穿孔路径的牙齿末端区域的蛋白质组表明阿尔茨海默病中的突触前损伤*

  • Hazal Haytural
    一致
    应如何解决对应的通信:神经学科,阿尔茨海默氏症中心,神经生物学系,护理科学和社会,Karolinska Institutet,Bioclincum J9:20,Visionsgatan 4,171 64 Solna,瑞典
    隶属关系
    神经节学,神经生物学系,护理科学系,护理科学系,SOLNA,SOLNA,SOLNA,SOLNA
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  • Georgios Mermelekas.
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    肿瘤病理科,生命实验室科学,Karolinska Institutet,斯德哥尔摩,瑞典
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  • CETEN EMRE.
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    神经节学,神经生物学系,护理科学系,护理科学系,SOLNA,SOLNA,SOLNA,SOLNA
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  • Saket Milind Nigam.
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    神经科学系,Karolinska Institutet,斯德哥尔摩,瑞典
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  • Steven L. Carroll.
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    南卡罗来纳州查尔斯顿医科大学病理与实验室医学系
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  • Bengt Winblad.
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    Karolinska大学医院,主题老化,斯德哥尔摩,瑞典
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  • Nenad Bogdanovic.
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    Karolinska大学医院,主题老化,斯德哥尔摩,瑞典

    临床老年病,神经生物学系,护理科学系,护理科学系,护理科学研究中心,Huddene,瑞典
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  • Gaïl括号
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    跨学科神经科学研究所,CNRS UMR,Bordeaux,法国

    法国波尔多大学
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  • Ann-Charlotte Granholm
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    科罗拉多州丹佛大学健康老龄化研究所
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  • Lukas M. Orre.
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    肿瘤病理科,生命实验室科学,Karolinska Institutet,斯德哥尔摩,瑞典
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  • Lars O. Tjernberg.
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  • Susanne Frykman
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    神经节学,神经生物学系,护理科学系,护理科学系,SOLNA,SOLNA,SOLNA,SOLNA
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  • 作者脚注
    *该项目已收到欧洲联盟地平线2020年的资金来自MarieSkłodowska-Curie Granc协议No 676144(阿尔茨海默病,悉尼达症突触功能障碍)。该项目也得到了StiftelsenFörGamlaTjänarinnor,O.E的补助金。 Och Edla Johanssons vetenskapliga 5,Demensfonden,Gun博登斯Stiftelse,Margaretha AF UGGLAS CTITELSE和Alzheimerfonden。提交人声明他们没有对本文内容的利益冲突。
    本文含有补充材料。
      突触功能障碍是阿尔茨海默病(AD)的早期致病事件,有助于网络障碍和认知下降。一些突触比其他突触更容易受到攻击,包括穿孔路径的突触,这为海马提供了主要的兴奋输入。为了阐明这些突触功能障碍的潜在功能障碍的分子机制,我们对穿孔路径的牙齿终端区进行了探索性蛋白质组学研究。穿孔路径突触所在的牙齿转象的分子层的外部三分之二是从具有AD和五种对照的五个受试者进行微小。通过胰蛋白酶溶解并消化微放射组织。将来自每个样品的肽用不同的等因素标记标记,通过高分辨率等电聚焦将其汇集在一起​​并预先分离成72个级分。然后通过液相色谱 - 质谱法分析每个级分。我们量化了7322蛋白的相对表达水平,其中724在AD中显示出显着改变的水平。我们使用富集和途径的综合数据分析强烈指出,在AD中的该区域中,突触前信令(例如胞尿精和突触囊泡循环过程)严重被扰乱,而突触后蛋白质保持不变。在显着改变的蛋白质中,我们选择了三种最下调的突触蛋白;复杂素-1,复合素-2和Synaptogyrin-1,用于进一步验证,使用由六个AD和8个控制案例组成的新群组。免疫组织化学染色的半定量分析证实了在AD中牙齿齿状齿状型分子层的外三分之二的复合素-1,复合素-2和突触葡聚糖-1水平降低。我们深入的蛋白质组学分析为潜在的分子机制提供了广泛的突触功能障碍相关的潜在分子机制,并支持突触前改变比疾病早期阶段的后腹膜变化更重要。鉴定的特定突触蛋白可能旨在靶向暂停AD中的突触功能障碍。

      图形概要

      阿尔茨海默病(广告)
      使用的缩写是:
      广告
      阿尔茨海默病
      Aβ.
      淀粉样蛋白β-肽
      应用程序
      淀粉样蛋白前体蛋白
      加利福尼亚州
      Cornu Ammonis.
      CPLX.
      复杂的
      DEQMS.
      定量质谱数据的差异表达分析
      DG.
      牙齿回归
      FDR.
      假发现率
      GCL.
      颗粒细胞层
      基因本体论
      GSEA.
      基因设定浓缩分析
      盗用
      高分辨率等电聚焦
      IML.
      内部分子层
      IPA.
      聪明的途径分析
      LC-MS / MS
      液相色谱 - 串联质谱法
      LMD.
      激光微生物
      MAPT.
      微管相关蛋白质
      MML.
      中间分子层
      毫克
      分子层
      分子层穿孔路径相关
      m / z.
      质量收取比率
      oml.
      外分子层
      PCA.
      主要成分分析
      PMI
      后期间隔
      SV.
      突触囊泡
      SYNGR1
      Synaptogyrin-1
      TMT.
      串联质量标签。
      1使用的缩写是:广告
      阿尔茨海默病
      Aβ.
      淀粉样蛋白β-肽
      应用程序
      淀粉样蛋白前体蛋白
      加利福尼亚州
      Cornu Ammonis.
      CPLX.
      复杂的
      DEQMS.
      定量质谱数据的差异表达分析
      DG.
      牙齿回归
      FDR.
      假发现率
      GCL.
      颗粒细胞层
      基因本体论
      GSEA.
      基因设定浓缩分析
      盗用
      高分辨率等电聚焦
      IML.
      内部分子层
      IPA.
      聪明的途径分析
      LC-MS / MS
      液相色谱 - 串联质谱法
      LMD.
      激光微生物
      MAPT.
      微管相关蛋白质
      MML.
      中间分子层
      毫克
      分子层
      分子层穿孔路径相关
      m / z.
      质量收取比率
      oml.
      外分子层
      PCA.
      主要成分分析
      PMI
      后期间隔
      SV.
      突触囊泡
      SYNGR1
      Synaptogyrin-1
      TMT.
      串联质量标签。
      是一种进步神经退行性疾病和痴呆症最常见的原因,影响所有痴呆病例的50-60%。 AD的特征在于其潜在的神经病理学过程,包括由淀粉样蛋白β-肽(Aβ)组成的淀粉样蛋白斑块的积累,以及由高磷酸化的Tau蛋白和神经变性的神经纤维绦虫缠结(
      • Jack Jr,C.r.
      • 贝内特D.A.
      • Blennow K.
      • Carrillo M.C.
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      • 锯齿W.
      • Jesszen F.
      • Karlawish J.
      • 刘娥。
      • Molinuevo J.L.
      • 蒙丁T.
      • 菲尔普斯C.
      • Rankin K.P.
      • Rowe C.C.
      • Scheltens P.
      • Siemers E.
      • 斯奈德H.M.
      • Sperling R.
      • 等等。
      NIA-AA研究框架:朝着阿尔茨海默病的生物学定义。
      )。在过去的几十年中,阐明了潜在机制的潜在机制,在包括线粒体功能障碍(
      • Duboff B.
      • 菲恩米
      • gotz J.
      为什么尺寸重要 - 平衡阿尔茨海默病的线粒体动态。
      ),自噬(
      • 尼克松R.A.
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      Alzheimer病失败的疾病定位初级缺陷。
      ),兴奋毒性(
      • 王R.
      • reddy p.h.
      谷氨酸和NMDA受体在阿尔茨海默病中的作用。
      )和炎症(
      • Heneka M.T.
      • 卡森M.J.
      • El Khoury J.
      • Landreth G.E.
      • Brosseron F.
      • Feinstein D.L.
      • 雅各布A.H.
      • WYSS-Coray T.
      • Vitorica J.
      • Ransohoff r.m.
      • 疝气
      • frautschy s.a.
      • 芬森B.
      • 棕色G.C.
      • Verkhratsky A.
      • Yamanaka K.
      • Koistinaho J.
      • 拉茨e.
      • 哈莉阿。
      • Petzold G.C.
      • 镇T.
      • 摩根D.
      • Shinohara M.L.
      • Perry V.H.
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      • 布鲁克斯D.J.
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      • Golenbock D.T.
      • Kummer M.P.
      在阿尔茨海默病中的神经炎炎症。
      )。然而,仍然存在破译早期致病过程以发展疾病改性治疗剂。最近,更多的关注已经致力于突触功能障碍,因为AD大脑中的突触损失和突触蛋白水平的水平与认知下降程度强烈关联(
      • Dekosky S.T.
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      阿尔茨海默病中正面皮质活检的突触损失:与认知严重程度相关。
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      在阿尔茨海默病进展期间,突触蛋白的表达改变了发生。
      )。然而,突触功能障碍的分子机制主要是未知的。
      由海马的Cornu Ammonis(CA)区域组成的海马形成,牙齿血管(DG)和亚比亚,在显口记忆形成和空间学习中起着至关重要的作用(
      • Cappaert N.L.M.
      • 范特里斯N.M.
      • Wetter M.P.
      第20章 - 海马形成。
      )。高层层压的敌合皮质通过穿孔路径向海马提供主要兴奋性输入(Fig. 1A)(
      • Amaral D.G.
      • Scharfman H.E.
      • Lavenex P.
      牙齿回归:基本神经杀菌组织(牙齿的假人)。
      )。穿孔路径的轴突主要来自二层和III梭形神经元。尽管来自层II的轴突主要终止于颗粒细胞的树突细胞,但是在DG的分子层(mL)的外部三分之二的颗粒细胞的树突状脊柱上,但是从CA1金字塔神经元的树枝上终止的那些。广泛的研究表明I)在Entorhinal皮质和DG的mL中存在淀粉样蛋白斑块和神经纤维纤维缠结(
      • thal d.r.
      • 霍尔米
      • 擦你。
      • Waldmann G.
      • Gunzel S.
      • Zedlick D.
      • 斯普尔·雷
      穿孔路径靶区和海马层的阿尔茨海默相关的TAU-病理学与海马层和辐射蛛与痴呆的开始和程度相关。
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      • Hyman B.T.
      • 范霍恩G.W.
      • Kromer L.J.
      • damasio a.r.
      穿孔途径变化和阿尔茨海默病的记忆障碍。
      )II)剧烈丧失的敌人神经元,特别是在第二层(
      • 戈麦斯 - 伊斯兰蒂
      • 价格J.L.
      • McKeel Jr,D.W.
      • 莫里斯J.C.
      • 咆哮J.H.
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      二层嗜酸剂疾病的深度丧失II型梭菌性神经元发生。
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      • Cochran E.J.
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      • Mufson e.j.
      患有轻度认知障碍的老年人二层Entorhinal Cortex神经元的丧失和萎缩。
      )和iii)在AD脑中减少DG的外部ML中的突触数量(
      • Scheff S.W.
      • 火花D.L.
      • 价格D.A.
      阿尔茨海默病患者外分子层突触密度的定量评估。
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      • Scheff S.W.
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      • 施密特F.A.
      • Mufson e.j.
      早期阿尔茨海默病患中的海马突触损失和轻度认知障碍。
      )。这些研究结果表明,与众不同的病理改变可能会损害海马形成和Entorlinal皮质之间的连通性,因此可能有助于认知障碍。因此,阐明这种断开的机制是至关重要的。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1研究实验工作流程概述。 A,主要海马电路的示意图。牙齿回形物(DG)的分子层(ml)由内(IM1),中间(MML)和外分子层(OM1)组成。穿孔路径提供海马的主要兴奋输入。层II穿孔路径的纤维终止于DG的M1的外部三分之二(以红色突出显示)。 B,DG的MML和OML从五种零星AD和使用激光微碎裂的五种控制盒中分离出来。然后将微小物切割的组织溶解,消化,并将来自十个样品的所得肽用十种不同的等异物标签(TMT10plex126-131da)标记,并使用抗升频PH 3-10 IPG Drystrip预先分离成72个级分。 。通过LC-MS / MS分析每个级分。 DEQMS用于统计分析,使用GSEA,大猩猩和IPA进一步进行不同的富集和途径分析工具。最后,在使用免疫组织化学的五种AD和七种对照病例组成的新群组中证实了三种蛋白质组学命中(CPLX1,CPLX2和SYNGR1)的表达。
      功能突触对于形成记忆和学习至关重要。突触传递需要突触囊泡(SV)蛋白,突触前和后腹膜蛋白之间的一系列相互作用(
      • 盛M.
      • 金E.
      突触后突触组织。
      ,
      • SUDHOF T.C.
      神经递质释放:突触囊泡的寿命中的最后毫秒。
      )。迄今为止,许多涉及突触前的突触蛋白(RAB3A,SNAP25,SEPTIN-5,SV2A,Synapsin I,Syspaptogmin,SybaptoTagmin,Synaptics-1A)和后突触机制(滴虫,神经蛋白,NMDA和AMPA受体,PSD95,Synaptopodin)已被发现在广告中被改变(
      • Mufson e.j.
      • Mahady L.
      • 水D.
      • 计数S.E.
      • 佩雷斯S.E.
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      阿尔茨海默病进展过程中的海马可塑性。
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      • Sijben J.W.
      • Masliah E.
      阿尔茨海默病中突触病理学的荟萃分析显示了选择性分子尿布机械脆弱性。
      ) - 强调广告中的突触完整性降低。
      基于质谱(MS)的蛋白质组学具有巨大的潜力,可以探讨以无偏异的方式研究蛋白质表达的变化,因此可能导致蛋白质疾病机制的鉴定。几个研究组具有施用质谱法以阐明不同脑区蛋白质组的变化,包括海马(
      • Manavalan A.
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      人阿尔茨海默氏症脑中的区域蛋白表达与疾病严重程度相关。
      )。此外,一些研究研究了从AD大脑中微小的海马子场的蛋白质组,例如Ca1金字塔神经元(
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      蛋白质组形表征阿尔茨海默病患者海马CA4 / DG子场中的信号相互作用。
      ),ca1和次次(
      • Hondius D.C.
      • van Nierop P.
      • 李克..
      • hoozemans J.J.
      • van der schors r.c ..
      • 范HapertE.S.
      • van der vies s.m.
      • rozemuller a.j.
      • smit a.b.
      在阿尔茨海默病的所有病理阶段分析人类海马蛋白质。
      )。然而,为了我们的知识,没有进行蛋白质组学研究,旨在更好地了解脆弱的穿孔路径突触的突触功能障碍。为了达到这个目标,我们将这些突触所在的DG的ML的外部三分之二进行了微小,并且执行了最先进的质谱。我们深入的蛋白质组分析导致许多突触蛋白质的鉴定,该突触蛋白显示出AD脑中的表达水平。有趣的是,蛋白质减少的突触前蛋白质的过度表示。对于这些蛋白质中的三种,复合素-1(CPLX1),复合素-2(CPLX 2)和Synaptogylin-1(Syngr1),在AD中的DG中的ML中的外部三分之二的表达降低是在另一个队列中的AD和控制案例,使用免疫组织化学染色。

      实验步骤

       实验设计与统计理由

      本研究包括两个阶段,其中我们首先使用非偏见的MS方法在五个AD和五种神经学健康对照病例中研究了DG的外部三分之二的蛋白质组,然后进行了免疫组织化学分析在额外的五个AD和七种神经系统健康对照病例中验证群组中的三种鉴定蛋白。选择蛋白质组学研究中使用的相对较少的生物重复,因为蛋白质组学研究是由于进行激光微粉(LMD)所需的广泛工作负载,并且通过在高分辨率的大量分馏中通过广泛的分馏来达到蛋白质组的深度在液相色谱 - 质谱(LC-MS)之前的等电聚焦(盗用)方案(72个级分)。没有进行技术复制,主要是因为临床材料的数量非常有限,而且因为我们以前的经验在MS之间使用盗用LC-MS之间的运行方式非常低的技术可变性。然而,队列的有效性是通过样品之间的低可变性证实了,并且广告和控制样品在主要成分分析(PCA)中分离出来的事实(Fig. 2A)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2广告中穿孔路径的终端区域的蛋白质组学轮廓。 A,主成分分析确定了两个主要簇,其可以通过临床诊断定义,除了广告案4。 B,一种显示AD和对照组蛋白质表达水平的变化的火山曲线图。广告中增加水平的蛋白质显示在正面 x 轴,而减少蛋白质显示在负面边上 x 轴。 Y轴显示统计学意义。红色虚线上方的击中对应于差异表达的蛋白质 p < 0.01 and FDR <10%. C,最改变的蛋白质(日志2 折叠变化 - / + 0.7;对应于38%以上减少或增加64%,而FDR<10%)显示在热图中。 D-E.,所有已识别的蛋白质通过其折叠改变来分类并使用GSEA分析,无论其p-和FDR值如何。前10名是负面的(D积极地(E绘制了广告中的富集的生物方法(BPS)。走向术语 p < 0.01 and FDR <5%被认为是统计学意义。 F-G.,蛋白质显着减少或增加(FDR<将10%,目标列表与大猩猩的整个数据集(背景列表)进行比较。下调的前10名富含BPS(F)和上调(G)显示蛋白质的子集。与fdr的条款<5%被认为是统计学意义。
      与对照样品相比,对每种蛋白质测试的假设在AD样品中差异表达。由于我们不能使用Shapiro-Wilk测试,非参数统计方法,DEQMS(定量质谱数据的差异表达分析,周 等等。,使用了在其他地方的出版物所考虑的稿件,在Biocconductor中的R包装)。 DEQMS在LiMMA包上工作,并考虑每种肽的检测到的肽光谱匹配数(PSMS),同时计算T统计。本杰里尼-Hochberg方法用于多假设检测校正。实验工作流程概述如图所示 Fig. 1。每个小节都解释了实验设计和统计理由的细节。

       案例选择

      从荷兰大脑银行(探索性队列)的五种零星AD和五种控制病例中获得冷冻海马组织。根据以前公布的研究标准临床诊断,AD病例(
      • Dubois B.
      • 费尔德曼H.H.
      • Jacova C.
      • Dekosky S.T.
      • Barberger-Gateau P.
      • 卡明j.
      • Delacourte A.
      • 格拉斯科D.
      • Gauthier S.
      • 吉迦G.
      • Meguro K.
      • o'brien J.
      • Pasquier F.
      • 罗伯特P.
      • 罗恩斯M.
      • Salloway S.
      • 斯特恩y.
      • visser p.j.
      • Scheltens P.
      阿尔茨海默病诊断研究标准:修改尼恩德 - ADRDA标准。
      )通过使用针对淀粉样蛋白斑块和神经纤维缠结的免疫组织化学染色,病理诊断和明确的诊断。我们选择了具有相对早期的AD病理学阶段的广告案例(AD Brak第4阶段和淀粉样蛋白沉积阶段C)。对照病例显示无神经或精神病疾病的迹象,并且呈现很少或没有的病理改变,超出正常年龄的适当变化,包括少数斑块和缠结(AD Brak第0-2和淀粉样蛋白沉积阶段0-B)。对于免疫组织化学分析,我们从Carroll A.Campbell Jr.的南卡罗来纳州医学大学(核查队)的Carroll A.Campbell Jr.神经病理学实验室(CCNL)脑库中获得了不同一组中石蜡包埋的海马部分。验证队列中的每种病例都经历了全神经病理学诊断,包括BRAAK和CERAD评估(
      • 蒙丁T.J.
      • 菲尔普斯C.H.
      • 海滩T.G.
      • 巨人e.h.
      • 凯恩斯N.J.
      • 迪克森D.W.
      • Duyckaerts C.
      • Frosch M.P.
      • Masliah E.
      • Mirra S.S.
      • 纳尔逊P.T.
      • 施耐德J.A.
      • thal d.r.
      • Trojanowski J.Q.
      • 葡萄酒商H.V.
      • Hyman B.T.
      • 国家老化学院 - 阿尔茨海默师协会
      国家老龄化学研究所 - 阿尔茨海默氏症症的神经病理学评估协会准则:一种实用的方法。
      )。在整个研究中使用各个群组中的所有病例。本研究中使用的所有病例的人口特征如图所示 补充表S1。所有捐助者或他们的下一代都发出了知情同意。本研究经斯德哥尔摩区域伦理审查委员会批准(2015/18/03-31 / 02),也得到了VU医疗中心和南卡罗来纳州医科大学的机构审查委员会批准。

       LMD.组织样品的制备

      使用低温恒温器(Leica Microsystems,Wetzlar,德国)从冷冻海马组织中切割连续的部分(20μm),并安装在聚乙烯萘甲酸酯膜涂覆的载玻片(1.0笔(D),Zeiss,Oberkochen,德国)。将载玻片空气干燥5分钟,固定在75%乙醇中1分钟并用甲苯胺蓝(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri)染色1分钟。用蒸馏水冲洗载玻片,风干,最后在-20℃下储存过夜。甲苯胺蓝染色了所有类型细胞的核,使我们鉴定位于牙齿颗粒细胞层和海马裂缝之间的DG的M1。使用LMD 6000/7000(Leica Microsystem),覆盖中间和外部mL的ML的外部三分之二是微小的。为了获得足够量的下游蛋白质组学方法,〜0.6毫米3 从每个案例的20-30个部分收集微小组织。在LMD期间第一部分和最后一段之间没有观察到明显的解剖学差异。最后,将微散射组织储存在-20℃直至进一步使用。

       质谱法制备

      将微小组织溶解在SDS裂解缓冲液中(4%SDS,25米m Hepes pH 7.6, 1 mm DTT)。将裂解物在95℃加热5分钟,然后超声处理1分钟以剪切DNA。将样品以13,000×离心 g 去除细胞碎片。收集上清液并用4米烷基化m 氯乙酰胺。进行改性的SERA-MAG SP3协议进行样品清理(
      • 休斯C.S.
      • Foehr s.
      • 加菲尔德D.A.
      • Furlong E.E.
      • Steinmetz L.M.
      • Krijgsveld J.
      采用顺磁珠技术的超敏感蛋白质组分析。
      )。在胰蛋白酶消化(16小时)之前,首先通过Lys-C(Pierce,Thermo Sciencific,Waltham,Massachusett)首先将SP3珠粒蛋白混合物蒸发16小时。最后,从珠子蛋白混合物中洗脱肽。通过DC-蛋白测定(Bio-rad,Hercules,California)测量肽浓度,并用10种不同的胺反应性同源性串联标签(TMT10Plex 126-131Da,Thermo Sciencific)标记45μg肽的45μg肽。 )。将等分试样的〜2μg悬浮在LC流动相A中,在LC-MS上注射1μg以确定每个TMT标签的标记效率。最后,汇集了样品,并通过固相萃取施加样品清理(SPE Strata-X-C,现象,托兰,加利福尼亚)和纯化的样品在SpeedVac中干燥。

       盗窃分离

      使用盗用预分级(
      • Branca r.m.
      • 奥尔l.m.
      • 约翰逊H.J.
      • 格兰霍尔姆V.
      • 哈斯·米
      • Perez-Bercoff A.
      • 伪装J.
      • KällL.
      • LehtiöJ.
      盗程LC-MS使得能够深入蛋白质组覆盖和无偏的蛋白质组。
      )。将汇集的样品(450μg)溶于250μl8 m 尿素和1%IPG药物(广场pH 3-10,GE Healthcare,Chicago,伊利诺伊州)和IPG Drystrip在一夜之间被再水化。肽基于它们的等电点聚焦在凝胶条上,并如前所述洗脱成72个连续的级分(
      • Bereczki E.
      • Branca r.m.
      • 弗朗西斯P.T.
      • Pereira J.B.
      • BAEK J.H.
      • Hortobagyi T.
      • 温伯勒B.
      • 巴拉德C.
      • LehtiöJ.
      • 艾萨斯兰D.
      神经变性疾病认知下降的突触标志:蛋白质组学方法。
      )。

       质谱

      对于每个LC-MS的盗用分数,自动采样器(Ultimate™3000 RSLCNANO系统,Thermo Scientific Dionex)将20μl流动相A(95%水,5%DMSO,0.1%甲酸)分配到相应的将微量滴定板的孔和10μl注射到LC-MS中。将样品捕获在C18保护 - 脱盐柱上(适度的PEPMAP100,75μm×2cm,纳米脚器,C18,5μm,100Å),并在50cm长的C18柱上分离(易于喷雾薄膜RSLC,C18,2μm ,100Å,75μm×50cm)。在250nl / min的恒定流动中,弯曲梯度在每个馏分中从2%的流动相B(5%水,5%DMSO,95%乙腈,0.1%甲酸),如下所示这 补充表S2,然后在5分钟内陡峭地增加至100%溶剂B.使用杂种Q-Axactive-HF质谱仪(Thermo Scientific)进行在线液相色谱 - 串联质谱(LC-MS / MS)。 FTMS主扫描具有70,000分辨率(和300-1700质量的质量范围(M / Z)),然后在五个离子上使用更高的能量碰撞解离在前五个离子上的数据依赖性MS / MS(35 000分辨率)标准化碰撞能量40%。前体用2分离出来 m/z 窗户。自动增益控制目标为1×106 for MS1 and 1 × 105 对于MS2。对于MS2,MS1和150-200ms的最大喷射时间为100 ms。整个占空比持续~2.5秒。动态排除用于60次持续时间。排除了未分配的充电状态或充电状态1的前体。使用1%的底部填充率。

       肽和蛋白质鉴定

      orbitrap原始ms / ms文件使用proteowizard工具套件使用msconvert转换为mzml格式(
      • 霍尔曼J.D.
      • Tabb D.L.
      • Mallick P.
      采用ProteoWizard转换原料质谱数据。
      )。然后使用MSGF +(V10072)搜索光谱(V10072)(
      • 金斯。
      • PEVZNER P.A.
      MS-GF +对蛋白质组学的通用数据库搜索工具进行进展。
      )和渗滤器(V2.08)(
      • 格兰霍尔姆V.
      • 金斯。
      • Navarro J.C.
      • Sjolund E.
      • 史密斯r.d.
      • Kall L.
      使用MS-GF + Percoltor进行快速准确的数据库搜索。
      ),其中八个后续级分的搜索结果被分组用于渗透靶/诱饵分析。所有搜索都针对银河平台中的Ensembl 75的人类蛋白质子集完成,包括51,153个条目(
      • Boekel J.
      • 奇尔顿金。
      • cooke i.r.
      • Horvatovich P.L.
      • jagtap p.d.
      • KällL.
      • LehtiöJ.
      • Lukasse P.
      • 摩尔兰P.D.
      • 格里芬T.J.
      使用Galaxy的多OMIC数据分析。
      )。 MSGF +设定包括10ppm的前体质量耐受性,片段离子质量耐受0.02Da,全胰蛋白肽,最大肽长度为50个氨基酸,最大电荷为6和最大2个错过的裂解。固定修饰在赖氨酸残基和肽N末端的TMT10PLEX在半胱氨酸残基上的氨基甲酰基甲基化,可变改性用于氧化硫内残基对氧化。使用Openms项目的IsobaricAlyzer(V2.0)进行TMT10PLEX报告离子的定量(
      • STURM M.
      • 伯克沙A.
      • 格拉普C.
      • 希尔德布兰特A.
      • Hussong R.
      • Lange E.
      • pfeifer n。
      • Schulz-Trieglacaff O.
      • Zerck A.
      • Reinert K.
      • Kohlbacher O.
      Openms - 质谱源的开源软件框架。
      )。 PSM以1%的假发现率(FDR)发现用于推断基因标识。蛋白质定量基于TMT10PLEX报告器离子,并使用TMT PSM比率计算到整个样品集(全部10 TMT通道)并标准化为样本中值。然后使用来自基因符号独特的肽的中位PSM TMT报告量进行量化。仅需要一种独特的肽来鉴定蛋白质,并且使用挑选FDR方法将1%的蛋白质FDR截止为1%的蛋白质(
      • Savitski m.m.
      • Wilhelm M.
      • Hahne H.
      • Kuster B.
      • Bantscheff M.
      大蛋白质组学集中的蛋白质假发现速率估计的可扩展方法。
      )。肽序列, m/z每种肽和蛋白质的修饰,肽鉴定分数,加入号,肽数,百分比覆盖率和定量测量已经使用骄傲储存库(DataSet标识符:PXD014557)沉积在ProteomexChange联盟上。在分析中排除了所有10例中未鉴定的蛋白质。

       统计分析

      使用r(周的DEQMS包)计算AD和控制病例之间平均蛋白表达的改变(周 等等。,在其他地方出版的稿件中的稿件),因为数据使用Shapiro-Wilk测试没有显示正态分布。 DEQMS在Limma封装的顶部工作,并在计算T统计时考虑每种肽的检测到的PSM数。 DEQMS可在Biocumons(
      • Huber W.
      • Carey V.
      • 戴维斯S.
      • 汉森K.
      • 摩根M.
      F1000Research中的生物体通道[版本2;同行评审:不是同行评审]。
      ),包装也沉积在GitHub(//github.com/yafeng/DEqMS)。本杰里尼 - Hochberg方法用于多个假设检测,施加10%FDR的截止水平。
      执行多变量数据分析,以在SIMCA V15中使用无监督的PCA找到我们数据集的最大变化。差异表达蛋白质的热图(日志2 折叠变化 - / + 0.7和FDR<10%)使用Morpheus(广泛的研究所)产生,并应用了基于Pearson距离指标的完整连锁的分层聚类,以可视化AD和控制案例之间的表达方式。为了比较广告和对照组之间的人口特征(包括年龄,性别和后期间隔(PMI),pH和Apoe),我们在GraphPad Prism 7.0(San Diego,CA)中使用Mann Whitney测试进行了单变量分析。使用Graphpad Prism 7.0(San Diego,CA)的Mann Whitney试验进行了免疫组织化学染色半定量密度测定的统计分析。
      生物信息学分析

       富集分析

      要概述哪些生物过程可能在AD中的DG的ML的外部三分之二受到影响,我们使用基因设定浓缩分析(GSEA,Broad Institute)(
      • Subramanian A.
      • Tamayo P.
      • Mootha V.k.
      • Mukherjee S.
      • Ebert B.L.
      • Gillette M.A.
      • 等等。
      基因设定富集分析:一种基于知识的解释基因组表达谱的方法。
      )。这种类型的分析基于含有来自基因本体(GO)注释(GO)注释的基因组的分子签名数据库(V6.1)(
      • Liberzon A.
      • Subramanian A.
      • pinchback R.
      • Thorvaldsdottir H.
      • Tamayo P.
      • Mesirov J.P.
      分子签名数据库(MSIGDB)3.0。
      )。我们运行了一项续集的统计方法,其中所有已识别的基因从最多增加到最小的表达式,无论其P - 和FDR值如何(从16-02-2019到16-02-2019)。本体论 p < 0.01 and FDR <5%被认为是显着富集的,比GSEA指南相当严格(
      • Subramanian A.
      • Tamayo P.
      • Mootha V.k.
      • Mukherjee S.
      • Ebert B.L.
      • Gillette M.A.
      • 等等。
      基因设定富集分析:一种基于知识的解释基因组表达谱的方法。
      )。此外,我们使用Gorilla工具进行了第二种类型的富集分析(Go Database从27-04-2019)(
      • 伊甸园E.
      • Navon R.
      • Steinfeld I.
      • Lipson D.
      • Yakhini Z.
      大猩猩:在排名基因列表中发现和可视化富集的GO术语的工具。
      )。两个不纳的蛋白质清单,由差异表达蛋白质组成的目标列表(FDR<10%)和背景列表,即所有已识别的蛋白质。我们对该分析进行了分析,分别减少和增加了蛋白质。与fdr.的本体<5%被认为是统计学意义。在GSEA和Gorilla工具中,本杰里尼-Hochberg方法用于计算FDR值。

       途径分析

      Ingenuity途径分析(IPA,Qiagen,Hilden,德国)用于我们数据集的系统分析,以便在生物学背景下解释我们的研究结果。 ad / c蛋白率(日志2)所有量化的蛋白质,对IPA上载的p-和FDR值,并进行核心分析。我们允许直接和间接的关系以及搜索在小鼠,大鼠和人类物种中进行的发布数据,并施加10%FDR切断,以避免与机会仅发生的关系。然后分析差异表达的蛋白质三类:生物学功能,富集的分子网络和上游调节因子。对于每个生物功能和上游调节器,IPA计算一个 p 使用右尾Fisher确切测试的价值 p <0.01被认为是统计学意义的。此外,IPA通过计算Z分数来对激活状态进行预测,如果Z分数则被认为是显着的>2 or z-score <-2。最后,IPA可以基于所识别的蛋白质创建分子网络,并且对于每个网络,IPA分配由超高度分布和右尾Fisher精确测试计算的分数。

       免疫组织化学

      将石蜡包埋的海马部分(5μm)再水化,使用柠檬酸盐缓冲液(pH6)或Tris-EDTA缓冲液(pH9)在110℃下施加热诱导的表位检索30分钟。设想双链路系统(Dako,Agilent,Santa Clara,California)含有过氧化物酶,HRP标记的聚合物,DAB和DAB底物缓冲液,用于可视化DAB染色。在阻断内源过氧化物酶活性5分钟后,在室温下用山羊血清(Dako,Agilent)封闭部分,然后用以下一抗染色4°C:复合物-1(CPLX1,蛋白质技术, Rosemont,伊利诺伊州,1:200稀释),复合素-2(CPLX2,蛋白质技术,1:200稀释)和Synaptogyrin-1(Syngr1,Sigma-Aldrich,1:200稀释)。在抗体稀释剂(Dako,Agilent)中制备抗体稀释液。然后将部分在室温下用HRP标记的聚合物孵育1小时,然后与DAB孵育。最后,使用Vectamount永久安装介质(矢量实验室,California)脱水并覆盖了覆盖物。来自AD和对照组的部分包含在相同的染色实验中,并使用相同的抗体溶液来避免染色间变异性。使用尼康Eclipse E800显微镜和尼康DS-RI2相机(10×目的,增益1,曝光2 MS)和NIS元素软件(日本尼康仪器,Inc.,日本)和图像进行扫描部分,并在8比特秤上分析图像imagej fiji(nih)。以致盲的方式测量感兴趣区域的平均像素强度,覆盖DG的中间和外部ML,并将其定义为组织外部的区域的信号强度,被减去(
      • 罗宾逊J.L.
      • 莫里娜州Porelel L.
      • corrada m.m.
      • 莱布斯K.
      • 李e.b.
      • 李五。
      • Kawas C.H.
      • Trojanowski J.Q.
      穿孔路径突触损失与最古老的老年人的认知障碍和阿尔茨海默病相关。
      )。此外,通过两个独立研究人员(C.和S.F.)的主观评估以蒙蔽方式检查感兴趣区域中染色强度的总体形态学观察。基于0到3的刻度进行视觉评分(0,不存在; 1,温和; 2,中等; 3,强)。

      结果

       人口特征

      本研究中使用的所有病例的人口特征如图所示 补充表S1。我们使用了荷兰大脑银行的一个队列,用于初始蛋白质组学研究(探索性)和来自Carroll A. Campbell Jr.神经病理学实验室(CCNL)脑群的另一个群组为免疫组织化学研究(验证)。在使用终级材料时,病例之间的可变性是不可避免的,因此,具有特征性的研究队列至关重要。我们试图通过考虑年龄,性别,PMI和与广告相关的病理来控制这种可变性。此外,为了使突触损失的效果最小化,我们选择具有相对早期阶段的AD(Ad Braak第4阶段4和淀粉样蛋白沉积阶段C)的AD案例,用于探索队列。在任何一个群组中,在群体之间的年龄,性别或PMI没有统计学上显着差异。脑组织的pH在探索队列中的群体之间没有显着差异。对于验证队员,所有广告案例都没有一个控制案例是APOE4载体,符合APOE4是广告的危险因素。

       鉴定差异表达蛋白质

      为了鉴定可能在突触功能障碍中发挥作用的蛋白质,我们研究了DG的ML的外部三分之二的蛋白质组,因为穿孔通道颗粒细胞的兴奋性突触在该区域中高度富集。此外,该区域还含有较小程度,轴突和衍生自各种细胞类型,神经胶质细胞和抑制作用的磁共纤谱(分子层穿孔路径相关的)细胞的轴突和树枝状物。考虑到这一区域对AD相关病理变化的影响非常易受影响,我们使用LMD从五个广告和五种神经学健康的对照病例中剖析并进行定量MS。所有病例均在肽水平上用不同的异常标签标记,允许同时检测十个样品,从而消除了运行之间的变化。在LC-MS / MS之前,将标记的肽基于其等电聚焦点分离成72个级分(
      • Branca r.m.
      • 奥尔l.m.
      • 约翰逊H.J.
      • 格兰霍尔姆V.
      • 哈斯·米
      • Perez-Bercoff A.
      • 伪装J.
      • KällL.
      • LehtiöJ.
      盗程LC-MS使得能够深入蛋白质组覆盖和无偏的蛋白质组。
      )。我们深入的蛋白质组学分析导致​​使用MSGF +渗滤器软件(在肽水平中1%FDR截止)的鉴定至7322蛋白(基因中心)的鉴定。使用基因符号作为蛋白质组的挑选FDR方法计算蛋白质假发现率,并限制为1%FDR(
      • Savitski m.m.
      • Wilhelm M.
      • Hahne H.
      • Kuster B.
      • Bantscheff M.
      大蛋白质组学集中的蛋白质假发现速率估计的可扩展方法。
      )。可以在所有情况下量化的蛋白质完整列表 补充表S3。有关肽和蛋白质水平的定量信息也使用普遍存器储存库(DataSet标识符:PXD014557)沉积在ProteomexChange联盟中。 PCA显示广告和控制案例之间的相对良好的分离,除了广告案例之一,ID-4(Fig. 2A)。该AD患者的临床和神经病理细节并不建议任何可以解释这种差异的突出证据。折叠变化的分布 与p 所有已识别的蛋白质的值显示在Volcano图中,在广告和控制之间显示蛋白质水平相当大的变化(Fig. 2B)。使用本Jamini-Hochberg方法调整多个假设比较后,发现724个蛋白质被显着改变(p < 0.01 and FDR <10%),由382减少,蛋白质增加342。蛋白质最改变的表达水平(FDR<10%)显示在热图中(Fig. 2C),并列出了最大折叠变化的前20个蛋白质 表I.。我们观察到蛋白质减少,包括复合素,Rab3a,代谢谷氨酸受体4(GRM4)和Syngr1的蛋白质中的突触前蛋白质的过度表示。然而,有趣的是,AMPA和NMDA受体如AMPA和NMDA受体,翅膀,PSD95,Homer1和Sybaptopodin的突触后蛋白质没有改变(补充表S4)。在我们数据集中的广告和控制案例之间的淀粉样蛋白前体蛋白(APP)和微管相关蛋白质TAU(MAPT)的水平没有差异。然而,这并不令人惊讶,因为即使感兴趣的区域含有淀粉样斑块和神经原纤维缠结,它们也可能不会使用当前方法来溶解。此外,APP和TAU的总量没有改变的事实不排除Aβ或磷酸化TAU的水平被改变的可能性。
      表I.前10名减少,前10名增加的蛋白质显示出广告的最大变化
      基因名称蛋白质名称日志2 of av. ratio (AD/C)比率(ad / c)PSM计数p value调整 p 价值 (FDR)生物过程
      CPLX.1复杂素-1−1.470.36100.000980.06外尿精,神经递质运输,运输
      HPRT1缺氧 - 鸟嘌呤磷纤维基转移酶−1.010.50140.006630.08嘌呤救生途径,Inosine单磷酸盐代谢过程
      ATP5JATP合成酶偶联因子6,线粒体−0.990.5080.004770.08氢离子运输,离子运输,运输
      FAH.Fumarylacetoacetase.−0.980.5150.009320.09苯丙氨酸分解代谢,酪氨酸分解代谢
      GNG3鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)/ g(s)/ g(o)亚基γ-3−0.970.5160.000450.05G蛋白偶联受体信号通路
      BCAS1乳腺癌放大序列1−0.940.52190.003240.07髓鞘
      GAP43神经调节蛋白−0.930.532680.001810.06调节增长
      ORM1α-1-酸糖蛋白1−0.920.5370.000070.04炎症反应
      CPLX.2复杂素-2.−0.900.54170.003430.07外尿精,神经递质运输,神经发生
      APOC3载脂蛋白C-III−0.890.5410.002000.06脂蛋白代谢过程,胆固醇稳态
      HRC.肌肉网状素富含组氨酸富含钙结合蛋白1.302.4620.005100.08细胞蛋白质代谢过程,肌肉收缩
      JPH2junctophilin-20.941.9210.003000.07钙离子稳态
      CD44CD44抗原0.931.91480.002220.06细胞粘附,炎症反应,细胞外基质组织
      GFAP.胶质纤维酸性蛋白质0.921.8924450.003040.07星形胶质细胞发展
      SPARC.SPARC.0.841.7960.001480.06细胞外反应对生长因子刺激,细胞外基质组织,对钙离子的反应,突触组织的调控
      HSPB6热休克蛋白β60.821.7650.005310.08伴侣介导的蛋白质折叠
      FAM184A蛋白质FAM184A0.761.69280.004900.08
      ITGA3整合素阿尔法3.0.731.6650.000100.04细胞外基质组织,细胞 - 基质粘附,树突脊柱维护,记忆
      COLEC12.收集12.0.731.6640.001910.06监管免疫应答
      ICAM1细胞间粘附分子10.721.65110.001230.06细胞粘附,调节免疫应答

       富集分析表明改变的线粒体和突触功能

      我们使用GSEA以通过AD发病机制概述可能在DG的ML的外部三分之二的生物过程中的概述。该分析考虑了所有已识别的蛋白的观察到的折叠变化,并导致94个负性,并产生118个积极的富集术语(p < 0.01 and FDR <5%, 补充表S5和6)。最负面且积极的10个生物过程排名 p 值显示在 Fig. 2D2E分别和个人富集地块可以在其中找到 补充图S1和S2。对包括细胞呼吸,氧化磷酸化和电子传输链包括细胞呼吸,氧化磷酸化和电子传输链的负富集表明AD的感兴趣区域的能量代谢改变。此外,还发现钙离子调节的外尿胞和SV定位在广告中是负富集的(补充表S5)。另一方面,在前10个正面富集的GO术语中,RNA加工和核糖核蛋白复杂生物发生更加突出(Fig. 2E)。
      另外,使用大猩猩工具,我们在只有差异表达蛋白质(FDR)时研究了生物过程的富集<将10%)(目标列表)与我们数据集中的所有已识别的蛋白质进行比较(背景列表)。富集分析仅在蛋白质减少(n = 382, FDR <10%)导致55条术语(FDR<5%, 补充表S7)。该子集中最富集的生物过程包括神经递质分泌,钙离子调节的外尿胞和信号释放(Fig. 2F)。另一方面,增加蛋白质的富集分析(n = 342, FDR <10%)确定了92个丰富的GO条款(FDR<5%, 补充表S8)。与GSEA发现一样,与基因表达相关的生物过程似乎是富含大猩猩的积极富集(Fig. 2G)。

       差异表达蛋白质的途径分析

      为了进一步照亮在AD中的DG中的ML的外部三分之二发生的生物学活性,我们对差异表达蛋白进行了详细的途径分析(n = 724, FDR <10%)使用IPA,其预测基于文献的影响生物过程,分子网络和上游调节因子。首先,使用疾病和功能工具来识别受感兴趣区域中观察到的表达简档影响的关键生物过程(补充表S9)。例如,IPA预测,广告中的卵尿量减少,因为膜蛋白-A1,钙依赖性分泌物2),CPLX2,神经元钙传感器-1(NCS1),RAB3A,RAB3B,RAB3D,SEDIN- 5,Snap25,Snap29,Syntaxin-1a和Visinin样蛋白1(Vsnl1)(Fig. 3A)。其他预测的过程包括分泌途径,神经元迁移,中枢神经系统细胞的迁移和金属离子的运输。此外,IPA预测包括癫痫发作的几种途径(Fig. 3B),肿瘤细胞系细胞扩散,肿瘤细胞系,肿瘤细胞系的形状变化,蛋白质,震颤和细胞存活的磷酸化(补充表S9)。其次,IPA可以创建可以提供有关所识别的蛋白质之间关系的更多信息的分子网络。创建了25个分子网络,并发现了一个名为“细胞到小区信令和相互作用/神经系统的开发和功能/蜂窝装配和组织”的网络受到广告中最多的影响(Fig. 3C)。有趣的是,这个网络由调解神经递质的途径组成(p = 4.92E-13),突触传输(p = 2.24E-11),SVS的运输(p = 3.74e-10),并释放神经递质(p = 7.46E-09)。最后,上游调节器工具用于鉴定哪些上游分子可能会潜在地解释我们数据集中观察到的蛋白质表达的变化。鉴定据鉴定地图激酶 - 相互作用的丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶1(MKNK1),转录因子7样2(TCF7L2),血红蛋白亚基α(HBA1 / HBA2)和核因子红外2-相关因子2(NFE2L2)作为上游调节剂,所有预计都预计抑制了显着的Z分数(补充表S10)。值得注意的是,NRF2(NFE2L2)是抗氧化代谢的关键调节剂,并且在神经变性障碍的领域中被广泛研究(Fig. 3D)。有趣的是,APP和MAPT也被识别为上游调节因子,但无法预测激活状态。有趣的是,IPA未识别任何重要的激活上游调节因子。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3IPA.的显着改变蛋白质的途径分析。 不同的IPA工具用于更好地了解在广告中受影响的生物过程。 A-B.,疾病和功能工具用于预测受差异表达蛋白质影响的生物学功能。预计胞尿量减少(A),而癫痫发作预计在广告中增加(B)。 C,分子网络工具产生了25个不同的网络。网络“细胞到小区信令和交互/神经系统开发和功能/蜂窝装配和组织”,所示(C),排名最高的分数并由介导神经递质的途径组成。星号表示该网络中的预突触蛋白。 D,上游调节器工具预测转录因子核因子红外2相关因子2(NFE2L2)作为其数据集中鉴定的靶蛋白的上游调节器。

       免疫组织化学分析

      除了许多差异表达的蛋白质中,我们选择了一些候选蛋白质,用于基于以下参数的免疫组织化学实验:(1)广告和控制之间的折叠变化(具有30%的截止值,下调或下调)( 2)生物学功能,(3)以前未在AD大脑中研究的蛋白质和(4)是否适合于免疫组化的抗体是可商购的。最后,(5)我们认为我们的兴趣区域在兴奋性突触中高度富集,我们的综合数据分析表明了突触前信令受损。使用这些标准,我们选择了CPLX1,CPLX2和Syngr1,用于进一步验证,并在由五个AD病例和七种控制组成的新群组中进行免疫组化。所有选定的抗体在DG的ML的神经岩中显示出强烈的免疫反应性。 CPLX2还在颗粒细胞层中显示出强烈染色,而CPLX1和Syngr1在该区域中具有弱染色强度( Fig. 4)。使用Imagej Fiji(NIH)测量DG的ML的外部三分之二的平均像素强度,并且减去了由组织部分外部的区域的平均像素强度组成的背景。半定量分析显示CPLX1减少28%( p = 0.005, Fig. 4A4C),CPLX2(p = 0.048, Fig. 4D4F),同步1减少26%(p = 0.005, Fig. 4G4I)在广告与对照相比。作为进一步的确认,由两个独立的研究人员(C.和S.F.)以致盲的方式进行主观评分,也表明所有三种突触前蛋白质(数据未显示)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4选定蛋白质组学命中的免疫组织化学分析。 免疫组织化学用于验证CPLX1的改变(A-C.),cplx2(D-F.)和syngr1(G-I.)在七个控制和五个广告案件中。一个控制案例的代表性数据(A, D, 和 G)和一个广告案例(B, E, 和 H)显示。使用图像J进行密度测量测量,并示出了平均像素强度。半定量密度测定分析显示CPLX1水平显着降低(A-C.),cplx2(D-F.)和syngr1(G-I.)。秤杆是100μm。

      讨论

      在这个探索性研究中,我们进行了基于MS的蛋白质组学,以鉴定可能在AD中的突触功能障碍中发挥作用的蛋白质。为此目的,我们专注于DG的ML的外部三分之二,其通过穿孔路径接收海马的主要谷氨酸谷氨酸输入,并且重要的是这些突触似乎易受广告病理学的影响。在LC-MS之前使用盗用(
      • Branca r.m.
      • 奥尔l.m.
      • 约翰逊H.J.
      • 格兰霍尔姆V.
      • 哈斯·米
      • Perez-Bercoff A.
      • 伪装J.
      • KällL.
      • LehtiöJ.
      盗程LC-MS使得能够深入蛋白质组覆盖和无偏的蛋白质组。
      )允许产生深入的MS数据,导致鉴定7322蛋白,从而占据了人类蛋白质组的显着比例,并能够检测低丰富蛋白质的疾病发病性的低丰富蛋白质的改变。
      要深入了解可能受到广告发病机制影响的潜在机制,我们进行了综合性富集和途径分析。基于其折叠变化分析所有蛋白质的GSEA,在AD中众所周知的受损的线粒体生物能诊学和增加的氧化应激增加(
      • Duboff B.
      • 菲恩米
      • gotz J.
      为什么尺寸重要 - 平衡阿尔茨海默病的线粒体动态。
      )。虽然这些个体线粒体蛋白的许多改变在统计学上没有统计学意义,但是大量降低的线粒体蛋白质,特别是复合I,III和IV的组分,发现略微降低,仍然会对线粒体功能产生影响。考虑到突触传递需要大量的能量,改变的线粒体生物能诊可以损害突触稳态,以前在广告中观察到(
      • devine m.j.
      • Kittler J.T.
      在医疗和疾病的神经元预先跨遍的线粒体。
      )。要了解蛋白质(FDR)的特异性富集的生物学过程(FDR<10%),我们使用大猩猩工具进行了第二份丰富分析。我们发现神经递质分泌,钙离子调节的卵尿量和SV对接在AD的兴趣区域中受到负面影响。符合此,使用IPA的途径分析还表明抑制AD中的胞卵症和分泌途径,并产生了富含突触前蛋白质的分子网络。所有这些分析都强烈支持AD中DG ML的外部三分之二的突触前损伤。因为在疾病课程的早期地区观察到突触损失(
      • Scheff S.W.
      • 火花D.L.
      • 价格D.A.
      阿尔茨海默病患者外分子层突触密度的定量评估。
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      • Scheff S.W.
      • 价格D.A.
      • 施密特F.A.
      • Mufson e.j.
      早期阿尔茨海默病患中的海马突触损失和轻度认知障碍。
      )这被认为反映了源自Entorhinal Cortex的传入丧失(
      • 戈麦斯 - 伊斯兰蒂
      • 价格J.L.
      • McKeel Jr,D.W.
      • 莫里斯J.C.
      • 咆哮J.H.
      • Hyman B.T.
      二层嗜酸剂疾病的深度丧失II型梭菌性神经元发生。
      ),在我们的研究中可能令人惊讶的是许多突触前蛋白质减少。但是,重要的是要注意,我们没有观察到突触后密度蛋白的任何改变(例如 AMPA和NMDA受体,PSD95)以及大多数轴突运输蛋白质(例如 KIF5B,KIF5C,DYNC1H1),表明突触前蛋白的特异性损失。有趣的是,若干研究显示了广告中该地区剩余突触的突触突触后的突触突出长度(
      • Scheff S.W.
      • 火花D.L.
      • 价格D.A.
      阿尔茨海默病患者外分子层突触密度的定量评估。
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      • Scheff S.W.
      • 价格D.A.
      • 施密特F.A.
      • Mufson e.j.
      早期阿尔茨海默病患中的海马突触损失和轻度认知障碍。
      ),这可能是补偿降低的突触前输入的机制(
      • Hyman B.T.
      • 范霍恩G.W.
      • damasio a.r.
      阿尔茨海默病:在海马穿孔途径区中的谷氨酸枯萎病。
      )。越来越多的证据表明,并非所有突触前蛋白都受到广告中的影响(
      • 荣获W.G.
      阿尔茨海默氏病突触蛋白的病理学:超过终端的简单损失。
      )。符合这一发现,在我们的研究中,一些突触前蛋白质显示出广告的最小变化,而其他蛋白质在更大程度上减少(>30%),如CPLX1,CPLX2,囊泡谷氨酸转运蛋白2(SYNGR1,RAB3B,NCS1,SYNGR3,GRM4和RAB3A(Fig. 5)。因此,某些特异性蛋白质可能比其他特定突触功能更重要。尽管先前已经显示出许多上述蛋白质是突触前,但我们不能排除它们在突触后终端也可能表达的可能性。对于进一步的验证实验,我们选择了突触前的三种蛋白质(CPLX1,CPLX2,Syng1)。复合物与陷阱蛋白和突触蛋白和突触蛋白相互作用,是SV融合的重要调节因素(
      • 贡j.
      • 赖Y.
      • 李X.
      • 王米
      • 莱特茨J.
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      • Choi U.B.
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      • pfuetzner r.a.
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      • 杨X.
      • Brunger A.T.
      • 刁J.
      哺乳动物复合物的C末端结构域-1定位于高弯曲的膜。
      )。为了支持我们的研究结果,先前在优越的时间皮层中观察到降低CPLX1和CPLX2水平(
      • Beeri M.S.
      • Haroutunian V.
      • 施梅德勒J.
      • 萨诺米
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      • 巴尔上午
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      • 卡特塞尔P.
      突触蛋白缺陷与痴呆症无关,而不管极度晚年如何。
      ),在海马和较低的AD颞皮质皮层(
      • Tannenberg R.K.
      • 斯科特H.L.
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      • Dodd P.R.
      阿尔茨海默病患突触蛋白的选择性丧失:具有Apoe Varepsilon4的严重程度增加的证据。
      )。 Syngr1是一种在SVS上表达的丰富蛋白质。虽然其作用仍有待阐明,但Syngr1被认为调节SV循环并影响神经递质释放性质(
      • 史蒂文斯r.j.
      • Akbergenova Y.
      • JORQUERA R.A.
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      果蝇突触葡萄蛋白突变体异常突触囊泡生物发生。
      )。 Syngr1尚未在课后脑组织中进行广泛研究,但在时间皮层中检测到SYNGR1的水平降低(
      • 穆伦里斯
      • Wetterhall M.
      • ingelsson m.
      • Lannfelt L.
      • Artemenko K.
      • 贝尔奎斯特J.
      • Kultima K.
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      复用质谱法定量阿尔茨海默病中脑蛋白质组。
      )和广告案件的CA1(
      • 计数S.E.
      • Alldred M.J.
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      • Ginsberg S.D.
      • Mufson e.j.
      海马CA1金字塔神经元中的突触基因失调在轻度认知障碍中。
      )。我们使用免疫组化确认了CPLX1,CPLX2和Syngr1的表达减少,使用免疫组化。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5在AD中改变的突触前蛋白的示意图概述。 “突触囊泡途径”(HSA04721)从KEGG修改(
      • Kanehisa M.
      • 佐藤Y.
      • Furumichi M.
      • Morishima K.
      • Tanabe M.
      了解吉夫基因组变化的新方法。
      ),并且在我们的MS数据集中的广告中具有改变的蛋白质在不同的绿色中突出显示,根据其比率突出显示。用虚线的蛋白质加入原始途径。
      IPA.的途径分析建议基于先前与文献中的这些过程相关的相关蛋白质的表达谱来参与癫痫发作,共济失调和震颤过程的过程。在患有假设家族广告和轻度认知障碍的受试者中的内侧颞叶中检测到早期的多动力(
      • Quiroz Y.T.
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      阿尔茨海默病患者疾病患者在非痴呆老年人的疾病签名区域相关联的海马血管活化。
      ),它可以解释为什么在AD患者中观察到癫痫发作(
      • Irtizarry M.C.
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      轻度至中度阿尔茨海默病的新发病癫痫发作的发病率。
      )。此外,电机标志如震颤和布拉德尼亚可以伴随广告(
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      临床诊断的阿尔茨海默病中的外锥瘤电机标志。
      )并表示恶化认知,特别是功能下降(
      • 担任伤害
      • 阿尔伯特米
      • Brandt J.
      • 黑色D.
      • hadjigeorgiou g.
      • Papadimitriou A.
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      电机标志预测阿尔茨海默病的差。
      )。有趣的是,蛋白质的磷酸化也被发现在AD中增加。例如,钙突蛋白亚基B(PPP3R1)和丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶2a(PP2CA),两者都已显示为Dephosphorylate Tau(
      • Yamamoto H.
      • SAITOH Y.
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      脑蛋白磷酸酶1和2A的微管蛋白的去磷酸化及其对微管组件的影响。
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      • Matsukado Y.
      • 米亚塔e。
      通过钙素素脱磷酸化微管相关蛋白2,TAU因子和微管蛋白。
      ),在AD中表现出降低的表达,同意这一领域的神经原纤维缠结的存在。 GSEA和大猩猩完成的富集分析表明,生物过程的激活,所述生物过程涉及基因表达,翻译引发,核糖体生物发生和RNA加工的调节。这些方法含有核糖体蛋白数量(例如 HNRNP,RPLS,RPSS)和真核翻译启动因子。与我们的发现相比,许多核糖体蛋白之前已经显示在AD大脑中降低(
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      )。由于我们感兴趣地区的当地改变,可能会发生这些差异。肿瘤细胞系的细胞扩散和形状变化的激活以及细胞存活过程中可能在神经变性背景下令人惊讶。然而,许多这些蛋白质, 例如 GFAP,CD44,ITGB1,EGFR和GAP43也参与了其他方法,并且IPA可能预测上述途径,因为癌症领域的发表文献的潜在过度表示。 IPA还可以预测改变​​蛋白质的上游调节因子。由IPA鉴定的一种这样的上游调节剂是NRF2,这是介导细胞防御机制的转录因子。响应于氧化应激,NRF2易转化为细胞核并靶向含有抗氧化剂反应元素的基因(
      • 李准。
      • 约翰逊J.A.
      NRF2-在细胞防御机制中的途径的重要作用。
      )。广泛的研究表明,衰老和神经变性的NRF2介导的转录途径中断。 Ramsey及其同事观察到AD病例的海马核NRF2水平下降(
      • Ramsey C.P.
      • 玻璃C.A.
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      • LINDL K.A.
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      NRF2在神经变性疾病中的表达。
      ),而在PD和AD微阵列研究的META分析中发现了NRF2水平但其靶基因水平降低(
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      帕金森病和阿尔茨海默病的荟萃分析揭示了常见的途径和NRF2依赖性基因的途径和失调。
      )。鉴于Aβ和超磷酸化TAU在AD发病机制中的重要作用,它也有趣的是,APP和MAPT被IPA预测为上游调节因素。然而,没有预测激活状态,因此我们只能得出结论,APP / MAPT和改变的蛋白质之间存在关系,并且在文献中没有共识,他们如何互相影响。
      最后,我们将我们的结果与其他蛋白质组学研究进行了比较,这些研究是使用不同地区的脑匀浆与广告的脑匀浆进行。我们观察到蛋白质数量以类似的方式改变,如时间Neocortex中的STX1a,syngr1,sv2a和sept5的降低,如下所示
      • 穆伦里斯
      • Wetterhall M.
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      复用质谱法定量阿尔茨海默病中脑蛋白质组。
      ); STX1B,SNAP91,PACSIN1和GFAP,MAOB,VIM和MICRODSENTED CA1和诸例中的AQP4水平降低(
      • Hondius D.C.
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      在阿尔茨海默病的所有病理阶段分析人类海马蛋白质。
      ); preforal cortex中LRFN2水平降低(
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      神经变性疾病认知下降的突触标志:蛋白质组学方法。
      )。另一方面,一些改变对于我们的研究是独一无二的,表明在AD大脑中全球可能发生一些变化,而其他改变则是特定于地区的。我们研究的潜在限制,特别是与使用突触体制剂的研究相比(
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      总之,我们研究了在后期人脑组织中高度脆弱的穿孔路径的牙齿终端区的蛋白质组。我们深入的蛋白质组学分析表明,在AD的兴趣区域中存在突触障碍,影响胞吐作用等过程和SV对接和SV等特异性蛋白质,如CPLX1,CPLX2和Syngr1。我们广泛的蛋白质组学数据和生物信息分析支持突触前信令确实在广告的早期阶段受到影响,因此,靶向突触前蛋白可能对未来的治疗策略缓慢或停止认知下降至关重要。

      数据可用性

      有关肽和蛋白质水平的定量信息,使用普遍储存库(PROSE)沉积在PROTEMEXCHANGE联盟中(//www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD014557,DataSet标识符:PXD014557)。本研究期间生成或分析的所有数据都包含在本文中及其补充信息文件中。

      致谢

      德国脑银行(阿姆斯特丹,荷兰)提供的蛋白质组学研究的后期人脑组织,并由Carroll A. Campbell Jr.神经病理学实验室(CCNL)脑堤在南卡罗来纳大学提供免疫组化研究。我们感谢所有捐赠者都用于本研究中使用的组织。通过临床蛋白质组学质谱设施,Karolinska Institutet / Karolinska大学医院/科学为生命实验室进行质谱分析。我们要感谢Chrisian Sibbers博士的帮助,以帮助蛋白质组学数据分析,以及Anah Gilmore女士和Laura Columbo女士进行脑解剖和CCNL脑库的加工。

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