BM1细胞,另一种NPC细胞系还用于研究斑块之间的蛋白质谱的差异(+) 和 speck( - ) 细胞通过ITRAQ的蛋白质组学分析。
      此外,我们进一步研究了候选蛋白是否对于用siRNA的基因敲低来调节NLRP3炎症组活化和线粒体功能是必不可少的。我们评估了在我们已建立的细胞模型中的NLRP3炎症体激活(NLRP3介导的ASC斑块形成,Caspase-1激活,IL-1β分泌和细胞糊酶)和线粒体活性(MTROS生产)中的功能。 。数据显示为平均值±S.D.三个独立实验,并与学生分析 t 测试。 p 值小于0.05被认为是显着的。
      确定NPC中毒物蛋白表达与临床病理参数之间的关联。收获的78名NPC患者的样品用于IHC分析。通过评估染色强度和染色阳性细胞的百分比来评价靶蛋白的表达水平。此外,我们寻找蛋白质表达与患者存活之间的相关性。使用PASW统计18.0.0统计软件包(SPSS Inc.,2009)进行统计分析,如前所述(
      • Chung i.C.
      • 袁S.N.
      • 欧阳C.N.
      • 林H.C.
      • 黄克.Y.
      • 陈Y.J.
      • Chung A.K.
      • Chu C.L.
      • Ojcius下午。
      • 常年。
      • Chen L.C.
      SRC-Family激酶-CBL轴负调节NLRP3炎症组活化。
      )。使用Kaplan-Meier估算器进行存活分析。日志等级测试用于比较两组的生存曲线并计算相关的曲线 p 价值。使用Cox比例危害模型进行多元分析,鉴定了哪些协变量与局部复发的存活和整体存活有关。相关的 p COX回归后计算值。此外,使用Pearson的Chi平方测试评估NDUFB8和ATP5B的表达水平之间的相关性。一种 p 值小于0.05被认为是显着的。

      结果

       没有ASC斑点的NPC细胞中差异表达蛋白质的综合蛋白质组学分析

      炎性组是一种感觉综合体,其响应于病原体和损伤诱导的信号而改变免疫系统。为了在用NLRP3激活刺激处理后阐明NLRP3炎性炎症的活化,我们用NLRP3刺激治疗NPC-HK1细胞,包括治疗药物顺铂,孔形成毒素Nigericin,ATP,MSU晶体或明矾(
      • Chen L.C.
      • 王L.J.
      • 曾地下
      • Ojcius下午。
      • 陈C.C.
      • 欧阳C.N.
      • Hsueh C.
      • 梁Y.
      • chang k.p.
      • 陈C.C.
      • 常年。
      肿瘤炎症衍生的IL-1BETA新核酸中性粒细胞,并改善了EBV诱导的鼻咽癌中的局部复发存活。
      ,
      • 马丁顿F.
      • Petrilli V.
      • 市长A.
      • Tardivel A.
      • Tschopp J.
      痛风相关的尿酸晶体活化NALP3炎症。
      ,
      • Hornung V.
      • Bauernfeind F.
      • 哈莉阿。
      • Samstad E.O.
      • kono h.
      • 岩石K.L.
      • Fitzgerald K.A.
      • 拉茨e.
      二氧化硅晶体和铝盐通过噬菌体稳定化激活NALP3炎性。
      ,
      • Katsnelson M.A.
      • rucker l.g.
      • russo h.m.
      • 杜巴克G.R.
      K +渗透剂激动剂诱导NLRP3炎症组合独立于CA2 +信号传导。
      )。用NLRP3活化剂处理的NPC-HK1细胞中IL-1β的分泌显着增加(左图 Fig. 1A)。此外,据报道,EBV感染与NPC连接,EBV阳性NPC-HK1-EBV细胞也用于用NLRP3活化剂(顺铂,Nigericin,ATP,MSU或ALUM)处理后的炎症活化。当我们使用EBV阳性NPC细胞(NPC-HK1-EBV)(右侧)时,获得了对IL-1β分泌的类似效果 Fig. 1A)。用顺铂(0.25%至5.59%),Nigericin(0.35%至3.05%),ATP(0.47%至1.81%),MSU(从0.19%到0.70%)(0.0%至0.70%) )或明矾(从0.16%到0.31%)(补充图。S1)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1ITRAQ分析以鉴定蛋白质,在具有或没有ASC斑点的NPC-HK1细胞中差异表达。 一种, 用顺铂处理NPC-HK1和NPC-HK1-EBV细胞(40μm),nigericin(10μm),ATP(5米m),MSU(200μm)或明矾(200μm)24小时。通过酶联免疫吸附测定(ELISA)在细胞的培养培养基中测量IL-1β的浓度。符号:*p < 0.05; **p < 0.01. B,ASC-GFP融合蛋白在NPC-HK1细胞中过表达。对细胞裂解物进行蛋白质印迹,用于ASC蛋白和β-肌动蛋白。 C,基于ITRAQ的蛋白质组学方法的流程图。 NPC-HK-1-ASC-GFP细胞用顺铂处理(40μm)对于24小时,通过流式细胞术(低和高脉冲宽度(W)脉冲区域(a)分布(ASC-W:ASC-A简介)分离ASC含有含量的细胞(ASC-W:ASC-A轮廓)。指示ASC Speck(+) 细胞 and ASC speck( - ) 分别进行细胞和基于ITRAQ的定量蛋白质组学分析。 D,总共634种蛋白质在斑点中富集(过表达)(+) 顺铂刺激后NPC-HK-1-ASC-GFP细胞。 E,饼图,显示发现蛋白质的细胞定位百分比以斑点(过表达)(+) NPC-HK-1-ASC-GFP细胞,如使用功能丰富分析工具的评估(http://www.funrich.org/)。
      以前的研究表明,NLRP3炎症组函数由均型结构域相互作用介导的蛋白质募集到复合物中,这导致形成斑点颗粒(
      • 陆A.
      • magupalli v.g.
      • 阮J.
      • 尹Q.
      • Atianand M.K.
      • vos m.r.
      • Schroder G.F.
      • Fitzgerald K.A.
      • 吴H.
      • Egelman E.H.
      ASC.依赖性炎症组装的统一聚合机制。
      )。然而,参与NLRP3-ASC斑块形成和炎症组活化的分子机制仍不清楚。为了解决这种差距,我们在此建立了稳定表达ASC-GFP融合蛋白的NPC-HK1细胞(以下简称为NPC-HK1-ASC-GFP细胞)(Fig. 1B)。 NPC-HK1-ASC-GFP细胞允许我们在视觉上监测ASC斑块形成,以响应于各种NLRP3激动剂的治疗(补充图。S1)。另外,在用NLRP3活化剂处理的NPC-HK1-ASC-GFP细胞中证明了IL-1β分泌的显着增加(补充图。S1)。实际上,用顺铂治疗细胞(〜6%斑点(+) 通常用于治疗NPC的细胞表现出比其他NLRP3激动剂的ASC斑块形成更高百分比,包括Nigericin(3.05%),ATP(1.81%),MSU(0.70%)或明矾(0.31%)(
      • SZE H.
      • Blanchard P.
      • ng w.t.
      • Pignon J.P.
      • 李阿维。
      鼻咽癌的化疗 - 当前推荐和争议。
      )(下面的小组 Fig. 1C补充图。S1)。调查斑点之间的蛋白质组学差异(+) 和 speck( - ) 细胞,我们通过流式细胞术分离这些细胞群(
      • 肉体D.P.
      • Thygesen S.J.
      • SAGULENKO V.
      • vajjhala p.r.
      • Cridland J.A.
      • Vitak N.
      • 陈K.W.
      • 奥斯本G.W.
      • 施罗德K.
      • Stacey K.J.
      一种评估炎性组织形成的新型流式细胞术方法。
      )并使其进行伊特拉克的蛋白质组学分析(Fig. 1C)。基于ITRAQ的分析导致4820和4780个蛋白质被鉴定出来(补充表S1)和量化(补充表S2), 分别。发现总共634种蛋白质在斑点中富集(过表达)(+) 顺铂刺激后NPC-HK1-ASC-GFP细胞(Fig. 1D补充表S3)。计算预测显示,超过30%的蛋白质富含斑点(+) 细胞参与线粒体功能(Fig. 1E补充表S4)。这些结果表明,线粒体蛋白可能在调节NPC细胞中的NLRP3炎性激活方面发挥至关重要的作用。

       线粒体汤组分在ASC斑点中富集(+) NPC.细胞

      基因本体学(GO)过程网络分析634蛋白发现富含斑点(+) 相对 speck( - ) NPC细胞显示,大多数人参与了两种基于线粒体的生物途径:线粒体毒药(p = 5.068e-41)和泛醌代谢(p = 4.440E-18) (Fig. 2A)。我们还观察到,ASC斑点的毒液蛋白水平较高(+) 细胞 (Fig. 2B)。值得注意的是,发现蛋白质被认为是显着富集的ASC斑点(+) 细胞散射在毒物机械的所有五种复合物中,具有较高的比例,分布到复合物I和V(Fig. 2B)。我们选择了ITRAQ比率的蛋白质(ASC Speck(+) 细胞 相对 ASC. speck( - ) 细胞在两个生物重复酸盐中的平均值上以上至少2SD,并使它们进一步使用Western印迹进行验证。在ASC Speck.(+) 细胞,我们检测来自复合物I(NDUFB3,NDUFB8和NDUFB5),复杂IV的奥帕洛斯相关亚基水平增加(MT-Co2)和复杂的V(ATP5B,ATP5D,ATP5J,ATP5H和ATP5F1)(Fig. 2C)。此外,NPC-BM1细胞,另一种NPC细胞系,其表现出增加的IL-1β分泌和响应顺铂刺激的ASC斑块形成(补充图S2A-S2B)还用于研究斑点之间的蛋白质谱的差异(+) 和 speck( - ) 细胞通过ITRAQ的蛋白质组学分析(补充图。S2B)。基于ITRAQ的分析导致4803和4667个蛋白质被确定(补充表S5)和量化(补充表S6), 分别。发现总共559种蛋白质在斑点中富集(过表达)(+) 顺铂刺激后NPC-BM1-ASC-GFP细胞(补充表S7)。结果,结果表明,线粒体毒药组分在ASC斑点中富集(+) NPC-BM1 cells (补充图。S2C-S2D补充表S8)。这些数据强烈表明线粒体毒药组分在NPC细胞中的NLRP3炎性组形成和活化中起着枢转作用。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2线粒体汤组分在ASC斑点中富集(+) NPC. cells. NPC-HK1-ASC-GFP细胞用顺铂处理(40μm)24小时和斑点(+) 和 speck( - ) 使用流式细胞术分离细胞。 一种。 使用Metacore途径分析包产生的富集蛋白质的过程网络。大多数富含或升高的蛋白质落入两种途径:氧化磷酸化(p = 5.068e-41)和泛醌代谢(p = 4.440e-18)。 B,由ITRAQ标记和LC-MS / MS分析鉴定的毒物蛋白亚基列表。 115/114和117/116的ITRAQ比率代表了ASC斑点之间的定量比率(+) (用115或117 Itraq试剂标记)和斑点( - ) (用114或116 Itraq试剂标记)细胞。红色盒子表明蛋白质与ITRAQ比例在平均值上方至少2SD。黄色框表示ITRAQ比率在1到2 S.D之间的蛋白质。在平均值之上。蓝色框表示蛋白质没有显示ITRAQ比率的变化。白色框表示蛋白质组中未鉴定的蛋白质。图形适应 //www.wikipathways.org/index.php/Pathway:WP111. C,来自ASC斑点的细胞裂解物(+) 和 ASC speck( - ) NPC-HK1-ASC-GFP细胞用于蛋白质印迹分析。通过与GAPDH的标准化计算奥氏蛋白的比例,具有来自ASC斑点的值( - ) 细胞 set as 1.0.

       NDUFB3,NDUFB8和ATP5B涉及NLRP3炎性激活和细胞糊酶

      四种蛋白质的水平>2倍富含斑点(+) 细胞(NDUFB3,NDUFB8,ATP5B和MT-CO2通过用基因特异性siRNA治疗NPC-HK1-ASC-GFP细胞进一步验证(Fig. 3A),然后进一步用顺铂治疗它们。如上所述 Fig. 3B,ASC-SPECK的百分比(+) 用siRNA对抗NDUFB3,NDUFB8和ATP5B处理细胞的细胞显着降低,但不是MT-CO2 (Fig. 3B)。我们使用FlICA试剂,其与活性蛋白酶形成共价键(
      • Grabarek J.
      • Darzynkiewicz Z.
      原位活化在通过亲和标记其酶活性中心与荧光染料抑制剂检测到的凋亡期间的凋亡中的激活。
      ),监测Caspase-1的激活,这是炎症活化过程中的一步。如图所示 Fig. 3C,与用对照siRNA处理的细胞相比,在对NDUFB3,NDUFB8或ATP5B的敲低进行的NPC-HK1细胞中降低了Cisplatin诱导的Caspase-1活性。此外,与对照细胞相比,NDUFB3-,NDUFB8或ATP5B敲低NPC-HK1细胞中的IL-1β分泌显着降低(Fig. 3D)。始终如一地,在NPC-BM1细胞中获得了类似的结果(补充图S3A-S3D)。相比之下,siRNA针对较不强烈富集的蛋白质(IE。 NDUFB5,ATP5H或ATP5J)(补充图S4a)没有显着改变顺铂诱导的ASC斑块形成(补充图S4B),caspase-1激活(补充图。S4C)或IL-1β分泌(补充图S4D)。总的来说,这些结果表明线粒体NDUFB3,NDUFB8和ATP5B参与调节NLRP3炎症组活化。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3NDUFB3,NDUFB8和ATP5B涉及NLRP3炎症组和细胞糊酶。 用NDUFB3-,NDUFB8,ATP5B-,MT-CO转染NPC-HK1细胞2或用顺铂处理的48小时的控制(Ctrl) - siRNA(40μm)24小时并分析ASC斑块形成,Caspase-1活性,IL-1β释放和细胞糊酶。 A,从敲低细胞收集裂解物并用于蛋白质印迹分析。 B,ASC斑点的百分比(+) 通过流式细胞术从NPC-HK1-ASC-GFP细胞中量化细胞。 C,通过用YVAD-FlIC染色,然后流式细胞术染色来确定活性的Caspase-1。 D,通过ELISA测量细胞培养上清液中IL-1β的水平。 E,通过流式细胞术检测糊状细胞(FlICA阳性/ pi阳性细胞)的百分比。 F,使用LDH细胞毒性测定试剂盒评估上清液LDH活性,并在直方图中呈现LDH释放的百分比。符号:*p < 0.05; **p < 0.01.
      为了评估糊状细胞死亡,这是一种由炎症激活引发的裂解细胞死亡的一种形式,我们将染色细胞双染成活化的Caspase-1和核(使用PI)或评估其LDH的释放(
      • 雷马赫米
      • 张Y.
      • 苗e.a.
      通过测量释放乳酸脱氢酶活性检测糊隙。
      )。如图所示 Fig. 3E,与顺铂诱导的炎症组血活化后的对照细胞相比,NDUFB3-,NDUFB8-或ATP5B敲低细胞中活化的Caspase-1 / PI双阳性NPC-HK1细胞的比例显着降低。类似地,这些敲低细胞相对于siRNA对照组表现出降低的LDH释放(Fig. 3F)。在NPC-BM1细胞中证明了类似的结果(补充图S3E-S3F)。我们的结果表明,线粒体汤蛋白,NDUFB3,NDUFB8和ATP5B似乎涉及炎症组活化并在调节炎症与炎症相关的细胞糊化症方面发挥重要作用。

       NDUFB3,NDUFB8和ATP5B通过调节MTROS生产来激活NLRP3炎性

      尽管上述结果强烈建议,线粒体毒药蛋白参与调节NLRP3炎症组活化,但将线粒体与NPC细胞中NLRP3炎症组合的机制保持不明确。研究表明,NLRP3炎性炎症由MTROS(
      • 阿巴斯准噶。
      • xia m.
      • 张Y.
      • Boini K.M.
      • 李P.L.
      NLRP3炎症的氧化还原调节:ROS作为触发器或效应器?
      ,
      • 沙丘R.
      • 霍尔A.
      • Sunkaria A.
      线粒体作为集中定位的集线器在先天免疫反应中。
      ),线粒体毒药机械是MTROS生产的主要部位,线粒体功能障碍导致MTROS升降(
      • Zorov D.B.
      • Juhaszova M.
      • Sollott S.J.
      线粒体活性氧(ROS)和ROS诱导的ROS释放。
      )。因此,我们研究了NDUFB3,NDUFB8和ATP5B对由NLRP3炎症组活化引发的MTROS生产的影响。我们的实验表明,MTRO的水平升高为ASC斑点(+) 与ASC斑点相比,NPC-HK1和NPC-BM1细胞( - ) group (Fig. 4A4B),并且caspase-1激活(Fig. 4C)和糊状细胞死亡(Fig. 4D通过使用MTROS清除剂MITOTEMPO预处理被显着抑制。此外,NDUFB3-,NDUFB8和ATP5B敲低NPC细胞在顺铂诱导的MTROS生产中表现出显着降低(Fig. 4E4F)。这些数据表明,MTROS是NPC细胞中NLRP3炎症组活化的上游调节剂,线粒体奥氏蛋白可以在这些细胞中介导MTROS产生。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4NDUFB3,NDUFB8和ATP5B通过调节MTROS生产来激活NLRP3炎性。 A,通过顺铂治疗的NPC-HK1-ASC-GFP细胞生产MTRO,具有或不具有ASC斑点。 B,通过顺铂治疗的NPC-BM1-ASC-GFP细胞生产MTROS,具有或不具有ASC斑点。用Mitotempo预处理NPC-HK1细胞1小时并用顺铂处理(40μm)24小时。 C,通过用YVAD-FlIC染色,然后流式细胞术染色,测定活性的Caspase-1; D,通过流式细胞术检测糊化体(FlICA阳性/ pi阳性)细胞的百分比。 NPC-HK1(E)和NBC-BM1细胞(F用NDUFB3-,NDUFB8-,ATP5B-或对照(CTRL) - siRNA转染48小时,用顺铂处理(40μm)24小时(NPC-HK1)或30小时(NPC-BM1),并进行MTROS生产分析。符号:*p < 0.05; **p < 0.01.

       NDUFB8和ATP5B在NPC患者中生存更好的关联

      我们之前报道了较高水平的炎症蛋白组分(例如 NLRP3)与NPC患者的更好后治疗复发存活有显着相关(
      • Chen L.C.
      • 王L.J.
      • 曾地下
      • Ojcius下午。
      • 陈C.C.
      • 欧阳C.N.
      • Hsueh C.
      • 梁Y.
      • chang k.p.
      • 陈C.C.
      • 常年。
      肿瘤炎症衍生的IL-1BETA新核酸中性粒细胞,并改善了EBV诱导的鼻咽癌中的局部复发存活。
      )。在本研究中,我们表明毒药蛋白参与在NPC细胞中调节NLRP3炎症组活化和糊化细胞死亡。为了检查这些炎症组活化相关的毒物蛋白是否与临床病理参数有关,我们检查了来自NPC患者的78个活检标本(临床特征摘要,见 Fig. 5A)。我们进行了IHC分析以评估NDUFB8和ATP5B在肿瘤中的表达水平。然后我们使用了NDUFB8的表达水平(上两面板 Fig. 5B)和atp5b(下两个面板 Fig. 5B)将NPC肿瘤样品分类为高或低表达组,并分析了每组的关联与患者存活。 Kaplan-Meier生存率分析显示,NDUFB8的高表达群体中NPC患者中可以看到更好的局部复发存活(p = 0.037;左图in. Fig. 5C)和ATP5B(p = 0.029;右侧小组 Fig. 5C)。因为我们的结果表明,NDUFB8和ATP5B可以调节NLRP3炎症组活化和细胞糊化酶,我们研究了它们的表达水平是否相关,以及是否存在预后的评估这些蛋白的组合表达。实际上,我们发现NDUFB8的表达并与NPC组织中的ATP5B的表达呈正相关(Fig. 5D),肿瘤中NDUFB8和ATP5B的高水平表达与患者的更好的局部复发存活强烈有关(p = 0.006, Fig. 5E)。接下来对NDUFB8和ATP5B表达的多变量分析,临床病理特征,包括肿瘤(T)阶段和节点(N)阶段,发现高ATP5B表达(p = 0.047)是一种更好的局部复发存活率的标志物(表I.)。虽然高NDUFB8表达不是多变量分析中更好的局部复发存活的独立预测因素(p >0.05),NDUFB8和ATP5b的高表达用作标志物,可用于更好的无局部复发存活(p = 0.035)。然而,Kaplan-Meier生存率分析(补充图。S5A-S5C)和多变量分析(补充图S5D)显示NDUFB8和ATP5B的表达与NPC患者的整体存活之间没有显着关联。在一起,我们的临床病理学分析结果表明,NDUFB8和ATP5B可能被开发为NPC中局部复发的有用生物标志物。
      表I.NDUFB8与ATP5B表达与NPC患者局部复发存活的关联的多变量分析
      特征危害比率(95%CI)p value
      患者(N. = 49)
      T阶段(3-4与1-2)0.543(0.125-2.367)0.416
      n阶段(2-3 vs. 0-1)1.012(0.230-4.453)0.987
      NDUFB8 + ATP5B(高与低电平)0.102(0.012-0.848)0.035
      患者(N. = 78)
      T阶段(3-4与1-2)1.126(0.377-359)0.831
      n阶段(2-3 vs. 0-1)1.377(0.444-4.273)0.580
      ndufb8(高与低)0.324(0.098-1.070)0.065
      患者(N. = 78)
      T阶段(3-4与1-2)1.169(0.390-3.503)0.780
      n阶段(2-3 vs. 0-1)1.511(0.489-4.663)0.473
      ATP5B(高与低)0.269(0.074-0.980)0.047
      将Cox比例危害模型应用于多变量分析以确定每个预后因子的独立性。

      讨论

      在本报告中,我们证明线粒体通过线粒体汤蛋白与NLRP3炎症组合有关。使用流式细胞仪分析和ITRAQ技术,我们孤立ASC斑点(+) 细胞并发现它们富含毒物蛋白质,其调节线粒体MTROS生产和下游炎症组活化。我们进一步发现NDUFB8(复合物I)和ATP5B(复合V)用作NPC患者局部复发存活的标志物。本研究是首先进行实验链接线粒体汤蛋白,炎症组血症和NPC患者的临床结果(Fig. 6)。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6线粒体汤蛋白在NPC中NLRP3炎症组活化中的作用。 基于我们综合蛋白质组学和功能研究的结果,我们提出了线粒体毒药组分在ASC斑点的NPC细胞中富集,增强了MTROS水平,从而有助于NLRP3炎症组形成和活化。汤膦组分的高表达水平,包括NDUFB8(复合物I)和ATP5B(复杂V),与NPC患者的更好的局部复发存活相关,因此可能证明是NPC局部复发的标志物。
      ASC.斑块形成,即炎症组体激活的标志,可以通过各种细胞事件来控制,包括磷酸化或ASC分子的ubiquitch(
      • 凯蒂玛。
      • Malynn B.A.
      • 马A.
      泛素改性酶和调节炎症。
      ,
      • 李T.
      通过磷酸化调节NLRP3炎症。
      )。我们之前证明Syk激酶可以磷酸化Pyk2,磷酸化的Pyk2在NLRP3炎症组活化时重新定位于ASC斑点,Pyk2可以直接在Tyr146磷酸化,并且只有磷酸化的ASC可以参与斑点形成并引发IL-1β分泌(
      • Chung i.C.
      • 欧阳C.N.
      • 袁S.N.
      • 李H.P.
      • 陈军。
      • Shieh H.R.
      • 陈Y.J.
      • Ojcius下午。
      • Chu C.L.
      • yu J.s.
      • 常年。
      • Chen L.C.
      PyK2通过直接磷酸化ASC激活NLRP3炎性炎症,并有助于抑制炎症凋亡的腹膜炎。
      )。其他报道表明,NLRP3 / ASC炎症的ASC-ubiquitination介导的组装需要线性泛素化组件复合物和TNFR相关因子3(
      • 罗格斯M.A.
      • 鲍曼J.W.
      • 富士塔H.
      • 奥拉西奥N.
      • 施M.
      • 梁Q.
      • amatya R.
      • 凯莉t.j.
      • iwai K.
      • 婷j.
      • Jung J.u.
      线性泛素组装复合物(Lubac)对于NLRP3炎症组件是必不可少的。
      ,
      • 关克。
      • 魏C.
      • 郑Z.
      • 吴F.
      • 张Y.
      • Cao Y.
      • 马。
      • 陈W.
      • 徐Q.
      • 夏W.
      • 顾J.
      • 他X.
      • 钟H.
      通过E3连接酶Traf3靶向K63连接的泛素,Mavs促进炎症组活化。
      )。但是,我们还没有完全理解有助于组装和调节炎症组装的信令网络。在这里,我们综合地比较了ASC斑点的蛋白表达模式(+) 和 speck( - ) NPC细胞,发现线粒体毒液蛋白对该体系中的炎症组形成和活化是关键的。此外,我们发现ASC斑点(+) 富含各种线粒体蛋白的NPC细胞,包括在嵴形成,脂肪酸β-氧化和线粒体蛋白质中具有一些功能。这些数据强烈建议,线粒体功能与NLRP3炎症组合/激活之间存在联系。
      线粒体功能障碍是NLRP3炎症组活化的主要事件,因为NLRP3刺激触发线粒体汤药机械增加MTROS并减少MTΔψ(
      • 钟Z.
      • UMEMURA A.
      • Sanchez-Lopez E.
      • 梁S.
      • Shalapour S.
      • Wong J.
      • Boassa D.
      • Perkins G.
      • 阿里S.R.
      • 麦格纳姆M.D.
      • Ellisman M.H.
      • Seki E.
      • Gustafsson A.B.
      • Hoffman H.M.
      • Diaz-Meco M.T.
      • Moscat J.
      • 卡琳米
      NF-Kappab通过消除受损的线粒体来限制炎症体活化。
      ,
      • 周R.
      • yazdi a。
      • 菜单P.
      • Tschopp J.
      线粒体在NLRP3炎症体激活中的作用。
      )。众所周知,汤膦络合物I,III和IV形成呼吸超复杂(
      • Chaban Y.
      • Boekema e.j.
      • Dudkina N.v.
      线粒体氧化磷酸化超复合物的结构及其稳定化机制。
      )在调节MTROS生产方面发挥着关键作用(
      • entiquez a.r-p。
      呼吸超复杂的功能:可塑性模型。
      )。汤酚复合物v是细胞内ATP生成的主要部位,也可能增加MTROS生产;相反,汤膦络合物V的活性可以被特异性ATP合酶抑制剂,寡霉素(
      • Vaamonde-Garcia C.
      • Loureo J.
      • valcarcel-ares m.n.
      • riveiro-naveira r.r.
      • Ramil-Gomez O.
      • Hermida-Carballo L.
      • 中心A.
      • Meijide-Failde R.
      • Blanco F.J.
      • Lopez-Armada M.J.
      线粒体抑制剂低霉素在大鼠膝关节中诱导炎症反应。
      )。在本研究中,我们在ASC斑点中观察到更高水平的汤膦蛋白和MTROS生产(+) NPC细胞,表明前两种参数与炎症组件相关。我们的研究结果与上一份报告一致,卵巢癌细胞系具有高水平的汤膦蛋白(高苯酚),与低汤酚细胞相比,具有较高水平的ROS和增强的化学敏感性和增强的化学敏感性(
      • 升华G.
      • Kieffer Y.
      • Mieulet V.
      • Goundiam O.
      • Bonneau C.
      • Nemati F.
      • 伤害我
      • Raposo G.
      • 波普娃T.
      • 斯特恩米
      • Lallemand-Breitenbach V.
      • Muller S.
      • Caneque T.
      • Rodriguez R.
      • Vincent-Salomon A.
      • 德河
      • rossignol r.
      • Mechta-Grigoriou F.
      PML调节的线粒体代谢增强了人卵巢癌中的化学敏感性。
      )。因此,高汤酚细胞中高水平RO的累积可能是激活NLRP3炎性组的关键决定因素,从而增加癌细胞的化学敏感性。
      我们之前证明的是,NPC患者中的更好的治疗后生存率相关(
      • Chen L.C.
      • 王L.J.
      • 曾地下
      • Ojcius下午。
      • 陈C.C.
      • 欧阳C.N.
      • Hsueh C.
      • 梁Y.
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      • 陈C.C.
      • 常年。
      肿瘤炎症衍生的IL-1BETA新核酸中性粒细胞,并改善了EBV诱导的鼻咽癌中的局部复发存活。
      )但这种效果的机制尚不清楚。 ROS与NLRP3炎症组激活以及癌症的开始,促进,进展和转移呈正相关(
      • 杨H.
      • Villani r.m.
      • 王H.
      • SIMPSON M.J.
      • 罗伯茨马
      • 唐米
      • 梁X.
      细胞反应性氧在癌症化疗中的作用。
      )。各种癌症化学治疗剂(例如 顺铂)通过大大增强MTROS水平来改变线粒体相关的ROS响应来触发细胞死亡(
      • Marullo R.
      • Werner E.
      • degtyareva n。
      • 摩尔B.
      • altavilla g。
      • Ramalingam S.S.
      • Doetsch P.W.
      顺铂诱导线粒体 - ROS响应,这取决于线粒体氧化还原状态和生物能量功能,有助于细胞毒性。
      )。在本研究中,我们对毒物复合组分的系统分析显示,在顺铂刺激的NPC细胞,NDUFB3,NDUFB8和ATP5B调节MTROS生产中,导致NLRP3炎症和细胞γγ胃泌素。重要的是,我们观察了NPC肿瘤标本中NDUFB8和ATP5B高表达水平与ATP5B之间的表观相关性,并且这种阳性关系似乎与NPC患者的更好的存活结果相关。这些发现表明,NDUFB8和ATP5B可协作促进NPC治疗的NLRP3炎性萌发调节。与我们的发现一致,ATP5B的更高级别表达与胆囊癌更好的生存(
      • 太阳J.
      • 杨Z.L.
      • 苗X.
      • 邹琦
      • 李杰。
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      ATP5B和BETA2-微球蛋白是胆囊癌患者预测的预测标志物。
      )和急性髓性白血病(
      • 小X.
      • 杨杰。
      • 李R.
      • 刘S.
      • 徐Y.
      • 郑W.
      • yi y.
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      • 彭H.
      • Pei M.
      • 邓硕
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      对急性髓性白血病细胞中线粒体ATPSYN-β进行放松管制,增加耐药性。
      )。因此,先前的发现和我们的目前的结果表明NLRP3,ATPT5B和NDUFB8可以被认为是评估NPC患者局部复发的标志物。
      总之,我们在本文中描述了先前未被识别的线粒体毒液组分/ MTROS轴,并表明它调节NLRP3炎性组形成和活化。我们进一步提出,可以将炎症与炎症组相关的毒物蛋白的高水平表达作为生物标志物,以便在NPC患者中局部复发和/或靶向对炎症相关癌症的新治疗策略。

      数据可用性

      在Proteomexchange Consortium网站上沉积了基于ITRAQ的蛋白质组分析的MS原始数据(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过自豪的合作伙伴存储库(
      • VizCaino J.A.
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      • Del-Toro N.
      • 戴安斯J.A.
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      2016年更新自豪数据库及其相关工具。
      ),数据集标识符:PXD013071。确定蛋白质的信息作为补充数据提供。

      补充材料

      参考

        • 他问:
        • 傅y.
        • 田D.
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        • Csordas A.
        • Del-Toro N.
        • 戴安斯J.A.
        • 怜悯J.
        • Lavidas I.
        • Mayer G.
        • Perez-Riverol Y.
        • Reinger F.
        • Ternent T.
        • 徐Q.W.
        • 王R.
        • Hermjakob H.
        2016年更新自豪数据库及其相关工具。
        核酸RES。 2016; 4411033